Name: Metody in vitro Transkrypcja i capping mRNA lucyferazy Gaussa, a następnie transfekcja komórek HeLa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Poznaj metodę syntezy mRNA lucyferazy Gaussa z capowaniem in vitro i transfekcję komórek HeLa. Technika ta umożliwia badanie ekspresji białek reporterowych w komórkach ssaków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dongxian Yue, Brett Robb, George Tzertzinis, Tanya Bhatia, Breton Hornblower.

RNazy są powszechnie obecne na skórze, włosach, w kurzu, na powierzchniach laboratoryjnych, w roztworach itp. Przed użyciem należy założyć rękawiczki i dokładnie wyczyścić powierzchnię blatu, pipety itp., aby uniknąć kontaminacji RNazami. Zdecydowanie zaleca się stosowanie wolnych od nukleaz końcówek do pipet, probówek, szkła laboratoryjnego oraz odczynników.
1. Transkrypcja in vitro z użyciem zestawu T7 High-yield RNA Synthesis Kit
Matrycą DNA dla reakcji transkrypcji jest zlinearyzowany plazmid zawierający gen lucyferazy Gaussia oraz promotor T7 powyżej sekwencji kodującej (Rysunek 1B).
<ol>
	<li>Rozmrozić składniki zestawu T7 High Yield RNA Synthesis i przechowywać je w lodzie.</li>
	<li>W przypadku niekapowanego RNA, przygotować reakcję w temperaturze pokojowej w następującej kolejności:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość (μl)</td>
			<td>Końcowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor reakcyjny 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA matrycowe *</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanka polimerazy RNA T7</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita ilość</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Dodaj 1 μg DNA i uzupełnij całkowitą objętość reakcji do 20 μl wodą wolną od nukleaz. Ilość dodawanej wody będzie zależeć od stężenia DNA matrycowego.
<ol start="3">
	<li>W przypadku RNA z czapką: Przygotować reakcję w temperaturze pokojowej w następującej kolejności:</li>
</ol>
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Komponent</td>
			<td>Objętość (μl)</td>
			<td>Końcowy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda wolna od nukleaz*</td>
			<td>X</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor reakcyjny 10X</td>
			<td>2</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UTP (100 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP (20 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3´-0-Me-m7analog czapeczki G(5')ppp(5')G (ARCA) (40mM)</td>
			<td>4</td>
			<td>8 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrycowy DNA*</td>
			<td>X</td>
			<td>1 μg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mieszanina polimerazy RNA T7</td>
			<td>2</td>
			<td> </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suma</td>
			<td>20</td>
			<td> </td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*Dodaj 1 μg DNA i uzupełnij całkowitą objętość reakcji do 20 μl wodą wolną od nukleaz. Ilość dodawanej wody będzie zależeć od stężenia matrycy DNA.
<ol start="4">
	<li>Wymieszać dokładnie za pomocą vortexu i inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez 2 godziny w inkubatorze z suchym powietrzem.</li>
	<li>Stosując kroki 1.3-1.4, zsyntetyzować czapeczkowane transkrypty lucyferazy Cypridina (CLuc) z liniowego plazmidu zawierającego gen CLuc. To mRNA zostanie współtransfekowane z czapeczkowanym i nieczapeczkowanym mRNA GLuc w celu normalizacji ekspresji GLuc.</li>
</ol>
2. Usuwanie matrycowego DNA
Reakcje transkrypcji poddaje się działaniu DNazy I w celu usunięcia matrycy DNA przed przystąpieniem do oczyszczania.
<ol>
	<li>Do reakcji transkrypcji dodać 70 μl wody wolnej od nukleaz, a następnie 10 μl buforu do reakcji DNase I.</li>
	<li>Do reakcji dodać 2 μl DNase I.</li>
	<li>Inkubować przez 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z suchym powietrzem.</li>
</ol>
3. Oczyszczanie RNA z czapeczką i bez czapeczki metodą kolumnową
<ol>
	<li>Oczyść RNA z czapeczką i bez czapeczki, używając zestawu MEGAclearKit zgodnie z instrukcją producenta (można użyć dowolnego zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumnach wirowych).</li>
	<li>Oznacz ilość RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop.</li>
	<li>Zgodnie z instrukcją producenta, oceń jakość próbek RNA, używając zestawu Agilent RNA 6000 Nano Kit oraz analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
4. Nakładanie czapeczki RNA z wykorzystaniem systemu cappingowego Vaccinia
<ol>
	<li>Pobierz 10 μg oczyszczonego, nieukoronowanego mRNA GLuc.</li>
</ol>
Standardowa reakcja nakładania czapeczki pozwala na modyfikację do 10 μg RNA (100nt lub więcej). Jeśli konieczne jest nałożenie czapeczek na większą ilość RNA, skalę reakcji można odpowiednio zwiększyć.
<ol start="2">
	<li>Zwiększyć objętość do 15 μl, używając wody wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Ogrzewać RNA w temperaturze 65 °C przez 10 minut w celu usunięcia struktur drugorzędowych. Odstawić na lód na 5 minut.</li>
	<li>Aby przygotować reakcję cappingu, do 15 μl zdenaturowanego RNA dodać 2 μl 10X Capping Buffer, 1 μl GTP (10 mM), 1 μl świeżo rozcieńczonej S-adenozylometioniny (2 mM) oraz 1 μl (10 jednostek) enzymu cappingowego Vaccinia.</li>
	<li>Dokładnie wymieszać, delikatnie wytrząsając na wortexie, a następnie inkubować reakcję w temperaturze 37 °C przez 30 minut w inkubatorze z suchym powietrzem.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie RNA z czapką za pomocą kolumny
<ol>
	<li>Oczyść RNA z czapeczką, używając zestawu MEGAclear Kit (można użyć dowolnego zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumnach wirówkowych).</li>
	<li>Zgodnie z instrukcjami producenta, oceń jakość próbek RNA, używając zestawu Agilent RNA 6000 Nano Kit oraz analizatora Agilent 2100 Bioanalyzer.</li>
</ol>
6. Transfekcja komórek HeLa przy użyciu zestawu TransIT mRNA Transfection Kit
<ol>
	<li>Wysiać komórki HeLa na płytkę 48-dołkową w 150 μl pożywki Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), High Glucose, uzupełnionej o 10% płatkowej surowicy bydlęcej (0,7-2,3 × 105 komórek/dołek).</li>
	<li>Inkubować przez 16-24 godziny w temperaturze 37 °C, aż komórki osiągną 60-90% konfluencji.</li>
	<li>Rozcieńczyć RNA GLuc (z czapeczką i bez czapeczki) oraz CLuc do stężenia 100 ng/μl.</li>
</ol>
Każda transfekcja jest wykonywana w 8 powtórzeniach.
