Kriokonserwacja i odzyskiwanie nasienia myszy za pomocą zestawu I·Cryo Kit
12 grudnia 2011
Tutaj demonstrujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do kriokonserwacji nasienia myszy. Rozwój zarodka w fazie dwukomórkowej z zamrożonymi i rozmrożonymi plemnikami uległ konsekwentnej poprawie w 5 szczepach myszy przy użyciu tego zestawu. W ciągu 1,5 roku 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy zostało zarchiwizowanych przez kriokonserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskanych przez IVF.
Ogólnym celem tej procedury jest kriokonserwacja nasienia myszy. Osiąga się to poprzez najpierw pobranie plemników z myszy EPI za pomocą słomek do kriokonserwacji. Słomki są następnie zamrażane w ciekłym azocie, gdzie są przechowywane do czasu odzyskania poprzez rozmrożenie ich w ciepłej wodzie.
Odzyskane plemniki myszy są ostatecznie wykorzystywane do zapłodnienia in vitro. Główną zaletą tego zestawu w porównaniu z istniejącymi metodami jest to, że zestaw zawiera wszystkie niezbędne materiały potrzebne do krioprezerwacji i odzyskiwania nasienia myszy: Ogólnie rzecz biorąc, u osób nowych w tej metodzie może się udusić podczas przenoszenia i ładowania słomek. Zacznij od złożenia 15 słomek do krioprezerwacji plemników na linię myszy, które mają być poddane kriokonserwacji.
Najpierw podłącz każdą słomkę o pojemności 0,25 mililitra do strzykawki o pojemności jednego mililitra za pomocą bawełnianej zatyczki znajdującej się najbliżej strzykawki. Następnie załaduj osiem centymetrów pożywki IVF do każdej słomki, a następnie jeden centymetr powietrza. Po trzecie, oznacz każdą z 15 słomek nazwą linii, która ma być zachowana dla każdej linii, która ma być kriokonserwowana.
Napełnij studzienkę naczynia z czterema dołkami 240 mikrolitrami krioochronnego środka. Przymocuj pipetę o pojemności jednego mililitra do uchwytu kanistra do zamrażania, aby przedłużyć uchwyt. Na koniec napełnij izolowane pianką pudełko dostarczone z zestawem 15 centymetrami ciekłego azotu i zamknij pokrywę eutanazji.
Dwa płodne dorosłe samce myszy. Aby każda linia została poddana kriokonserwacji i chirurgicznie, należy usunąć ich kodalne EPI. Umieść mysz w grzbietowym recu i otwórz brzuszną ścianę ciała.
Delikatnie pociągnij za ogromny szacunek i usuń nadmiar tłuszczu. Następnie zlokalizuj najądrze i usuń je w stanie nienaruszonym za pomocą małego kawałka szybkiego szacunku. Umieść EPI w studzience z przygotowanych czterech dołków wypełnionych CPA pod lunetą preparacyjną.
Wykonaj od pięciu do siedmiu podłużnych nacięć w każdym najądrzu. Następnie za pomocą kleszczy delikatnie ściśnij każdą szybką różnicę. Aby wypchnąć plemniki, inkubuj mieszaninę CPA i najądrza w temperaturze pokojowej przez trzy do pięciu minut.
Delikatnie mieszaj naczynie ręcznie dwa do trzech razy podczas inkubacji. Umożliwi to plemnikom wypłynięcie przez aspirację. Załaduj każdą przygotowaną słomkę pięcioma milimetrami zawiesiny nasienia, a następnie jednym centymetrem powietrza.
W procesie zamrażania ważne jest, aby wszystkie słomki były załadowane równomiernie. Po załadowaniu wszystkich 15 słomek ostrożnie zgrzej oba końce każdej słomki. Aby zapewnić przeżycie plemników, zakończ proces dla wszystkich 15 słomek w ciągu 10 minut.
Po przygotowaniu wszystkich słomek załaduj je do kolumny nasienia w kanistrze do zamrażania. Najpierw umieść kanister w pudełku piankowym i pozwól mu unosić się pionowo w ciekłym azocie. Przez 10 minut kanister musi unosić się pionowo, w przeciwnym razie wpłynie to na szybkość zamrażania plemników.
Następnie zanurz kanister w ciekłym azocie. W ten sposób plemniki są kriokonserwowane i są gotowe do długotrwałego przechowywania ciekłego azotu. Około 60 godzin przed planowanym odzyskaniem plemników.
Postępuj zgodnie z pisemnym protokołem, aby przeprowadzić super owulację u kobiet przed zapłodnieniem in vitro. Dla każdej słomki przeznaczonej do rozmrożenia należy przygotować i zrównoważyć wszystkie podłoża przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Materiały te obejmują 35-milimetrową szalkę Petriego z 90-mikrolitrową kroplą pożywki do leczenia nasienia pokrytą olejem.
