Name: Metody in vitro Pomiary zwężenia tchawicy na myszach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę pomiaru kurczliwości mięśni gładkich tchawicy myszy za pomocą izolowanych pierścieni tchawiczych w układzie do pomiaru siły izometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta została sfinansowana z grantu przyznanego przez Center for Innovation in Prevention and Treatment of Airway Diseases, grantu NINDS (NS052574) oraz z Sandler Program for Asthma Research.

1. Wyposażenie
Główne elementy urządzenia do pomiaru skurczu przedstawiono schematycznie na Rysunku 2A).
<ol>
 <li>Kąpiel tkankowa. Kąpiel tkankowa utrzymuje natleniony roztwór fizjologiczny w podwyższonej temperaturze. W przypadku pierścieni tchawicy myszy stosujemy kąpiel tkankową o pojemności 10 ml, która posiada płaszcz wodny do cyrkulacji roztworu grzewczego, spiekaną szklaną dyszę do napowietrzania tlenem (mieszanina 95%/5% O2/CO2) oraz porty wlotowe i wylotowe do wymiany roztworów. Zapas roztworu PSS jest przechowywany z ciągłym bąbelkowaniem mieszaniny 95%/5% O2/CO2 w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C (nie pokazano). Podczas wymiany roztworu, PSS jest pompowany z rezerwuaru do wlotu kąpieli tkankowej (dolny port) z prędkością około 100 ml na minutę, aby umożliwić stosunkowo szybką wymianę. Wylot roztworu odbywa się przez port przelewowy (górny port), co pozwala na utrzymanie stałej objętości (~10 ml) w kąpieli tkankowej podczas wymiany. Do pompowania ciepłej wody przez płaszcz kąpieli tkankowej (w celu utrzymania 37 °C) używamy cyrkulatora grzewczego Haake. Kąpiele tkankowe można nabyć od wielu dostawców; występują w różnych rozmiarach i typach, aby dostosować się do potrzeb badawczych eksperymentatora. </li>
 <li>Przetwornik siły. Aby zmierzyć napięcie izometryczne, fragment tchawicy jest nawleczony na L-kształtne końce dwóch prętów ze stali nierdzewnej (Rycina 2A). Należy zadbać o użycie rodzaju stali nierdzewnej kompatybilnej z materiałem biologicznym. Górny pręt jest połączony za pomocą klipsa z izometrycznym przetwornikiem siły. Dolny pręt trzyma tchawicę w stałej pozycji i jest zamocowany na mikrometrze w celu regulacji napięcia pasywnego i/lub długości mięśnia. Skurcz tchawicy generuje napięcie na przetworniku siły, które jest przekształcane w sygnał napięciowy w przedwzmacniaczu. Dolny pręt może być również skonfigurowany tak, aby zawierać dwie prostokątne płytki platynowe (w odstępie 4 mm), które flankują tchawicę (Rycina 2B). Płytki platynowe są podłączone do stymulatora Grass S88, który umożliwia przyłożenie pola elektrycznego do tchawicy. Odsłonięte przewody i luty są pokryte Sylgardem (Sylgard 184 Silicone Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI), aby zapobiec wymywaniu metali do roztworu kąpieli.</li>
 <li>Przetwornik A/C, komputer i oprogramowanie do akwizycji danych. Sygnały z przedwzmacniaczy są rejestrowane w systemie MacLab 8 A/D. Jest to starsza wersja obecnie stosowanego sprzętu ADInstrument Powerlab. Używamy programu Chart (ADInstruments), który pozwala na ciągłe rejestrowanie napięcia przez cały czas trwania eksperymentu. Generowanie napięcia przez mięśnie tchawicy jest dość powolne, dlatego uznajemy, że akwizycja 100 punktów na sekundę jest wystarczająca. Pomiar napięcia jest kalibrowany za pomocą znanych ciężarków (do 5 g) przed każdym eksperymentem. Podobne systemy są dostępne u innych dostawców (np. BioPac, GW Instruments).</li>
</ol>
2. Izolacja tchawki
<ol>
 <li>Przed izolacją tkanki przetwornik siły jest kalibrowany za pomocą znanych odważników, a kąpiel tkankowa jest napełniana normalnym roztworem PSS (patrz Tabela I). Wlot powietrza jest regulowany w celu uzyskania lekkiego strumienia O2/CO2.</li>
 <li>Optymalne są tchawice z myszy w wieku dwóch miesięcy lub starszych. Można użyć młodszych zwierząt, ale tchawice pobrane od nich wymagają większej wprawy przy montażu na drutach przetwornika siły ze względu na ich niewielki rozmiar. Przed sekcją myszy są głęboko sedowane izofluranem. Odpowiedni poziom sedacji zostaje osiągnięty, gdy uciśnięcie palca pęsetą nie wywołuje reakcji. Myszy są natychmiast uśmiercane poprzez zwichnięcie szyi. Ważna uwaga: Zaobserwowaliśmy, że Avertin (tribromoetanol), środek sedatywny powszechnie stosowany u myszy, wykazuje silne działanie rozluźniające na mięśnie gładkie dróg oddechowych i dlatego nie powinien być stosowany w badaniach nad skurczem tchawicy.</li>
 <li>Skórę (i futro) usuwa się od klatki piersiowej do gardła. Żebra są przecinane od podstawy mostka, bocznie (po obu stronach), do górnej części serca. Następnie mostek i żebra są odciągane do przodu, w stronę gardła, aby odsłonić serce/płuca, grasicę, tchawicę (brzusznie) i przełyk (przylegający do tchawicy i znajdujący się grzbietowo względem niej).</li>
 <li>Tchawicę wycina się, przecinając ją poniżej rozwidlenia oskrzeli i powyżej gardła. Tchawicę umieszcza się w lodowatym, natlenionym (95/5) roztworze PSS (skład podany w Tabeli I).</li>
 <li>Tchawica jest oczyszczana z tkanek otaczających. Podczas czyszczenia tchawicę można trzymać za gardło lub poniżej rozwidlenia. Należy jednak zachować ostrożność, aby nie przykładam pęsety bezpośrednio do samej tchawicy. Do odcinania tkanek otaczających można użyć drobnych nożyczek, ale cięcie powinno być zawsze prowadzone równolegle do tchawicy, aby uniknąć uszkodzeń. Ta część procedury jest ułatwiona, jeśli preparat tchawicy zostanie przypięty poniżej rozwidlenia i powyżej gardła do naczynia powleczonego Sylgardem (Sylgard 184 Silicone Elastomer, Dow Corning Corp, Midland, MI).</li>
 <li>Po usunięciu tkanek otaczających tchawica jest przecinana poniżej gardła i powyżej rozwidlenia oskrzeli, a następnie delikatnie montowana na drutach przetwornika siły.</li>
