Name: Sekcja i hodowla mysich eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia w trójwymiarowych testach matrycy kolagenowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-23T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Naucz się hodowli eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia myszy w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju szlaków nerwowych i odpowiedzi aksonalnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Test macierzy kolagenowej został opracowany i udoskonalony dzięki pracy wielu różnych grup badawczych w ciągu ostatnich dwóch do trzech dekad. Opisane tutaj podejścia dla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych w znacznym stopniu korzystają z tych badań. Ponadto autorzy pragną podziękować Asheecie Prasad za pomoc w przygotowaniu kultur eksplantów prążkowia. Prace w laboratorium były finansowane przez Human Frontier Science Program Organization (Career Development Award), Holenderską Organizację Badań i Rozwoju w Dziedzinie Zdrowia (ZonMW-VIDI i ZonMW-TOP), Unię Europejską (mdDA-NeuroDev, FP7/2007-2011, Grant 222999) (dla RJP) oraz Holenderską Organizację Badań Naukowych (TopTalent; dla ERES).

1. Przygotowanie kolagenu z ogona szczura
<ol>
 <li>Zebrać ogony od 6–10 dorosłych szczurów (ogony można przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia).</li>
 <li>Namoczyć ogony w 95% etanolu przez noc w temperaturze pokojowej (RT).</li>
</ol>
Disekcja ogonów szczura (w komorze z laminarnym przepływem powietrza): 
(narzędzia nieużywane należy przechowywać w 70% etanolu; należy upewnić się, że wszystkie roztwory, narzędzia i szkło laboratoryjne używane podczas tej procedury są sterylne) 
<ol start="3">
 <li>Aby pobrać ścięgna z ogonów, odetnij końcówkę ogona. Przytrzymaj szerszy koniec ogona pęsetą. Użyj drugiej pęsety, aby uchwycić, zgiąć i złamać ogon w pobliżu pierwszej pęsety. Rozdziel tkanki, a ścięgna pozostaną wewnątrz (Rycina 1A,B).</li>
 <li>Zbierz ścięgna do sterylnej H2O, a po zebraniu wszystkich ścięgien przenieś je do nowej płytki Petriego ze sterylną H2O.</li>
 <li>Pobierz 2-3 ścięgna i rozdrobnij je za pomocą dwóch pęset w nowej płytce Petriego ze sterylną H2O. Usuń tkanki inne niż ścięgna, np. żyły (tkanka ścięgnista jest błyszcząca i refleksyjna; Rycina 1C). Po usunięciu wszystkich tkanek innych niż ścięgna, z każdego ogona uzyskuje się około 100-150 mg ścięgien.</li>
 <li>Przenieś ścięgna do 300 ml sterylnego 3% kwasu octowego i mieszaj powoli przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Dodaj kolejne 200 ml sterylnego 3% kwasu octowego i mieszaj powoli przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Wirowarkuj roztwór kwasu octowego zawierający ścięgna przy ~2700 xg przez 120 min w temperaturze 4 °C, aby uzyskać osad z nierozpuszczonych ścięgien i tkanek innych niż ścięgna.</li>
 <li>W czasie wirowania przygotuj rurki do dializy:
 <ul>
 <li>odetnij kawałki o długości 40 cm</li>
 <li>gotuj w 500 μM EDTA przez 5 min</li>
 <li>schłodź w sterylnej H2O</li>
 </ul>
 </li>
 <li>Zwiąż węzeł na jednym końcu rurki do dializy i wypełnij rurkę nadpłynem z wirowanego roztworu ścięgien, wykonując czynność na lodzie w dygestorium do hodowli tkankowych za pomocą pipety automatycznej i pipety 25 ml. Unikaj powstawania pęcherzyków powietrza. Zwiąż drugi koniec rurki i przechowuj rurki na sterylnej folii aluminiowej na lodzie, aż wszystkie kawałki rurek zostaną wypełnione (Rycina 1D).</li>
 <li>Przygotuj 10 l sterylnego 0,1X MEM, pH 4,0, w dygestorium do hodowli tkankowych. Dodaj pływak do rurek i umieść je w schłodzonym roztworze 0,1X MEM w zlewce o pojemności 10 l. Dializuj przez noc w temperaturze 4 °C przy powolnym mieszaniu. Dializa ta usuwa nadmiar kwasu, utrzymując niskie pH.</li>
 <li>Wymień roztwór na nowy, schłodzony 10 l 0,1X MEM i mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Powtórz poprzedni krok, wymieniając roztwór na nowy, schłodzony 10 l 0,1X MEM i mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Rozlej roztwór kolagenu do sterylnych probówek 50 ml. Przechowuj alikwoty w temperaturze 4 °C. Przechowywać od 6 do 12 miesięcy; zapas kolagenu należy manipulować wyłącznie w dygestorium do hodowli tkankowych.</li>
