Name: Generowanie organtypowych kultur tratwy z pierwotnych ludzkich keratynocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Naucz się generować organtypowe kultury tratwy z pierwotnych ludzkich keratynocytów. Ta metoda pozwala badać różnicowanie nabłonkowe i interakcje wirus-gospodarz w warunkach przypominających in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Sally Roberts (University of Birmingham, Birmingham UK) za uprzejme przekazanie przeciwciała E1ˆE4. Praca ta została sfinansowana z grantu National Cancer Institute (4R00CA137160-03).

1. Przygotowanie do organotypowych kultur raftowych
<ol>
	<li>Metalowe siatki do raftów muszą zostać najpierw poddane działaniu kwasu chromowo-siarkowego w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń, które mogłyby zakłócić proces różnicowania. Zanurz metalowe siatki w zlewce z kwasem siarkowym na jedną godzinę, a następnie płucz je w sposób ciągły przez noc wodą z kranu. Po płukaniu nocnym siatki należy płukać przez 3-5 godzin w podwójnie destylowanej wodzie.</li>
	<li>Aby zapewnić wsparcie dla raftów, zgnij trzy boki raftu o około 0,5 cm w równych odstępach od siebie. Następnie metalowe siatki należy poddać autoklawowaniu.</li>
	<li>Przygotuj 10X bufor do rekonstytucji, dodając 2,2 g NaHCO3 oraz 4,8 g Hepes. Rozpuść w 100 ml 0,05 M NaOH. Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w aliquotach po 5 ml w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przygotuj 10X DMEM bez wodorowęglanu sodu. Przefiltruj w celu sterylizacji i przechowuj w aliquotach po 5 ml w temperaturze -20°C.</li>
	<li>Przygotuj mysi czynnik wzrostu naskórka: rozpuść 100 mg EGF oraz 10 mg BSA, z każdego osobno w 10 ml zdejonizowanej ddH20. Połącz EGF i BSA, a następnie dodaj do 80 ml zdejonizowanej ddH20, tak aby uzyskać objętość końcową 100 ml. Przefiltruj w celu sterylizacji, podziel na aliquoty (5 ml) i przechowuj w -20°C. Do każdego litra pożywki E dodaj 5 ml EGF o stężeniu 1 mg/ml (stężenie końcowe 5 ng/ml).</li>
</ol>
2. Przygotowanie żeli kolagenowych
<ol>
	<li>Do każdego raftu wymagany jest jeden żel kolagenowy. Kolagen należy przechowywać w lodzie, aby zapobiec jego krzepnięciu. Każdy żel kolagenowy wymaga 3 ml mieszaniny kolagenowej składającej się z: 2,4 ml zimnego kolagenu typu I z ogona szczura (stężenie końcowe 3-4 mg/ml), 0,3 ml 10X buforu do rekonstytucji, 0,3 ml 10X DMEM oraz 1-2 X 106 fibroblastów mysich 3T3 J2 jako komórek odżywiających (feeder cells). W przypadku roztworów kolagenu z ogona szczura o wysokim stężeniu, należy rozcieńczyć je w 0,02 M kwasie octowym, aby uzyskać odpowiednie stężenie robocze.</li>
	<li>Określ liczbę potrzebnych żeli kolagenowych (raftów), a następnie oblicz ilość mieszaniny głównej (master mix) dla wymaganej ilości kolagenu, 10X buforu do rekonstytucji, 10X DMEM i fibroblastów J2. W każdej mieszaninie głównej uwzględnij zapas na 3-4 dodatkowe żele ze względu na lepkość kolagenu.</li>
	<li>Aby przygotować żel kolagenowy, poddaj fibroblasty J2 trypsynizacji i zneutralizuj je medium. Połącz wszystkie fibroblasty i umieść je w probówce stożkowej o pojemności 50 ml. Policz komórki, aby określić liczbę raftów, które można przygotować. Ponownie: na jeden żel kolagenowy, a tym samym na jeden raft, wymagane jest 1-2x106 fibroblastów. Odwiruj komórki przy niskiej prędkości.</li>
	<li>Odsuń medium z osadu fibroblastów i resuspenduj je w odpowiedniej ilości 10X buforu do rekonstytucji, 10X DMEM i kolagenu dla obliczonej liczby raftów. Kolagen dodaj na samym końcu, aby zapobiec zbyt szybkiemu krzepnięciu żelu. Po dodaniu kolagenu wymieszaj szybko, ale delikatnie, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do żelu. Żel powinien mieć czerwonopomarańczowy kolor, co wskazuje na prawidłowe pH. Jeśli mieszanina żelu jest zbyt żółta, dodaj kilka kropli filtrowanego sterylnie 1N NaOH i delikatnie wymieszaj, aby uzyskać właściwy kolor.</li>
