Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu ekspozycji na etanol na rozwijające się danio pręgowane. Osiąga się to poprzez wstępne poddanie zarodków danio pręgowanych działaniu dawek etanolu w standardowej wodzie do embrionów podczas wczesnego rozwoju. Następnie etanol jest usuwany, a ryby rozwijają się do pożądanego punktu czasowego.

Następnie w embrionach traktowanych, w porównaniu z kontrolnymi, analizuje się zarówno ogólne zmiany fizyczne, jak i modyfikacje w ekspresji genów. Na koniec embriony poddaje się manipulacjom z użyciem mRNA, morfolino lub leków, aby ustalić, czy defekty rozwojowe wywołane przez etanol mogą zostać zmienione. Ostatecznie, kombinacja ilościowego PCR oraz hybrydyzacji in situ wykazuje, że wpływ etanolu na rozwijające się embriony danio pręgowanego jest powiązany ze zmianami w ekspresji genów.

Kolejna manipulacja poziomami ekspresji genów może poprawić stan lub zapobiec wadom rozwojowym wywołanym przez etanol. Techniki, które prezentujemy dzisiaj, rozszerzają naszą wiedzę na temat natury zespołu alkoholowego płodu, a także pozwalają badać zachowane procesy rozwojowe u kręgowców. Dzisiejszą prezentację dotyczącą traktowania embrionów etanolem poprowadzi Steph Erhardt, technik w moim laboratorium.

Hoduj je z krzyżówek typu dzikiego do stadium kopułki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w wodzie do embrionów. Rozdziel embriony z jednego wysadu do odpowiedniej liczby szalek, mieszcząc od 10 do 50 embrionów w każdej szalce. Dodaj do embrionów roztwór etanolu o stężeniu od 0,2 do 2,5% objętościowo w wodzie dla ryb i przenieś je z powrotem do inkubatora na okres do 24 godzin po pożądanym czasie ekspozycji.

Zastąp etanol zawierający wodę świeżą wodą do embrionów na określony okres rozwoju, aby zebrać mRNA do ilościowego PCR. Umieść dopasowane embriony H w probówkach typu Eppendorf. Usuń wodę z rybami i dodaj bufor lizujący z TCEP.

Za pomocą zmotoryzowanego rozdrabniacza fizycznie rozdziel embriony, a następnie umieść je w wirówce w celu powolnego wirowania. Przenieś roztwór do kolumny wstępnie oczyszczającej, a następnie odwirowuj kolumnę, aby usunąć rozdzielone duże fragmenty.

Do izolacji RNA należy użyć zestawu do izolacji RNA. Następnie przeprowadza się syntezę cDNA standardowymi metodami dla analizy qPCR lub mikromacierzy, aby przygotować embriony do hybrydyzacji in situ oraz barwienia przeciwciałami. Embriony w okresie od 6 do 24 godzin po zapłodnieniu należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS z dodatkiem 0,1% Tween.

Usuń choon za pomocą dwóch ostrych pincet pod mikroskopem. Następnie przenieś embriony do metanolu, stosując serię wymian cieczy o rosnącym stężeniu metanolu i malejącym stężeniu PBT. Po przeniesieniu embrionów do 100% metanolu, przechowuj je w temperaturze -20 °C w celu barwienia chrząstki.

Hodować zarodki do piątego lub szóstego dnia po zapłodnieniu. Utrwalić je przez noc w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć je trzykrotnie w PBT, aby określić, jakie poziomy ekspresji genów uległy zmianie pod wpływem ekspozycji na etanol.

Przeprowadź qPCR, zaczynając od zaprojektowania starterów w celu ich walidacji. Przetestuj je na trzech próbkach biologicznych. Te kontrolne próbki biologiczne mogą pochodzić od osobników w dowolnym wieku, pod warunkiem że badany gen ulega ekspresji w tym konkretnym wieku.

Po zweryfikowaniu starterów, należy wykorzystać wcześniej przygotowane cDNA do przeprowadzenia qPCR, analizując próbki w trzech powtórzeniach i uwzględniając próbkę kontrolną dla danio pręgowanego; jako kontrolę używamy starterów do gap dh. Wyniki należy znormalizować względem poziomów gap DH. Następnie obliczamy względny poziom ekspresji genów przy użyciu metody 2⁻ΔΔCt.

Wariancja dwóch metod delta delta CT wykazująca różnicę między próbką eksperymentalną a typem dzikim. W C dwa konstrukty hybrydyzacyjne. Znakowane sondy rybotekowe do badanego genu.

Następnie inkubuj je z embrionami w tym samym wieku w standardowych warunkach i wykryj wzór hybrydyzacji za pomocą fosfatazy alkalicznej; obrazuj próbki przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić rozwój morfogenetyczny, taki jak kształt; obrazuj żywe embriony, aby ocenić odległość międzyoczną i długość ciała. Najpierw utrwal embriony w parafomaldehydzie. Następnie wykonaj zdjęcia, aby zbadać wpływ działania alkoholu na rozwijające się struktury chrzęstne w utrwalonych larwach.