 <li>Ważne jest sprawdzenie, czy oczyszczony kolagen wymaga rozcieńczenia (w 0,1x MEM), aby uzyskać optymalne wyniki w teście macierzy kolagenowej. W związku z tym przygotuj serię rozcieńczeń kolagenu (kolagen nierozcieńczony, 1:1, 1:2 i 1:5) i przeprowadź testy macierzy kolagenowej zgodnie z poniższym opisem, aby określić optymalne rozcieńczenie kolagenu.</li>
</ol>
2. Disekcja dopaminergicznego śródmózgowia7,8
<ol>
 <li>Wypreparować zarodki myszy w stadium E14.5 z macicy matki i przechowywać w pożywce L15 w lodzie do momentu użycia.</li>
</ol>
Wszystkie kolejne etapy sekcji przeprowadza się w medium L15 na lodzie.
<ol start="2">
 <li>Wypreparować mózg.</li>
 <li>Usunąć telencefalon, przecinając tkankę wzdłuż przyśrodkowej części każdego pęcherzyka telencefalicznego (pęcherzyki telencefaliczne można wykorzystać do przygotowania eksplantów prążkowia).</li>
 <li>Usunąć osłonę oponową.</li>
 <li>Wykonać cięcie grzbietowo-brzuszne tuż rostralnie od zgięcia śródmózgowia.</li>
 <li>Wykonać kolejne cięcie grzbietowo-brzuszne tuż caudalnie od zgięcia śródmózgowia.</li>
 <li>Za pomocą noża do mikrodysekcji wykonać cięcie rostro-caudalne wzdłuż linii pośrodkowej grzbietu, aby odsłonić leżącą poniżej brzuszną tkankę śródmózgowia. Należy uważać, aby nie uszkodzić brzusznej części śródmózgowia, ponieważ znajdują się w niej neurony dopaminergiczne (Rycina 2).</li>
 <li>Wykonać dwa cięcia rostro-caudalne, bocznie i równolegle do linii pośrodkowej brzusznej, aby usunąć grzbietową tkankę śródmózgowia.</li>
 <li>Za pomocą noża do mikrodysekcji podzielić pozostałą brzuszną tkankę śródmózgowia na eksplanty.</li>
 <li>Przechowywać eksplanty w medium L15 z dodatkiem 5% FBS w lodzie do momentu użycia.</li>
</ol>
3. Disekcja prążkowia
Wszystkie etapy sekcji przeprowadza się w medium L15 na lodzie.
<ol>
 <li>Użyć pęcherzyków końcowych wypreparowanych podczas sekcji śródmózgowia.</li>
 <li>Usunąć wzgórze, przecinając tkankę między wzgórzem a prążkowiem za pomocą pęsety.</li>
 <li>Wykonać cięcie mediolateralne rostralnie względem prążkowia, aby usunąć struktury rostralne, takie jak cebulka węchowa. Powtórzyć ten krok dla tkanki znajdującej się kaudalnie względem prążkowia.</li>
 <li>Ułożyć pozostały plaster tak, aby uzyskać widok koronarny prążkowia (Rycina 2).</li>
 <li>Prążkowie można rozpoznać jako nieco mniej gęstą (bardziej przezroczystą) część tkanki. Wypreparować prążkowie i pociąć na eksplantaty za pomocą noża do mikrodysekcji. Należy unikać nieco ciemniejszej tkanki blisko linii środkowej, która zawiera migrujące neurony bocznego i przyśrodkowego wybrzuszenia zwojowego.</li>
 <li>Przechowywać eksplantaty w medium L15 zawierającym 5% FBS na lodzie do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Testy montażu matrycy kolagenowej
Przygotowanie kolagenu (wszystkie etapy w lodzie, należy używać schłodzonych końcówek do pipet)
<ol>
 <li>Wymieszać 860 μl rozcieńczonego kolagenu ze 100 μl 10x MEM oraz 40 μl 1M wodorowęglanu sodu (NaHCO3) i przechowywać w lodzie. Jeśli na tym etapie kolagen się ogrzeje, ulegnie on zestaleniu.</li>
 <li>Nanieść kroplę 20 μl (o średnicy około 5 mm) przygotowanego kolagenu na szkiełko podstawowe w dołku 4-dołkowej płytki Nunc i pozostawić w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C i przy 5%CO2 na 30 min (wystarczające jest otoczenie o naturalnym stężeniu O2). Podczas tej inkubacji kolagen przejdzie w stan żelu.</li>
</ol>
Przygotowanie kokultury w żelu kolagenowym
<ol start="3">
 <li>Po żelatynizacji kolagenu, za pomocą pipety z końcówką 200 μl przenieść eksplant dopaminergiczny lub prążkowiowy do kolagenu.</li>
 <li>Przybliżyć eksplanty do siebie za pomocą igły. Zachować między nimi odstęp odpowiadający w przybliżeniu średnicy jednego eksplantu (~200-300 μm) (Rysunek 2).</li>
 <li>Usunąć nadmiar medium i dodać 20 μl przygotowanego kolagenu na wierzch eksplantów. Często powoduje to przemieszczanie się eksplantów. Ponownie ustawić eksplanty za pomocą igły, zgodnie z opisem w punkcie 4.4.</li>