	<li>Dodaj 3 ml mieszaniny kolagenu i fibroblastów do dołków płytki hodowlaną 6-dołkowej. Mieszaninę kolagenową należy nanosić pipetą powoli po ściance każdego dołka, aby uniknąć powstawania pęcherzyków. Umieść płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i pozostaw do zestalenia na 30 minut.</li>
	<li>Po 30 minutach dodaj 3 ml medium E z EGF na powierzchnię zestalonego żelu kolagenowego i wprowadź płytkę z powrotem do inkubatora. Żele powinny być przechowywane w 37°C przez co najmniej jeden dzień, ale wykorzystane w ciągu czterech dni. Optymalne wyniki uzyskuje się po dwóch dniach inkubacji.</li>
</ol>
3. Przygotowanie keratynocytów do różnicowania
<ol>
	<li>Keratynocyty o niskim numerze pasażu należy hodować do osiągnięcia około 70% konfluencji. Każdy raft wymaga 1-2x106 keratynocyty. Keratynocyty poddać trypsynizacji i zneutralizować w medium E z dodatkiem EGF. Policzyć komórki, aby określić liczbę możliwych do przygotowania raftów. Odwiruj komórki przy niskiej prędkości. Osad resuspendować w 1 ml medium E z EGF na każdą obliczoną kulturę raftu.</li>
	<li>Odssać pożywkę z żelów kolagenowych, przechylając płytkę 6-dołkową. Do każdego żelu dodać 2 ml świeżej pożywki E z dodatkiem EGF. Do każdego żelu ostrożnie dodać 1 ml resuspenderowanych keratynocytów do 2 ml pożywki E znajdującej się już w dołku. Delikatnie pipetować keratynocyty wraz z 2 ml pożywki, a następnie powoli nanosić kroplami z powrotem na żel. Wstrząsanie lub kołysanie płytki może doprowadzić do nierównomiernego rozprzestrzenienia się komórek po jednej stronie żelu kolagenowego. Umieścić płytkę w 37°C inkubator</li>
	<li>Komórki należy hodować do osiągnięcia konfluencji, codziennie wymieniając pożywkę E. Konfluencję komórek stwierdza się, gdy po jednym dniu od wymiany pożywki jej kolor zmieni się na żółty. Zazwyczaj trwa to od 2 do 4 dni. Jeśli do czwartego dnia kolor pożywki nie ulegnie zmianie, należy przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
4. Przygotowanie kultur na tratwach
<ol>
	<li>Używając sterylnej pęsety, umieść sterylną metalową siatkę do hodowli (raft grid), zgiętymi stronami do dołu, w naczyniu o średnicy 10 cm. Odessaj pożywkę z żelu kolagenowego. Aby oddzielić żel od ścianek dołka, prowadź sterylną szpatułką wzdłuż obwodu żelu, wykonując ruchy góra-dół. Aby usunąć żel kolagenowy, lekko przechyl płytkę i podnieś go, wsuwając szpatułkę pod spód. Połóż żel kolagenowy na metalowej siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między siatką a żelem. Na każdej siatce można umieścić dwa żele.</li>
	<li>W celu stworzenia granicy faz powietrze-ciecz (air-liquid interface), powoli dodaj pożywkę E bez dodatku EGF na dno naczynia, tak aby siatka stykała się z pożywką, ale żel kolagenowy nie. Pożywka nie powinna przenikać przez otwory w siatce. Dodawaj pożywkę powoli, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza pod siatką, ponieważ mogłoby to zapobiec jednolitej różnicowaniu. Inkubuj hodowle w temperaturze 37°C i wymieniaj pożywkę co drugi dzień, utrzymując granicę faz powietrze-ciecz. Zbierz hodowle po 14 dniach.