Name: Ocena zmian teratogennych w modelu narażenia płodu na alkohol u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Poznaj metodę oceny zmian teratogennych wywołanych etanolem u zarodków Danio rerio. Technika obejmuje analizę ekspresji genów i manipulację mRNA w celu identyfikacji potencjalnych interwencji terapeutycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Monte Westerfieldowi, Makoto Kobayashi i Jackowi Topczewskiemu za przekazanie plazmidów do hybrydyzacji in situ oraz mikroiniekcji mRNA. Jesteśmy wdzięczni Steph Erhard za wystąpienie w filmie. Chcielibyśmy również podziękować Williamowi Goossensowi za pomoc w zakresie mikroskopii konfokalnej przedstawionej w materiale wideo. Tyler Schwend dostarczył obrazów wykorzystanych w filmie, a Rodney Dale pomógł w przygotowaniach do nagrania. Dziękujemy również personelowi ds. opieki nad zwierzętami w CMRC za pracę związaną z hodowlą zebrafish. Niniejsza praca została sfinansowana z grantu NIH R21 AA13596 przyznanego SCA.

1. Obróbka zarodków etanolem
<ol>
 <li>Zarodki danio pręgowanego pochodzące z krzyżówek typu dzikiego hodowano w temperaturze 28 °C w 5 ml wody do zarodków (woda Milli-Q z dodatkiem 60 mg/L Instant Ocean). Różne linie zarodków typu dzikiego wykazują nieco inną tolerancję na ekspozycję na etanol9.</li>
 <li>Ekspozycję na etanol rozpoczynano w stadium kopuły (~4,3 godziny po zapłodnieniu, hpf) na wybrany czas, do maksymalnie 24-godzinnego impulsu. Stadium początkowe to jest w przybliżeniu odpowiednikiem stadium implantacji zarodków ssaków, tuż przed gastrulacją. Stężenia etanolu wynoszą od 0,2% do 2,5%, objętość/objętość. Badania wykazały, że od 25% do 50% roztworu zawartego w wodzie przenika do rozwijającego się zarodka10, 11. Zarodki utrzymuje się w temperaturze 28 °C przez wybrany czas. Po zakończeniu ekspozycji na etanol roztwór etanolowo-wodny usuwa się i zastępuje trzykrotnym przemyciem standardową wodą dla danio pręgowanego, a następnie inkubuje przez wybrany czas. Specyfika wady zależy od momentu rozpoczęcia, dawki oraz czasu trwania impulsu etanolu.</li>
</ol>
2. Pobieranie embrionów do analizy RNA, hybrydyzacji in situ, barwienia przeciwciałami oraz barwienia chrząstki
<ol>
 <li>W celu pobrania mRNA do qPCR, embriony w tym samym wieku zbierane są do probówek Eppendorf. Po usunięciu wody z zebrafish dodawany jest bufor lizujący z TCEP. Do fizycznej dysocjacji embrionów w roztworze lizującym wykorzystuje się zmotoryzowany pulveryzator. Następnie roztwór przepuszcza się przez kolumnę do wstępnego oczyszczania (preclear), która usuwa wszelkie niedysocjowane duże fragmenty. Otrzymany roztwór zawiera wszystkie makrocząsteczki uwolnione w procesie lizy. RNA jest następnie ekstrahowane poprzez przepuszczenie roztworu przez kolumnę, a następnie poddane etapom płukania i traktowaniu DNazą. Elucję przeprowadza się przy użyciu wody lub roztworu elucyjnego dostarczonego przez producenta (5'-Prime). RNA może zostać przekształcone w cDNA przy użyciu standardowych technik qPCR lub wykorzystane w analizie mikroarray.</li>
 <li>Do hybrydyzacji in situ i barwienia przeciwciałami, embriony od 6 do 24 hpf utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadzano 3 płukania w PBS + 0,1% Tween (PBT), aby zapobiec sklejaniu się embrionów. Embriony przenoszono następnie przez serię 3 płukań w metanolu:PBT do 100% metanolu, po czym mogły być one przechowywane w temperaturze -20 °C. Tak przygotowane embriony mogą być wykorzystane do hybrydyzacji in situ lub barwienia przeciwciałami. Niektóre przeciwciała nie działają po traktowaniu metanolem, dlatego należy wziąć pod uwagę to zastrzeżenie i przetestować konkretne przeciwciało, aby sprawdzić, czy będzie ono skuteczne po obróbce metanolem.</li>
 <li>Do barwienia chrząstki embriony muszą zostać doprowadzone do 5 lub 6 dni po zapłodnieniu (dpf). Następnie utrwala się je w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przeprowadza 3 płukania w PBT.</li>
</ol>
3. Ocena zmian w ekspresji genów indukowanych etanolem oraz konsekwencji rozwojowych
<ol>