 <li>Tchawica jest nawleczona na dwa metalowe trzpienie w kształcie litery L (Rysunek 2A). Jeden trzpień jest połączony z przetwornikiem siły i przemieszczenia do ciągłego rejestrowania napięcia izometrycznego. Drugi trzpień jest połączony z mikrometrem. Następnie podnosi się kąpiel tkankową tak, aby tchawica została zanurzona w PSS. Montaż tchawicy powinien być wykonany jak najszybciej, aby zminimalizować czas przebywania tchawicy poza roztworem PSS. Z praktyką montaż tchawicy można przeprowadzić w ciągu jednej minuty, jednak zazwyczaj unikamy przekraczania 3 minut, aby zapobiec utracie żywotności.</li>
 <li>Mikrometr jest powoli regulowany, aby uzyskać napięcie pasywne rzędu ~10 mN (~ 1 gram-siły). Optymalne napięcie spoczynkowe zostało określone empirycznie i stwierdzono, że napięcie pasywne ~ 5 - 10 mN skutkuje równoważną, maksymalną odpowiedzią na stymulację wysokim stężeniem potasu. Jest to zgodne z szeregiem innych badań, w których wykorzystano napięcie pasywne w tym zakresie16,17,18. W ciągu pierwszych 5-10 minut napięcie pasywne tchawicy ma tendencję do lekkiego spadku (zjawisko relaksacji naprężeń), a mikrometrem reguluje się napięcie pasywne do poziomu ~10 mN podczas equilibracji. Tchawicy pozwala się na equilibrację przez co najmniej 1 godzinę przed rozpoczęciem prób doświadczalnych.</li>
</ol>
3. Stymulacja wysokim stężeniem potasu
Po osiągnięciu stanu równowagi tchawicę poddaje się dwukrotnemu wyzwaniu za pomocą roztworu PSS z wysoką zawartością potasu (67 mM KCl, Tabela I). Skurcz zazwyczaj wymaga ~ 5-10 minut do osiągnięcia stanu stacjonarnego, po czym kąpiel tkankowa jest kilkukrotnie płukana normalnym roztworem PSS, aby całkowicie rozluźnić tchawicę. Skurcz wywołany potasem powtarza się po raz drugi, a w razie potrzeby trzeci, aż do uzyskania powtarzalnych skurczów.
4. Skurcz wywołany stymulacją elektryczną
Tchawica jest flankowana przez dwie prostokątne platynowe płytki (elektrody), które umożliwiają stymulację polem elektrycznym (EFS) preparatu. Odpowiedź skurczowa na EFS jest funkcją częstotliwości i napięcia. Wpływają na nią również parametry fizyczne, takie jak powierzchnia elektrod oraz odległość między nimi. Charakterystyka mocy stymulatora również wpływa na odpowiedzi w taki sposób, że przy wyższych napięciach i natężeniach prądu stymulator może osiągnąć swoje maksimum. Charakterystykę każdego systemu EFS należy określić poprzez badanie odpowiedzi skurczowych mięśni przy różnych czasach trwania bodźca, częstotliwościach, napięciach i czasach trwania impulsu. Dla naszej aparatury eksperymentalnej ustaliliśmy, że elektrody oddalone o ~ 4 mm, amplituda stymulacji 44 V (impulsy 0.5 ms) i częstotliwość 30 Hz są optymalne dla uzyskania powtarzalnych, bliskich maksymalnym odpowiedzi skurczowych.
5. Skurcz wywołany stymulacją cholinergiciczną
Reaktywność tchawicy na egzogennie podane związki ocenia się albo poprzez dodanie pojedynczej dawki badanego leku, albo poprzez wielokrotne dodawanie leku w sposób kumulatywny. W przypadku tchawicy w naszym laboratorium rutynowo stosowano karbachol do aktywacji receptorów cholinergicznych, ponieważ w przeciwieństwie do acetylocholiny, karbachol nie jest degradowany przez acetylocholinoesterazę. Właściwy zakres dawka-odpowiedź obejmuje stężenia karbacholu od 10-8 do 10-5 M. Dopasowanie krzywej Log[karbachol]-odpowiedź skurczowa za pomocą równania typu Hilla pozwala na oszacowanie EC50 (połowicznego maksymalnego stężenia efektywnego), które jest miarą wrażliwości skurczu tchawicy na agonistę cholinergiczny 19. Warto zauważyć, że dana dawka karbacholu wywoła nieco silniejszą odpowiedź jako dawka pojedyncza niż jako element kumulatywnej krzywej dawka-odpowiedź.
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład odpowiedzi skurczowej na wysokie stężenie potasu przedstawiono na Ryc. 3A. Skurcz osiąga maksimum w ciągu około 10 minut, po czym może nastąpić niewielki spadek. Podczas początkowego wypłukiwania wysokiego stężenia potasu mięsień może wykazać przejściowy wzrost skurczu, co wynika ze spadku temperatury w momencie, gdy niewielka objętość niepodgrzanego roztworu PSS w liniach doprowadzających przejściowo przepływa przez preparat. Można to zminimalizować, ograniczając objętość martwą w rurkach łączących podgrzewany zbiornik z PSS z kąpielą tkankową, a także poprzez stosunkowo szybką wymianę roztworu (zazwyczaj pompujemy roztwory z prędkością 100 ml/min). Każdy preparat będzie wykazywał pewne różnice w odpowiedzi skurczowej ze względu na różnice w masie mięśnia lub uszkodzenia powstałe podczas sekcji. Ryc. 3B przedstawia dwie tchawice o różnej masie mięśniowej poddane działaniu wysokiego stężenia potasu oraz karbacholu. Chociaż skurcze wywołane cholinergicnie różnią się od siebie, są one zbliżone po normalizacji do odpowiedzi na roztwór z wysokim stężeniem potasu (Ryc. 3C).
Rysunek 4 przedstawia przykład skurczu wywołanego karbacholem (cholinergicznym) przy zastosowaniu pojedynczych dawek (A) oraz kumulatywnego zwiększania dawki (B). Roztwory karbacholu są dodawane bezpośrednio do kąpieli, a wprowadzany gaz pomaga w szybkim mieszaniu. Warto zauważyć, że dodanie pojedynczej dawki (tj. 1 μM, Rysunek 4A) wywołuje nieco silniejszą odpowiedź niż równoważne stężenie podczas kumulatywnej krzywej dawka-odpowiedź (1 μM, Rysunek 4B). Rysunek 4C przedstawia wykres siły skurczu w funkcji stężeń karbacholu na podstawie danych z Rysunku 4B. Efekty działania karbacholu nasycają się przy stężeniu 10-5 M. Chociaż agoniści cholinergiczni inicjują skurcz poprzez mechanizmy uwalniania wapnia, istotna część skurczu jest również pośredniczona przez depolaryzację i aktywację napięciowo-zależnych kanałów wapniowych 20.