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Przy prawidłowym przeprowadzeniu protokołu z wykorzystaniem pierwotnych keratynocytów, procedura ta pozwoli na uzyskanie dobrze zróżnicowanego nabłonka, w którym widoczne są poszczególne warstwy skóry. Można to potwierdzić w badaniu histologicznym poprzez barwienie preparatów kultur raftów hematoksyliną i eozyną (H&amp;E), jak pokazano na Ryc. 1B. Barwienie H&amp;E jest również przydatne do badania morfologii raftów oraz wpływu wirusów lub związków przeciwwirusowych na zdolność komórek do stratyfikacji i różnicowania. Na przykład rafty wykonane z pierwotnych ludzkich keratynocytów unieśmiertelnionych przez HPV (HFK-31) są wyraźnie grubsze w porównaniu do raftów wykonanych z normalnych ludzkich keratynocytów napletka (HFK), co odzwierciedla zwiększone tempo proliferacji oraz zdolność białek HPV do utrzymywania komórek różnicujących się w cyklu komórkowym (Ryc. 1B)10. Skutkuje to utrzymaniem jąder komórkowych w całym nabłonku, podczas gdy normalne keratynocyty opuszczają cykl komórkowy podczas różnicowania, co prowadzi do rozpadu otoczki jądrowej. Aby dokładniej zbadać proces różnicowania, można przeprowadzić immunohistochemię w celu analizy specyficznych markerów różnicowania, w tym cytokeratyn, a także inwolukryny i filagryny. Różne cytokeratyny są ekspresowane na specyficznych etapach różnicowania7. Jak pokazano na Ryc. 2, cytokeratyna 10 (K10) nie jest ekspresowana w warstwie podstawnej i występuje jedynie w warstwach nadpodstawnych, składających się z komórek ulegających stopniowemu różnicowaniu. W raftach HPV-dodatnich ekspresja K10 jest opóźniona w porównaniu do normalnych keratynocytów, co ponownie odzwierciedla wpływ białek HPV na różnicowanie keratynocytów. Immunohistochemia może być również wykorzystana do badania profilu ekspresji genów wirusowych. Na Ryc. 3 przedstawiono reprezentacyjne barwienie sprawdzające ekspresję białka HPV E1^E4, które jest białkiem późnym, którego ekspresja ogranicza się do najwyższych warstw nabłonka. Zgodnie z oczekiwaniami, w kulturach raftów z normalnych ludzkich keratynocytów napletka nie obserwuje się barwienia.
<img alt="Schemat metody hodowli nabłonkowej 3D; proces: zatyczka kolagenowa, wzrost nabłonka, granica powietrze-ciecz." src="/files/ftp_upload/3668/3668fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. A) Schemat metody przygotowywania organotypowych kultur raft z pierwotnych keratynocytów lub linii komórek nabłonkowych. B) Barwienie hematoksyliną i eozyną organotypowych kultur raft wytworzonych z keratynocytów ludzkiej napletka stabilnie utrzymujących episomy HPV-31 (HFK-31) lub z normalnych keratynocytów ludzkiej napletka (HFK). Zidentyfikowano poszczególne warstwy nabłonka oraz zatyczkę kolagenową.
<img alt="Schemat mikroskopii fluorescencyjnej pokazujący barwienie K10 i DAPI w komórkach HFK, podkreślający ekspresję." src="/files/ftp_upload/3668/3668fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Ekspresja cytokeratyny 10 (K10) jest ograniczona do warstw nadbazalnych nabłonka. Immunohistochemię przeprowadzono na przekrojach organotypowych kultur raft generowanych z komórek HFK-31, a także prawidłowych komórek HFK, z użyciem przeciwciała przeciwko K10. DNA komórkowe przeciwbarwiono DAPI. Obrazy zarejestrowano za pomocą konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Strzałki wskazują warstwę podstawną nabłonka.
<img alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek HFK; E1^E4, barwienie DAPI, nałożone; ekspresja białka." src="/files/ftp_upload/3668/3668fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Białko E1^E4 HPV jest produkowane w późnej fazie produktywnej cyklu życiowego wirusa. Immunohistochemię wykonano na przekrojach organotypowych kultur raft generowanych z komórek HFK-31, a także normalnych komórek HFK z użyciem przeciwciał przeciwko E1ˆE4. DNA komórkowe przeciwbarwiono DAPI. Obrazy zarejestrowano przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. Strzałki wskazują warstwę podstawną nabłonka.

