Metody in vitro Transkrypcja i capping mRNA lucyferazy Gaussa, a następnie transfekcja komórek HeLa

Ogólnym celem tej procedury jest transfekcja komórek hela z zamkniętym i nieosłoniętym mRNA, transkryptami lucyferazy gal i oznaczeniem kultury komórkowej pod kątem aktywności lucyferazy. Osiąga się to poprzez uprzednie użycie zestawu do syntezy T seven High Yield RNA do syntezy zarówno nieograniczonego, jak i ograniczonego mRNA, transkryptów lucyferazy Gaia przez transkrypcję in vitro. Przedstawiono dwie metody cappingu mRNA.

Jeden używa analogu czapu podczas transkrypcji, a drugi wykorzystuje enzym ograniczający krowiankę do czapekowania potranskrypcyjnego. Następnym krokiem jest transfekcja zakrytych i nieosłoniętych transkryptów mRNA do komórek heli. Ostatecznie aktywność lucyferazy wynikająca z nieosłoniętego lub ograniczonego mRNA jest porównywana w hodowli komórek heli o super nazwanej.

Główną zaletą tej metody w porównaniu z tworzeniem własnej reakcji transkrypcji jest to, że zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności T seven został przetestowany i zoptymalizowany w celu uzyskania wysokiej wydajności i, co ważniejsze, wysokiej jakości transkryptów RNA o pełnej długości. Jest to niezwykle ważne dla udanej translacji RNA i ekspresji funkcjonalnie aktywnego białka. Tak więc ta metoda zapewnia wgląd w transfekcję RNA in vitro, transkrybowane RNA mogą być również wykorzystywane do innych zastosowań, takich jak analiza mikromacierzy mikroiniekcyjnej, plamy oparte na hybrydyzacji oraz badania struktury i funkcji RNA.

Matryca DNA dla tej przykładowej reakcji to zlinearyzowany plazmid zawierający lucyferazy gaussowskiej lub gen gluc. Z promotorem T seven syntetyzowane będą zarówno produkty z ograniczeniem, jak i bez limitu. Zacznij od rozmrożenia składników z zestawu do syntezy RNA o wysokiej wydajności T seven i trzymaj je na lodzie.

Aby uniknąć zanieczyszczenia RNA, należy nosić rękawice i dokładnie czyścić powierzchnię stołu, pipety i inne materiały Zdecydowanie zaleca się stosowanie końcówek do pipet bez nukleazy, probówek i naczyń szklanych do syntezy nieosłoniętego RNA. Ustaw reakcję w temperaturze pokojowej, zaczynając od 10-krotnego buforu i wody, a następnie nukleotydów, matrycy DNA. I wreszcie mieszanina polimeraz.

Kolejność dodawania odczynnika jest ważna dla syntezy zakrytego RNA. Używając analogu kapu, przygotuj podobną mieszaninę reakcyjną, ale dodaj nukleotydy analogu czapu. Po dodaniu standardowych nukleotydów, teraz wymieszaj składniki reakcji przez delikatne wirowanie, a następnie pulsuj, wiruj i inkubuj reakcje w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny w inkubatorze z suchym powietrzem, ponieważ kontrola wewnętrzna ustawia drugą reakcję w celu syntezy transkryptów czapeczki c Luke ze zlinearyzowanego plazmidu C Wyrażenie Luke'a służy do normalizacji ekspresji gluc.

Po inkubacji należy usunąć matrycę DNA z każdej mieszaniny reakcyjnej. Dodaj 70 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz, następnie 10 DNA, jeden bufor reakcyjny, a następnie dwa mikrolitry DNA. Po pierwsze, pozwól DNA reagować przez 15 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza w inkubatorze z suchym powietrzem.

Teraz oczyść reakcje za pomocą dowolnego zestawu do oczyszczania RNA opartego na kolumnie spinowej i określ ilościowo RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop TM. Na koniec oceń jakość RNA za pomocą bioanalizatora Agilent RNA 6 000 nano Kitt i Agilent 2100. W przypadku standardowej reakcji cappingu należy umieścić 10 mikrogramów oczyszczonego, nieograniczonego mRNA gluc w 15 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz.

Można to odpowiednio przeskalować. Podgrzej RNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 10 minut, aby rozbić struktury drugorzędowe, a następnie umieść go na lodzie na pięć minut. Aby uruchomić reakcję cappingu, dodaj bufor zamykający GTP, świeżo rozcieńczoną metioninę ślimaka i enzym zamykający krowiankę do zdenaturowanego RNA Delikatnie odwiruj składniki reakcji, wiruj impulsowo i inkubuj reakcję w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut w inkubatorze z suchym powietrzem.

Po inkubacji oczyść i przeanalizuj RNA, jak to zrobiono na końcu poprzedniej sekcji. Zacznij od posiewu komórek hela. W 28 dołkach z 48-dołkową płytką, każda studzienka powinna zawierać od 70 do 230 000 komórek i 150 mikrolitrów DMEM o wysokiej zawartości glukozy uzupełnionej 10% surowicą.

Inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż komórki zlewają się w 60 do 90%, co powinno zająć od 16 do 24 godzin. Gdy komórki będą gotowe, przygotuj mieszaniny transfekcji. Rozcieńczyć RNA do stężenia 100 nanogramów na mikrolitr.

Następnie ustaw 24 mikroprobówki wirówkowe do trzech różnych reakcji. Zduplikowane osiem razy do ośmiu probówek. Dodaj jeden mikrolitr bez zasklepionego gluku RNA, jeden mikrolitr zaślepiony c luke RNA do normalizacji i 25 mikrolitrów surowicy za darmo.

DMEM zawsze dobrze mieszaj za pomocą pipety w następnych ośmiu probówkach. Ustaw tę samą reakcję, ale zamiast niezamkniętego gluc, RNA, dodaj zakryty gluc RNA przygotowany przy użyciu analogu czapeczki w ostatnich ośmiu probówkach. Zamiast gluc RNA przygotowanego przy użyciu analogu kapu, dodaj teraz zakryty gluc RNA z reakcji krowianki do pierwszego zestawu ośmiu probówek z nieosłoniętym gluc RNA wymieszaj w 0,2 mikrolitra odczynnika wzmacniającego mRNA, a następnie wymieszaj 0,2 mikrolitra.

Odczynnik mRNA tranzytowy pozwala reakcjom postępować w temperaturze pokojowej nie dłużej niż pięć minut. Po dwóch minutach reakcji rozpocznij przenoszenie każdej mieszaniny kroplami do studzienki z hodowanymi komórkami. Powtórz ten krok z następnymi dwoma zestawami probówek zawierających czapeczkę, analogowy gluc kapu, RNA i czapeczkowany gluc RNA z reakcji krowianki.

Pozostaw cztery studzienki jako kontrole ujemne, inkubuj komórki przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza w teście 5% dwutlenku węgla. Supra nazwana przy użyciu zestawu testowego Lucyferazy Biox GIA do testu Gluc. Przygotuj świeży roztwór testowy, dodając 15 mikrolitrów substratu biox gluc do 1,5 mililitra buforu do oznaczania biox gluc.

Nie mieszaj końcowej mieszanki. Wymieszaj go przez odwrócenie probówki do testu CLU. Przygotować 100 x świeżo rozpuszczony substrat.

Następnie przygotuj roztwór testowy, dodając 15 mikrolitrów odtworzonego substratu do 1,5 mililitra buforu do oznaczania lucyferazy Blu Ciena. Wymieszaj roztwór testowy C Luke'a bez wirowania i inkubuj go w temperaturze pokojowej przez 30 minut z dala od światła. Z przygotowanymi roztworami testowymi.

Zmierz luminescencję komórki za pomocą luminometru mikropłytki. Ustaw luminometr tak, aby wstrzykiwał 50 mikrolitrów roztworu testowego przez dwie do 10 sekund. Następnie przenieś 10 mikrolitrów każdej super nazwy kultury komórkowej do studzienki 96, podczas gdy płytka.

Zalać wtryskiwacz roztworem testowym i przystąpić do pomiaru luminescencji. Zestaw do syntezy RNA o wysokiej wydajności T seven może wytworzyć do 180 mikrogramów RNA bez osłonki i od 40 do 50 mikrogramów RNA z ograniczoną pokrywą na 20 mikrolitrów reakcji podczas analizy na bioanalizatorze Agilent 2100. Dobra jakość w nienaruszonym stanie.

RNA powinien wykazywać pojedynczy ostry pik reprezentujący transkrypt RNA. Szeroki pik lub wielokrotne piki wskazują na degradację RNA. Ważne jest również, aby zweryfikować rozmiar R-N-A-R-N-A.

Transkrypty o dłuższej długości niż oczekiwano mogą być spowodowane niepełnym trawieniem plazmidu matrycowego, degradacją D-N-A-R-N-A i niższą wydajnością są zwykle wynikiem zanieczyszczeń wprowadzonych do reakcji z matrycy. Po transfekcji DNA nastąpiła inkubacja i oznaczenie aktywności lucyferazy. Struktura pięciu pierwszych czapeczek jest ważna dla ochrony RNA przed degradacją egzonukleazy i promowania inicjacji translacji.

Dlatego capping RNA jest niezbędnym krokiem w eksperymentach transfekcyjnych. Różnica w zmierzonej luminescencji między kulturami komórkowymi transfekowanymi transkryptami z czapeczką i bez czapeczki wyraźnie to potwierdza, a także pokazuje, że zarówno techniki cappingu przy użyciu analogu czapu, jak i przy użyciu enzymu cappingu krowianki z powodzeniem wytwarzają funkcjonalne transkrypty RNA z czapeczką. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak syntetyzować wysokiej jakości transkrypty RNA z czapeczką do użytku w transfekcji i innych różnych zastosowaniach.