 <li>Pozostawić kolagen do stężenia przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie przez 30 min w 37 °C i 5% CO2.</li>
 <li>Po zastygnięciu kolagenu dodać 400 μl medium do eksplantów i inkubować przez 2-3 dni w inkubatorze CO2 w 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
5. Analiza metodą immunohistochemii i kwantyfikacja
Immunohistochemia
<ol>
 <li>Aby utrwalić eksplanty, należy delikatnie dodać 400 μl 8% paraformaldehydu (PFA) w PBS do 400 μl pożywki (rozcieńczając tym samym PFA do 4%) i pozostawić na 1 godzinę w RT.</li>
 <li>Przemyć 3x przez 15 min w PBS w RT.</li>
 <li>Inkubować w buforze blokującym (BB; PBS + 1% FBS + 0,1% Triton X-100) przez 2 godziny.</li>
 <li>Inkubować przez noc z przeciwciałem pierwotnym w BB w 4 °C. W przypadku aksonów dopaminergicznych należy użyć przeciwciał anty-tyrozynohydroksylaza (1:1000)7, dla aksonów prążkowiowych przeciwciał anty-DARPP32 (1:500)9, a w celu wizualizacji wszystkich aksonów anty-βIII tubuliny (1:3000)7.</li>
 <li>Przemyć 5x przez 1 godzinę w PBS w RT.</li>
 <li>Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z odpowiednim fluorophorem (1:500) w BB przez noc w 4 °C. Od tego etapu należy minimalizować ekspozycję eksplantów na światło (np. przykryć je folią aluminiową).</li>
 <li>Przemywać przez noc w PBS w 4 °C, a następnie kilkakrotnie przemyć w ciągu następnego dnia.</li>
 <li>Zamontować eksplanty na szkiełkach przedmiotowych, używając medium montażowego Prolong Antifade. Nanieść kroplę o objętości ~10 μl na szklane szkiełko przedmiotowe. Wziąć szkiełko nakrywkowe i delikatnie położyć je na kropli medium montażowego stroną z eksplantem skierowaną w dół. Aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod nakrywką, należy bardzo powoli opuszczać ją na kroplę medium montażowego.</li>
</ol>
Ilościowe oznaczenie poprzez obliczenie stosunku P/D
<ol start="9">
 <li>Należy wykonać cyfrowe zdjęcia eksplantów przy użyciu mikroskopu epifluorescencyjnego (Rysunek 3).</li>
 <li>Na podstawie tych zdjęć należy podzielić każdy eksplant na ćwiartki, aby wyznaczyć ćwiartkę proksymalną (tzn. część eksplantu najbliższą eksplantowi sąsiedniemu) oraz ćwiartkę dystalną (część eksplantu najdalej oddaloną od eksplantu sąsiedniego) (Rysunek 2, 4).</li>
 <li>Należy zmierzyć długość 20 najdłuższych neurytów wyrastających z eksplantu zarówno w ćwiartce proksymalnej, jak i dystalnej.</li>
 <li>Średnią długość 20 najdłuższych neurytów należy wykorzystać do obliczenia stosunku P/D dla każdego pojedynczego eksplantu. Stosunek P/D &gt; 1 wskazuje na przyciąganie aksonów, natomiast stosunek &lt; 1 wskazuje na odpychanie aksonów.</li>
 <li>W niektórych przypadkach gęsty wzrost neurytów uniemożliwia ocenę długości pojedynczych neurytów. W takich sytuacjach kwantyfikację można przeprowadzić poprzez pomiar odległości między krawędzią eksplantu a czołem wzrostu aksonów w ćwiartkach proksymalnej i dystalnej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne obrazy
Po udanej hodowli eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych, przy użyciu mikroskopii w polu jasnym lub poprzez wizualizację immunocytochemiczną przeciwko βIII tubulinie (nie pokazano), widoczna jest duża liczba aksonów. Podzbiór tych aksonów będzie stanowił aksony dopaminergiczne lub prążkowiowe, co można zwizualizować za pomocą immunocytochemii (Rycina 3). Poprzez podzielenie eksplantów na kwadranty zgodnie z opisem i wyznaczenie stosunków P/D, można ilościowo określić domniemany efekt przyciągania lub odpychania aksonów (Rycina 3E).
<img alt="Proces preparowania ścięgien, schemat żyły i ścięgna w szalce Petriego, zestaw laboratoryjny do badania biologicznego." src="/files/ftp_upload/3691/3691fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Zdjęcia ilustrujące przygotowanie kolagenu ze ścięgien ogona szczura. A) Rozciągnięcie ogona szczura odsłania ścięgna. B) Ścięgna są widoczne jako sznurowate pęczki. C) Ścięgna łatwo odróżnić od żył po ich błyszczącym, białym wyglądzie. D) Po rozpuszczeniu ścięgien w kwasie octowym roztwór przenosi się do membrany dializacyjnej. Aby utrzymać niską temperaturę rozpuszczonego kolagenu, probówki umieszcza się na sterylnej folii aluminiowej na lodzie.


