Name: Kriokonserwacja i odzyskiwanie nasienia myszy za pomocą zestawu I·Cryo Kit (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj metodę kriokonserwacji nasienia myszy za pomocą zestawu I·Cryo Kit. Technika ta umożliwia archiwizację linii genetycznie modyfikowanych myszy poprzez zamrażanie w ciekłym azocie i odzyskiwanie przez zapłodnienie in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania przedstawione w niniejszej pracy były wspierane przez firmę Charles River. Autorzy są ogromnie wdzięczni grupie Genetically Engineered Models and Services oraz personelowi oddziału embriologii za opiekę nad zwierzętami i iniekcje hormonów.

1. Kriokonserwacja plemników myszy
<ol>
	<li>Dla każdej linii przeznaczonej do krio konserwacji, przed rozpoczęciem przygotuj następujące elementy:
	<ol>
		<li>1 dołek płytki 4-dołkowej zawierający 240 l zestawowego CPA</li>
		<li>15 słomek do krio konserwacji plemników w następujący sposób:
		<ol>
			<li>Połącz słomki 0,25 ml ze strzykawkami 1 ml tak, aby bawełniany czop znajdował się najbliżej strzykawki. Do każdej słomki naciągnij 8 cm (około 160 μl) medium IVF, a następnie 1 cm powietrza. Oznacz słomki nazwą linii przeznaczonej do konserwacji.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>LN2 powinien znajdować się na głębokości 15 cm w pudełku styropianowym. Zamknij pokrywę.</li>
	<li>Uśmierć 2 samce myszy z każdej linii przeznaczonej do krio konserwacji. Myszy powinny być w wieku od 10 do 60 tygodni. Usuń oba najogonowe najaąd라 (epididymides) wraz z przewodami nasiennymi od każdej myszy.</li>
	<li>Umieść najaąd라 w uprzednio przygotowanym dołku płytki 4-dołkowej zawierającym CPA (krok 1.1).</li>
	<li>Wykonaj 5-7 nacięć wzdłużnych w każdym najaądle i delikatnie uciśnij każdy przewód nasienny, aby wypchnąć plemniki.</li>
	<li>Delikatnie wstrząśnij ręcznie mieszaniną CPA i najaądla w temperaturze pokojowej przez 3-5 minut. Pozwoli to plemnikom wypłynąć.</li>
	<li>Używając wcześniej przygotowanej słomki, odessij 5 mm (około 10 μl) zawiesiny plemników, a następnie 1 cm powietrza.</li>
	<li>Powtórz ten proces, aż do zapełnienia maksymalnie 15 słomek. W celu zapewnienia najlepszej przeżywalności plemników, napełnij i zapieczętuj słomki w ciągu 10 minut.</li>
	<li>Ostrożnie zapieczętuj termicznie oba końce słomki. Umieść słomki w kanistrze do mrożenia, zaczynając od słupa plemników.</li>
	<li>Do kanistra przymocuj dołączoną do zestawu pipetę 1 ml, aby przedłużyć uchwyt. Umieść kanister w LN2 w pudełku styropianowym przez otwór w pokrywie. Pozostaw kanister w pozycji pionowej, aby dryfował w LN2 przez 10 minut.</li>
	<li>Zanurz kanister w LN2. Plemniki zostały poddane krio konserwacji i mogą zostać przeniesione do długoterminowego przechowywania w LN2.</li>
	<li>Kanistra nie należy używać do następnej linii, dopóki nie ogrzeje się do temperatury pokojowej.</li>
</ol>
2. Superowulacja u myszy
<ol>
	<li>Zazwyczaj należy używać młodych samic myszy o tym samym tle genetycznym co dawcy plemników.</li>
	<li>Myszki powinny ważyć ok. 12 g (wiek 3-4 tygodnie).</li>
	<li>Wykonuje się wstrzyknięcie dosytronialne 5-10 IU gonadotropiny surowiczej klaczy ciężarnej (PMSG).</li>
	<li>Należy odczekać 46-48 godzin.</li>
	<li>Wykonuje się wstrzyknięcie dosytronialne 5-10 IU ludzkiej gonadotropiny kosmórki płodowej (hCG).</li>
	<li>Oocyty należy pobrać 14-16 h po wstrzyknięciu hCG zgodnie z poniższym opisem.</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie plemników myszych i IVF
<ol>
	<li>Przed IVF, dla każdej słomki przeznaczonej do rozmrożenia, przygotować następujące elementy i inkubować przez co najmniej jedną godzinę w inkubatorze CO2 w temperaturze 37°C.