<ol start="4">
	<li>Przygotuj 8 probówek Eppendorf probówki. Do każdej probówki dodać 1 μl nieukoronowane RNA GLuc, 1 μl zmodyfikowane RNA CLuc z czapeczką (do normalizacji) oraz 25 μl pożywki DMEM bez surowicy. Wymieszać dokładnie.</li>
	<li>Przygotuj 8 probówek Eppendorf. Do każdej probówki dodaj 1 μl capped RNA GLuc (analog kapu), 1 μl capped RNA CLuc (do normalizacji) i 25 μl bezwiertniowego DMEM. Wymieszać dokładnie.</li>
	<li>Przygotuj 8 probówek typu Eppendorf. Do każdej probówki dodaj 1 μl kapowane RNA GLuc (Vaccinia), 1 μl capped RNA CLuc (do normalizacji) i 25 μl bezsurowiczego DMEM. Dobrze wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 0.2 μl dodać odczynnik mRNA Boost do pierwszej grupy 8 probówek i wymieszać.</li>
	<li>Dodaj 0.2 μl TłumaczenieDodaj odczynnik mRNA IT do pierwszej serii 8 probówek i wymieszaj.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2–5 minut (nie inkubować dłużej niż 5 minut).</li>
	<li>Dodaj mieszaninę do transfekcji kroplami do dołków zawierających hodowle komórek HeLa (patrz Rycina 3 (do przygotowania płytki).</li>
	<li>Powtórz kroki od 7 do 10 dla próbek 2nd oraz 3B&R zestawy po 8 probówek.</li>
	<li>Inkubować przez noc (16 godzin) w temperaturze 37 °C w 5% CO2.</li>
</ol>
7. Analiza lucyferazy Gaussia (GLuc)
Oznacz aktywność GLuc w nadpływie z każdej studzienki, używając zestawu BioLux Gaussia Luciferase Assay Kit w następujący sposób:
<ol>
	<li>Przygotuj świeży roztwór pomiarowy, dodając 15 μl BioLux GLuc Substrate do 1,5 ml BioLux GLuc Assay Buffer (na jedną próbkę wymagane jest 50 μl roztworu pomiarowego). Przygotuj ilość wystarczającą dla próbek oraz do przepłukania wtryskiwacza luminometru (zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
	<li>Wymieszaj dokładnie, kilkakrotnie odwracając probówkę (nie używaj wirówki typu vortex).</li>
</ol>
Luminescencję mierzy się przy użyciu luminometru do mikropłytek Centro LB 960 firmy Berthold Technologies.
<ol start="3">
	<li>Ustaw luminometr na objętość wtrysku 50 μl oraz czas całkowania od 2 do 10 sekund.</li>
	<li>Przenieś 10 μl supernatantu z hodowli komórkowej z każdej studni do czarnej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Wypłucz wtryskiwacz roztworem testowym i przystąp do pomiaru luminescencji.</li>
	<li>Wartości uzyskane ze studni nietransfekowanych posłużą jako kontrole negatywne.</li>
</ol>
8. Analiza z użyciem lucyferazy Cypridina (CLuc)
Oznacz aktywność CLuc w nadpłynach z każdej studzienki, wykorzystując zestaw BioLux Cypridina Luciferase Assay Kit w następujący sposób:
<ol>
	<li>Przygotować świeżo zrekonstytuowany substrat (100x) zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji do zestawu.</li>
	<li>Rozmrozić bufor do analizy BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer i dobrze wymieszać (chronić przed światłem).</li>
	<li>Aby przygotować roztwór do analizy CLuc, dodać 15 μl zrekonstytuowanego substratu (100x) do 1,5 ml buforu BioLux Cypridina Luciferase Assay Buffer (wymagane 50 μl roztworu do analizy na jedną próbkę). Przygotować ilość wystarczającą dla próbek oraz do przepłukania wtryskiwacza luminometru (patrz instrukcja producenta).</li>
	<li>Dobrze wymieszać, kilkukrotnie odwracając probówkę (nie używać mieszadła wortex).</li>
	<li>Przechowywać roztwór w temperaturze pokojowej przez 30 minut (chronić przed światłem).</li>
</ol>
Luminescencję mierzy się za pomocą luminometru do mikropłytek Centro LB 960 firmy Berthold Technologies.
<ol start="6">
	<li>Ustaw luminometr na wtrysk 50 μl, opóźnienie 1-2 s oraz integrację 2-10 s.</li>
	<li>Przenieś 10 μl supernatantu z hodowli komórkowej z każdej studzienki do czarnej płytki 96-dołkowej.</li>
	<li>Wypełnij wstrzykiwacz roztworem pomiarowym CLuc i zmierz luminescencję.</li>
	<li>Wartości uzyskane ze studzienek nietransfekowanych posłużą jako kontrole negatywne.</li>
</ol>
9. Reprezentatywne wyniki
Zestaw T7 High Yield RNA Synthesis Kit pozwala na otrzymanie do 180 μg niekapowanego RNA oraz od 40 do 50 μg kapowanego RNA z jednej reakcji o objętości 20 μl. W analizie za pomocą Agilent 2100 Bioanalyzer RNA wysokiej jakości i nie zdegradowane powinno wykazywać pojedynczy, ostry pik reprezentujący transkrypty RNA. Szeroki pik lub wiele pików świadczy o degradacji RNA. Istotna jest również weryfikacja rozmiaru RNA. Transkrypty RNA o długości większej niż oczekiwana mogą wynikać z niepełnego trawienia plazmidowego DNA matrycy. Degradacja RNA i niższa wydajność są zazwyczaj wynikiem zanieczyszczeń wprowadzonych do reakcji wraz z DNA matrycy. Rycina 2 przedstawia przykład elektrofereogramu i obrazu żelu otrzymanych po analizie wysokiej jakości, nienaruszonego RNA w Bioanalyzerze.
Transfekcja komórek HeLa zarówno kapułkowanym, jak i niekapułkowanym RNA GLuc przebiega z późniejszą inkubacją oraz analizą nadnadczyn z kultur komórkowych pod kątem aktywności lucyferazy. Struktura czapeczki 5' jest istotna dla ochrony RNA przed degradacją przez egzonukleazy8 oraz dla promowania inicjacji translacji9 mRNA. Dlatego też kapułkowanie RNA jest kluczowym etapem w eksperymentach z transfekcją. Metoda kotranskrypcyjna (z użyciem analogu czapeczki) pozwala uzyskać około 40 μg RNA, z czego 80% jest kapułkowanych. Protokół z wykorzystaniem enzymu kapułkującego z wirusa Vaccinia pozwala na kapułkowanie do 10 μg RNA (100 nt lub więcej) na reakcję z wydajnością bliską 100%.
Rysunek 4 przedstawia różnicę w ekspresji lucyferazy pomiędzy kulturami transfekowanymi próbkami RNA z czapką i bez czapki. Wyraźnie widać, że kultury komórkowe transfekowane RNA z czapką wykazują znacznie wyższą ekspresję lucyferazy w porównaniu do tych transfekowanych RNA bez czapki (które nie wykazują aktywności lucyferazy). Ponadto Rysunek 4 potwierdza, że obie techniki nakładania czapki – z użyciem analogu czapki oraz enzymu cappingowego wirusa Vaccinia – skutecznie wytwarzają funkcjonalne, czapkowe transkrypty RNA, które mogą być translacyjne na białko. Dwustronna wartość p uzyskana z testu t wyniosła 0,2583, co wskazuje na brak istotnej statystycznie różnicy pomiędzy danymi luminescencyjnymi dla obu metod nakładania czapki.
<img alt="Schemat transkrypcji T7; matryca DNA, transkrypty RNA; proces sekwencji nukleotydowej." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1.">
Rysunek 1A. Synteza RNA przez polimerazę RNA T7
 