<img alt="Proces od sekcji do kwantyfikacji; schemat eksplantów, macierzy kolagenowej i etapów wypustek aksonalnych." src="/files/ftp_upload/3691/3691fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat przedstawiający poszczególne etapy procedury. Odpowiednie obszary mózgu są wycinane i dzielone w celu przygotowania eksplantów. Pojedynczy eksplant śródmózgowia oraz eksplant prążkowia są umieszczane w bliskim sąsiedztwie w macierzy kolagenowej i inkubowane przez 48-72 godziny w 37 °C. Aksony są wizualizowane za pomocą fluorescencyjnej immunohistochemii, a następnie oblicza się stosunek P/D w celu kwantyfikacji odpowiedzi chemotropowych.
<img alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiające formowanie się sieci neuronalnej, z widocznym wzrostem aksonów w kolorze zielonym i czerwonym." src="/files/ftp_upload/3691/3691fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki ukazujące wzrost aksonów w kulturze w macierzy kolagenowej. A) Eksplant śródmózgowia barwiony przeciwciałem przeciwko tyrozynowej hydroksylazie, wykazujący wypustki aksonalne. Linia przerywana oznacza sąsiedni eksplant. B) Powiększenie obrazu A, przedstawiające poszczególne neuryty i stożki wzrostu (strzałki). C) Eksplant prążkowia barwiony przeciwciałem przeciwko DARPP32. D) Powiększenie obrazu C, przedstawiające poszczególne neuryty. E) Przykład kwantyfikacji stosunku P/D. Eksplanty są podzielone na równe kwadranty. Kwadrant proksymalny jest zwrócony w stronę sąsiedniego eksplantu, natomiast kwadrant dystalny jest od niego oddalony. Paski skali oznaczają 100 μm.