 <li>Aby określić zmiany poziomów ekspresji genów, analizowane geny badane są za pomocą qPCR oraz hybrydyzacji in situ. qPCR przeprowadza się przy użyciu starterów zaprojektowanych w oprogramowaniu Integrated DNA Technologies (IDT), a następnie walidowanych na 3 oddzielnych próbkach biologicznych. Po walidacji starterów qPCR wykonuje się na cDNA otrzymanym z zebranych próbek RNA. Każda próbka jest analizowana w trzech powtórzeniach. Reakcje PCR przeprowadzane są z użyciem Platinum SYBR Green qPCR Super mix (Invitrogen) na urządzeniu Chroma-4 PCR (BioRad) lub podobnym termocyklerze z systemem detekcji wielokolorowej. Oprócz badanych genów krytyczne jest zastosowanie zestawu starterów kontrolnych w celu zrównoważenia niewielkich różnic w przygotowaniu cDNA lub RNA. W przypadku zarodków danio-pręgowanego stosujemy gapdh: 5'GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3' oraz 5'TTGCACCACCCTTAATGTGA3'. Analizowane geny są następnie normalizowane względem poziomów gapdh, a względną kwantyfikację ekspresji genów oblicza się za pomocą wariantu metody Pfaffla opartej na 2- Ct, prezentując dane jako krotność różnicy między grupą eksperymentalną a grupą typu dzikiego12. Standardowe obliczenia zakładają, że wszystkie geny duplikują DNA dwukrotnie w każdym cyklu, i tym samym wyrażają dane jako stosunek zmiany w genie eksperymentalnym do zmiany w genie referencyjnym, zapisany jako obliczenia potęgowe z podstawą „2”, która reprezentuje wydajność podwojenia DNA na cykl w idealnej reakcji PCR. Metoda Pfaffla zastępuje generyczną wartość „2” rzeczywistą wydajnością starterów PCR wyznaczoną przez eksperymentatora. Pozwala to na dokładniejsze odzwierciedlenie różnic w reakcjach PCR. Pełny wzór to: 
 <table border="0">
 <tbody >
 <tr>
 <td>(Wydajność genu eksperymentalnego)(Ct próbki kontrolnej - Ct próbki traktowanej)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>-------------------------------------------------------------------------------------</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>(Wydajność genu referencyjnego)(Ct próbki kontrolnej - Ct próbki traktowanej)</td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Do hybrydyzacji in situ konstruuje się ryboproby znakowane digoksigeniną (dig) z plazmidów zawierających fragmenty interesującego genu. Zarodki w tym samym wieku poddaje się działaniu ryboprob w standardowych warunkach13, a następnie wykrywa za pomocą przeciwciał anty-dig sprzężonych z fosfatazą alkaliczną, co pozwala na lokalizację znakowanych ryboprob za pomocą reakcji barwnej (NBT/BCIP). Zarodki są następnie wizualizowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego Leica (Rycina 1B-G).</li>
 <li>Aby ocenić rozwój morfogenetyczny, zarodki zbiera się w wybranym czasie i bada pod mikroskopem stereoskopowym. W przypadku kształtu somitów obrazowane są żywe zarodki 14. Do pomiaru odległości międzyocznej i długości ciała zarodki utrwalane są w PFA. W każdym przypadku obrazy interesującego obszaru są rejestrowane za pomocą mikroskopu stereoskopowego przy stałym powiększeniu, a pomiary wykonywane są w oprogramowaniu Adobe Photoshop 10,14.</li>
 <li>Aby zbadać wpływ traktowania na rozwijające się struktury chrzęstne w larwach danio-pręgowanego, stosujemy barwienie błękitem Alcian. Utrwalone larwy danio-pręgowanego traktuje się roztworem błękitu Alcian rozpuszczonym w 80% etanolu: 20% octu lodowego (alkohol kwasowy) przez kilka godzin lub przez noc. Larwy są odbarwiane w kilku płukaniach alkoholem kwasowym, a następnie przenoszone do roztworu 1% KOH i 3% nadtlenku wodoru w celu dalszego przejrzyszczania komórek pigmentowych. Larwy danio-pręgowanego muszą mieć co najmniej 4 dni, aby wykazać struktury chrzęstne, które są lepiej zdefiniowane u ryb w wieku 5 lub 6 dni.</li>
 <li>Śmierć komórek w żywych zarodkach ocenia się za pomocą pomarańczowej akrydyny (AO). AO nie przenika przez błony żywych komórek i wiąże się z DNA w komórkach o uszkodzonych błonach, w tym w tych przechodzących apoptozę i nekrozę. Żywe zarodki inkubuje się z 5 mg/ml AO w PBS przez 1 godzinę, po czym wykonuje się 3 płukania w PBS. Zarodki są następnie obrazowane za pomocą mikroskopu konfokalnego. Cyfrowe obrazy z serii Z są łączone w celu stworzenia kompozytów.</li>
</ol>
4. Manipulacja zarodkiem rybki danio
<ol>
 <li>Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja ulega obniżeniu pod wpływem etanolu, można podjąć próbę ich uzupełnienia poprzez wstrzyknięcie mRNA zaprojektowanego w celu zastąpienia brakującego genu. mRNA z czapką jest transkrybowane z linearyzowanych plazmidów DNA przy użyciu zestawów do transkrypcji RNA polimerazą in vitro, zgodnie z instrukcjami producenta (mMessage Machine, Applied Biosystems). Do jaj zebrafish w stadium 1-2 komórek wstrzykuje się od 25-200 pg/nl RNA w roztworze 0,1 M KCl. Następnie pozwala się zarodkom na regenerację przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej (Rysunek 5).</li>