Rycina 5A przedstawia przykład skurczów wywołanych przez EFS. Tchawice są stymulowane impulsami o czasie trwania 0,5 ms i napięciu 40 V, aż skurcze osiągną plateau (patrz wstawka a1). Zwiększenie częstotliwości stymulacji powoduje wzrost odpowiedzi skurczowej (krzywa zależność odpowiedzi od częstotliwości przedstawiona jest na Rycynie 5B). Wykazano, że stymulacja polem elektrycznym wywołuje skurcze głównie poprzez aktywację nerwów presynaptycznych. Świadczy o tym efekt toksyny botulinowej, blokera uwalniania neuroprzekaźników, która hamuje większość skurczów tchawicy wywołanych przez EFS 21. Ponadto tetrodotoksyna, środek blokujący kanały Na+, również hamuje aktywność nerwową i eliminuje odpowiedź tchawicy na EFS.
<img alt="Schemat depolaryzacji komórki z napływem Ca, cAMP, ACH; przedstawia sygnalizację w neuronach cholergicznych." src="/files/ftp_upload/3703/3703fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat głównych szlaków sygnalizacyjnych w preparacie izolowanej tchawicy. Przedstawiono zakończenie aksonu cholergicznego unerwiającego komórkę mięśni gładkich tchawicy. Główne szlaki sygnalizacyjne to aktywacja muskarynowych receptorów acetylocholiny (mACHR) typu M3 i M2, które powodują uwalnianie wapnia poprzez receptory IP3 (M3) oraz redukcję cAMP (M2). Receptory M2 (przy częściowym udziale receptorów M3) powodują również wywołaną cholergicznie depolaryzację, która aktywuje napięciozależne kanały wapniowe typu L i napływ wapnia. Typowe czynniki skurczowe i ich efektory to: 1. wysokie stężenie potasu (depolaryzuje komórkę mięśni gładkich i akson cholergiczny), 2. stymulacja polem elektrycznym (EFS, depolaryzuje akson cholergiczny) oraz 3. egzogenna aplikacja czynników cholergicznych, takich jak acetylocholina lub karbachol (bezpośrednio aktywuje receptory muskarynowe).
<img alt="Układ kąpieli tkankowej, przetwornik siły, eksperyment na tchawicy, schemat, pomiar siły mechanicznej." src="/files/ftp_upload/3703/3703fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Schemat aparatury użytej do pomiaru skurczów tchawicy. A. Przetwornik siły, mikrometr i kąpiel tkankowa są zamocowane na prętach wspierających za pomocą zacisków śrubowych. Pierścień tchawiczy jest nawleczony na górny i dolny pręt. Na schemacie kąpiel tkankowa znajduje się poniżej preparatu (tj. podczas montażu tchawicy na przetworniku siły). Podczas badań nad skurczami kąpiel tkankowa jest przemieszczana pionowo, aby obmywać preparat. B. W celu stymulacji polem elektrycznym dolny pręt został zmodyfikowany poprzez dodanie dwóch platynowych płytek, które są zamontowane bocznie do drutu podtrzymującego tchawicę. Płytki platynowe są połączone przewodami elektrycznymi ze stymulatorem.
<img alt="Wykres skurczu mięśni; przedstawia siłę w funkcji czasu pod wpływem stymulacji wysokim stężeniem K* i CCh; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3703/3703fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Przykłady odpowiedzi skurczowej tchawicy na wysokie stężenie potasu (67 mM). (A) pokazuje powtarzalne, zduplikowane odpowiedzi na wysokie stężenie potasu. (B) Przykłady odpowiedzi skurczowej na karbachol w dwóch różnych tchawicach. (C) Odpowiedzi tchawic z punktu B są podobne po normalizacji do odpowiedzi na wysokie stężenie potasu.
<img alt="Wykresy analizy siły skurczu cholergicznego w odpowiedzi na dawkowanie CCh, wizualizacja danych eksperymentalnych." src="/files/ftp_upload/3703/3703fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przykłady skurczów indukowanych karbacholem. (A) Skurcze indukowane karbacholem przy zastosowaniu pojedynczych dawek, po których nastąpiło wypłukanie. (B) Przykład kumulatywnej krzywej zależności odpowiedzi od dawki dla tchawicy z punktu A. (C) Szczytowe skurcze z punktu B przedstawione jako funkcja stężenia karbacholu.
<img alt="Wykres przedstawiający siłę skurczu w funkcji częstotliwości stymulacji; analiza odpowiedzi mięśniowej; wynik naukowy." src="/files/ftp_upload/3703/3703fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Przykłady skurczów wywołanych stymulacją polem elektrycznym. (A) Stymulacja polem elektrycznym skurczu tchawicy przy użyciu impulsu 0,5 ms, napięcia 40 V i różnych częstotliwości stymulacji zgodnie z oznaczeniem. Wstawka przedstawia powiększenie czasowe skurczu przy 30 Hz. (B) Szczytowe skurcze z części A przedstawione jako funkcja częstotliwości stymulacji.
Normalny PSS
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Sól</td>
 <td>Stężenie (mM)</td>
 <td>Ilość (g/2 L)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>119</td>
 <td>13.91</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>4.7</td>
 <td>0.7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KH2PO4</td>
 <td>1.18</td>
 <td>0.32</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MgSO4 x 7H2O</td>
 <td>1.17</td>
 <td>0.58</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaHCO3</td>
 <td>18</td>
 <td>3.02</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA</td>
 <td>0.026</td>
 <td>0.1 ml 0.5 M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Glukoza</td>
 <td>11</td>
 <td>3.96</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Saharoza</td>
 <td>12.5</td>
 <td>8.56</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CaCl2</td>
 <td>2</td>
 <td>400 ml 10 mM</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Wysokie stężenie K+ PSS (regulacja NaCl i KCl)
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Sól</td>
 <td>Stężenie (mM)</td>
 <td>Ilość (g/2 L)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NaCl</td>
 <td>56.7</td>
 <td>6.628</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>KCl</td>
 <td>67</td>
 <td>9.991</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Skład roztworów PSS. Uwaga: Roztwory są przygotowywane na bieżąco co tydzień, przy użyciu wody ultraczystej, i przechowywane w lodówce nie dłużej niż przez 5 dni, aby uniknąć zanieczyszczenia wzrostu.