35-milimetrowa szalka Petriego z trzema mililitrami pożywki IVF, która służy jako naczynie do krojenia i na każde pięć super owulowanych samic przygotowuje danie IVF, które jest jedną studzienką z czterostudzienkowej płytki załadowanej 500 mikrolitrami pożywki IVF. Do każdej płytki do zapłodnienia in vitro przygotuj naczynie do mycia, które jest 35-milimetrową szalką Petriego z trzema mililitrami KSOM oraz naczynie do hodowli zarodków, które jest 35-milimetrową szalką Petriego z 50 mikrolitrowymi kroplami pożywki KSOM pokrytej olejem. Po szybkim przygotowaniu wszystkich wymaganych materiałów wyjmij słomkę z magazynu i umieść ją w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dwie do trzech minut.
Osusz słomę. Następnie wykonaj kątowe nacięcie w kolumnie powietrza poniżej bawełnianej zatyczki. Na drugim końcu słomki wykonaj kolejne cięcie pod kątem nad inną kolumną powietrzną.
Unikaj przecinania kolumny nasienia. Teraz odessać zawiesinę nasienia z końca słomki za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów i umieścić ją w środku pożywki do badania nasienia. Kropla. Następnie inkubuj naczynie przez 45 do 60 minut.
Podczas inkubacji plemników należy wyizolować wzdęcia samic z super owulacją i przenieść je do naczynia do krojenia. Użyj igły lub kleszczyków o rozmiarze 30, aby rozerwać każdy jajowód, uwalniając kompleksy cytów wzgórka. Przenieś C C od pięciu kobiet do każdego IVF.
Cóż, przy minimalnej ilości mediów. Unikaj przenoszenia tłuszczu i krwi, ponieważ brudne podłoże hamuje efektywność nawożenia. Po inkubacji należy pobrać od 10 do 15 mikrolitrów zawiesiny nasienia z obwodu kropli STM i zdeponować zawiesinę w jednym zapłodnieniu in vitro.
Cóż, teraz hoduj komórki przez cztery do sześciu godzin w celu zapłodnienia. Po zapłodnieniu przepuść zarodki przez co najmniej 2-tyczkowe płukanie SOM w naczyniu do mycia. Potem kultura.
Zarodki w KSOM do momentu osiągnięcia pożądanego etapu rozwojowego. Plemniki z pięciu szczepów myszy wsobnych Charles River zostały zamrożone. Współczynniki ochrony ruchliwości plemników i szybkiej ruchliwości postępowej wahały się od 81% do 47% w pięciu szczepach tych plemników.
Wskaźniki zapłodnienia in vitro z zamrożonym, rozmrożonym nasieniem wahały się w różnych szczepach od 26 do 88% w ciągu półtora roku. W sumie 49 genetycznie modyfikowanych linii myszy zostało zarchiwizowanych przez kriokonserwację nasienia, a następnie odzyskanych przez IVF w czterech różnych szczepach żeńskich. C 57 sześć BC DBA jeden i 1 29 SV Po opanowaniu techniki kriokonserwacji nasienia można wykonać w ciągu 30 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
W przypadku tej procedury ważne jest, aby przepływać do kanistra pionowo i ciekły azot.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestaw I•Cryo do skutecznej kriokonserwacji plemników myszy, wykazując poprawę rozwoju embrionów u wielu szczepów myszy. Zestaw ten ułatwia archiwizację genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez kriokonserwację plemników i ich późniejsze odzyskanie za pomocą IVF.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozrodu
- Techniki krio konserwacji
- Zapłodnienie in vitro (IVF)
Wstęp
- Kriokonserwacja plemników myszy ma kluczowe znaczenie dla badań genetycznych.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niską wydajnością i brakiem łatwości w użyciu.
- Zestaw I•Cryo ma na celu usprawnienie procesu kriokonserwacji.
- Skuteczne odzyskanie plemników jest niezbędne dla rezultatów procedury IVF.
Cel badania
- Ocena skuteczności zestawu I•Cryo w kriokonserwacji plemników myszy.
- Ocena wpływu kriokonserwowanych plemników na rozwój zarodków.
- Archiwizacja genetycznie zmodyfikowanych linii myszy na potrzeby przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Pobieranie plemników z najądrza myszy przy użyciu słomek do krio konserwacji.
- Zamrażanie plemników w ciekłym azocie do długoterminowego przechowywania.
- Rozmrażanie plemników do wykorzystania w procedurach IVF.
- Ocena ruchliwości plemników i wskaźników sukcesu IVF w różnych szczepach.
Główne wyniki
- Zaobserwowano poprawę rozwoju embrionów w 5 szczepach myszy z zastosowaniem zestawu I•Cryo.
- Pomyślnie zarchiwizowano i odzyskano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.
- Wskaźniki ruchliwości plemników w poszczególnych szczepach wynosiły od 47% do 81%.
- Wskaźniki IVF w przypadku mrożonych i rozmrożonych plemników wahały się od 26% do 88%.