<ol><li>van den Heuvel, D. M., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+connected+in+the+dopamine+system%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Getting connected in the dopamine system.</a> Prog. Neurobiol. 85, 75-93 (2008).</li>
<li>Lobo, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+profiling+of+striatonigral+and+striatopallidal+medium+spiny+neurons+past%2C+present%2C+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Molecular profiling of striatonigral and striatopallidal medium spiny neurons past, present, and future.</a> Int. Rev. Neurobiol. 89, 1-35 (2009).</li>
<li>Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of axon guidance.</a> Science. 298, 1959-1964 (2002).</li>
<li>Chilton, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecules+mechanisms+of+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecules mechanisms of axon guidance.</a> Dev. Biol. 292, 13-24 (2006).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Tessier-Lavigne, M., Placzek, M., Lumsden, A. G., Dodd, J., Jessel, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+guidance+of+developing+axons+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic guidance of developing axons in the mammalian central nervous system.</a> Nature. 336, 775-778 (1988).</li>
<li>Kolk, S. M., Gunput, R. A., Tran, T. S., van den Heuvel, D. M., Prasad, A. A., Hellemons, A. J., Adolfs, Y., Ginty, D. D., Kolodkin, A. L., Burbach, J. P., Smidt, M. P., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3F+is+a+bifunctional+guidance+cue+for+dopaminergic+axons+and+controls+their+fasciculation%2C+channeling%2C+rostral+growth%2C+and+intracortical+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3F is a bifunctional guidance cue for dopaminergic axons and controls their fasciculation, channeling, rostral growth, and intracortical targeting.</a> J. Neurosci. 29, 12542-12557 (2009).</li>
<li>Fenstermaker, A. G., Prasad, A. A., Bechara, A., Adolfs, Y., Tissir, F., Goffinet, A., Zou, Y., Pasterkamp, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fplanar+cell+polarity+signaling+controls+the+anterior-posterior+organization+of+monoaminergic+axons+in+the+brainstem%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wnt/planar cell polarity signaling controls the anterior-posterior organization of monoaminergic axons in the brainstem.</a> J. Neurosci. 30, 16053-16064 (2010).</li>
<li>Arlotta, P., Molyneaux, B. J., Jabaudon, D., Yoshida, Y., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ctip2+controls+the+differentiation+of+medium+spiny+neurons+and+the+establishment+of+the+cellular+architecture+of+the+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ctip2 controls the differentiation of medium spiny neurons and the establishment of the cellular architecture of the striatum.</a> J. Neurosci. 28, 622-632 (2008).</li>
<li>De Wit, J., Toonen, R. F., Verhage, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+local+retention+of+secretory+vesicle+cargo+in+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent local retention of secretory vesicle cargo in cortical neurons.</a> J. Neurosci. 29, 23-37 (2009).</li>
<li>Gähwiler, B. H., Capogna, M., Debanne, D., McKinney, R. A., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+slice+cultures%3A+a+technique+has+come+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organotypic slice cultures: a technique has come of age.</a> Trends Neurosci. 20, 471-477 (1997).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisany tutaj test z macierzą kolagenową był stosowany i udoskonalany przez wiele różnych laboratoriów w ciągu ostatnich dziesięcioleci w celu zbadania różnorodnych cząsteczek kierujących wzrostem aksonów oraz układów neuronalnych (np. patrz odniesienia 5-8). Badania te wykazały, że test ten jest potężnym narzędziem do badania efektów i regulacji cząsteczek kierujących wzrostem aksonów wydzielanych przez różne (pośrednie) tkanki docelowe.
Należy jednak zauważyć, że macierz kolagenowa stanowi ...