<ol><li>Lloyd, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+better+mouse+models+of+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Allergy+Asthma+Rep%22%5BJournal%5D)">Building better mouse models of asthma.</a> Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 231-236 (2007).</li>
<li>Hausding, M., Sauer, K., Maxeiner, J. H., Finotto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+models+in+allergic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Transgenic models in allergic responses.</a> Curr. Drug Targets. 9, 503-510 (2008).</li>
<li>Eglen, R. M., Hegde, S. S., Watson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptor+subtypes+and+smooth+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptor subtypes and smooth muscle function.</a> Pharmacol Rev. 48, 531-565 (1996).</li>
<li>Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contractile+role+of+M2+and+M3+muscarinic+receptors+in+gastrointestinal%2C+airway+and+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in gastrointestinal, airway and urinary bladder smooth muscle.</a> Life Sci. 74, 355-366 (2003).</li>
<li>Hall, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+messengers%2C+ion+channels+and+pharmacology+of+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Second messengers, ion channels and pharmacology of airway smooth muscle.</a> Eur. Respir. J. 15, 1120-1127 (2000).</li>
<li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li>
<li>Ehlert, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+analysis+of+the+contractile+role+of+M2+and+M3+muscarinic+receptors+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Receptors+Channels%22%5BJournal%5D)">Pharmacological analysis of the contractile role of M2 and M3 muscarinic receptors in smooth muscle.</a> Receptors Channels. 9, 261-277 (2003).</li>
<li>Sankary, R. M., Jones, C. A., Madison, J. M., Brown, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+cholinergic+inhibition+of+cyclic+AMP+accumulation+in+airway+smooth+muscle.+Role+of+a+pertussis+toxin-sensitive+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir+Dis%22%5BJournal%5D)">Muscarinic cholinergic inhibition of cyclic AMP accumulation in airway smooth muscle. Role of a pertussis toxin-sensitive protein.</a> Am. Rev. Respir Dis. 138, 145-150 (1988).</li>
<li>Widdop, S., Daykin, K., Hall, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+muscarinic+M2+receptors+in+cultured+human+airway+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of muscarinic M2 receptors in cultured human airway smooth muscle cells.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 9, 541-546 (1993).</li>
<li>Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+movements%2C+distribution%2C+and+functions+in+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Calcium movements, distribution, and functions in smooth muscle.</a> Pharmacol. Rev. 49, 157-230 (1997).</li>
<li>Somlyo, A. V., Somlyo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electromechanical+and+pharmacomechanical+coupling+in+vascular+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Electromechanical and pharmacomechanical coupling in vascular smooth muscle.</a> J. Pharmacol Exp. Ther. 159, 129-145 (1968).</li>
<li>Fryer, A. D., Jacoby, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+receptors+and+control+of+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Muscarinic receptors and control of airway smooth muscle.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 158, 154-160 (1998).</li>
<li>Fernandez-Rodriguez, S., Broadley, K. J., Ford, W. R., Kidd, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+muscarinic+receptor+activity+of+airway+smooth+muscle+isolated+from+a+mouse+model+of+allergic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased muscarinic receptor activity of airway smooth muscle isolated from a mouse model of allergic asthma.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 23, 300-307 (2010).</li>
<li>Garssen, J., Loveren, H. V. an, Van Der Vliet, H., Nijkamp, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+isometric+method+to+study+respiratory+smooth+muscle+responses+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Methods%22%5BJournal%5D)">An isometric method to study respiratory smooth muscle responses in mice.</a> J. Pharmacol. Methods. 24, 209-217 (1990).</li>
<li>Vass, G., Horvath, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+and+adenosine+receptors+in+the+pathomechanism+and+treatment+of+respiratory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adenosine and adenosine receptors in the pathomechanism and treatment of respiratory diseases.</a> Curr. Med. Chem. 15, 917-922 (2008).</li>
<li>Borchers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methacholine-induced+airway+hyperresponsiveness+is+dependent+on+Galphaq+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Methacholine-induced airway hyperresponsiveness is dependent on Galphaq signaling.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 285, 114-120 (2003).</li>
<li>Sausbier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+rather+than+enhanced+cholinergic+airway+constriction+in+mice+with+ablation+of+the+large+conductance+Ca2%2B-activated+K%2B+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb.+J%22%5BJournal%5D)">Reduced rather than enhanced cholinergic airway constriction in mice with ablation of the large conductance Ca2+-activated K+ channel.</a> Faseb. J. 21, 812-822 (2007).</li>
<li>Scheerens, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+topical+exposure+to+toluene+diisocyanate+in+mice+leads+to+antibody+production+and+in+vivo+airway+hyperresponsiveness+three+hours+after+intranasal+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Long-term topical exposure to toluene diisocyanate in mice leads to antibody production and in vivo airway hyperresponsiveness three hours after intranasal challenge.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 1074-1080 (1999).</li>
<li>Kenakin, T. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKenakin%2C+TP+%22A+pharmacology+primer+%3A+theory%2C+applications%2C+and+methods%22">A pharmacology primer : theory, applications, and methods</a>. , 3rd edn, Academic Press/Elsevier. (2009).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+Channel+%7Bbeta%7D1+Subunits+Regulate+Airway+Contraction+Secondary+to+M2+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Mediated+Depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK Channel {beta}1 Subunits Regulate Airway Contraction Secondary to M2 Muscarinic Acetylcholine Receptor Mediated Depolarization.</a> J. Physiol. , 1803-1817 (2011).</li>
<li>Moffatt, J. D., Cocks, T. M., Page, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+epithelium+and+acetylcholine+in+mediating+the+contraction+to+5-hydroxytryptamine+in+the+mouse+isolated+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of the epithelium and acetylcholine in mediating the contraction to 5-hydroxytryptamine in the mouse isolated trachea.</a> Br. J. Pharmacol. 141, 1159-1166 (2004).</li>
<li>Bachar, O., Adner, M., Uddman, R., Cardell, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+enhances+cholinergic+innervation+and+contractile+response+to+electric+field+stimulation+in+a+murine+in+vitro+model+of+chronic+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor enhances cholinergic innervation and contractile response to electric field stimulation in a murine in vitro model of chronic asthma.</a> Clin. Exp. Allergy. 34, 1137-1145 (2004).</li>
<li>Weigand, L. A., Myers, A. C., Meeker, S., Undem, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-cholinergic+nerve+interaction+in+mouse+airways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mast cell-cholinergic nerve interaction in mouse airways.</a> J. Physiol. 587, 3355-3362 (2009).</li>
<li>Kao, J., Fortner, C. N., Liu, L. H., Shull, G. E., Paul, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ablation+of+the+SERCA3+gene+alters+epithelium-dependent+relaxation+in+mouse+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ablation of the SERCA3 gene alters epithelium-dependent relaxation in mouse tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. 277, 264-270 (1999).</li>
<li>Krane, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin+5-deficient+mouse+lungs+are+hyperresponsive+to+cholinergic+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Aquaporin 5-deficient mouse lungs are hyperresponsive to cholinergic stimulation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 14114-14119 (2001).</li>
<li>Semenov, I., Wang, B., Herlihy, J. T., Brenner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BK+channel+beta1-subunit+regulation+of+calcium+handling+and+constriction+in+tracheal+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">BK channel beta1-subunit regulation of calcium handling and constriction in tracheal smooth muscle.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell Mol. Physiol. 291, L802-L810 (2006).</li>
<li>Fortner, C. N., Breyer, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EP2+receptors+mediate+airway+relaxation+to+substance+P+ATP%2C+and+PGE2%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">EP2 receptors mediate airway relaxation to substance P ATP, and PGE2.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 281, 469-474 (2001).</li>
<li>Hay, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+endothelin+ligand-induced+contraction+in+isolated+tracheae+from+endothelin+B+%28ET%28B%29%29+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of endothelin ligand-induced contraction in isolated tracheae from endothelin B (ET(B)) receptor knockout mice.</a> Br. J. Pharmacol. 132, 1905-1915 (2001).</li>
<li>Stengel, P. W., Yamada, M., Wess, J., Cohen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%283%29-receptor+knockout+mice%3A+muscarinic+receptor+function+in+atria%2C+stomach+fundus%2C+urinary+bladder%2C+and+trachea%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">M(3)-receptor knockout mice: muscarinic receptor function in atria, stomach fundus, urinary bladder, and trachea.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp Physiol. 282, R1443-R1449 (2002).</li>
<li>Trevisani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+in+vitro+expression+of+B1+receptor+in+the+mouse+trachea+and+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Evidence for in vitro expression of B1 receptor in the mouse trachea and urinary bladder.</a> Br. J. Pharmacol. 126, 1293-1300 (1038).</li>
<li>Mehats, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDE4D+plays+a+critical+role+in+the+control+of+airway+smooth+muscle+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">PDE4D plays a critical role in the control of airway smooth muscle contraction.</a> FASEB J. 17, 1831-1841 (2003).</li>
<li>Kumar, R. K., Herbert, C., Foster, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22classical%22+ovalbumin+challenge+model+of+asthma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The "classical" ovalbumin challenge model of asthma in mice.</a> Curr. Drug Targets. 9, 485-494 (2008).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Przedstawiony tutaj protokół opisuje przygotowanie fizjologiczne służące do oceny funkcji mięśni dróg oddechowych. Zazwyczaj jednocześnie obsługujemy 3-4 układy kąpieli organowych, jednak od wielu dostawców dostępne są gotowe systemy umożliwiające jednoczesny pomiar do 8 preparatów (ADInstruments, World Precision Instruments oraz Harvard Apparatus). Wykorzystaliśmy szereg przetworników siły i kąpieli organowych, uzyskując porównywalne wyniki. Stwierdziliśmy jednak, że stymulacja polem elektrycznym wykazuje pewną zmiennoś...