<ol><li>Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+raft+cultures+for+investigations+of+virus+growth%2C+pathogenesis+and+efficacy+of+antiviral+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents.</a> Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).</li>
<li>Asselineau, D., Prunieras, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+%27simplified%27+skin%3A+control+of+fabrication%5BTitle%5D)+AND+%22The+British+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of 'simplified' skin: control of fabrication.</a> The British Journal of Dermatology. 111, Suppl . 27. 219-222 (1984).</li>
<li>Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBodily%2C+J+%22Organotypic+epithelial+raft+cultures+and+the+study+of+the+natural+history+of+human+papillomavirus%22">Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus</a>. , Caister Academic Press. Norfolk. (2006).</li>
<li>Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+up-regulation+of+the+human+papillomavirus+E7+gene+reactivates+cellular+DNA+replication+in+suprabasal+differentiated+keratinocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes.</a> Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).</li>
<li>Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+human+papillomavirus+and+modulation+of+the+infectious+program+in+epithelial+raft+cultures.+OFF%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF.</a> Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).</li>
<li>Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+synthesis+of+oncogenic+human+papillomaviruses+requires+episomal+genomes+for+differentiation-dependent+late+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).</li>
<li>Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+as+important+regulators+of+terminal+differentiation%3A+examining+keratin+expression+in+individual+epidermal+cells+at+various+stages+of+keratinization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization.</a> The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).</li>
<li>Longworth, M. S., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+human+papillomaviruses+in+differentiating+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Review%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia.</a> Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).</li>
<li>Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+of+human+papillomavirus+from+a+continuous+cell+line+upon+epithelial+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation.</a> Science. 257, 971-973 (1992).</li>
<li>Wilson, R., Laimins, L. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilson%2C+R+%22Differentiation+of+HPV-Containing+Cells+Using+Organotypic+Raft+Culture+or+Methylcellulose%22">Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose</a>. , Humana Press Inc. Totowa. 119-119 (2006).</li>
<li>zur Hausen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Papillomavirus+infections--a+major+cause+of+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Papillomavirus infections--a major cause of human cancers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisujemy tutaj metodę, która może być wykorzystana do ogólnego badania różnicowania nabłonkowego, ale może zostać również łatwo zaadaptowana do badania patogenezy wirusowej, jak i skuteczności potencjalnych środków terapeutycznych. Wiele wirusów atakuje komórki nabłonkowe albo jako pierwotne miejsce infekcji, jak w przypadku HPV, albo w pewnym momencie cyklu życiowego wirusa, jak w przypadku wirusów herpes. Chociaż hodowla organotypowych kultur raft (kultur na rusztowaniach), jest czasochłonna, zdolność do wiernego odtw...