	<ol>
		<li>Szalka do inkubacji plemników: jedna szalka Petriego 35 mm z kroplą 90 μl medium do traktowania plemników (STM) przykrytą olejem.</li>
		<li>Szalka do wycinania: do pobrania oocytów od maksymalnie 10 superowulowanych samic, jedna szalka Petriego 35 mm z 3 ml medium do IVF.</li>
		<li>Dołek do IVF: dla każdej grupy 5 superowulowanych samic do IVF, jeden dołek w płytce 4-dołkowej z 500 μl medium do IVF (na przykład przy użyciu 10 superowulowanych samic będą potrzebne 2 dołki...)</li>
		<li>Szalka do płukania: jedna szalka Petriego 35 mm z 3 ml zoptymalizowanego medium potasowego simplex (KSOM) do płukania każdego użytego dołka płytki do IVF</li>
		<li>Szalka do hodowli: jedna szalka Petriego 35 mm z kroplami 50 μl medium KSOM przykrytymi olejem do hodowli embrionów z każdego dołka płytki do IVF.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjąć słomkę z LN2 i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na 2-3 minuty.</li>
	<li>Wyjąć słomkę z kąpieli wodnej i wytrzeć, aby usunąć nadmiar wody. Wykonać pierwsze cięcie blisko pierwszej kolumny powietrza znajdującej się najbliżej zatyczki bawełnianej. Przeciąć słomkę w medium do IVF; przed kolumną plemników wciąż powinna być widoczna kolumna powietrza.</li>
	<li>Następnie przeciąć koniec słomki w drugiej kolumnie powietrza, uważając, aby nie przeciąć kolumny plemników. Cięcie wykonać pod kątem 45° – znacznie ułatwi to aspirację plemników.</li>
	<li>Aspirować zawiesinę plemników z dystalnego końca słomki za pomocą pipety 200 μl.</li>
	<li>Umieścić zawiesinę plemników w centrum kropli STM i inkubować szalkę przez 45-60 minut w inkubatorze 37°C z 5% CO2.</li>
	<li>Podczas inkubacji plemników wypreparować jajowody superowulowanych samic do szalki do wycinania. Użyć igły 30 g lub pęsety, aby przerwać każdy jajowód, uwalniając kompleksy cumulus-oocyt (COC). Należy unikać przedostawania się tłuszczu i krwi do medium do IVF, ponieważ zanieczyszczone medium wymaga dodatkowych etapów płukania.</li>
	<li>Po przerwaniu wszystkich jajowodów przenieść kompleksy COC od 5 samic do każdego z dołków do IVF. Liczba kompleksów COC uzyskanych w wyniku superowulacji jest silnie zależna od szczepu.</li>
	<li>Pobrać 10-15 μl plemników z obwodu kropli STM i przeprowadzić zapłodnienie w jednym dołku IVF około 14-16 godzin po iniekcji hCG. Powtórzyć zapłodnienie dla każdego użytego dołka. Końcowe stężenie plemników wyniesie około 1 milion/ml.</li>
	<li>Kulturować wspólnie plemniki i oocyty przez 4-6 godzin w inkubatorze 37°C z 5% CO2.</li>
	<li>Przepłukać embriony medium KSOM minimum 2 razy i hodować w kroplach KSOM w celu rozwoju w inkubatorze 37°C z 5% CO2.</li>
	<li>Wskaźnik IVF obliczono jako liczbę embrionów w stadium dwóchkomórkowym w stosunku do całkowitej liczby użytych oocytów po nocnej hodowli.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Zamrożono plemniki pochodzące z 5 inbredowych szczepów myszy Charles River. Współczynniki ochrony obliczono poprzez podzielenie wartości oceny zamrożonych plemników przez wartości oceny plemników świeżych. Współczynniki ochrony ruchliwości plemników wynosiły odpowiednio 60,2%, 81,3%, 78,6%, 66,5% oraz 61,0% dla C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl. Współczynniki ochrony dla szybkiej ruchliwości progresywnej wynosiły odpowiednio 47,3%, 69,4%, 57,0%, 52,8% oraz 54,1% w przypadku C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl (Rys. 1).
Wskaźniki IVF z użyciem rozmrożonych plemników wyniosły odpowiednio 55,7%, 26,4%, 87,3%, 87,8% oraz 26,2% dla szczepów C57BL/6NCrl, 129S2/SvPasCrl, FVB/NCrl, DBA/2NCrl i BALB/cAnNCrl (Ryc. 2).