<table><tbody><tr><td>Płodowa surowica cielęca</td><td>BioWhittaker</td><td>14-801F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina (200mM)</td><td>PAA Laboratories</td><td>M11-004</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>VWR international</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Essential Media (MEM)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>61100-087</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka L-15 Leibovitz&amp;rsquo;a</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11415-049</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik antyblaknący Prolong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Membrana do dializy</td><td>Spectrum Labs</td><td>132660</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-tyrozynowa hydroksylaza</td><td>Pel-Freez Biologicals</td><td>P40101-0</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało anty-Darpp32 (H-62)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-11365</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-&amp;#946;III tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8660</td><td></td></tr><tr><td>Wtórne przeciwciała znakowane Alexa Fluor</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Neurony dopaminergiczne śródmózgowia (mdDA) rzutują za pośrednictwem przyśrodkowego pęczka przedmózgowia do kilku obszarów w telencefalonie, w tym do prążkowia1. W sposób odwrotny, neurony kolczyste w prążkowiu, które tworzą drogę prążkowio-czarną (bezpośrednią), unerwiają istotę czarną2. Rozwój tych traktów aksonalnych zależy od kombinacyjnego działania wielu sygnałów wzrostu i prowadzenia aksonów, w tym cząsteczek uwalnianych przez neuryty lub przez (pośrednie) regiony docelowe3,4. Czynniki rozpuszczalne te można badać in vitro, hodując eksplantaty mdDA i/lub prążkowia w matrycy kolagenowej, która zapewnia trójwymiarowe podłoże dla aksonów, naśladując środowisko zewnątrzkomórkowe. Ponadto matryca kolagenowa umożliwia tworzenie stosunkowo stabilnych gradientów białek uwalnianych przez inne eksplantaty lub komórki umieszczone w pobliżu (np. patrz odnośniki 5 i 6). W niniejszym opracowaniu opisujemy metody oczyszczania kolagenu z ogona szczura, mikrodysekcji eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia, ich hodowli w żelach kolagenowych oraz późniejszej analizy immunohistochemicznej i ilościowej. Najpierw izolowane są mózgi embrionów mysich w stadium E14.5, a następnie przeprowadzana jest mikrodysekcja eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia. Eksplantaty te są następnie (współ)hodowane w żelach kolagenowych na szkiełkach podstawowych przez 48 do 72 godzin in vitro. Następnie projekcje aksonalne są wizualizowane przy użyciu markerów neuronalnych (np. tyrozynowej hydroksylazy, DARPP32 lub βIII tubuliny), a wzrost aksonów oraz reakcje przyciągania lub odpychania aksonów są ilościowo określane. Ta preparatyka neuronalna stanowi przydatne narzędzie do badań in vitro nad komórkowymi i molekularnymi mechanizmami wzrostu i prowadzenia aksonów mezoprążkowiowych i prążkowio-czarnych podczas rozwoju. Z wykorzystaniem tego testu możliwe jest również ocenienie innych (pośrednich) celów dla aksonów dopaminergicznych i prążkowia lub testowanie specyficznych sygnałów molekularnych.