<table><tbody><tr><td>Kolagen typu 1 z ogona szczura (4-5mg/ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM bez NaHC0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Invitrogen</td><td>12100-061</td><td></td></tr><tr><td>NaHC0&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Calbiochem</td><td>391338</td><td></td></tr><tr><td>Stalowe siatki metalowe</td><td>Williams and Mettle Co.</td><td>CR-03063-040-100-S</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka E&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Epidermalny czynnik wzrostu</td><td>BD Biosciences</td><td>354010</td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Generation of Organotypic Raft Cultures from Primary Human Keratinocytes

Opracowanie organotypowych hodowli raftowych nabłonka dostarczyło badaczom wydajnego systemu in vitro, który wiernie odtwarza różnicowanie nabłonka. System ten znajduje wiele zastosowań. Na przykład możliwość hodowli trójwymiarowych organotypowych raftów keratynocytów stanowiła ważny kamień milowy w badaniach nad wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV)1. Cykl życiowy HPV jest ściśle powiązany z różnicowaniem nabłonka wielowarstwowego pasmowego2. Organotypowe hodowle raftowe nabłonka, zaprezentowane w niniejszym materiale, odtwarzają cały cykl życiowy papillomawirusa, w tym produkcję wirusa3,4,5. Ponadto hodowle raftowe te wykazują zmiany dysplastyczne podobne do tych obserwowanych podczas infekcji HPV in vivo. Zatem system ten może być również wykorzystywany do badania nowotworów komórek nabłonkowych, a także wpływu leków na różnicowanie komórek nabłonkowych w ujęciu ogólnym. System organotypowych hodowli raftowych nabłonka, opracowany pierwotnie przez Asselineau i Prunierasa6 i zmodyfikowany przez Kopana et al.7, stał się ogólnym, stosunkowo łatwym w obsłudze modelem hodowlanym, który polega na namnażaniu komórek na wtykach kolagenowych utrzymywanych na granicy faz powietrze-ciecz (Rysunek 1A). W ciągu 10–14 dni komórki ulegają stratyfikacji i różnicowaniu, tworząc pełnowarstwowy nabłonek produkujący cytokeratyny specyficzne dla różnicowania. Zebrane rafty można badać histologicznie, a także przy użyciu standardowych technik molekularnych i biochemicznych. W niniejszym artykule opisujemy metodę generowania hodowli raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów. Tą samą technikę można zastosować w przypadku ustalonych linii komórkowych nabłonka, a także łatwo zaadaptować do wykorzystania tkanek nabłonkowych z prawidłowych lub zmienionych chorobowo biopsji8. Wiele wirusów w ramach swojego replikacyjnego cyklu życiowego atakuje nabłonek skóry lub błon śluzowych. W ciągu ostatnich kilku lat wykazano możliwość wykorzystania organotypowych hodowli raftowych jako metody badania interakcji wirus-komórka gospodarza w przypadku kilku herpeswirusów, a także adenowirusów, parwowirusów i poxwirusów9. Organotypowe hodowle raftowe mogą zatem zostać zaadaptowane do badania patogenezy wirusowej i stanowią jedyny sposób testowania nowych środków przeciwwirusowych w przypadku wirusów, których nie można hodować w stałych liniach komórkowych.

Opisano metodę in vitro pozwalającą na naśladowanie różnicowania nabłonkowego in vivo. Wiele wirusów w ramach swojego cyklu życiowego atakuje komórki nabłonkowe, a niniejsza metoda umożliwia badanie interakcji wirus-gospodarz w warunkach ściślej przypominających te występujące in vivo. Technikę tę można zastosować w przypadku pierwotnych keratynocytów, ustalonych linii komórkowych, a także w badaniach prawidłowej lub zmienionej chorobowo tkanki pobranej z biopsji.

Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Opracowanie organotypowych kultur nabłonkowych na rusztowaniach (raft cultures) dostarczyło badaczom wydajnego systemu in vitro, który wiernie odtwarza ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych keratynocytów lub ustalonych linii komórek nabłonkowych. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie kolagenowych czopów z fibroblastów, a następnie naniesienie warstwy komórek nabłonkowych na wierzch czopów.Następnie zatyczki przenosi się na siatki platformowe i utrzymuje na granicy fazy powietrze-ciecz przez 10 do 14 dni. W ostatnim kroku przeprowadza się zbiór platform. Ostatecznie zmiany w różnicowaniu nabłonka można ocenić za pomocą analizy histologicznej lub immunohistochemicznej, co pozwala na uzyskanie informacji na temat różnicowania nabłonka.Można ją również zastosować w innych układach, takich jak wirusy, które w ramach swojego cyklu życiowego infekują nabłonek skóry lub błon śluzowych. Procedurę zademonstruje Dan Anneker, doktorant w moim laboratorium. Najpierw wlej kwas chromowo-siarkowy do zlewki szklanej i zanurz metalowe siatki typu raft w kwasie na jedną godzinę.Następnie płucz siatki w wodzie z kranu przez całą noc. Po nocnym płukaniu płucz siatki przez kolejne trzy do pięciu godzin w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie pozostaw siatki na tratwie do wyschnięcia. Następnie zgnij trzy boki tratwy, około 0,5 centymetra w równych odstępach od siebie, i poddaj siatki na tratwie autoklawowaniu.Po przygotowaniu żelu kolagenowego, fibroblasty traktuje się trypsyną, a następnie neutralizuje trypsynę za pomocą medium. Fibroblasty przenosi się do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zlicza komórki, aby określić liczbę możliwe do przygotowania tratw (rafts). Następnie, po odwirowaniu komórek przez cztery minuty przy 244 ×g w temperaturze pokojowej, odsysa się medium z osadu fibroblastów i resuspenduje komórki w odpowiedniej ilości buforu rekonstrukcyjnego DMEM oraz kolagenu, zgodnie z obliczoną liczbą tratw.Kolagen dodaje się na samym końcu, aby zapobiec zbyt szybkiemu krzepnięciu żelu. Po dodaniu kolagenu należy szybko, lecz delikatnie wymieszać roztwór, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w żelu. Jeśli mieszanina żelowa ma zbyt żółty kolor, należy dodać kilka kropli sterylizowanego filtrem roztworu.Dodaj jedną jednostkę wodorotlenku sodu. Mieszaj delikatnie, aż żel przybierze czerwonopomarańczowy kolor, co wskazuje na prawidłowe pH. Następnie powoli pipetuj trzy mililitry mieszaniny kolagenu i fibroblastów po ściance każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki hodowlanej, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby żel mógł stwardnieć.Gdy żel stężeje, dodać 3 mL pożywki E z EGF na powierzchnię zestalonego żelu kolagenowego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po wyhodowaniu keratynocytów o niskim numerze pasażu do około 70% konfluencji, keratynocyty poddać trypsynizacji, a następnie zneutralizować trypsynę pożywką E z EGF. Następnie policzyć komórki, aby określić liczbę raftów, które można przygotować.Po odwirowaniu komórek zawiesić osad w jednym mililitrze eed z EGF dla każdej obliczonej kultury raftu. Następnie usunąć medium z żeli kolagenowych, przechylając płytkę 6-dołkową na bok, a następnie dodać dwa mililitry świeżego eed z EGF do każdego żelu. W kolejnym kroku ostrożnie dodać jeden mililitr zawiesiny keratynocytów do dwóch mililitrów eed znajdujących się już w każdym z dołków.Ostrożnie pipetuj keratynocyty wraz z dwoma mililitrami pożywki i nanieś je kroplami na czop kolagenowy. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwa do czterech dni, aby komórki osiągnęły pełną konfluencję. Komórki są gotowe, gdy pożywka zmieni kolor na żółty jeden dzień po jej wymianie; najpóźniej w czwartym dniu, za pomocą sterylnej pęsety, umieść sterylną metalową kratkę (raft) wygiętymi bokami w dół w naczyniu o średnicy 10 cm.Odsaj proporcję medium z jednego żelu kolagenowego, a następnie przesuwaj sterylną szpatułkę wokół obwodu żelu ruchem góra-dół, aby oddzielić go od ścianek dołka. Przeniesienie kolagenowego krążka z płytki 6-dołkowej na siatkę jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Należy uważać, aby delikatnie wsunąć szpatułkę pod krążek, nie rozrywając go, a następnie położyć go płasko na siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między krążkiem a siatką.Następnie można użyć szpatułki, aby wygładzić wszelkie fragmenty, które zwinęły się podczas tej procedury. Aby wyjąć żel, należy lekko przechylić płytkę, wsunąć szpatułkę pod żel i go podnieść. Połóż żel kolagenowy na metalowej siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między siatką a żelem.Aby stworzyć interfejs powietrze-ciecz, powoli dodaj EED bez EGF na dno naczynia w taki sposób, aby siatka rusztowania stykała się z medium, ale żel kolagenowy nie był w niego zanurzony. Następnie inkubuj rusztowania w temperaturze 37°C. Utrzymując interfejs powietrze-ciecz, zbierz rusztowania po 14 dniach. Jak widać na tej figurze, rusztowania wykonane z primary human keratinocytes unieśmiertelnionych HPV 31 (HFK 31) są wyraźnie grubsze w porównaniu do rusztowań wykonanych z normalnych ludzkich keratynocytów skóry (HK).Zatem białka HPV wykazują zdolność do utrzymywania aktywności różnicujących się komórek w cyklu komórkowym. W tym przypadku przeprowadzono analizę immunohistochemiczną przekrojów organotypowych kultur raft generowanych z linii HK 30 oraz prawidłowych HKS, wykorzystując przeciwciało przeciwko cytokeratynie 10 lub K 10, zaznaczonej na zielono. K 10 nie była ekspresowana w warstwie podstawnej, wskazanej tutaj strzałkami, lecz występowała wyłącznie w warstwach ponadpodstawnych, które składają się z postępująco różnicujących się komórek.Na tym rysunku przedstawiono oczekiwaną ekspresję białka HPV E1, E4 – białka późnego, które ogranicza się do najwyższych warstw nabłonka i jest tutaj zaznaczone kolorem zielonym. W kulturach typu raft z prawidłowych hks nie obserwuje się żadnego barwienia, podobnie jak na poprzednim rysunku.Strzałki ponownie wskazują warstwę podstawną nabłonka po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii nowotworów do badania patogenezy wirusów brodawczaka ludzkiego przy użyciu systemu, który naśladuje różnicowanie nabłonka in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tworzenia organotypowych kultur raft z pierwotnych keratynocytów lub ustalonych linii komórek nabłonkowych.

generation-organotypic-raft-cultures-from-primary-human

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Generacja kultur raftowych organotypowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Ten film opisuje szczegółowy protokół generowania organotypowych rekonstrukcji skóry in vitro 3D w celu zbadania progresji czerniaka. Ten model skóry naśladuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządów in vivo.