 <li>W przypadku transkryptów genów, których poziom wzrasta pod wpływem etanolu, można je zredukować lub wyciszyć („knock-down”) przy użyciu technologii antysensownych morfolino. Antysensowne morfolino (AMOs) są projektowane przez firmę Gene Tools i blokują translację RNA na białko lub blokują dojrzewanie i splicing RNA, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Działanie morfolino ogranicza ilość aktywnego białka dla ukierunkowanego genu; deficyt ten można zmierzyć przy użyciu przeciwciał, jeśli są one dostępne. Wydajność morfolino blokujących splicing RNA można zmierzyć za pomocą RT-PCR, aby wykryć względne ilości transkryptów splicowanych i niesplicowanych. Miareczkowanie morfolino może prowadzić do aktywności zależnej od dawki15. AMOs są rozcieńczane do stężeń roboczych (miareczkowane stężenia od pg do ng) w roztworze Danieau (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO4, 0,6 mM Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH 7,6). Iniekcja odbywa się w stadium 1-2 komórek, a następnie pozwala się zarodkom na rozwój przed poddaniem ich działaniu etanolu, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
 Narażenie zarodków danio pręgowanego na etanol prowadzi do szeregu wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców. Udokumentowaliśmy nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym notochordu (dane nie pokazane14). Opóźnienie rozwojowe wywołane przez etanol najwyraźniej prowadzi do zaburzenia prawidłowego wydłużania się notochordu, co skutkuje jego skróceniem, a sporadycznie również przerwaniem jego ciągłości (dane nie pokazane14). To wczesne opóźnienie i wada notochordu prawdopodobnie przyczyniają się częściowo do późniejszych nieprawidłowości w somytach (Rysunek 2), które utraciły swój wyraźny kształt w literę V (chevron), widoczny w nieleczonych kontrolach, i bardziej przypominają somyty w kształcie litery U, charakterystyczne dla fenotypów obserwowanych przy zredukowanym sygnale sonic14. Kąt somytów można zmierzyć za pomocą standardowego oprogramowania; kąt ten zwiększa się z 92,1 ± 4,6° w nieleczonych kontrolach do 122,6 ± 6,6° w zarodkach traktowanych etanolem (p &lt; 0,001).
Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, które może wynikać z wczesnego opóźnienia rozwojowego i późniejszych wad notochordu, jest skrócona długość zarodka (Rysunek 3). Nawet przy pomiarach zarodków uwzględniających zakrzywienie wywołane ekspozycją na etanol, działanie to prowadzi do skrócenia tułowia, co jest zależne od dawki etanolu, na którą wystawiono zarodek (Rysunek 3E14). Wynik ten jest podobny do utrzymującego się niskiego wzrostu przed okresem dojrzewania u dzieci narażonych na etanol podczas rozwoju16, 17, co sugeruje, że model danio pręgowanego jest istotny dla zrozumienia tej ludzkiej wady wrodzonej.
Jedną z klasycznych cech FAS jest charakterystyczny wygląd twarzy, obejmujący niedorozwój żuchwy, małe szczeliny eyelids oraz wygładzone wgłębienie nadustne. Wiele z tych cech wiąże się z redukcją tkanek linii pośrodkowej. Wykazano na modelach zwierzęcych, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do jeszcze bardziej wyraźnych fenotypów, w tym synoftalmii i cyklopii. Podczas narażania embrionów rybek danio na zwiększone dawki etanolu, odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki (Rysunek 4), co jest zgodne z charakterem ludzkiej wady wrodzonej. Cyklopia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, jednak niższe dawki powodują znaczną redukcję IOD (Rysunek 4), co sugeruje, że ten model zwierzęcy wykazuje podobną wadę w rozwoju linii pośrodkowej twarzy10.
Aby zrozumieć mechanizm leżący u podstaw wad ciała i twarzy wywołanych ekspozycją na etanol, dążyliśmy do ustalenia zmian w ekspresji genów, które występują wcześnie w rozwoju i które mogą racjonalnie przyczyniać się do późniejszych wad rozwojowych. Robimy to na dwa sposoby: ekstrakcja mRNA z embrionów pozwala na ilościową ocenę poziomów ekspresji genów w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z grupą kontrolną (Rysunek 1A). Dodatkowo możemy przeprowadzić hybrydyzację in situ, aby zbadać wzorzec ekspresji genów, niezależnie od tego, czy sygnał jest osłabiony, czy nie (Rysunek 1B-G18). W tym przykładzie pokazano dwa geny, których ekspresja ulega zmniejszeniu po ekspozycji na etanol: gli1 oraz six3b. Analizując wzorzec in situ dla six3b, stwierdziliśmy zmniejszenie przestrzennego zakresu ekspresji tego genu (Rysunek 1 E-G) w embrionach narażonych na etanol. Podobne zmniejszenie odnotowano w przypadku genu gsc (Rysunek B-D). Zarówno six3b, jak i gsc są eksprimowane w tkankach, które w przyszłości będą tworzyć tkanki linii środkowej twarzoczaszki. Zatem redukcja tych genów w 8 hpf jest zgodna z późniejszym zmniejszeniem IOD, co pokazano na Rysunku 4.