<img alt="Schemat mapy plazmidu pCMV-GLuc, 5764 bp; ekspresja genów, wektory klonujące, miejsca restrykcyjne." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig1B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 1B. Wektor pCMV-GLuc zawierający gen GLuc i promotor T7.
 
<img alt="Wyniki chromatografii RNA; analiza RNA niezmodyfikowanego i zmodyfikowanego (capped); wykres elektroforezy." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. Elektroferogramy z Bioanalizatora i obraz żelowy RNA niezmodyfikowanego oraz zmodyfikowanego (capped). Oś X przedstawia wielkość RNA w nukleotydach (nt), a oś Y reprezentuje jednostki fluorescencji (FU). A) Elektroferogram mRNA GLuc (niezmodyfikowanego) po puryfikacji. B) Elektroferogram mRNA GLuc (zmodyfikowanego za pomocą enzymu czapeczkującego Vaccinia). C) Elektroferogram mRNA GLuc (zmodyfikowanego kotranskrypcyjnie przy użyciu analogu czapeczki). D) Obraz przypominający żel wygenerowany przez Bioanalizator. Ścieżka „L” to drabinka RNA, ścieżka 1 to niezmodyfikowane mRNA GLuc, ścieżka 2 to mRNA GLuc zmodyfikowane przy użyciu analogu czapeczki, a ścieżka 3 to RNA GLuc zmodyfikowane za pomocą enzymu czapeczkującego Vaccinia.
 
<img alt="Schemat układu płytki dla eksperymentu ekspresji genów; typy próbek: niezafilatowane/zafilatowane GLuc i CLuc." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3. Przykład konfiguracji płytki do transfekcji komórek HeLa. Każda studnia zawiera wysiane komórki HeLa o konfluencji 60-90%. Do każdej studni dodaje się mieszaninę transfekcyjną składającą się z odpowiedniego RNA GLuc (niezafilatowanego, zafilatowanego analogiem czapeczki lub zafilatowanego za pomocą enzymu czapeczkującego Vaccinia), zafilatowanego RNA CLuc (do normalizacji), odczynnika mRNA Boost oraz odczynnika TransIT mRNA. Każda transfekcja jest wykonywana w 8 powtórzeniach (studnie o tym samym kolorze na rysunku).
 
 
<img alt="Wykres słupkowy znormalizowanej luminescencji; GLuc RNA z czapeczką i bez czapeczki; wyniki analizy RNA." src="/files/ftp_upload/3702/3702fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4."> 
Rysunek 4.Ekspresja GLuc w komórkach HeLa. Oczyszczone mRNA GLuc z czapeczką i bez czapeczki przetransfekowano do komórek HeLa i inkubowano przez noc (16 hrs) w temperaturze 37 °C. W supernatantach kultur komórkowych z każdej studzienki przeprowadzono analizę aktywności GLuc i CLuc, a następnie zarejestrowano wartości luminescencji. Wartości luminescencji GLuc znormalizowano względem wartości luminescencji RNA CLuc z czapeczką.
<img alt="Wzór na stosunek luminescencji GLuc, pomiar luminescencji, równanie dla wartości znormalizowanych, RLU." src="/files/ftp_upload/3702/3702eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
* Luminescencję z komórek nietransfekowanych odjęto od wartości GLuc i CLuc przed normalizacją.
 
Znaki towarowe
BioLux jest znakiem towarowym New England Biolabs, Inc.
TransIT jest zarejestrowanym znakiem towarowym firmy Mirus Bio LLC.
MEGAclear jest znakiem towarowym firmy Ambion.