W okresie 1,5 roku 49 linii myszy GM zarchiwizowano poprzez kriokonserwację plemników. Linie te zostały później pomyślnie odzyskane (definiowane jako urodzenie żywych szczeniąt) za pomocą IVF u 4 szczepów samic (C57BL/6, BALB/c, DBA/1 oraz 129Sv) (Rys. 3).
<img alt="Wykres współczynnika ochrony; badanie ruchliwości szczepów myszy; wykres słupkowy; analiza zmienności genetycznej." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Współczynniki ochrony ruchliwości oraz szybkiej ruchliwości progresywnej plemników u myszy
<img alt="Wykres słupkowy; rozwój embrionów dwukomórkowych (%) w różnych szczepach myszy; wyniki badań genetycznych." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2."> 
Rysunek 2. In vitro zapłodnienie zamrożonymi i rozmrożonymi plemnikami u myszy
<img alt="Wykres rozwoju zarodków szczepów genetycznych; wykres słupkowy porównuje wyniki oocytów IVF w zależności od linii dawców." src="/files/ftp_upload/3713/3713fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3. In vitro zapłodnienie zamrożonym i rozmrożonym nasieniem u myszy GM

<ol><li>Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+in+the+presence+of+raffinose+and+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Fertil%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol.</a> J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).</li>
<li>Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+normal+young+following+transfer+of+mouse+embryos+obtained+by+in+vitro+fertilization+using+cryopreserved+spermatozoa%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa.</a> Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+of+cryopreserved+mouse+spermatozoa+affected+by+temperature+of+collection+and+rate+of+thawing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing.</a> Cryobiology. 35, 46-52 (1997).</li>
<li>Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+numbers+of+mice+established+by+in+vitro+fertilization+with+cryopreserved+spermatozoa%3A+implications+and+applications+for+genetic+resource+banks%2C+mutagenesis+screens%2C+and+mouse+backcrosses%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm.+Genome%22%5BJournal%5D)">Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses.</a> Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).</li>
<li>Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+fertilization+with+cryopreserved+inbred+mouse+sperm%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm.</a> Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).</li>
<li>Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+freezing+and+in+vitro+fertilization+in+three+substrains+of+C57BL%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Assoc.+Lab.+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice.</a> J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).</li>
<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+mouse+spermatozoa+and+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization.</a> Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).</li>
<li>Mazur, P., Koshimoto, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+intracellular+ice+formation+the+cause+of+death+of+mouse+sperm+frozen+at+high+cooling+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Biol.+Reprod%22%5BJournal%5D)">Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates.</a> Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).</li>
<li>Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+by+which+mouse+spermatozoa+are+injured+during+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing.</a> J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).</li>
<li>Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+signaling+pathways+involved+in+sperm+acquisition+of+fertilizing+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity.</a> J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).</li>
<li>Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserving%2C+distributing+and+managing+genetically+modified+mouse+lines+by+sperm+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation.</a> PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Charles River, producenta tego zestawu.

Od 1990 roku podstawowy protokół mrożenia plemników z wykorzystaniem 18% rafinozy i 3% mleka odtłuszczonego okazał się niezawodny u wielu szczepów myszy, a kriokonserwacji poddano liczne linie myszy 1,2,3,4,5,6,7. Główne przyczyny uszkodzeń komórek plemników podczas procesu mrożenia i rozmrażania wiązano z tworzeniem się kryształków lodu 8,9 oraz reaktywnymi formami tlenu 10. Badano wpływ suplementacji medium do mrożenia wymiataczami wolnych rodników, takimi jak aminokwasy, oraz reduktorami, takimi jak monotioglicerol, co okazało się znacząco zwiększać odsetek IVF z użyciem plemników rozmrożonych u szczepów inbredalnych, w tym C57BL/6 11,6.
W niniejszym protokole opracowaliśmy nowy zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy poprzez optymalizację podstawowego CPA przy użyciu komercyjnie dostępnych przeciwutleniaczy i blokerów lodu oraz poprzez modyfikację procedury mrożenia plemników i IVF. W przypadku plemników z pięciu inbredowych szczepów myszy mrożonych za pomocą zestawu I•Cryo zaobserwowano wskaźniki ochrony ruchliwości plemników (&gt;60%) oraz ruchliwości progresywnej szybkiej (&gt;45%). Wskaźnik rozwoju embrionów do stadium 2 komórek przy użyciu plemników rozmrożonych w 5 inbredowych szczepach myszy uległ znacznej poprawie w porównaniu z wynikami uzyskanymi przy zastosowaniu podstawowego CPA 11,6.