Po zidentyfikowaniu genów pod wpływem etanolu istnieją mechanizmy, dzięki którym ich ekspresję można zwiększyć lub zmniejszyć. W tym konkretnym przykładzie za pomocą qPCR wykazaliśmy dwa geny, których ekspresja uległa zmniejszeniu (gli1 i six3b). Postanowiliśmy wstrzyknąć mRNA, aby sprawdzić, czy odwrócenie tych zmian genetycznych może poprawić wyniki. W tym doświadczeniu zamiast wstrzykiwać gli1, zdecydowaliśmy się na wstrzyknięcie shh, liganda zwiększającego poziom gli1. W przypadku six3b mogliśmy wstrzyknąć sam six3b. Nie odnotowaliśmy żadnych zmian po wstrzyknięciu six3b (dane nie zostały przedstawione), lecz zdołaliśmy zasadniczo zniwelować wady morfologiczne w embrionach rybek danio pręgowany poprzez dodatkowe wstrzyknięcia shh (Rysunek 5).
<img alt="Wyniki qPCR dla zarodków danio pręgowanego w 8 hpf; ekspresja genów po ekspozycji na etanol; wykres porównawczy." src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Ekspozycja na etanol zmienia wczesny wzorzec oraz poziomy ekspresji wybranych genów rozwojowych. A) Wyniki qPCR dla zarodków w 8 hpf. Przedstawiono wyniki dla dwóch genów: six3b oraz gli1. Wyniki przedstawiono jako średnią z trzech oddzielnych eksperymentów, a zastosowana dawka etanolu wynosi 2.5%. Ekspresja obu genów jest obniżona w sposób istotny w porównaniu z kontrolą (test t, p &lt; 0.05). B-G) Hybrydyzacja in situ zarodków danio pręgowanego w 8 hpf. W tym punkcie czasowym wzorce obu genów, gsc oraz six3b, są zmienione w porównaniu z kontrolą. (Opracowano za zgodą Loucks et al. 2007).
<img alt="Morfologia zarodka rybki danio pod wpływem ekspozycji na etanol; porównanie krzywizny kręgosłupa; obraz mikroskopowy." src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Rozwój somytów jest zaburzony w zarodkach poddanych działaniu preparatu. Strukturę i kąty somytów badano w 48 hpf. W zarodkach kontrolnych (A) somyty mają kształt litery V i ostry kąt. Rybki danio eksponowane na etanol wykazują częściej somyty w kształcie litery I lub U oraz mniej ostre kąty. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks i Ahlgren 2009).
<img alt="Rozwój zarodków danio-osteoma przy różnych stężeniach etanolu; zawiera analizę wykresu dawka-odpowiedź." src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Traktowanie etanolem znacząco zmniejsza długość ciała u danio-osteoma. Długość zarodków nietraktowanych oraz narażonych na etanol mierzono w 5. dobie po zapłodnieniu. Znaczący spadek długości zaobserwowano u wszystkich traktowanych zarodków (ANOVA, p &lt; 0.001). B-D. Odnotowano niewielki, ale istotny spadek całkowitej długości zarodków traktowanych 1,0% i 1,5% etanolem, natomiast większy spadek zaobserwowano u zarodków otrzymujących dawki 2,0% i 2,5% etanolu. E. Aby skontrolować różnice w wielkości w obrębie każdego cyklu, zarodki kontrolne dla każdego eksperymentu znormalizowano do wartości 100, a traktowane zarodki z tego samego cyklu wyrażono jako procent wartości 100. (Zmodyfikowano za zgodą Loucks i Ahlgren 2009).
<img alt="Ekspozycja zarodków ryby danio na etanol; A) obrazy porównawcze, B) wykres odległości międzygałkowej." src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ekspozycja na etanol prowadzi do zmniejszenia odległości międzygałkowej (iod) u zarodków ryby danio. A) Widoki frontalne zarodków przedstawiają prawidłowy fenotyp oraz fenotyp z zrośniętymi oczami. B) Różne dawki etanolu podane przez 3 godziny podczas gastrulacji skutkują zmniejszeniem iod w badaniu ryb po 24 godzinach. Zrośnięte oczy i cyklopia występują jedynie przy najwyższej badanej dawce (2,4%). * oznacza istotne zmniejszenie iod w porównaniu z grupą kontrolną. (zmodyfikowano za zgodą Ahlgren, 2004).
<img alt="Rozwój zarodka danio pręgowanego w grupie kontrolnej H2O, pod wpływem 2% etanolu oraz po podaniu mRNA Shh-N i 2% etanolu." src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 5"> 
Rycina 5. shh-NmRNA wstrzyknięte w celu zniwelowania ogólnych wad powstałych w wyniku ekspozycji zarodków danio pręgowanego na etanol. Do zarodków w stadium jednej lub dwóch komórek wstrzyknięto 100 pg/nl shh-NmRNA, a połowę wstrzykniętych zarodków poddano działaniu standardowych dawek etanolu od 4,3 do 24 hpf. Zarodki analizowano w 5 dpf. Zarodki traktowane 2,0% etanolu wykazują zakrzywione grzbietowo krótsze ogony, somity w kształcie litery I oraz wady oczu, w tym cyklopię. Odzyskanie prawidłowego fenotypu zaobserwowano u 71/76 wstrzykniętych zarodków (93%). W tych zarodkach ciało jest proste, somity mają kształt grotu strzały, a oczy są całkowicie rozdzielone.