<ol><li>Lazarev, D., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+splicing+and+transcription+are+not+sufficient+to+enhance+splicing+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Concurrent splicing and transcription are not sufficient to enhance splicing efficiency.</a> RNA. 13, 1546-1557 (2007).</li>
<li>Donze, O., Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+mammalian+cells+using+siRNAs+synthesized+with+T7%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Polymerase.+Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">RNA interference in mammalian cells using siRNAs synthesized with T7.</a> RNA Polymerase. Nucl. Acids Res. 30, 10-46 (2002).</li>
<li>Van Gelder, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nati.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Schneider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+analysis+of+T7+RNA+polymerase+based+in+vitro+linear+RNA+amplification+for+use+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Systematic analysis of T7 RNA polymerase based in vitro linear RNA amplification for use in microarray experiments.</a> BMC Genomics. 5, 29-29 (2004).</li>
<li>Conry, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+messenger+RNA+polynucleotide+vaccine+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a messenger RNA polynucleotide vaccine vector.</a> Cancer Research. 55, 1397-1400 (1995).</li>
<li>Huang, F., Wang, G., Coleman, T., Li, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+adenosine+derivatives+as+transcription+initiators+and+preparation+of+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+fluorescein-+and+biotin-labeled+RNA+through+one-step+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis of adenosine derivatives as transcription initiators and preparation of 5â€² fluorescein- and biotin-labeled RNA through one-step transcription.</a> RNA. 9, 1562-1570 (2003).</li>
<li>Warren, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+reprogramming+to+pluripotency+and+directed+differentiation+of+human+cells+with+synthetic+modified+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA.</a> Cell Stem Cell. 7, 618-630 (2010).</li>
<li>Furuichi, Y., LaFiandra, A., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5%27-Terminal+structure+and+mRNA+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">5'-Terminal structure and mRNA stability.</a> Nature. 266, 235-239 (1977).</li>
<li>Topisirovic, I., Svitkin, Y. V., Sonenberg, N., Shatkin, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+and+cap+binding+proteins+in+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cap and cap binding proteins in the control of gene expression.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. 2, 277-298 (2011).</li>
<li>Lewis, J. D., Izaurflde, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+the+Cap+Structure+in+RNA+Processing+and+Nuclear+Export%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Role of the Cap Structure in RNA Processing and Nuclear Export.</a> Eur. J. Biochem. 247, 461-469 (1997).</li>
<li>Inoue, K., Ohno, M., Sakamoto, H., Shimura, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+cap+structure+on+pre-mRNA+splicing+in+Xenopus+oocyte+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Effect of the cap structure on pre-mRNA splicing in Xenopus oocyte nuclei.</a> Genes Dev. 3, 1472-1479 (1989).</li>
<li>Martin, S. A., Paoletti, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+mRNA+guanylyltransferase+and+mRNA+%28guanine+7-%29methyltransferase+from+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of mRNA guanylyltransferase and mRNA (guanine 7-)methyltransferase from vaccinia virus.</a> J. Biol. Chem. 250, 9322-9329 (1975).</li>
<li>Martin, S. A., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+RNA+by+mRNA+guanylytransferase+and+mRNA+%28guanine-7-%29methyl-transferase+from+vaccinia+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modification of RNA by mRNA guanylytransferase and mRNA (guanine-7-)methyl-transferase from vaccinia virions.</a> J. Biol. Chem. 250, 9330-9335 (1975).</li>
<li>Shuman, S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+use+of+vaccinia+virus+mRNA+capping+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Meth.+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and use of vaccinia virus mRNA capping enzyme.</a> Meth. Enzymol. 181, 170-180 (1990).</li>
<li>Thiel, V., Herold, J., Scelle, B., Siddell, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+RNA+transcribed+in+vitro+from+a+cDNA+copy+of+the+human+coronavirus+genome+cloned+in+vaccinia+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Infectious RNA transcribed in vitro from a cDNA copy of the human coronavirus genome cloned in vaccinia virus.</a> J. Gen. Virol. 82, 1273-1281 (2001).</li>
<li>Marcotrigiano, J., Gingras, A. -C., Sonenberg, N., Burley, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystal+Structure+of+the+Messenger+RNA+5%C3%A2%E2%82%AC%C2%B2+Cap-Binding+Protein+%28eIF4E%29+Bound+to+7-methyl-GDP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cocrystal Structure of the Messenger RNA 5â€² Cap-Binding Protein (eIF4E) Bound to 7-methyl-GDP.</a> Cell. 89, 951-961 (1997).</li>
<li>Stepinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+mRNAs+containing+the+novel+%22anti-reverse%22+cap+analogs+7-methyl+%283%27-O-methyl%29GpppG+and+7-methyl+%283%27-deoxy%29+GpppG%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of mRNAs containing the novel "anti-reverse" cap analogs 7-methyl (3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl (3'-deoxy) GpppG.</a> RNA. 7, 1486-1495 (2001).</li>
<li>Kuge, H., Brownlee, G. G., Gershon, P. D., Richter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cap+ribose+methylation+of+c-mos+mRNA+stimulates+translation+and+oocyte+maturation+in+Xenopus+laevis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cap ribose methylation of c-mos mRNA stimulates translation and oocyte maturation in Xenopus laevis.</a> Nucl. Acids Res. 26, 3208-3214 (1998).</li>
<li>Schagat, T., Paguio, A., Kopish, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalizing+Genetic+Reporter+Assays%3A+Approaches+and+Considerations+for+Increasing+Consistency+and+Statistical+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Notes%22%5BJournal%5D)">Normalizing Genetic Reporter Assays: Approaches and Considerations for Increasing Consistency and Statistical Significance.</a> Cell Notes. 17, 9-12 (2007).</li>
<li>Barbosa, E., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mRNA+%28nucleoside-2%27-%29+-+methyltransferase+from+Vaccinia+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">mRNA (nucleoside-2'-) - methyltransferase from Vaccinia Virus.</a> J. Biol. Chem. 253, 7698-7702 (1978).</li>
<li>Lockless, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+capped+RNA+substrates+by+VP39%2C+the+vaccinia+virus-encoded+mRNA+cap-specific+2%27-O-methyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Recognition of capped RNA substrates by VP39, the vaccinia virus-encoded mRNA cap-specific 2'-O-methyltransferase.</a> Biochemistry. 37, 8564-8574 (1998).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy są pracownikami firmy New England Biolabs, Inc.