Eksplanty z układu dopaminergicznego śródmózgowia oraz prążkowia są wykorzystywane w teście z matrycą kolagenową do analizy in vitro rozwoju szlaków mezostriatalnych i striatonigralnych. W tym teście wzrost i prowadzenie aksonów mogą być manipulowane oraz kwantyfikowane. Metodę tę można również zmodyfikować w celu oceny innych obszarów lub sygnałów molekularnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Neurony dopaminergiczne śródmózgowia (mdDA) rzutują poprzez przyśrodkowy pęczek przedmózgowia do kilku obszarów w telencefalonie, w tym do prążkowia1. ...

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla dopaminergicznych i prążkowiowych eksplantów AAL w celu zbadania rozwoju szlaków Mezo Sal i Sal Nigro. Osiąga się to poprzez mikrodysekcję prążkowia oraz dopaminergicznego śródmózgowia z embrionów myszy w stadium E 14.5. Drugim krokiem jest wycięcie odpowiednio wielkich eksplantów z wysektoryzowanej tkanki.Następnie eksplanty są umieszczane w żelu kolagenowym w bliskiej odległości od siebie. Ostatnim krokiem jest hodowla eksplantów przez okres od dwóch do trzech dni, aby umożliwić wzrost aksonów. W końcowym etapie wykorzystuje się immunohistochemię w celu wykazania i ilościowego określenia atrakcyjnych lub repulsywnych reakcji aksonów w odniesieniu do konkretnych markerów neuronalnych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowle rozproszone lub dwie kultury eksplantów DX, jest fakt, że macierz kolagenowa zapewnia trójwymiarowy podkład dla eksonów, naśladując środowisko pozakomórkowe. Ponadto macierz kolagenowa umożliwia tworzenie stosunkowo stabilnych gradientów białek uwalnianych przez eksplanty X lub komórki umieszczone w pobliżu. Procedurę zaprezentują Ava Smith i Francesca, dwie studentki studiów magisterskich z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj zarodki myszy w stadium E 14.5 z macicy matki. Przechowuj je w pożywce L 15 na lodzie do momentu użycia. Następnie przenieś zarodek pod mikroskop i wyizoluj mózg z zarodka.Następnie usuń głowę, przecinając przyśrodkową część każdego pęcherzyka głowowego. Po tym usuń pochewkę oponową. Wykonaj cięcie grzbietowo-brzuszne tuż rostralnie od przyśrodkowego zgięcia głowowego.Następnie wykonaj kolejne cięcie grzbietowo-brzuszne tuż za zgięciem głowowym. Następnie wykonaj cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej grzbietu za pomocą noża do mikrosekcji, aby odsłonić leżącą poniżej tkankę brzusznej części śródmózwia. Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki brzusznej części śródmózwia, ponieważ znajdują się w niej neurony dopaminergiczne.Następnie wykonaj dwa cięcia wzdłużne i równoległe do linii środkowej brzusznej, aby usunąć tkankę grzbietową śródmózgowia. Dalej, za pomocą noża do mikrodyssekcji, podziel pozostałą tkankę brzuszna śródmózgowia na X eksplantów. Eksplanty X przechowuj na lodzie w medium L 15 z dodatkiem 5% FBS do momentu użycia.Przenieś teraz pęcherzyki głowowe gosika uzyskane wcześniej podczas sekcji śródmózgowia pod mikroskop. Usuń wzgórze, przecinając obszar między wzgórzem a satum za pomocą pęsety. Następnie wykonaj cięcie w płaszczyźnie przyśrodkowej bocznej rostralnie względem prążkowia, aby usunąć struktury rostralne, takie jak opuszka węchowa.Następnie powtórz ten krok dla tkanki znajdującej się przyśrodkowo względem prążkowia. Po tym ustaw pozostały przekrój tak, aby uzyskać widok koronarny prążkowia. Prążkowie można rozpoznać jako nieco bardziej przezroczystą część tkanki.Następnie wyizoluj prążkowie, a potem podziel go na implanty za pomocą noża do mikrodysekcji. Unikaj nieco ciemniejszej tkanki w pobliżu linii środkowej, która zawiera migrujące neurony bocznego i przyśrodkowego wybrzuszenia zwojowego. Dodaj kroplę przygotowanego kolagenu na szkiełko zakrywkowe w dołku czterodołkowej płytki hodowlanej.Przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut. W czasie tej inkubacji kolagen ulegnie żelatynizacji. Po żelatynizacji kolagenu użyj pipety z końcówką 200 µl, aby przenieść eksplanty dopaminergiczne lub sal do kolagenu.Następnie za pomocą igły przysuń do siebie eksplanty. Zachowaj między nimi odstęp wynoszący w przybliżeniu średnicę jednego eksplantu. Następnie usuń nadmiar pożywki.Dodaj 20 µL przygotowanego kolagenu na wierzch eksplantu. Może to spowodować przemieszczenie się eksplantów. Ustaw eksplanty ponownie w odpowiedniej pozycji za pomocą igły.Pozostaw kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przenieś go do inkubatora ustawionego na 37 °C z dopływem 5% CO2 na 30 minut. Po zestaleniu kolagenu dodaj 400 µL pożywki do eksplantów i inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C.Aby delikatnie utrwalić preparat, dodaj 4% paraformaldehyd i pozostaw go w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po godzinie przemyj preparat w PBS w temperaturze pokojowej trzykrotnie, po 15 minut za każdym razem.Następnie, po usunięciu PBS, inkubuj je w buforze blokującym przez dwie godziny. Po tym czasie inkubuj je przez noc z przeciwciałem pierwotnym i buforem blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj je pięciokrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, inkubując za każdym razem przez jedną godzinę. Następnie inkubuj je z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z odpowiednim fluoroforem.Przez noc w buforze blokującym w temperaturze 4 °C. Od tego momentu należy przykryć eksplanty folią aluminiową, aby zminimalizować ich ekspozycję na światło. Następnie płukać je przez noc w PBS w temperaturze 4 °C, a następnego dnia przeprowadzić kilka kolejnych płukań.Następnie zamocuj eksplanty na szkiełku przedmiotowym, używając medium montażowego z odczynnikiem antyblakowym o przedłużonym działaniu, tak aby strona z eksplantem była skierowana w dół. Bardzo delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na medium montażowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod nim. Następnie wykonaj cyfrowe obrazy x eksplantów za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.Na podstawie tych obrazów podziel każdy eksplant X na ćwiartki, aby wyznaczyć ćwiartkę proksymalną oraz ćwiartkę dystalną. Następnie zmierz długość 20 najdłuższych neurytów wyrastających z eksplantu X, zarówno w ćwiartce proksymalnej, jak i dystalnej. Wykorzystaj średnią długość 20 najdłuższych neurytów do obliczenia stosunku proksymalno-dystalnego dla każdego poszczególnego eksplantu.Stosunek proksymalno-dystalny większy od jeden wskazuje na przyciąganie aksonów. Natomiast stosunek mniejszy od jeden wskazuje na odpychanie aksonów. Przedstawiony tutaj przekrój przez śródmózgowie, barwiony przeciwciałami przeciwko tyrozynowej hydroksylazie, ujawnia wypustki aksonalne.Linia przerywana oznacza sąsiednie eksplanty. Strzałki wskazują poszczególne neuryty i stożki wzrostu. Oto przykład kwantyfikacji stosunku proksymalno-dystalnego.Są one podzielone na równe ćwiartki. Ćwiartka proksymalna jest skierowana w stronę sąsiednich eksplantów X, natomiast ćwiartka dystalna jest skierowana w przeciwną stronę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić kokulturę eksplantów dopaminergicznych i warstwowych w celu zbadania rozwoju szlaku misal andal nigro oraz analizy mechanizmów molekularnych zaangażowanych w formowanie tych szlaków.

dissection-culture-mouse-dopaminergic-striatal-explants-three

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przekroj i hodowla eksplantatów dopaminergicznych i zwojowych myszy w trójwymiarowym badaniu macierzy kolagenowej

Niniejszy test ocenia zdolność cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku białka morfogenetycznego kostnego 7 (BMP7), do zmiany kierunku wzrostu aksonów komisuralnych. Eksplant embrionalnego grzbietowego rdzenia kręgowego jest hodowany obok agregatu komórek COS wydzielających badane czynniki wzrostu. Zmiana kierunku wzrostu aksonów komisuralnych w obrębie eksplantu jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii.

Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Ten film przedstawia metodę hodowli neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy. Proces ten obejmuje leczenie śródmózgowia enzymem proteolitycznym, odłączenie komórek i wyhodowanie ich na pokrytych polimerem szkiełkach nakrywkowych w pożywce bogatej w składniki odżywcze z antybiotykami dla ich wzrostu i długoterminowej żywotności.

Hodowla i utrzymanie neuronów dopaminergicznych z embrionalnej tkanki mózgowej myszy

Wideo pokazuje proces izolacji i hodowli neuronów dopaminowych ze śródmózgowia embrionów myszy. Izolowane brzuszne dno śródmózgowia jest dysocjowane za pomocą enzymów. Powstałe neurony dopaminowe są zbierane i przenoszone do mikrowysp wewnątrz płytek wielodołkowych. Komórki są inkubowane z pożywką neuronów dopaminowych, aby utrzymać komórki w dużej gęstości wewnątrz mikrowysp.

Izolacja i hodowla pierwotnych embrionalnych neuronów dopaminowych śródmózgowia myszy

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Neurony dopaminergiczne odgrywają istotną rolę regulacyjną w mózgu. Ich utrata jest związana z chorobą Parkinsona. W tym filmie pokazujemy, jak wygenerować pierwotne kultury centralnych neuronów dopaminergicznych z embrionalnego śródmózgowia myszy. Takie kultury są przydatne do badania ekstremalnej podatności tych neuronów na różne stresy.

Pierwotna hodowla mysich neuronów dopaminergicznych

Wgląd w złożone działania mózgu wymaga zaawansowanych narzędzi badawczych. Tutaj demonstrujemy nowatorski, oparty na jedwabnym kolagenie, zaprojektowany w 3D model tkanki nerwowej przypominający architekturę przypominającą mózg. Model może być wykorzystany do badania budowy sieci neuronalnej, prowadzenia aksonów, interakcji komórka-komórka i aktywności elektrycznej.

Zaprojektowany model 3D spolaryzowanej tkanki nerwowej oparty na jedwabiu

W chorobie Parkinsona (PD) neurony dopaminergiczne istoty czarnej (SNc) ulegają degeneracji, co prowadzi do dysfunkcji motorycznej. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli neuronów brzusznej części śródmózgowia od myszy wyrażającej eGFP napędzany sekwencją promotora hydroksylazy tyrozyny (TH), zbierania pojedynczych neuronów fluorescencyjnych z kultur i pomiaru ich transkryptomu za pomocą sekwencji RNA.

Wiarygodna identyfikacja żywych neuronów dopaminergicznych w hodowlach śródmózgowia przy użyciu sekwencjonowania RNA i ekspresji eGFP sterowanej przez promotor TH

W tym raporcie, zalety kultur organotypowych i dysocjacji kultur pierwotnych zwojów korzenia grzbietowego pochodzących od myszy są podkreślone w celu zbadania szerokiego zakresu mechanizmów związanych z interakcją neuron-glej, neuroplastycznością, zapaleniem nerwów i reakcją na infekcję wirusową.

Dorosłe myszy DRG eksplantowane i zdysocjowane modele komórkowe w celu zbadania neuroplastyczności i reakcji na zniewagi środowiskowe, w tym infekcje wirusowe

Tutaj prezentujemy protokół uzyskiwania systemów hodowli 3D w samoorganizujących się rusztowaniach peptydowych, aby promować różnicowanie odróżnicowanych ludzkich chondrocytów stawowych w tkankę podobną do chrząstki.

Hodowla komórek ssaków w trójwymiarowych rusztowaniach peptydowych

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Naucz się hodowli eksplantatów dopaminergicznych i prążkowia myszy w trójwymiarowej matrycy kolagenowej. Ta metoda umożliwia badanie rozwoju szlaków nerwowych i odpowiedzi aksonalnych.

Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Przeglądaj więcej filmów