Utrwalono zarodki danio pręgowanego, stosując lc i niebieskie światło przez kilka godzin lub przez noc, aby unieruchomić i oczyścić zarodki przed obrazowaniem. Analizę śmierci komórek w żywych zarodkach przeprowadzono poprzez inkubację w roztworze aine orange o stężeniu 5 mg/mL w PBS przez jedną godzinę. Zarodki przemyto trzykrotnie w PBS, następnie osadzono na szkiełkach przedmiotowych, wykonano obrazy próbek przy użyciu mikroskopu konfokalnego i zastosowano serie Z w celu stworzenia kompozytów.

Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja uległa zmniejszeniu w wyniku ekspozycji na etanol, wstrzyknij od 25 do 200 picogramów na nanolitr mRNA z kapsą dla genu zainteresowania w stadium jednego do dwóch komórek. Pozostaw jaja do regeneracji w inkubatorze podgrzanym do 28 stopni Celsjusza, aż osiągną stadium kopuły, a następnie poddaj je działaniu etanolu jak poprzednio. W przypadku genów, których ekspresja wzrosła w wyniku ekspozycji na etanol, przeprowadź ich wyciszenie poprzez wstrzyknięcie ilości od pikogramów do nanogramów morfino antisense do embrionów w stadium jednego do dwóch komórek.

Protokół ten jest podobny do protokołu dla mRNA z czapką. W przypadku wstrzykiwania mRNA lub morphino splicingowego, należy zmierzyć wydajność za pomocą R-T-P-C-R, aby porównać ilości transkryptów splicingowanych i niesplingingowanych w celu analizy aktywności genów zależnej od dawki; należy miareczkować wstrzykiwane morphino i pozwolić zarodkom rozwinąć się do pożądanego stadium przed podaniem im etanolu. Narażenie zarodków danio pręgowanego na etanol prowadzi do szeregu wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców.

Nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym Noor, prowadzi do skrócenia, a niekiedy przerwania noord, co częściowo skutkuje późniejszymi nieprawidłowościami w somytach, jak pokazano tutaj. Podczas gdy w nieleczonych kontrolach widoczny jest wyraźny kształt szewrona, somyty traktowane etanolem przyjmują kształt litery U, charakterystyczny dla zredukowanego sygnałowania sonic hedgehog. Jak widać tutaj.

Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, prawdopodobnie wynikającym z wczesnego opóźnienia rozwoju i następujących po nim wad Noor, jest skrócenie długości zarodka. Wynik ten jest podobny do utrzymującego się przedpokwitania oraz niskiego wzrostu obserwowanego u dzieci eksponowanych na etanol podczas rozwoju, co sugeruje, że model zebrafish jest istotny dla zrozumienia tej ludzkiej wady wrodzonej. Na modelach zwierzęcych wykazano, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do wyraźnych fenotypów zespołu alkoholowego płodu, w tym synthia i opia.

U danio pręgowanych odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki etanolu, co jest zgodne z naturą ludzkiej wady wrodzonej. Opia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, jednak niższe dawki powodują znaczną redukcję IOD, co sugeruje, że ten model zwierzęcy wykazuje podobną wadę rozwoju linii środkowej twarzy. Na powyższej rycinie porównano wczesne poziomy ekspresji genów six3b oraz glee1 w embrionach niepoddanych działaniu etanolu oraz w embrionach traktowanych etanolem.

W obu genach odnotowano obniżony poziom ekspresji w próbkach traktowanych etanolem. Przy użyciu hybrydyzacji in situ przeprowadzono analizę wzorców ekspresji dla genów six3b oraz goid, co przedstawiono na rysunku. W tym przypadku oba geny wykazały zmniejszenie ekspresji przestrzennej w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z niepoddanymi działaniu preparatu kontrolami.

Ponieważ oba geny są eksprymowane w tkankach przeznaczonych na tkanki linii pośrodkowej czaszki C, ich redukcja w ósmym godzinie po zapłodnieniu jest spójna z późniejszą w rozwoju redukcją IOD. Po zidentyfikowaniu genów, na które wpływa etanol, istnieją mechanizmy pozwalające na zwiększenie lub zmniejszenie ich ekspresji. W tym przykładzie wstrzyknięto mRNA dla sonic hedgehog, ligandu zwiększającego poziomy glee one, co doprowadziło do odwrócenia makroskopowych wad wynikających z redukcji glee one w embrionach traktowanych etanolem.

Wstrzyknięcie six three B nie zdołało jednak odwrócić fenotypu wywołanego ekspozycją na etanol. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak badać defekty genetyczne i rozwojowe wywołane przez etanol w rozwijającym się zarodku zebrafish. Techniki zastosowane w niniejszym materiale mogą być również wykorzystane przez osoby chcące badać toksyczność innych związków rozpuszczalnych w wodzie w rozwijającym się zarodku kręgowców.