<ol><li>Streissguth, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+syndrome+in+adolescents+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Jama%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol syndrome in adolescents and adults.</a> Jama. 265 (15), 1961-1967 (1991).</li>
<li>Floyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+from+the+CDC.+Preventing+alcohol-exposed+pregnancies+among+women+of+childbearing+age%3A+the+necessity+of+a+preconceptional+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Womens+Health+Gend.+Based+Med%22%5BJournal%5D)">Observations from the CDC. Preventing alcohol-exposed pregnancies among women of childbearing age: the necessity of a preconceptional approach.</a> J. Womens Health Gend. Based Med. 8 (6), 733-736 (1999).</li>
<li>Ali, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+analysis+of+acute+ethanol+exposure+in+zebrafish+development%3A+a+critical+time+window+and+resilience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Large-scale analysis of acute ethanol exposure in zebrafish development: a critical time window and resilience.</a> PLoS One. 6 (5), e20037-e20037 (2011).</li>
<li>Dlugos, C. A., Rabin, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+effects+of+developmental+exposure+to+ethanol+on+the+zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional effects of developmental exposure to ethanol on the zebrafish heart.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 34 (6), 1013-1021 (2010).</li>
<li>Fernandes, Y., Gerlai, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+behavioral+changes+in+response+to+early+developmental+exposure+to+ethanol+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Clin.+Exp.+Res%22%5BJournal%5D)">Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33 (4), 601-609 (2009).</li>
<li>Bilotta, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+embryonic+exposure+to+ethanol+on+zebrafish+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Effects of embryonic exposure to ethanol on zebrafish visual function.</a> Neurotoxicol. Teratol. 24 (6), 759-766 (2002).</li>
<li>Tanguay, R. L., Reimers, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+ethanol+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of ethanol developmental toxicity in zebrafish.</a> Methods Mol. Biol. 447, 63-74 (2008).</li>
<li>Blader, P., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+impairs+migration+of+the+prechordal+plate+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ethanol impairs migration of the prechordal plate in the zebrafish embryo.</a> Dev. Biol. 201 (2), 185-201 (1998).</li>
<li>Loucks, E., Carvan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3rd%2C+Strain-dependent+effects+of+developmental+ethanol+exposure+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">3rd, Strain-dependent effects of developmental ethanol exposure in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 745-755 (2004).</li>
<li>Ahlgren, S. C. Molecular Mechanisms of Fetal Alcohol Syndrome: Shh-signaling. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAhlgren%2C+SC+%22Comprehensive+Handbook+of+Alcohol+Related+Pathology%22">Comprehensive Handbook of Alcohol Related Pathology</a>. Preedy, V. , (2004).</li>
<li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 26 (6), 769-781 (2004).</li>
<li>Pfaffl, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29 (9), 45-45 (2001).</li>
<li>Jowett, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJowett%2C+T+%22Tissue+in+situ+hybridization%3A+methods+in+animal+development%22">Tissue in situ hybridization: methods in animal development</a>. , John Wiley & Sons. New York. 128-128 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 86, 556-567 (2009).</li>
<li>Schwend, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+Npc1+and+availability+of+cholesterol+for+early+embryonic+cell+movements+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Requirement of Npc1 and availability of cholesterol for early embryonic cell movements in zebrafish.</a> J. Lipid Res. 52 (7), 1328-1344 (2011).</li>
<li>Spohr, H. L., Willms, J., Steinhausen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+alcohol+spectrum+disorders+in+young+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr%22%5BJournal%5D)">Fetal alcohol spectrum disorders in young adulthood.</a> J. Pediatr. 150 (2), 175-179 (2007).</li>
<li>Strauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+intrauterine+environment+on+childhood+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+Med.+Bull%22%5BJournal%5D)">Effects of the intrauterine environment on childhood growth.</a> Br. Med. Bull. 53 (1), 81-95 (1997).</li>
<li>Loucks, E. J., Schwend, T., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+associated+with+teratogen-induced+cyclopia%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Molecular changes associated with teratogen-induced cyclopia.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 79 (9), 642-651 (2007).</li>
<li>Schwend, T., Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+Gli+activity+in+craniofacial+tissues+of+hedgehog-pathway+reporter+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of Gli activity in craniofacial tissues of hedgehog-pathway reporter transgenic zebrafish.</a> PLoS One. 5 (9), 14396-14396 (2011).</li>
<li>Chrisman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gestational+ethanol+exposure+disrupts+the+expression+of+FGF8+and+Sonic+hedgehog+during+limb+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res.+A.+Clin.+Mol.+Teratol%22%5BJournal%5D)">Gestational ethanol exposure disrupts the expression of FGF8 and Sonic hedgehog during limb patterning.</a> Birth Defects Res. A. Clin. Mol. Teratol. 70 (4), 163-171 (2004).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Metody opisane w niniejszym materiale oraz przedstawione wyniki stanowią jedynie zarys możliwości wykorzystania danio pręgowanych do badania wad rozwojowych. Ze względu na łatwy dostęp do zarodka, dużą liczbę jaj w każdym cyklu tarła oraz wysoką powtarzalność wyników, kręgowce te są idealne do badań teratogennych. Ryby można również modyfikować tak, aby zawierały cząsteczki fluorescencyjne, służące jako wizualny reporter dla konkretnego genu lub interesującej badacza ścieżki sygnałowej19. W badaniach nad etanolem zastosowane dawki wydają się dość wysokie w porównaniu z poziomem alkoholu we krwi ssaków. Poziomy te odzwierciedlają jednak stężenie w wodzie, a nie cały etanol nie dociera do zarodka.
Podsumowując, opisane i szczegółowo omówione powyżej metody sugerują, że embriony danio pręgowanego są niezwykle użyteczne w modelowaniu ludzkich wad wrodzonych związanych z ekspozycją na etanol. Ponadto zmiany w ekspresji genów zaobserwowane u danio pręgowanego zostały potwierdzone przez innych badaczy w modelach ssaków20, co sugeruje, że wpływ etanolu na rozwój jest zachowany u wszystkich kręgowców. Wiele z zaprezentowanych powyżej technik można zastosować w przypadku innych czynników środowiskowych lub farmakologicznych, aby szybko i łatwo wykrywać potencjalne teratogeny oraz określać mechanizmy leżące u podstaw teratogenezy wywoływanej przez konkretną substancję.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do izolacji RNA z tkanek: 5-Prime PerfectPure</td><td>Fisher Scientific</td><td>FP2302410</td><td></td></tr><tr><td>Platinum SYBR green qPCR SuperMix-UDG</td><td>Invitrogen</td><td>11733038</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do wysokowydajnej transkrypcji RNA z cappingiem mMessage mMachine</td><td>Applied Biosystems</td><td>Zależnie od polimerazy RNA w plazmidzie</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Zespół alkoholowy płodu (FAS) jest ciężką postacią ekspozycji embrionalnej na etanol. Charakteryzuje się on typowymi wadami twarzy i narządów, w tym opóźnieniem rozwoju psychicznego wynikającym z zaburzonego i uszkodzonego rozwoju mózgu. Spektrum zaburzeń alkoholowych płodu (FASD) to termin obejmujący kontinuum wad wrodzonych występujących w wyniku spożywania alkoholu przez matkę, które dotyczy około 4% dzieci urodzonych w Stanach Zjednoczonych. Biorąc pod uwagę, że 50% kobiet w wieku rozrodczym deklaruje spożywanie alkoholu, a połowa wszystkich ciąż jest niezaplanowana, niezamierzona ekspozycja pozostaje aktualnym problemem2. Aby jak najlepiej zrozumieć uszkodzenia wywołane przez etanol oraz stworzyć model do testowania potencjalnych interwencji, opracowaliśmy model rozwojowej ekspozycji na etanol z wykorzystaniem embrionu danio pręgowanego. Danio pręgowane są idealne do tego rodzaju badań teratogennych3-8. Każda para składa setki jaj, które można następnie zebrać bez szkody dla dorosłych ryb. Embrion danio pręgowanego jest przezroczysty i może być łatwo obrazowany przy użyciu wielu rodzajów barwień. Analiza tych embrionów po ekspozycji na etanol w różnych dawkach, czasie trwania i sposobach aplikacji pokazuje, że ogólne wady rozwojowe wywołane przez etanol są spójne z ludzkimi wadami wrodzonymi. W niniejszym opracowaniu opisano podstawowe techniki stosowane do badania i manipulacji w modelu FAS u danio pręgowanych.

