Disekcja i hodowla eksplantów dopaminergicznych i prążkowiowych myszy w trójwymiarowych testach w matrycy kolagenowej

Ogólnym celem tej procedury jest hodowla dopaminergicznych i prążkowiowych eksplantów AAL w celu zbadania rozwoju szlaków Mezo Sal i Sal Nigro. Osiąga się to poprzez mikrodysekcję prążkowia oraz dopaminergicznego śródmózgowia z embrionów myszy w stadium E 14.5. Drugim krokiem jest wycięcie odpowiednio wielkich eksplantów z wysektoryzowanej tkanki.

Następnie eksplanty są umieszczane w żelu kolagenowym w bliskiej odległości od siebie. Ostatnim krokiem jest hodowla eksplantów przez okres od dwóch do trzech dni, aby umożliwić wzrost aksonów. W końcowym etapie wykorzystuje się immunohistochemię w celu wykazania i ilościowego określenia atrakcyjnych lub repulsywnych reakcji aksonów w odniesieniu do konkretnych markerów neuronalnych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak hodowle rozproszone lub dwie kultury eksplantów DX, jest fakt, że macierz kolagenowa zapewnia trójwymiarowy podkład dla eksonów, naśladując środowisko pozakomórkowe. Ponadto macierz kolagenowa umożliwia tworzenie stosunkowo stabilnych gradientów białek uwalnianych przez eksplanty X lub komórki umieszczone w pobliżu. Procedurę zaprezentują Ava Smith i Francesca, dwie studentki studiów magisterskich z mojego laboratorium.

Aby rozpocząć tę procedurę, wypreparuj zarodki myszy w stadium E 14.5 z macicy matki. Przechowuj je w pożywce L 15 na lodzie do momentu użycia. Następnie przenieś zarodek pod mikroskop i wyizoluj mózg z zarodka.

Następnie usuń głowę, przecinając przyśrodkową część każdego pęcherzyka głowowego. Po tym usuń pochewkę oponową. Wykonaj cięcie grzbietowo-brzuszne tuż rostralnie od przyśrodkowego zgięcia głowowego.

Następnie wykonaj kolejne cięcie grzbietowo-brzuszne tuż za zgięciem głowowym. Następnie wykonaj cięcie podłużne wzdłuż linii środkowej grzbietu za pomocą noża do mikrosekcji, aby odsłonić leżącą poniżej tkankę brzusznej części śródmózwia. Należy uważać, aby nie uszkodzić tkanki brzusznej części śródmózwia, ponieważ znajdują się w niej neurony dopaminergiczne.

Następnie wykonaj dwa cięcia wzdłużne i równoległe do linii środkowej brzusznej, aby usunąć tkankę grzbietową śródmózgowia. Dalej, za pomocą noża do mikrodyssekcji, podziel pozostałą tkankę brzuszna śródmózgowia na X eksplantów. Eksplanty X przechowuj na lodzie w medium L 15 z dodatkiem 5% FBS do momentu użycia.

Przenieś teraz pęcherzyki głowowe gosika uzyskane wcześniej podczas sekcji śródmózgowia pod mikroskop. Usuń wzgórze, przecinając obszar między wzgórzem a satum za pomocą pęsety. Następnie wykonaj cięcie w płaszczyźnie przyśrodkowej bocznej rostralnie względem prążkowia, aby usunąć struktury rostralne, takie jak opuszka węchowa.

Następnie powtórz ten krok dla tkanki znajdującej się przyśrodkowo względem prążkowia. Po tym ustaw pozostały przekrój tak, aby uzyskać widok koronarny prążkowia. Prążkowie można rozpoznać jako nieco bardziej przezroczystą część tkanki.

Następnie wyizoluj prążkowie, a potem podziel go na implanty za pomocą noża do mikrodysekcji. Unikaj nieco ciemniejszej tkanki w pobliżu linii środkowej, która zawiera migrujące neurony bocznego i przyśrodkowego wybrzuszenia zwojowego. Dodaj kroplę przygotowanego kolagenu na szkiełko zakrywkowe w dołku czterodołkowej płytki hodowlanej.

Przechowuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut. W czasie tej inkubacji kolagen ulegnie żelatynizacji. Po żelatynizacji kolagenu użyj pipety z końcówką 200 µl, aby przenieść eksplanty dopaminergiczne lub sal do kolagenu.

Następnie za pomocą igły przysuń do siebie eksplanty. Zachowaj między nimi odstęp wynoszący w przybliżeniu średnicę jednego eksplantu. Następnie usuń nadmiar pożywki.

Dodaj 20 µL przygotowanego kolagenu na wierzch eksplantu. Może to spowodować przemieszczenie się eksplantów. Ustaw eksplanty ponownie w odpowiedniej pozycji za pomocą igły.

Pozostaw kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Następnie przenieś go do inkubatora ustawionego na 37 °C z dopływem 5% CO2 na 30 minut. Po zestaleniu kolagenu dodaj 400 µL pożywki do eksplantów i inkubuj przez dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C.

Aby delikatnie utrwalić preparat, dodaj 4% paraformaldehyd i pozostaw go w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po godzinie przemyj preparat w PBS w temperaturze pokojowej trzykrotnie, po 15 minut za każdym razem.

Następnie, po usunięciu PBS, inkubuj je w buforze blokującym przez dwie godziny. Po tym czasie inkubuj je przez noc z przeciwciałem pierwotnym i buforem blokującym w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnego dnia przemyj je pięciokrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, inkubując za każdym razem przez jedną godzinę. Następnie inkubuj je z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z odpowiednim fluoroforem.

Przez noc w buforze blokującym w temperaturze 4 °C. Od tego momentu należy przykryć eksplanty folią aluminiową, aby zminimalizować ich ekspozycję na światło. Następnie płukać je przez noc w PBS w temperaturze 4 °C, a następnego dnia przeprowadzić kilka kolejnych płukań.

Następnie zamocuj eksplanty na szkiełku przedmiotowym, używając medium montażowego z odczynnikiem antyblakowym o przedłużonym działaniu, tak aby strona z eksplantem była skierowana w dół. Bardzo delikatnie nałóż szkiełko nakrywkowe na medium montażowe, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza pod nim. Następnie wykonaj cyfrowe obrazy x eksplantów za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Na podstawie tych obrazów podziel każdy eksplant X na ćwiartki, aby wyznaczyć ćwiartkę proksymalną oraz ćwiartkę dystalną. Następnie zmierz długość 20 najdłuższych neurytów wyrastających z eksplantu X, zarówno w ćwiartce proksymalnej, jak i dystalnej. Wykorzystaj średnią długość 20 najdłuższych neurytów do obliczenia stosunku proksymalno-dystalnego dla każdego poszczególnego eksplantu.

Stosunek proksymalno-dystalny większy od jeden wskazuje na przyciąganie aksonów. Natomiast stosunek mniejszy od jeden wskazuje na odpychanie aksonów. Przedstawiony tutaj przekrój przez śródmózgowie, barwiony przeciwciałami przeciwko tyrozynowej hydroksylazie, ujawnia wypustki aksonalne.

Linia przerywana oznacza sąsiednie eksplanty. Strzałki wskazują poszczególne neuryty i stożki wzrostu. Oto przykład kwantyfikacji stosunku proksymalno-dystalnego.

Są one podzielone na równe ćwiartki. Ćwiartka proksymalna jest skierowana w stronę sąsiednich eksplantów X, natomiast ćwiartka dystalna jest skierowana w przeciwną stronę. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić kokulturę eksplantów dopaminergicznych i warstwowych w celu zbadania rozwoju szlaku misal andal nigro oraz analizy mechanizmów molekularnych zaangażowanych w formowanie tych szlaków.