In vitro transkrypcja jest użyteczną metodą uzyskiwania wysokich wydajności RNA dla wielu różnych zastosowań. Główną zaletą stosowania zestawu T7 High Yield RNA Synthesis Kit jest optymalizacja jego składu w celu osiągnięcia wysokiej wydajności RNA. Ponadto odczynniki dostarczone w zestawie są wolne od zanieczyszczeń nukleazami, co pozwala na syntezę wysokiej jakości, nienaruszonych transkryptów RNA. Zestaw został zaprojektowany z myślą o wysokiej stabilności i elastyczności, dzięki czemu może być stosowany do syntezy mRNA, RNA znakowanego barwnikami, sond znakowanych izotopowo o wysokiej aktywności właściwej oraz RNA z czapką. Instrukcja zestawu zawiera listę szczegółowych protokołów oraz dodatkowych materiałów wymaganych dla każdego z tych zastosowań. Zawiera ona również informacje techniczne dotyczące wykorzystania produktów PCR i syntetycznych oligonukleotydów DNA jako matryc do transkrypcji. Należy pamiętać, że zestaw do transkrypcji może być stosowany wyłącznie z matrycami DNA zawierającymi promotor T7.
Metoda opisana w niniejszym artykule demonstruje posttranskrypcyjne nakładanie czapeczki RNA przy użyciu enzymu cappingowego z wirusa Vaccinia, a także nakładanie czapeczki w sposób kotranskrypcyjny z wykorzystaniem analogu struktury czapeczki RNA. Wykazaliśmy, że obie metody pozwalają na syntezę czapeczkowanego RNA, które jest funkcjonalnie aktywne po transfekcji. Struktura czapeczki 5' poprawia stabilność RNA oraz wydajność translacji, a co za tym idzie, jest istotna dla eksperymentów z wykorzystaniem mikroiniekcji11 i transfekcji7. Metoda kotranskrypcyjna generuje 40-50 μg RNA z stopniem czapeczkowania wynoszącym ok. 80%. Należy zauważyć, że zastosowanie analogu czapeczki RNA 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G (ARCA), który jest zablokowany w pozycji 3'-hydroksylowej m7G, zapewnia wbudowanie czapeczki w prawidłowej orientacji17. W celu czapeczkowania większych ilości RNA możliwe jest zwiększenie skali standardowych reakcji dla obu metod. Jednakże zastosowanie systemu cappingowego Vaccinia byłoby opcją bardziej korzystną pod względem kosztów, ponieważ kotranskrypcyjne nakładanie czapeczki wykorzystuje analog czapeczki, który jest stosunkowo drogim komponentem. System cappingowy Vaccinia jest również lepszą metodą, gdyż jego wydajność nakładania czapeczki wynosi niemal 100%.
Opisane powyżej metody cappingu RNA syntetyzują RNA z strukturą cap 0 na końcu 5'. Struktura cap 1 obejmuje dodatkową metylację w pozycji 2'-O cukru rybozy pierwszego nukleotydu na końcu 5' RNA. Wykazano, że struktura cap 1 zwiększa wydajność translacji RNA18, a można ją wprowadzić przy użyciu 2'-O-metylotransferazy20, 21.
Metoda opisana w niniejszej pracy może być wykorzystana do transkrypcji, cappingu i transfekcji dowolnego wybranego mRNA. W niniejszym protokole zastosowano konkretnie lucyferazy GLuc i CLuc ze względu na ich liczne zalety. Są one bezpośrednio wydzielane do pożywki komórkowej, co eliminuje konieczność lizy komórek. Ponadto generują one wysoką intensywność sygnału bioluminescencyjnego, a testy aktywności są wysoce czułe i łatwe do przeprowadzenia. Należy zauważyć, że ekspresja GLuc w komórkach może być zależna od różnych czynników innych niż funkcjonalność samego RNA. Przykładami są błędy pipetowania, różna liczba komórek w studni, wydajność transfekcji itp. W celu skorygowania tych czynników stosuje się normalizację danych. W naszym protokole współtransfekujemy RNA CLuc jako kontrolę wewnętrzną wraz z RNA GLuc. Po podzieleniu luminescencji GLuc przez wartości kontrolne CLuc, wynik zostaje znormalizowany pod kątem błędów i zmienności transfekcji19.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wysokowydajnej syntezy RNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>E2040S</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;-0-Me-m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;Analog struktury czapeczki RNA </td><td>New England Biolabs</td><td>S1411S</td><td></td></tr><tr><td>DNaza I (wolna od RNaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>System cappingowy Vaccinia</td><td>New England Biolabs</td><td>M2080S</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw MEGAclear</td><td>Ambion</td><td>AM1908</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Tłumaczenie&lt;/em&gt;Zestaw do transfekcji mRNA IT </td><td>Mirus Bio LLC</td><td>MIR2250</td><td></td></tr><tr><td>Klasyczne pożywki płynne HyClone*: Dulbecco&amp;rsquo;zmodyfikowane podłoże Eagle&amp;rsquo;pożywka DMEM, wysoka zawartość glukozy</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30285.01</td><td></td></tr><tr><td>Niezbędne aminokwasy HyClone</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30238.01</td><td></td></tr><tr><td>Centro LB 960 </td><td>Berthold Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLux&lt;em&gt; Gaussia&lt;/em&gt; Zestaw do analizy lucyferazy</td><td>New England Biolabs</td><td>E3300S</td><td></td></tr><tr><td>BioLux &lt;em&gt;Cypridina&lt;/em&gt; Zestaw do analizy lucyferazy</td><td>New England Biolabs</td><td>E3309S</td><td></td></tr><tr><td>inhibitor RNazy, mysi </td><td>New England Biolabs</td><td>M0314</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor RNazy z ludzkiej łożyska</td><td>New England Biolabs</td><td>M0307</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-GLuc plazmid kontrolny</td><td>New England Biolabs</td><td>N8081</td><td></td></tr></tbody></table>

transkrypcja in vitro i capping mrna lucyferazy gaussia z następującą transfekcją komórek hela