<table><tbody><tr><td>Przetwornik analogowo-cyfrowy</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/products/pl3504#overview" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td>PowerLab 4/35</td><td></td></tr><tr><td>Karbachol (chlorek karbamoilocholiny)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4832</td><td>10&lt;sup&gt;-2&lt;/sup&gt; M w wodzie (alikwoty można przechowywać w -20 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do rejestracji danych</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/products/software/labchart-pro" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstrtuments</a></td><td>LabChart</td><td></td></tr><tr><td>Cyrkulator grzewczy</td><td>Haake</td><td>Mixer Mill MM400</td><td></td></tr><tr><td>Izometryczny przetwornik siły</td><td>Kent Scientific</td><td>TRN001</td><td></td></tr><tr><td>Stymulator</td><td>Grass Technologies</td><td>S88 Dual Output Square Pulse Stimulator</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel tkankowa</td><td>WPI</td><td>47264</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

In vitro Measurements of Tracheal Constriction Using Mice

Myszy transgeniczne i knockout stanowią potężne narzędzia w badaniu fizjologii i patofizjologii dróg oddechowych1,2. Tensometria in vitro izolowanych preparatów tchawicy okazała się użytecznym testem odpowiedzi skurczowej mięśni gładkich dróg oddechowych (ASM) u myszy modyfikowanych genetycznie. Te preparaty tchawicy in vitro są stosunkowo proste, zapewniają silną odpowiedź i zachowują zarówno funkcjonalne cholinergiczne zakończenia nerwowe, jak i reakcje mięśniowe, nawet po długiej inkubacji.
Tensometria tchawicy zapewnia również funkcjonalny test do badania różnych szlaków sygnalizacyjnych wtórnych przekaźników, które wpływają na skurcz mięśni gładkich. Skurcz w tchawicy jest pośredniczony głównie przez przywspółczulne nerwy cholinergiczne, które uwalniają acetylocholinę na ASM (Rycina 1). Głównymi receptorami acetylocholiny w ASM są receptory muskarynowe M2 i M3, które są odpowiednio receptorami sprzężonymi z Gi/o i Gq3,4,5. Receptory M3 wywołują skurcz poprzez sprzężenie z Gq w celu aktywacji fosfolipazy C, zwiększenia produkcji IP3 oraz zależnego od IP3 uwalniania wapnia z siateczki sarkoplazmatycznej3,6,7. Uważa się, że sygnalizacja M2/Gi/o nasila skurcze poprzez hamowanie cyklazy adenylanowej, co prowadzi do obniżenia poziomu cAMP5,8,9,10. Szlaki te stanowią tak zwane „sprzężenie farmako-skurczowe” mięśni gładkich dróg oddechowych11. Dodatkowo sygnalizacja cholinergiczna poprzez receptory M2 (modulowana przez sygnalizację M3) obejmuje szlaki, które depolaryzują ASM, co z kolei aktywuje wapniowe kanały typu L zależne od napięcia (Rycina 1) i napływ wapnia (tzw. „sprzężenie wzbudzenie-skurcz”)4,7. Bardziej szczegółowe przeglądy szlaków sygnalizacyjnych kontrolujących skurcz dróg oddechowych można znaleźć w literaturze4,12. Powyższe szlaki wydają się być zachowane u myszy i innych gatunków. Jednak tchawice myszy różnią się od innych gatunków w niektórych szlakach sygnalizacyjnych. Najbardziej prominentny jest brak odpowiedzi skurczowej na histaminę i adenozynę13,14, które są dobrze znanymi modulatorami ASM u ludzi i innych gatunków5,15.
W niniejszej pracy przedstawiamy protokoły izolacji pierścieni tchawicy mysiej oraz pomiaru ich zdolności skurczowej in vitro. Zawarto opisy konfiguracji sprzętu, izolacji pierścieni tchawicy oraz pomiarów skurczowych. Przedstawiono przykłady wywoływania skurczów pośrednio za pomocą stymulacji nerwów wysokim stężeniem potasu oraz bezpośrednio poprzez depolaryzację mięśni ASM w celu aktywacji napięciowo zależnego napływu wapnia (1. wysokie K+, Rysunek 1). Dodatkowo zaprezentowano metody stymulacji samych nerwów z wykorzystaniem stymulacji polem elektrycznym (2. EFS, Rysunek 1) lub bezpośredniej stymulacji mięśni ASM przy użyciu egzogennego neurotransmitera dodanego do kąpieli (3. egzogenny ACH, Rysunek 1). Ta elastyczność i łatwość przygotowania sprawiają, że model izolowanego pierścienia tchawicy jest niezawodnym i funkcjonalnym testem dla wielu kaskad sygnalizacyjnych uczestniczących w skurczu mięśni gładkich dróg oddechowych.

Myszy transgeniczne okazały się niezwykle użyteczne w przypisywaniu funkcji fizjologicznych konkretnym genom. W związku z tym badania ogólne, a w szczególności studia funkcjonalne dróg oddechowych, przeszły znaczący zwrot w stronę modeli mysich. W niniejszym materiale przedstawiamy protokoły badań skurczu tchawicy in vitro w celu oceny funkcji mięśni gładkich w drogach oddechowych myszy.