Aby zrozumieć molekularne mechanizmy uszkodzeń rozwojowych wywołanych przez etanol, opracowaliśmy model ekspozycji na etanol u rybek danio (zebrafish) i badamy zmiany fizyczne, komórkowe oraz genetyczne występujące po takiej ekspozycji1. Następnie dążymy do znalezienia potencjalnych interwencji i ich szybkiego przetestowania w tym modelu zwierzęcym.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Zespół alkoholowy płodu (FAS) jest ciężką manifestacją ekspozycji embrionu na etanol. Objawia się charakterystycznymi wadami twarzy i narządów, ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie wpływu ekspozycji na etanol na rozwijające się danio pręgowane. Cel ten osiąga się poprzez wstępną ekspozycję zarodków danio pręgowanych na dawki etanolu w standardowej wodzie embrionalnej podczas wczesnego rozwoju. Następnie etanol jest usuwany, a ryby pozostawia się do rozwoju aż do pożądanego punktu czasowego.Następnie w embrionach traktowanych, w porównaniu z kontrolnymi, analizuje się zarówno makroskopowe zmiany fizyczne, jak i zmiany w ekspresji genów. Na koniec embriony poddaje się manipulacjom przy użyciu mRNA, morfolino lub leków, aby ustalić, czy wady rozwojowe wywołane przez etanol mogą zostać zmienione. Ostatecznie połączenie ilościowego PCR i hybrydyzacji in situ wykazuje, że wpływ etanolu na rozwijające się embriony danio pręgowanego jest powiązany ze zmianą ekspresji genów.Kolejne manipulacje poziomami ekspresji genów mogą poprawić stan lub zapobiec wadom rozwojowym wywołanym przez etanol. Techniki, które prezentujemy dzisiaj, rozszerzają naszą wiedzę na temat natury zespołu alkoholowego płodu, a także pozwalają na badanie zachowawczych procesów rozwojowych u kręgowców. Procedurę traktowania embrionów etanolem zademonstruje Steph Erhardt, technik w moim laboratorium.Hodować je z par typu dzikiego do stadium kopułki w temperaturze 28 stopni Celsjusza w wodzie do embrionów. Podzielić embriony z jednego wysadzenia do odpowiedniej liczby szalek, mieszcząc od 10 do 50 embrionów w każdej szalce. Dodać do embrionów roztwór etanolu o stężeniu od 0,2 do 2,5% objętościowo w wodzie dla ryb, a następnie przenieść je z powrotem do inkubatora na okres do 24 godzin po pożądanym czasie ekspozycji.Zastąp etanol zawierający wodę świeżą wodą do embrionów na określony okres rozwoju, aby zebrać mRNA do ilościowej PCR. Umieść dopasowane embriony H w probówkach typu Eppendorf. Odlej wodę z rybami i dodaj bufor lizujący z TCEP.Używając zmechanizowanego homogenizatora, rozdziel fizycznie zarodki, a następnie umieść je w wirówce w celu powolnego wirowania. Przenieś roztwór do kolumny wstępnego oczyszczania, a następnie odwiruj kolumnę, aby usunąć oddzielone duże fragmenty.Do wyizolowania RNA należy użyć zestawu do izolacji RNA. Następnie należy zsyntetyzować cDNA, stosując standardowe metody dla analizy qPCR lub mikromacierzy, aby przygotować zarodki do hybrydyzacji in situ oraz barwienia przeciwciałami. Zarodki w okresie od 6 do 24 godzin po zapłodnieniu należy utrwalić w 4% paraformaldehydzie przez noc w temperaturze 4°C, a następnie trzykrotnie przemyć w PBS z dodatkiem 0,1% Tween.Za pomocą dwóch ostrych pęset pod mikroskopem usuń choon. Następnie przenieś embriony do metanolu, stosując serię wymian cieczy o rosnącym stężeniu metanolu i malejącym stężeniu PBT. Po przeniesieniu embrionów do 100% metanolu, przechowuj je w temperaturze -20°C w celu barwienia chrząstki.Hodować embriony do piątego lub szóstego dnia po zapłodnieniu. Utrwalić je przez noc w 4% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przemyć je trzykrotnie w PBT, aby określić, jakie poziomy ekspresji genów uległy zmianie w wyniku ekspozycji na etanol.Przeprowadź qPCR, rozpoczynając od zaprojektowania starterów w celu ich walidacji. Przetestuj je na trzech próbkach biologicznych. Te kontrolne próbki biologiczne mogą pochodzić od osobników w dowolnym wieku, pod warunkiem że badany gen wykazuje ekspresję w tym konkretnym wieku.Po zweryfikowaniu starterów, należy wykorzystać wcześniej przygotowane cDNA do przeprowadzenia qPCR, analizując próbki w trzech powtórzeniach i uwzględniając próbkę kontrolną dla rybki danio-ostropłetwej; jako kontrolę stosujemy startery do gapdh. Wyniki należy znormalizować względem poziomów gapdh. Następnie oblicza się względny poziom ekspresji genów, stosując metodę 2⁻ΔΔCt.Wariancja w metodzie 2^-ΔΔCT wykazująca różnicę w grupie eksperymentalnej w stosunku do typu dzikiego. W punkcie C przedstawiono dwa konstrukty hybrydyzacyjne. Znakowane sondy rybowe skierowane przeciwko genowi zainteresowania.Następnie inkubuj je z embrionami w tym samym wieku w standardowych warunkach i wykryj wzór hybrydyzacji za pomocą fosfatazy alkalicznej; obrazuj próbki przy użyciu mikroskopu stereoskopowego, aby