Wnioski
- Zestaw I•Cryo znacząco zwiększa efektywność kriokonserwacji plemników.
- Skuteczne odzyskanie linii genetycznie zmodyfikowanych potwierdza jego użyteczność w badaniach.
- Dalsza optymalizacja metody może skrócić czas przetwarzania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kriokonserwacja plemników myszy stanowi kosztową i skalowalną metodę archiwizowania szczepów modyfikowanych genetycznie, co pozwala ograniczyć zależność od żywych kolonii zwierząt i zminimalizować ryzyko utraty linii. Zestaw I•Cryo zwiększa pewność w zakresie zachowania szczepów poprzez poprawę ruchliwości plemników po rozmrożeniu oraz rozwoju embrionów uzyskanych drogą IVF w wielu liniach inbredowych. Wspiera to strategiczne zarządzanie portfolio w badaniach przedklinicznych, umożliwiając niezawodne długoterminowe przechowywanie i odzyskiwanie cennych modeli chorób na żądanie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną modeli genetycznych poprzez zapewnienie możliwości odzyskania plemników do fenotypowego przesiewu opartego na IVF.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza obciążenie związane z hodowlą zwierząt oraz koszty utrzymywania żywych kolonii modeli o niskiej przepustowości lub modeli indukowalnych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Wartość naukowa: Zapewnia standaryzowane źródło plemników dla spójnych testów IVF, wspierając odtwarzalną ocenę wpływu związków na zapłodnienie i wczesny rozwój embrionalny.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie testów dzięki wykorzystaniu kriobankowanych plemników, eliminując zmienność wynikającą z różnic między osobnikami męskimi lub między partiami przy pobieraniu świeżych próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na zachowanie integralności genetycznej modeli chorobowych w czasie, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych oraz zapewnienie ciągłości eksperymentalnej między pokoleniami.
- Wartość operacyjna: Wspiera współpracę wieloośrodkową poprzez umożliwienie dystrybucji kriosuplementowanych plemników zamiast żywych zwierząt, co zmniejsza stopień skomplikowania transportu oraz problemy związane z bezpieczeństwem biologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania – od wczesnego tworzenia modeli po walidację przedkliniczną – stanowiąc pomost między inżynierią genetyczną a fenotypowaniem funkcjonalnym za pomocą IVF.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie odzyskiwania kriokonserwowanych plemników do IVF, co pozwala na ocenę wpływu modyfikacji genetycznych na płodność i wczesną embriogenezę.
- Przesiewy: Umożliwia prowadzenie standaryzowanych analiz opartych na IVF z wykorzystaniem rozmrożonych plemników, co poprawia powtarzalność oceny funkcji plemników, ich kapacytacji oraz zdolności do zapłodnienia.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty, takie jak ruchliwość plemników (% progresywna), szybka ruchliwość progresywna oraz tempo rozwoju embrionów, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w zależności od stabilności modelu.
- Badania translacyjne: Łączy modyfikacje genetyczne z efektami rozwojowymi poprzez umożliwienie IVF z wykorzystaniem kriokonserwowanych plemników, wspierając przesiewy fenotypowe powiązane z biomarkerami w embrionach przedimplantacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę kriobankowania do ciągłego archiwizowania i odzyskiwania linii GM, co ogranicza redundantne wysiłki związane z ponowną derywacją w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie zachowania modelu, wykazując poprawę ruchliwości i rozwoju zarodków w porównaniu z podstawowymi metodami CPA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces krio konserwacji dzięki komponentom w formie zestawów, co redukuje zmienność wynikającą z działań użytkownika oraz czas szkolenia.
- Wartość strategiczna: Obniża długoterminowe koszty utrzymania szczepów i zmniejsza ryzyko nieodwracalnej utraty linii z powodu niepowodzeń w rozrodzie, dryfu genetycznego lub wybuchu patogenu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii GM do archiwizacji w oparciu o wartość strategiczną z uwzględnieniem ryzyka, zapewniając pewność co do możliwości ich przyszłej regeneracji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość techniczna w zakresie pobierania nasienia, obchodzenia się ze słomkami oraz zgrzewania termicznego w celu zapewnienia integralności próbek.
- Procedura zależy od dostępu do przechowywania w ciekłym azocie oraz sprzętu do kontrolowanego rozmrażania (kąpiel wodna 37°C) w celu uzyskania spójnych wyników po rozmrożeniu.
- Niezbędne są zestandaryzowane pożywki do IVF oraz protokoły superowulacji dla zapewnienia niezawodnych wyników zapłodnienia i hodowli zarodków.
- Efektywność może się różnić w zależności od tła genetycznego, co wymaga optymalizacji etapów inkubacji i płukania specyficznej dla danej linii.
- Metoda jest ograniczona koniecznością zapewnienia płodnych samic oraz wiedzy eksperckiej z zakresu IVF w celu odzyskania plemników, co ogranicza bezpośrednie zastosowanie w testach opartych na naturalnym kojeniu.