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

Myszy transgeniczne i z nokautem genów stały się potężnymi narzędziami w badaniach nad fizjologią i patofizjologią dróg oddechowych1,2. Tensometria in vitro ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest pomiar kurczliwości mięśni gładkich tchawki myszy. Jest to realizowane poprzez przygotowanie kąpieli tkankowych i kalibrację izometrycznego przetwornika siły, a następnie wyizolowanie tchawki myszy i zamocowanie jej na prętach przetwornika siły.Następnie stymuluje się tchawicę, a powstałe napięcie jest mierzone i analizowane. Ostatecznie wyniki mogą wykazać kurczliwość mięśni tchawicy poprzez pomiary siły izometrycznej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak pomiary oporu dróg oddechowych in vivo, jest to, że pomiary napięcia in vitro stanowią bardziej bezpośredni test kurczliwości mięśni gładkich.Wadą tej techniki jest to, że jest to preparat w kąpieli organowej, w związku z czym czynniki krążące, które mogą wpływać na kurczliwość mięśni gładkich in vivo, mogą być nieobecne w preparacie in vitro. Chociaż metoda ta pozwala na uzyskanie informacji o mięśniach gładkich tchawicy myszy, można ją również zastosować do innych tkanek mięśni gładkich, takich jak duże naczynia, różne odcinki jelit oraz mięśnie gładkie pęcherza moczowego, o ile preparaty pierścieniowe mięśni są wystarczająco duże, aby można było je zamocować na drutach przetwornika siły.Dwa elementy urządzenia do pomiaru skurczu wymagają tutaj opisu: kąpiel tkankowa oraz przetwornik siły. Kąpiel tkankowa utrzymuje napowietrzony roztwór fizjologiczny w wysokiej temperaturze dla pierścieni tchawicy myszy. Stosowana jest kąpiel tkankowa o pojemności 10 ml, wyposażona w płaszcz wodny do podgrzewania, szklany wlot do napowietrzania tlenem oraz otwory wlotowe i wylotowe do wymiany roztworów przechowywanych oddzielnie.Do wymiany roztworów wykorzystuje się zbiornik z roztworem PSS napowietrzanym tlenem i utrzymywanym w temperaturze 37 °C za pomocą kąpieli wodnej. Roztwór PSS jest pompowany ze zbiornika do wlotu komory tkankowej z przepływem około 100 mL/min. Jednocześnie podgrzewająca pompa cyrkulacyjna tłoczy wodę o temperaturze 37 °C przez płaszcz komory tkankowej.Drugim istotnym elementem wyposażenia jest przetwornik siły. Jest on wykorzystywany do pomiaru napięcia izometrycznego w tchawicy. Rurkę tchawicy nawleka się na L-kształtne końcówki dwóch prętów wykonanych z materiału biokompatybilnego, takiego jak stal nierdzewna.Górna pręt jest połączony za pomocą klipsa z izometrycznym przetwornikiem siły. Dolny pręt utrzymuje tchawicę w stałej pozycji i jest zamontowany na mikrometrze służącym do regulacji napięcia pasywnego lub długości mięśnia. Skurcz tchawicy generuje napięcie na przetworniku siły, które jest przekształcane w sygnał napięciowy w przedwzmacniaczu do stymulacji elektrycznej.Dolny pręt wyposażono w dwie prostokątne płytki platynowe umieszczone w odległości czterech milimetrów od siebie, tak aby flankowały tchawicę. Płytki platynowe są podłączone przewodami do konwencjonalnego stymulatora, takiego jak grass S 88.W tym przygotowaniu odsłonięte przewody muszą zostać przylutowane i pokryte izolacją w celu zapobiegania wymywaniu metali do roztworu kąpieli. Dodatkowe wyposażenie obejmuje komputer z przetwornikiem analogowo-cyfrowym oraz oprogramowanie do akwizycji danych. Sygnały z przedwzmacniaczy są rejestrowane w systemie Mac Lab eight ad.Przed rozpoczęciem izolacji tkanki kąpiel tkankowa musi zostać napełniona standardowym roztworem PSS, a wlot powietrza musi zostać wyregulowany w celu uzyskania lekkiego strumienia tlenu. Należy również skalibrować przetworniki siły, montując znane obciążenia na przewodach przetwornika i odpowiednio kalibrując oprogramowanie do akwizycji danych.Użyj myszy w wieku co najmniej dwóch miesięcy, ponieważ mniejsze tchawice młodszych osobników są trudniejsze do wypreparowania i zamontowania. Zaobserwowaliśmy, że triolol, środek uspokajający powszechnie stosowany u myszy, wykazuje silne działanie rozluźniające na mięśnie gładkie górnych dróg oddechowych, w związku z czym nie należy go stosować w badaniach nad skurczem tchawicy. Po wyizolowaniu tchawicy umieść ją w naczyniu powleczonym agarozą, zawierającym lodowaty, napowietrzony roztwór PSS.Przytwierdź tchawicę do szalki poniżej rozwidlenia i powyżej gardła, korzystając z mikroskopu stereoskopowego. Usuń otaczające tkanki za pomocą pęsety. Trzymaj tchawicę w obrębie gardła lub poniżej rozwidlenia, unikając bezpośredniego przykładania pęsety do