ocenić rozwój morfogenetyczny, taki jak kształt; obrazuj żywe embriony w celu oceny odległości międzyocznej i długości ciała. Najpierw utrwal embriony w paraformaldehydzie. Następnie wykonaj zdjęcia, aby zbadać wpływ działania alkoholu na rozwijające się struktury chrzęstne w barwionych larwach.Zafiksowano danio pręgowane, używając lc i niebieskiego światła przez kilka godzin aż do nocy, aby zatrzymać rozwój i utrwalić embriony przed obrazowaniem. Analizę śmierci komórek w żywych embrionach przeprowadzono poprzez inkubację w roztworze aine orange w stężeniu 5 mg/mL w PBS przez jedną godzinę. Embriony przemyto trzykrotnie w PBS, następnie zamocowano na szkiełkach przedmiotowych i poddano obrazowaniu przy użyciu mikroskopu konfokalnego, wykorzystując serie Z do stworzenia obrazów kompozytowych.Po zidentyfikowaniu genów, których ekspresja uległa zmniejszeniu w wyniku ekspozycji na etanol, wstrzyknij od 25 do 200 pg/nl capped mRNA dla genu zainteresowania w stadium od jednego do dwóch komórek. Pozostaw jaja do regeneracji w inkubatorze nagrzanym do 28 °C, aż osiągną stadium kopułki, a następnie poddaj je działaniu etanolu w sposób opisany wcześniej. W przypadku genów, których ekspresja wzrosła w wyniku ekspozycji na etanol, przeprowadź ich wyciszenie poprzez wstrzyknięcie ilości od pikogramów do nanogramów morfino antisense do embrionów w stadium od jednego do dwóch komórek.Protokół ten jest podobny do protokołu stosowanego dla mRNA z czapką. W przypadku wstrzykiwania mRNA lub morfolino przeciwko splicingowi, należy zmierzyć wydajność za pomocą R-T-P-C-R, aby porównać ilości transkryptów splicingowanych i niesplingingowanych w celu analizy aktywności genów zależnej od dawki; należy miareczkować wstrzykiwane morfolino i pozwolić zarodkom rozwijać się do pożądanego stadium przed podaniem im etanolu. Narażenie zarodków danio pręgowanego na etanol skutkuje szeregiem wad rozwojowych i genetycznych, które są powiązane z fenotypami występującymi u innych kręgowców.Nieprawidłowy rozwój tkanek osiowych, w tym Noor, prowadzi do skrócenia, a niekiedy przerwania noord, co częściowo skutkuje późniejszymi nieprawidłowościami w somytach, jak pokazano tutaj. Podczas gdy nieleczone kontrole mają wyraźny kształt szewrona, somyty traktowane etanolem przyjmują kształt litery U, obserwowany przy zredukowanym sygnalizowaniu sonic hedgehog. Jak widać tutaj.Kolejnym następstwem ekspozycji na etanol, prawdopodobnie wynikającym z wczesnego opóźnienia rozwojowego i następujących po nim wad Noor, jest skrócenie długości zarodka. Wynik ten jest podobny do utrzymywania się stanu przedpokwitaniowego oraz niskiego wzrostu obserwowanego u dzieci eksponowanych na etanol podczas rozwoju, co sugeruje, że model ryb zebrafish jest istotny dla zrozumienia tej ludzkiej wady wrodzonej. Wykazano na modelach zwierzęcych, że silna ekspozycja na etanol prowadzi do wyraźnych fenotypów zespołu alkoholowego u płodu, w tym synthia i opia.U danio pręgowanych odległość międzygałkowa (IOD) zmniejsza się w sposób zależny od dawki etanolu, co jest zgodne z charakterem ludzkiej wady wrodzonej. Opia występuje jedynie przy bardzo wysokich dawkach, jednak niższe dawki wywołują istotną redukcję IOD, co sugeruje, że ten model zwierzęcy wykazuje podobną wadę rozwoju linii środkowej twarzy. Na niniejszej rycinie porównano wczesne poziomy ekspresji genów six3b oraz glee1 w embrionach nieleczonych i traktowanych etanolem.W obu genach odnotowano obniżony poziom ekspresji w próbkach traktowanych etanolem. Z zastosowaniem hybrydyzacji in situ (NC) przeanalizowano wzorce ekspresji dla six3b oraz gooID, co przedstawiono na schemacie. W tym przypadku oba geny wykazały spadek ekspresji przestrzennej w embrionach traktowanych etanolem w porównaniu z nie traktowanymi kontrolami.Ponieważ oba geny są ekspresowane w tkankach przeznaczonych na tkanki środkowej linii twarzoczaszki, ich redukcja w ósmym godzinie po zapłodnieniu jest spójna z redukcją IOD w późniejszym etapie rozwoju. Po zidentyfikowaniu genów, na które wpływa etanol, istnieją mechanizmy pozwalające na zwiększenie lub zmniejszenie ich ekspresji. W tym przykładzie wstrzyknięto mRNA dla sonic hedgehog, ligandu zwiększającego poziomy glee one, co doprowadziło do cofnięcia wad makroskopowych wynikających z redukcji glee one w embrionach traktowanych etanolem.Iniekcja six three B nie była jednak w stanie odwrócić fenotypu wywołanego ekspozycją na etanol. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak badać wady genetyczne i rozwojowe wywołane przez etanol w rozwijającym się zarodku rybki danio. Techniki zastosowane w tym materiale mogą zostać wykorzystane również przez osoby chcące badać toksyczność innych związków rozpuszczalnych w wodzie w rozwijającym się zarodku kręgowca.

