Tworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych ludzkich keratynocytów

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie organotypowych kultur raftowych z pierwotnych keratynocytów lub ustalonych linii komórek nabłonkowych. Osiąga się to poprzez najpierw przygotowanie kolagenowych czopów z fibroblastów, a następnie naniesienie warstwy komórek nabłonkowych na wierzch czopów.

Następnie zatyczki przenosi się na siatki platformowe i utrzymuje na granicy fazy powietrze-ciecz przez 10 do 14 dni. W ostatnim kroku przeprowadza się zbiór platform. Ostatecznie zmiany w różnicowaniu nabłonka można ocenić za pomocą analizy histologicznej lub immunohistochemicznej, co pozwala na uzyskanie informacji na temat różnicowania nabłonka.

Można ją również zastosować w innych układach, takich jak wirusy, które w ramach swojego cyklu życiowego infekują nabłonek skóry lub błon śluzowych. Procedurę zademonstruje Dan Anneker, doktorant w moim laboratorium. Najpierw wlej kwas chromowo-siarkowy do zlewki szklanej i zanurz metalowe siatki typu raft w kwasie na jedną godzinę.

Następnie płucz siatki w wodzie z kranu przez całą noc. Po nocnym płukaniu płucz siatki przez kolejne trzy do pięciu godzin w wodzie podwójnie destylowanej, a następnie pozostaw siatki na tratwie do wyschnięcia. Następnie zgnij trzy boki tratwy, około 0,5 centymetra w równych odstępach od siebie, i poddaj siatki na tratwie autoklawowaniu.

Po przygotowaniu żelu kolagenowego, fibroblasty traktuje się trypsyną, a następnie neutralizuje trypsynę za pomocą medium. Fibroblasty przenosi się do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i zlicza komórki, aby określić liczbę możliwe do przygotowania tratw (rafts). Następnie, po odwirowaniu komórek przez cztery minuty przy 244 ×g w temperaturze pokojowej, odsysa się medium z osadu fibroblastów i resuspenduje komórki w odpowiedniej ilości buforu rekonstrukcyjnego DMEM oraz kolagenu, zgodnie z obliczoną liczbą tratw.

Kolagen dodaje się na samym końcu, aby zapobiec zbyt szybkiemu krzepnięciu żelu. Po dodaniu kolagenu należy szybko, lecz delikatnie wymieszać roztwór, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza w żelu. Jeśli mieszanina żelowa ma zbyt żółty kolor, należy dodać kilka kropli sterylizowanego filtrem roztworu.

Dodaj jedną jednostkę wodorotlenku sodu. Mieszaj delikatnie, aż żel przybierze czerwonopomarańczowy kolor, co wskazuje na prawidłowe pH. Następnie powoli pipetuj trzy mililitry mieszaniny kolagenu i fibroblastów po ściance każdej studzienki sześciostudzienkowej płytki hodowlanej, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza, a następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w temperaturze 37 °C, aby żel mógł stwardnieć.

Gdy żel stężeje, dodać 3 mL pożywki E z EGF na powierzchnię zestalonego żelu kolagenowego i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Po wyhodowaniu keratynocytów o niskim numerze pasażu do około 70% konfluencji, keratynocyty poddać trypsynizacji, a następnie zneutralizować trypsynę pożywką E z EGF. Następnie policzyć komórki, aby określić liczbę raftów, które można przygotować.

Po odwirowaniu komórek zawiesić osad w jednym mililitrze eed z EGF dla każdej obliczonej kultury raftu. Następnie usunąć medium z żeli kolagenowych, przechylając płytkę 6-dołkową na bok, a następnie dodać dwa mililitry świeżego eed z EGF do każdego żelu. W kolejnym kroku ostrożnie dodać jeden mililitr zawiesiny keratynocytów do dwóch mililitrów eed znajdujących się już w każdym z dołków.

Ostrożnie pipetuj keratynocyty wraz z dwoma mililitrami pożywki i nanieś je kroplami na czop kolagenowy. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C na dwa do czterech dni, aby komórki osiągnęły pełną konfluencję. Komórki są gotowe, gdy pożywka zmieni kolor na żółty jeden dzień po jej wymianie; najpóźniej w czwartym dniu, za pomocą sterylnej pęsety, umieść sterylną metalową kratkę (raft) wygiętymi bokami w dół w naczyniu o średnicy 10 cm.

Odsaj proporcję medium z jednego żelu kolagenowego, a następnie przesuwaj sterylną szpatułkę wokół obwodu żelu ruchem góra-dół, aby oddzielić go od ścianek dołka. Przeniesienie kolagenowego krążka z płytki 6-dołkowej na siatkę jest najtrudniejszym etapem tej procedury. Należy uważać, aby delikatnie wsunąć szpatułkę pod krążek, nie rozrywając go, a następnie położyć go płasko na siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między krążkiem a siatką.

Następnie można użyć szpatułki, aby wygładzić wszelkie fragmenty, które zwinęły się podczas tej procedury. Aby wyjąć żel, należy lekko przechylić płytkę, wsunąć szpatułkę pod żel i go podnieść. Połóż żel kolagenowy na metalowej siatce, nie dopuszczając do powstania pęcherzyków powietrza między siatką a żelem.

Aby stworzyć interfejs powietrze-ciecz, powoli dodaj EED bez EGF na dno naczynia w taki sposób, aby siatka rusztowania stykała się z medium, ale żel kolagenowy nie był w niego zanurzony. Następnie inkubuj rusztowania w temperaturze 37°C. Utrzymując interfejs powietrze-ciecz, zbierz rusztowania po 14 dniach. Jak widać na tej figurze, rusztowania wykonane z primary human keratinocytes unieśmiertelnionych HPV 31 (HFK 31) są wyraźnie grubsze w porównaniu do rusztowań wykonanych z normalnych ludzkich keratynocytów skóry (HK).

Zatem białka HPV wykazują zdolność do utrzymywania aktywności różnicujących się komórek w cyklu komórkowym. W tym przypadku przeprowadzono analizę immunohistochemiczną przekrojów organotypowych kultur raft generowanych z linii HK 30 oraz prawidłowych HKS, wykorzystując przeciwciało przeciwko cytokeratynie 10 lub K 10, zaznaczonej na zielono. K 10 nie była ekspresowana w warstwie podstawnej, wskazanej tutaj strzałkami, lecz występowała wyłącznie w warstwach ponadpodstawnych, które składają się z postępująco różnicujących się komórek.

Na tym rysunku przedstawiono oczekiwaną ekspresję białka HPV E1, E4 – białka późnego, które ogranicza się do najwyższych warstw nabłonka i jest tutaj zaznaczone kolorem zielonym. W kulturach typu raft z prawidłowych hks nie obserwuje się żadnego barwienia, podobnie jak na poprzednim rysunku.

Strzałki ponownie wskazują warstwę podstawną nabłonka po jego rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii nowotworów do badania patogenezy wirusów brodawczaka ludzkiego przy użyciu systemu, który naśladuje różnicowanie nabłonka in vivo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tworzenia organotypowych kultur raft z pierwotnych keratynocytów lub ustalonych linii komórek nabłonkowych.