Generowanie organotypowych rekonstrukcji całej skóry: procedura tworzenia modelu 3D skóry na podstawie próbek ludzkiej skóry

Ten film opisuje izolację keratynocytów - najważniejszych komórek warstwy naskórka ludzkiej skóry, poprzez zastosowanie kombinacji trawienia enzymatycznego i metod mechanicznego zakłócania. Ta metoda pomaga w preferencyjnym wzroście keratynocytów w porównaniu z innymi typami komórek skóry przy użyciu selektywnej pożywki wzrostowej.

Izolacja keratynocytów ludzkiej skóry: metoda hodowli pierwotnych keratynocytów z próbek skóry

Ten film opisuje szczegółowy protokół produkcji genetycznie modyfikowanych pierwotnych rekombinowanych retrowirusów ludzkich keratynocytów. Metoda ta może być stosowana do manipulowania ekspresją genów w keratynocytach.

Modyfikacja genetyczna pierwotnych ludzkich keratynocytów: metoda genetycznej manipulacji keratynocytami przy użyciu rekombinowanych retrowirusów

Ten protokół wideo opisuje technikę hodowli in vitro opartą na kasecie do generowania ludzkiej skóry organotypowej przy użyciu keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej. Naśladują funkcję i fizjologię swoich odpowiedników tkankowych in vivo.

Organotypowa hodowla skóry 3D: kasetowa technika hodowli in vitro do regeneracji ludzkiego naskórka na bezkomórkowej skórze właściwej

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego i szczegółowego protokołu generowania genetycznie zmodyfikowanej ludzkiej organotypowej skóry z keratynocytów naskórka i zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych organotypowych kultur skóry przy użyciu zdewitalizowanej ludzkiej skóry właściwej

Ludzka skóra działa jako pierwsza linia obrony przed środowiskiem zewnętrznym. Przedstawiono metodę izolacji pierwotnych keratynocytów ludzkich od skóry osoby dorosłej. Te izolowane keratynocyty są przydatne w wielu konfiguracjach eksperymentalnych i są bardzo odpowiednim modelem do badania mechanizmów molekularnych w biologii skóry in vitro.

Wytwarzanie i hodowla pierwotnych ludzkich keratynocytów ze skóry dorosłej

Tutaj prezentujemy protokół generowania 3D organotypowego modelu skóry czerniaka sferoidalnego, który podsumowuje zarówno architekturę, jak i złożoność wielokomórkową narządu/guza in vivo, ale jednocześnie uwzględnia systematyczną interwencję eksperymentalną.

Organotypowy model sferoidalny czerniaka 3D

Tutaj prezentujemy protokół skutecznego izolowania pierwotnych ludzkich keratynocytów z tkanek skóry dorosłych. Metoda ta upraszcza konwencjonalną procedurę poprzez zastosowanie inhibitora ROCK Y-27632 w pożywce do inokulacji w celu spontanicznego oddzielenia komórek naskórka od komórek skóry właściwej.

Uproszczona i skuteczna metoda izolacji pierwotnych ludzkich keratynocytów z dorosłej tkanki skórnej

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Tutaj opisujemy protokół systematycznej hodowli sferoidów naskórka w hodowli zawiesinowej 3D. Protokół ten ma szerokie zastosowanie do stosowania w różnych typach tkanek nabłonkowych oraz do modelowania kilku chorób i stanów u ludzi.

Opracowanie wysokoprzepustowego systemu hodowli sferoidów naskórka do modelowania plastyczności komórek macierzystych keratynocytów

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Naucz się generować organtypowe kultury tratwy z pierwotnych ludzkich keratynocytów. Ta metoda pozwala badać różnicowanie nabłonkowe i interakcje wirus-gospodarz w warunkach przypominających in vivo.

Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Przeglądaj więcej filmów