assessing-teratogenic-changes-zebrafish-model-fetal-alcohol

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ocena zmian teratogennych w modelu ryby zebra na tle ekspozycji na alkohol u płodów

W tym artykule, zarodki danio pręgowanego są wykorzystywane do badań przesiewowych toksyczności chemicznej. Toksyczność chemiczna jest skorelowana z odczytami fenotypu. W protokole próbki przedstawiono metodologiczne podejście do przeprowadzania badań przesiewowych toksyczności chemicznej.

Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

Pokazujemy budowę komór parowych z użyciem łatwo dostępnych materiałów, które jednocześnie mieszczą 6 klatek dla myszy. Dalej opisujemy ich zastosowanie w mysim modelu ekspozycji płodu na alkohol równoważnej we wszystkich 3 trymestrzech ciąży ludzkiej. Ten paradygmat eksponuje zwierzęta w czasie ciąży i w dniach poporodowych 1-12.

Budowa komór parowych używanych do wystawiania myszy na działanie alkoholu w czasie odpowiednika wszystkich trzech trymestrów rozwoju człowieka

Celem przedstawionego tutaj protokołu jest opisanie procedur wystawiania szczurów na umiarkowane poziomy alkoholu podczas prenatalnej ewolucji mózgu oraz ilościowe określenie wynikających z tego zmian w zachowaniach społecznych w wieku dorosłym.

Umiarkowana prenatalna ekspozycja na alkohol i kwantyfikacja zachowań społecznych u dorosłych szczurów

Narażenie na teratogeny może powodować wady wrodzone. Danio pręgowany jest przydatny do określania potencjału teratogennego chemikaliów. Wykazujemy użyteczność danio pręgowanego, wystawiając zarodki na działanie różnych poziomów azotynów, a także w różnych momentach ekspozycji. Pokazujemy, że azotyny mogą być toksyczne i powodować poważne wady rozwojowe.

Danio pręgowany jako model do oceny potencjału teratogennego azotynów

Ten protokół opisuje analizy histologiczne wątroby larw danio pręgowanego, które były leczone 2% etanolem przez 24 godziny. Takie ostre leczenie etanolem powoduje stłuszczenie wątroby i obrzęk naczyń krwionośnych wątroby.

Analizy histologiczne ostrego alkoholowego uszkodzenia wątroby u danio pręgowanego

Ta praca opisuje protokół ilościowego oznaczania poziomu etanolu w zarodku danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy, od właściwych metod ekspozycji do przetwarzania zarodków i analizy etanolu.

Kwantyfikacja poziomów etanolu w zarodkach danio pręgowanego za pomocą chromatografii gazowej w przestrzeni głowy

Danio pręgowany został ostatnio wykorzystany jako model do walidacji potencjalnych modyfikatorów promieniowania. Niniejszy protokół opisuje szczegółowe kroki w celu wykorzystania zarodków danio pręgowanego do eksperymentów przesiewowych opartych na promieniowaniu oraz niektóre podejścia obserwacyjne do oceny wpływu różnych metod leczenia i promieniowania.

Larwy danio pręgowanego jako model do oceny potencjalnych radiosensybilizatorów lub obrońców

Ta praca opisuje protokół dla modułowego systemu transgenezy Tol2, metody klonowania opartej na bramie, służącej do tworzenia i wstrzykiwania transgenicznych konstruktów do embrionów zebranego.

System Danio pręgowanego Tol2: modułowe i elastyczne podejście do transgenezy oparte na bramce

Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.

Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

Praca ta opisuje protokół do ilościowego określania kształtu chrząstki czaszkowo-twarzowej za pomocą wolnego oprogramowania (tpsDigs2, MorphoJ i PAST) do pomiaru zmian struktury twarzy u larw danio dano.

Morfometryczne analizy kształtu: narzędzie analityczne do kwantyfikacji kształtu czaszkowo-twarzowego u danio pręgowanego

Poznaj metodę oceny zmian teratogennych wywołanych etanolem u zarodków Danio rerio. Technika obejmuje analizę ekspresji genów i manipulację mRNA w celu identyfikacji potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Ocena zmian teratogennych w modelu ekspozycji płodowej na alkohol u rybek danio pręgowanych

Przeglądaj więcej filmów