samej tchawicy.Podobnie, podczas wycinania tkanek, należy prowadzić cięcie równolegle do tchawicy po uprzednim usunięciu tkanek otaczających. Przetnij tchawicę prostopadle poniżej gardła i powyżej rozwidlenia tchawicy. Teraz można zamocować tchawicę do urządzenia.Montaż tchawicy należy przeprowadzić tak szybko, jak to możliwe, aby zminimalizować czas przebywania tkanki poza PSS; ostrożnie, lecz szybko nasuń tchawicę na dwa metalowe pręty w kształcie litery L. Następnie szybko podnieś wannę tkankową, aby zanurzyć tchawicę w ciepłym PSS. Po ponownym umieszczeniu tchawicy w PSS powoli dostosuj mikrometr, aby uzyskać napięcie pasywne na poziomie około pięciu do 10 millinewtonów lub od pół grama do jednego grama siły.Jest to optymalne napięcie spoczynkowe w ciągu kolejnych pięciu do 10 minut. Napięcie będzie spadać, dlatego należy kontynuować regulację w celu utrzymania pożądanego napięcia, aż do jego stabilizacji. Po ustabilizowaniu napięcia należy pozwolić tchawicy na equilibrację przez co najmniej jedną godzinę przed eksperymentalnym wywołaniem skurczów.Po osiągnięciu równowagi można wywołać skurcze za pomocą potasu, stymulacji polem elektrycznym lub wybranych leków. Aby zastosować stymulację potasem, należy poddać tchawicę działaniu roztworu PSS o wysokim stężeniu potasu. Zazwyczaj po 5–10 minutach skurcze osiągają stan stacjonarny; w tym momencie należy kilkukrotnie przepłukać kąpiel zwykłym roztworem PSS, aby całkowicie rozluźnić tchawicę.Następnie należy powtarzać powrót do roztworu PSS z wysoką zawartością potasu. Do momentu uzyskania powtarzalnych skurczów zazwyczaj nie potrzeba więcej niż trzech kąpieli. Stymulacja polem elektrycznym jest dostarczana za pomocą platynowych płytek flankujących tchawicę.Odpowiedź skurczowa zależy od powierzchni elektrod oraz odległości między nimi. Ze względu na charakterystykę mocy stymulatora, wyjściowe natężenia prądu osiągają maksimum przy wyższych napięciach. Odpowiedź bliską maksymalnej można uzyskać, stosując impulsy o czasie trwania 0.5 millisecond lub napięcie 44 volts przy częstotliwości 30 hertz.Wartość ta będzie się jednak różnić w zależności od układu i powinna zostać określona empirycznie. Układ ten pozwala również na pomiar odpowiedzi tchawicy na lek podany egzogennie. Możliwa jest ocena wpływu roztworu kąpieli, pojedynczych dawek leku lub wielokrotnych dodatków leku podawanych w sposób kumulatywny.Na przykład do aktywacji receptorów cholinergicznych można wykorzystać karbachol. W przeciwieństwie do acetylocholiny nie jest on degradowany przez acetylocholinoesterazę i wywołuje bardziej stabilną odpowiedź. Dopasowanie wyników do logarytmicznej krzywej odpowiedzi za pomocą równania typu Hilla pozwala na oszacowanie połowowej maksymalnej stężenia efektywnego lub C 50.Preparat tchawicy stymulowano kąpielą z wysokim stężeniem potasu. Skurcz osiągnął maksimum w ciągu około 10 minut. Podczas początkowego wypłukiwania wysokiego stężenia potasu w mięśniu zaobserwowano przejściowy wzrost skurczu spowodowany spadkiem temperatury.Przygotowanie przemyto przejściowo niewielką objętością niepodgrzanego roztworu PSS w liniach doprowadzających. Następnie dwie tchawice o różnej masie mięśniowej poddano stymulacji wysokim stężeniem potasu oraz karbacholem.Mimo że skurcze wywołane środkami cholinergicznymi różniły się między sobą, stały się one podobne po normalizacji do odpowiedzi na roztwór z wysokim stężeniem potasu. Następnie do wywołania skurczu za pomocą pojedynczych dawek oraz zwiększania kumulacyjnego zastosowano karbachol. Roztwory OL dodawano bezpośrednio do kąpieli.Warto zauważyć, że podanie pojedynczej dawki wywołało nieco silniejszą odpowiedź niż równoważne stężenie podczas kumulacyjnej krzywej dawka-odpowiedź. Wykreślenie siły skurczu w funkcji stężeń karbacholu wykazało, że efekty karbacholu nasycają się przy 10⁻⁵ M. Tchawice poddano EFS, stosując impulsy o długości 0,5 ms i napięciu 40 V, aż do momentu osiągnięcia plateau skurczów. Zwiększenie częstotliwości stymulacji spowodowało wzrost odpowiedzi skurczowej.Może to wynikać z faktu, że wykazano, iż EFS wywołuje skurcze głównie poprzez aktywację nerwów presynaptycznych. Na przykład toksyna botulinowa blokuje większość skurczów tchawicy wywołanych przez EFS. Ponadto tetrodotoksyna hamuje aktywność nerwową i eliminuje reakcję tchawicy na EFS.Po opanowaniu, technikę tę można wykonać w około półtorej godziny, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Jednak w eksperymentach z wykorzystaniem klocków organowych tchawice pozostają żywotne przez wiele godzin. Zbędne.