Podczas korzystania z zestawu użytkownik przygotowuje skoncentrowaną zawiesinę plemników poprzez zamrożenie nasienia od 2 samców dla każdej linii. Dzięki zamrożeniu tylko 15 słomek proces ten jest szybki, łatwy i zajmuje mniej miejsca w magazynie podczas przechowywania krótkoterminowego lub długoterminowego. W większości przypadków linie myszy można odzyskać, rozmrażając tylko 1 lub 2 słomki.

<table><tbody><tr><td>CPA</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczony w zestawie</td></tr><tr><td>STM</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczony w zestawie</td></tr><tr><td>Pożywka do IVF</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczona w zestawie</td></tr><tr><td>Plastikowa słomka 0,25 ml</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczona w zestawie</td></tr><tr><td>Kapsułka do mrożenia nasienia</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczona w zestawie</td></tr><tr><td>Trzpień i kielich</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>Dostarczone w zestawie</td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Należy sprawdzić pod kątem wpływu na embriony</td></tr><tr><td>Pożywka KSOM</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 35 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Zgrzewarka termiczna</td><td>ABTEC</td><td>TISH-200</td><td></td></tr><tr><td>Wielodobojka 4-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>73521-424</td><td></td></tr><tr><td>Pipet automatyczna</td><td>Gilson, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kondensatory do pipet</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator 37&amp;#x00B0;C + 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System przechowywania w LN&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Różne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna 37&amp;#x00B0;C</td><td>VWR international</td><td>89032-196</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ800</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Intervet Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>EMD Millipore</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1cc z igłą 26G 3/8</td><td>BD Biosciences</td><td>BD309625</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-nożyczki do dyssekcji</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 gauge &amp;frac12;</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6802</td><td></td></tr><tr><td>Pęsety</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5135, RS-5110, RS-5005</td><td></td></tr></tbody></table>

kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu i·cryo

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Od czasu wprowadzenia technologii transgenezy i nokautu stworzono tysiące nowych genetycznie zmodyfikowanych (GM) szczepów myszy. Wiele z tych cennych zwierząt istnieje jedynie w formie żywych osobników, bez planu awaryjnego na wypadek sytuacji kryzysowej. Kriokonserwacja zarodków może zapewnić takie zabezpieczenie, jednak jest kosztowna, może być procedurą długotrwałą i zazwyczaj wymaga użycia licznej grupy zwierząt, aby odnieść sukces. Od czasu odkrycia, że plemniki myszy można skutecznie kriokonserwować za pomocą podstawowego środka krioprotekcyjnego (CPA) składającego się z 18% rafinozy i 3% mleka odtłuszczonego, kriokonserwacja plemników stała się akceptowalną i ekonomicznie opłacalną procedurą archiwizowania, dystrybucji i odzyskiwania tych cennych szczepów.
 W niniejszym materiale prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Plemniki z pięciu powszechnie stosowanych szczepów myszy inbredowych zostały zamrożone przy użyciu tego zestawu, a następnie rozmrożone. W pięciu szczepach myszy inbredowych zaobserwowano wyższe wskaźniki ochrony ruchliwości plemników (&gt; 60%) oraz ruchliwości progresywnej szybkiej (&gt; 45%) w porównaniu z grupą kontrolną (podstawowy CPA) dla plemników zamrożonych za pomocą tego zestawu. Rozwój embrionów do stadium dwóch blastomerów po IVF z użyciem odzyskanych plemników uległ konsekwentnej poprawie we wszystkich 5 badanych szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 linii myszy GM poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie odzyskano je w procesie IVF.