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro transkrypcja jest syntezą transkryptów RNA przez polimerazę RNA z liniowej matrycy DNA zawierającej odpowiednią sekwencję promotora (T7, T3, SP6) oraz gen do transkrypcji (Rysunek 1A). Typowa reakcja transkrypcji składa się z matrycy DNA, polimerazy RNA, rybonukleotydów trifosforanowych, inhibitora RNazy oraz buforu zawierającego jony Mg2+.
W wielu zastosowaniach często wymagane są duże ilości wysokiej jakości RNA. Wykorzystanie transkrypcji in vitro zgłaszano w badaniach nad strukturą i funkcją RNA, takich jak splicing1, eksperymenty RNAi w komórkach ssaków2, amplifikacja antysensownego RNA metodą „Eberwine’a”3, analiza mikromacierzy4 oraz badania nad szczepionkami RNA5. Technika ta może być również stosowana do produkcji sond znakowanych radioaktywnie i barwnikami6. Warren et al. donieśli niedawno o przeprogramowaniu ludzkich komórek poprzez transfekcję transkrybowanym in vitro RNA z czapką7. Zestaw T7 High Yield RNA Synthesis Kit firmy New England Biolabs został opracowany do syntezy do 180 μg RNA w reakcji o objętości 20 μl. Za pomocą tego zestawu pomyślnie transkrybowano RNA o długości do 10kb. W качестве matryc do transkrypcji można wykorzystać zlinearyzowane DNA plazmidowe, produkty PCR oraz syntetyczne oligonukleotydy DNA, pod warunkiem, że posiadają one sekwencję promotora T7 powyżej genu podlegającego transkrypcji.
Dodanie struktury czapeczki na końcu 5' RNA jest istotnym procesem u eukariontów. Jest on niezbędny dla stabilności RNA8, wydajnej translacji9, transportu jądrowego10 oraz splicingu11. Proces ten polega na dołączeniu czapeczki 7-metyloguanozyny do końca 5'-trifosforanowego RNA. Czapeczkowanie RNA może być przeprowadzane posttranskrypcyjnie przy użyciu enzymów czapeczkujących lub kotranskrypcyjnie za pomocą analogów czapeczki. W metodzie enzymatycznej mRNA jest czapeczkowane przy użyciu enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia12,13. Enzym ten dołącza czapeczkę 7-metyloguanozyny do końca 5' RNA, wykorzystując GTP oraz S-adenozylometioninę jako donory (struktura cap 0). Obie metody pozwalają na otrzymanie funkcjonalnie aktywnego czapeczkowanego RNA odpowiedniego do transfekcji lub innych zastosowań14, takich jak generowanie wirusowego genomowego RNA dla systemów genetyki odwrotnej15 oraz badania krystalograficzne białek wiążących czapeczkę, takich jak eIF4E16.
W opisanej poniżej metodzie zestaw T7 High Yield RNA Synthesis Kit od NEB jest wykorzystywany do syntezy z capped i uncapped transkryptów RNA lucyferazy z Gaussia (GLuc) oraz lucyferazy z Cypridina (CLuc). Część uncapped RNA GLuc zostaje poddana cappingowi za pomocą Vaccinia Capping System (NEB). Jako matrycę DNA wykorzystuje się zlinearyzowany plazmid zawierający gen GLuc lub CLuc oraz promotor T7. Transkrybowane RNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie nadnadczości z hodowli komórkowych są analizowane pod kątem aktywności lucyferazy. Capped RNA CLuc służy jako wewnętrzna kontrola do normalizacji ekspresji GLuc.

Niniejsza metoda opisuje wysokowydajną syntezę in vitro zarówno zmodyfikowanego (z czapeczką), jak i niezmodyfikowanego (bez czapeczki) mRNA z liniowego plazmidu zawierającego gen lucyferazy Gaussia (GLuc). RNA zostaje poddane oczyszczaniu, a następnie część mRNA bez czapeczki zostaje enzymatycznie zmodyfikowana z wykorzystaniem enzymu czapeczkującego wirusa Vaccinia. W ostatnim kroku mRNA jest transfekowane do komórek HeLa, a następnie analizowana jest aktywność lucyferazy w supernatantach kultur komórkowych.