in-vitro-measurements-of-tracheal-constriction-using-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

In vitro pomiary zwężenia tchawicy u myszy

Wielokrotne pomiary fizjologii układu oddechowego gryzoni oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych są pożądane, lecz zazwyczaj niewykonalne. W niniejszym materiale opisujemy powtarzalną metodę intubacji doustnej myszy, która umożliwia wielokrotne pomiary nadreaktywności dróg oddechowych oraz pobieranie próbek komórek zapalnych dróg oddechowych.

Odwracalna, nieinwazyjna metoda pomiaru oporu dróg oddechowych i pobierania płynu z płukania pęcherzykowo-oskrzelowego u myszy

Poprzeczne zwężenie aorty (TAC) u myszy jest powszechnie stosowanym modelem eksperymentalnym do badania mechanizmów leżących u podstaw przerostu mięśnia sercowego i rozwoju niewydolności serca. W niniejszym materiale opisujemy procedury zwężania aorty w celu wywołania powtarzalnego stopnia przerostu serca u myszy.

Poprzeczne zwężenie aorty u myszy

Opracowaliśmy prostą, niezawodną i stosunkowo tanią metodę intubacji dotchawiczej u myszy za pomocą bezpośredniej laryngoskopii przy użyciu otoskopu z wziernikiem 2,0 mm. Technika ta jest atraumatyczna i może być stosowana do powtarzania pomiarów w przewlekłych eksperymentach. Uważamy, że jest lepsza od tracheostomii lub wcześniej opisanych technik niechirurgicznych.

Intubacja dotchawicza u myszy za pomocą laryngoskopii bezpośredniej przy użyciu otoskopu

Ten artykuł opisuje szybką i efektywną metodę intubacji myszy do pomiarów funkcji płuc lub wkraplania płuc, która pozwala myszom na regenerację i badanie w późniejszym czasie.  Zabieg polega na niedrogim światłowodowym źródle światła, które bezpośrednio oświetla tchawicę.

Prosta metoda intubacji płuc myszy

Glikokaliks śródbłonka/warstwa powierzchniowa śródbłonka jest idealnie badana za pomocą mikroskopii przyżyciowej.  Mikroskopia przyżyciowa jest technicznie trudna w przypadku poruszającego się narządu, takiego jak płuca.   Pokazujemy, w jaki sposób można wykorzystać jednoczesną mikroskopię jasnego pola i mikroskopię fluorescencyjną do oszacowania grubości warstwy powierzchniowej śródbłonka w swobodnie poruszającym się płucu myszy in vivo.

In vivo (in vivo) Pomiar warstwy powierzchniowej śródbłonka płucnego myszy

Celem tego protokołu jest dostarczenie zautomatyzowanych metod ilościowego określania przewlekłych patologii płuc w mysim modelu POChP. Protokół obejmuje wystawienie myszy na dym papierosowy (CS), pomiar czynności płuc, napompowanie płuc oraz zastosowanie metod morfometrycznych do pomiaru rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy.

Zautomatyzowany pomiar rozedmy płuc i przebudowy małych dróg oddechowych u myszy narażonych na dym papierosowy

Ten artykuł przedstawia szybką i prostą metodę podawania bleomycyny bezpośrednio do tchawicy myszy poprzez intubację. Kluczowymi zaletami tej metody jest to, że jest wysoce powtarzalna, łatwa do opanowania i nie wymaga specjalistycznego sprzętu ani długiego czasu rekonwalescencji.

Ulepszona metoda szybkiej intubacji tchawicy u myszy

Tutaj prezentujemy protokół poprzecznego zwężenia aorty (TAC) za pomocą torakotomii bocznej. Technika ta jest minimalnie inwazyjnym, zamkniętym zabiegiem chirurgicznym klatki piersiowej, mającym na celu symulację przeciążenia ciśnieniem i niewydolności serca u myszy wykorzystujących standardowe warunki laboratoryjne TAC.

Model z zamkniętą klatką piersiową do wywoływania poprzecznego zwężenia aorty u myszy

Celem tego artykułu jest opisanie wyrafinowanej metody intubacji myszy laboratoryjnej. Metoda jest nieinwazyjna i dlatego idealnie nadaje się do badań, które wymagają seryjnego monitorowania funkcji oddechowych i/lub wkraplania leków do płuc.

Wielokrotna intubacja jamy ustnej i tchawicy u myszy

Różne modele zwierzęce wrodzonej przepukliny przeponowej i niedrożności tchawicy płodu prezentują zalety i wady dotyczące kwestii etycznych, kosztów, trudności chirurgicznych, rozmiaru, wskaźników przeżycia i dostępności narzędzi genetycznych. Model ten zapewnia nowe narzędzie do badania wpływu zarówno niedrożności tchawicy, jak i zwiększonego ciśnienia świetlnego na rozwój płuc.

Przezmaciczny model niedrożności tchawicy płodu u myszy

Tutaj proponujemy protokół dostarczania lipopolisacharydów dotchawiczych (LPS) poprzez nieinwazyjną intubację dotchawiczą ustno-gardłową. Metoda ta minimalizuje uraz związany z zabiegiem chirurgicznym u zwierzęcia i dokładnie dostarcza LPS do tchawicy, a następnie do płuc.

Nieinwazyjne wkraplanie lipopolisacharydu dotchawiczego u myszy

Poznaj metodę pomiaru kurczliwości mięśni gładkich tchawicy myszy za pomocą izolowanych pierścieni tchawiczych w układzie do pomiaru siły izometrycznej.

In vitro pomiary skurczu tchawki u myszy

Przeglądaj więcej filmów