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Transkrypcja in vitro to synteza transkryptów RNA przez polimerazę RNA z liniowej matrycy DNA zawierającej odpowiednią sekwencję promotora...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest transfekcja komórek HeLa mRNA z czapką oraz bez czapki, będących transkryptami lucyferazy Gaia, a następnie analiza hodowli komórkowej pod kątem aktywności lucyferazy. Zostaje to osiągnięte poprzez syntezę transkryptów lucyferazy Gaia w formie mRNA bez czapki oraz z czapką za pomocą transkrypcji in vitro z wykorzystaniem zestawu T seven high yield RNA synthesis kit. Zaprezentowano dwie metody nakładania czapki na mRNA.W jednym przypadku podczas transkrypcji stosuje się analog czapeczki, a w drugim enzym nakładający czapeczkę wirusa vaccinia w celu cappingu posttranskrypcyjnego. Kolejnym krokiem jest transfekcja transkryptów mRNA z czapeczką i bez czapeczki do komórek heli. Ostatecznie porównuje się aktywność lucyferazy wynikającą z mRNA bez czapeczki lub z czapeczką w nadsączu hodowli komórek heli.Główną zaletą tej metody w stosunku do samodzielnego przygotowania reakcji transkrypcji jest fakt, że zestaw T seven high yield RNA synthesis został przetestowany i zoptymalizowany w celu uzyskania wysokiej wydajności, a co ważniejsze, wysokiej jakości pełnowymiarowych transkryptów RNA. Jest to niezwykle istotne dla pomyślnej translacji RNA i ekspresji funkcjonalnie aktywnego białka. Zatem metoda ta pozwala na zgłębienie kwestii transfekcji RNA; RNA transkrybowane in vitro mogą być również wykorzystywane w innych zastosowaniach, takich jak mikroiniekcja, analiza mikromacierzy, bloty oparte na hybrydyzacji oraz badania struktury i funkcji RNA.Matryca DNA dla tej przykładowej reakcji to zlinearyzowany plazmid zawierający gen lucyferazy Gaussian lub gen gluc. Dzięki zastosowaniu promotora T7 syntetyzowane będą produkty zarówno z czapką, jak i bez czapki. Należy rozpocząć od rozmrożenia komponentów z zestawu do wysokowydajnej syntezy RNA T7 i utrzymywania ich w lodzie.Aby uniknąć kontaminacji RNA, należy założyć rękawiczki i dokładnie oczyścić powierzchnię blatu, pipety oraz pozostałe materiały. W celu syntezy RNA bez czapy (uncapped RNA) zdecydowanie zaleca się stosowanie końcówek do pipet, probówek i szkła laboratoryjnego wolnych od nukleaz. Odczynnik do reakcji należy przygotować w temperaturze pokojowej, rozpoczynając od dodania 10 x buforu i wody, następnie nukleotydów i matrycy DNA, a na koniec mieszaniny polimerazy.Kolejność dodawania odczynników jest istotna dla syntezy RNA z czapką. Używając analogu czapki, przygotuj podobną mieszaninę reakcyjną, ale dodaj nukleotydy analogu czapki. Po dodaniu standardowych nukleotydów wymieszaj składniki reakcji, delikatnie wstrząsając nimi w wirówce typu vortex, a następnie krótko wiruj i inkubuj reakcje w temperaturze 37 °C przez dwie godziny w inkubatorze z suchym powietrzem. Jako wewnętrzną kontrolę przygotuj drugą reakcję w celu syntezy transkryptów c Luke z linearyzowanego plazmidu; ekspresja C Luke jest wykorzystywana do normalizacji ekspresji gluc.Po inkubacji usuń matrycę DNA z każdej mieszaniny reakcyjnej. Dodaj 70 µL wody wolnej od nukleaz, następnie 10 µL DNAs, jeden bufor reakcyjny, a następnie 2 µL DNAs. Pozostaw DNAs do reakcji na 15 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z suchym powietrzem.Następnie oczyść produkty reakcji, korzystając z dowolnego zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumienkach wirowych, a następnie oznacz ilość RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop TM. Na koniec oceń jakość RNA, używając zestawu Agilent RNA 6, 000 nano Kit oraz bioanalizatora Agilent 2100. W celu przeprowadzenia standardowej reakcji cappingu, przygotuj 10 µg oczyszczonego, niezmodyfikowanego mRNA gluc w 15 µL wody wolnej od nukleaz.Skalę tej procedury można odpowiednio zwiększyć. RNA należy podgrzać do 65°C przez 10 minut w celu rozbicia struktur drugorzędowych, a następnie umieścić na lodzie na pięć minut. Aby przygotować reakcję cappingu, do zdenaturowanego RNA należy dodać bufor do cappingu, GTP, świeżo rozcieńczoną metioninę oraz enzym cappingowy vaccinia. Składniki reakcji należy delikatnie wymieszać w wirówce typu vortex, krótko wirować (pulse spin) i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37°C w inkubatorze z suchym powietrzem.Po inkubacji należy oczyścić i przeanalizować RNA w sposób opisany na końcu poprzedniej sekcji. Rozpocznij od wysiewu komórek HeLa. W 28 dołkach płytki 48-dołkowej każdy dołek powinien zawierać od 70 000 do 230 000 komórek oraz 150 µL DMEM z wysoką zawartością glukozy, uzupełnionego o 10% serum.Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C do momentu, aż komórki osiągną 60 do 90% konfluencji, co powinno zająć od 16 do 24 godzin. Po uzyskaniu odpowiedniej konfluencji komórek przygotować mieszaniny do transfekcji. Rozcieńczyć RNA do stężenia 100 ng/µL.Następnie przygotować 24 probówki do mikrocentryfugi dla trzech różnych reakcji. Każda z nich powinna być powtórzona ośmiokrotnie w ośmiu probówkach. Dodać 1 µL niekapowanego gluc RNA, 1 µL kapowanego c luke RNA w celu normalizacji oraz 25 µL pożywki bezsurowiczej.DMEM zawsze dobrze wymieszaj za pomocą pipety w kolejnych ośmiu probówkach. Przygotuj taką samą reakcję, ale zamiast niekapsylowanego gluc RNA, dodaj kapsylowane gluc RNA przygotowane z użyciem analogu czapeczki w ostatnich ośmiu probówkach. Zamiast gluc RNA przygotowanego z użyciem analogu czapeczki, dodaj kapsylowane gluc RNA z reakcji vaccinia do pierwszego zestawu ośmiu probówek z niekapsylowanym gluc RNA; wymieszaj z 0,2 µL odczynnika mRNA boost, a następnie dodaj kolejne 0,2 µL.Odczynnik Transit mRNA pozwala na prowadzenie reakcji w temperaturze pokojowej nie dłużej niż przez pięć minut. Po dwóch minutach od rozpoczęcia reakcji należy zacząć przenosić każdą mieszaninę kroplami do dołka z hodowlą komórek. Powtórz ten krok dla kolejnych dwóch zestawów probówek zawierających cap, analog cap gluc, RNA oraz capped gluc RNA z reakcji z wirusem vaccinia.Cztery dołki pozostaw jako kontrole negatywne, a komórki inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C w 5% carbon dioxide assay. Powyższą analizę przeprowadź przy użyciu zestawu Biox GIA Luciferase assay kit dla Gluc assay. Przygotuj świeży roztwór analityczny, dodając 15 µL biox gluc substrate do 1,5 mL biox gluc assay buffer.Nie mieszać końcowej mieszaniny w wirówce typu vortex. W przypadku testu CLU wymieszać ją poprzez odwracanie probówki. Przygotować 100 x świeżo zrekonstytuowany substrat.Następnie przygotować roztwór do analizy, dodając 15 µL zrekonstytuowanego substratu do 1,5 mL buforu do analizy lucyferazy Blu Ciena. Wymieszać roztwór do analizy C Luke bez użycia wirówki i inkubować go w temperaturze pokojowej przez 30 minut w ciemności. Po przygotowaniu roztworów do analizy.Zmierz luminescencję komórek przy użyciu luminometru do mikropłytek. Ustaw luminometr tak, aby wstrzykiwał 50 µL roztworu testowego w czasie od 2 do 10 sekund. Następnie przenieś 10 µL nadsączu z każdej hodowli komórkowej do dołka białej płytki 96-dołkowej.Napełnij injektor roztworem do analizy, a następnie przystąp do pomiaru luminescencji. Zestaw do wysokowydajnej syntezy RNA T seven pozwala na otrzymanie do 180 µg niekapowanego RNA oraz od 40 do 50 µg kapowanego RNA z jednej reakcji o objętości 20 µL, co potwierdzono w analizie na bioanalizatorze Agilent 2100. Dobra jakość, nienaruszona struktura.RNA powinno wykazywać jeden wyraźny pik reprezentujący transkrypty RNA. Szeroki pik lub wiele pików świadczy o degradacji RNA. Ważne jest również zweryfikowanie wielkości RNA.Transkrypty o długości większej niż oczekiwana mogą wynikać z niepełnego trawienia plazmidu matrycy; degradacja DNA/RNA oraz niższa wydajność są zazwyczaj wynikiem zanieczyszczeń wprowadzonych do reakcji wraz z matrycą. Po transfekcji DNA przeprowadzono inkubację i analizę aktywności lucyferazy. Struktura czapeczki 5' jest istotna dla ochrony RNA przed degradacją przez egzonukleazy oraz dla promowania inicjacji translacji.W związku z tym capping RNA jest niezbędnym etapem w eksperymentach z transfekcją. Różnica w zmierzonej luminescencji pomiędzy kulturami komórek transfekowanymi transkryptami z cappingiem a tymi bez cappingu wyraźnie to potwierdza, a także pokazuje, że obie techniki cappingu – z użyciem analogu cap oraz z użyciem enzymu cappingowego vaccinia – skutecznie pozwalają na otrzymanie funkcjonalnych, capped transkryptów RNA. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat syntezy wysokiej jakości capped transkryptów RNA do zastosowań w transfekcji oraz w innych różnorodnych aplikacjach.

in-vitro-transcription-capping-gaussia-luciferase-mrna-followed-hela

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In vitro Transkrypcja i zamknięcie kodującego Gaussia luciferase mRNA poprzedzone transfekcją komórek HeLa

W związku z rosnącym zainteresowaniem terapiami komórkami macierzystymi, techniki obrazowania molekularnego są idealne do monitorowania zachowania tych komórek po transplantacji. Geny reporterowe lucyferazy umożliwiły nieinwazyjną, powtarzalną ocenę przeżywalności, lokalizacji i proliferacji komórek in vivo. W niniejszym filmie zaprezentrowano sposób śledzenia proliferacji hESC w żywej myszy.

Obrazowanie genem reporterowym bioluminescencyjnym ludzkich embrionalnych komórek macierzystych in vitro i in vivo

W niniejszej pracy opisujemy metody konstruowania, wizualizacji i kwantyfikacji reakcji bioluminescencyjnych enzymów lucyferazy świetlikowej oraz renilla, wykazujących ekspresję w komórkach przerzutowego raka piersi podczas ich wzrostu i przerzutowania in vivo.

In vivo dwusubstratowe obrazowanie bioluminescencyjne

Zegary okołodobowe funkcjonują w obrębie poszczególnych komórek, tzn. są autonomiczne komórkowo. W niniejszej pracy opisujemy metody tworzenia autonomicznych komórkowo modeli zegara z wykorzystaniem nieinwazyjnej technologii bioluminescencji w czasie rzeczywistym opartej na lucyferazie. Komórki reporterowe stanowią praktyczne, funkcjonalne systemy modelowe do badania biologii okołodobowej.

Monitorowanie komórkowych autonomicznych rytmów okołodobowych ekspresji genów z wykorzystaniem reporterów bioluminescencyjnych lucyferazy

Osiągnięcie zrozumienia procesów komórkowych na poziomie systemowym jest celem współczesnej biologii komórki. Opisujemy tutaj strategie multipleksowania reporterów lucyferazy różnych punktów końcowych funkcji komórkowych w celu zbadania funkcji genów przy użyciu bibliotek RNAi w skali genomu.

Multipleksowana platforma przesiewowa oparta na lucyferazie do badania transdukcji sygnału związanego z rakiem w hodowanych komórkach

W tym artykule wideo opisujemy syntezę in vitro zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach.

In vitro Synteza zmodyfikowanego mRNA do indukcji ekspresji białek w komórkach ludzkich

Ekspresja białek malarycznych w systemach komórkowych pozostaje wyzwaniem. Pokazujemy dwuetapowe i jednoetapowe systemy ekspresji komórkowej IVT (translacja in vitro) do ekspresji rekombinowanych białek rhoptrii malarii z komórek HeLa. Do oczyszczania białek rhoptrii używamy systemu oczyszczania opartego na powinowactwie do żywicy Ni.

Oparte na HeLa systemy ekspresji bezkomórkowej do ekspresji białek Plasmodium Rhoptry

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

W tej pracy zapewniamy eksperymentalny przepływ pracy, w jaki sposób aktywne wzmacniacze mogą być identyfikowane i eksperymentalnie weryfikowane.

Przewidywanie i walidacja elementów regulatorowych genów aktywowanych podczas różnicowania embrionalnych komórek macierzystych indukowanego kwasem retinowym

Ten protokół opisuje metodę osiągnięcia stabilnej integracji interesującego genu z ludzkim genomem przez regulowany transkrypcyjnie system Śpiącej Królewny. Opisano przygotowanie do integracji wadliwych wektorów lentiwirusowych, transdukcję in vitro komórek ludzkich oraz test molekularny na transdukowanych komórkach.

Skuteczna metoda transpozycji in vitro za pomocą regulowanego transkrypcyjnie systemu Śpiącej Królewny zapakowanego w wadliwy wektor lentiwirusowy z uszkodzoną integracją

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru interakcji eIF4E-eIF4G w żywych komórkach, który umożliwiłby użytkownikowi ocenę wywołanych przez lek zaburzeń dynamiki kompleksu eIF4F w formatach przesiewowych.

Monitorowanie montażu eIF4F poprzez pomiar interakcji eIF4E-eIF4G w aktywnych komórkach

Tu dostarczamy szczegółów dotyczących przygotowania lizatów i przeprowadzania in vitro translacji za pomocą Drosophila zarodków.

Wolnokomórkowa in vitro translacja mRNA w Drosophila Lizowaniu

Poznaj metodę syntezy mRNA lucyferazy Gaussa z capowaniem in vitro i transfekcję komórek HeLa. Technika ta umożliwia badanie ekspresji białek reporterowych w komórkach ssaków.

Transkrypcja in vitro i capping mRNA lucyferazy Gaussia z następującą transfekcją komórek HeLa

Przeglądaj więcej filmów