W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Od czasu wprowadzenia transgenezy oraz technologii knockoutu stworzono tysiące nowych genetycznie zmodyfikowanych (GM) szczepów myszy. Wiele z nich...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja plemników myszy. Jest to realizowane poprzez uprzednie pobranie plemników z naczyń rozpylnych (EPI) myszy do słomek do kriokonserwacji. Następnie słomki są mrożone w ciekłym azocie, w którym są przechowywane aż do momentu ich odzyskania poprzez rozmrożenie w ciepłej wodzie.Odizolowane plemniki mysie są ostatecznie wykorzystywane do zapłodnienia in vitro. Główną zaletą tego zestawu w stosunku do istniejących metod jest fakt, że zawiera on wszystkie materiały niezbędne do kriokonserwacji i odzyskiwania plemników mysich. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z obsługą i napełnianiem słomek. Należy rozpocząć od przygotowania 15 słomek do kriokonserwacji plemników na każdą linię myszy przeznaczoną do zamrożenia.Najpierw podłącz każdą słomkę o pojemności 0,25 mililitra do strzykawki o pojemności jednego mililitra, tak aby bawełniana zaponka znajdowała się najbliżej strzykawki. Następnie wprowadź do każdej słomki 8 cm medium do IVF, a po nim 1 cm powietrza. W trzecim kroku opisz każdą z 15 słomek nazwą linii, która ma zostać kriokonserwowana dla każdej linii przeznaczonej do kriokonserwacji.Napełnij dołek płytki czterodołkowej 240 µL środka krioprotekcyjnego. Do uchwytu pojemnika do zamrażania przymocuj pipetę o pojemności 1 ml, aby wydłużyć uchwyt. Na koniec nalej do dołączonego do zestawu pudełka z izolacją piankową 15 cm ciekłego azotu i zamknij pokrywę.Dwa płodne, dorosłe samce myszy. W przypadku każdej linii przeznaczonej do kriokonserwacji i zabiegu chirurgicznego, należy usunąć ich EPI z okolic ogona. Umieść mysz w pozycji grzbietowej i otwórz brzuszną ścianę ciała.Delikatnie pociągnij za deferent i usuń nadmiar tkanki tłuszczowej. Następnie zlokalizuj najduszek i usuń go w całości wraz z niewielkim fragmentem deferenta. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść najduszki w dołku przygotowanej płytki czterodołkowej wypełnionej CPA.W każdym najądrzu wykonaj od pięciu do siedmiu nacięć podłużnych. Następnie, używając pęsety, delikatnie uciśnij każdą różnicę. Aby wypchnąć plemniki, inkubuj mieszaninę CPA i najądrza w temperaturze pokojowej przez trzy do pięciu minut.Podczas inkubacji delikatnie i ręcznie potrząśnij naczyniem dwa lub trzy razy. Pozwoli to plemnikom wypłynąć w procesie aspiracji. Do każdej przygotowanej słomki pobierz 5 mm zawiesiny plemników, a następnie pozostaw 1 cm powietrza.Dla procesu mrożenia istotne jest, aby wszystkie słomki były napełnione równomiernie. Po napełnieniu wszystkich 15 słomek należy ostrożnie zgrzać termicznie oba końce każdej z nich. Aby zapewnić przeżywalność plemników, cały proces dla wszystkich 15 słomek należy przeprowadzić w ciągu 10 minut.Po przygotowaniu wszystkich słomek, załaduj je do kolumny na nasienie w pojemniku do mrożenia. Najpierw umieść pojemnik w piankowej skrzyni i pozwól mu unosić się pionowo w ciekłym azocie. Pojemnik musi unosić się pionowo przez 10 minut, w przeciwnym razie szybkość mrożenia nasienia zostanie zaburzona.Następnie zanurz pojemnik w ciekłym azocie. W ten sposób spermatozoa zostają kriokonserwowane i są gotowe do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Około 60 godzin przed planowanym odzyskiwaniem nasienia.Należy postępować zgodnie z protokołem pisemnym w celu wywołania nadliczbowej owulacji u samic przed zabiegiem IVF. Dla każdej słomki przeznaczonej do rozmrożenia należy przygotować i inkubować wszystkie media przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Materiały te obejmują 35 mm szalkę Petriego z 90 µl kroplą medium do obróbki nasienia przykrytą warstwą oleju.Przygotuj 35-milimetrową szalkę Petriego z trzema mililitrami pożywki do IVF, która posłuży jako naczynie do cięcia; dodatkowo dla każdego pięciu superowulowanych samic przygotuj naczynie do IVF, czyli jedną studnię płytki czterostudniowej wypełnioną 500 mikrolitrami pożywki do IVF. Dla każdego naczynia do IVF przygotuj naczynie do płukania, którym jest 35-milimetrowa szalka Petriego z trzema mililitrami KSOM, oraz naczynie do hodowli embrionów, czyli 35-milimetrowa szalka Petriego z 50-mikrolitrowymi kroplami pożywki KSOM przykrytymi olejem. Po przygotowaniu wszystkich niezbędnych materiałów szybko wyjmij słomkę z miejsca przechowywania i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na dwie do trzech minut.Osusz słomkę. Następnie wykonaj skośne cięcie w kolumnie powietrza poniżej bawełnianego zatyczki. Na drugim końcu słomki wykonaj kolejne skośne cięcie nad drugą kolumną powietrza.Należy unikać przerwania kolumny nasienia. Następnie, używając pipety 200 µL, aspirujemy zawiesinę plemników z końca słomki i przenosimy ją do centrum kropli medium do obróbki nasienia. Następnie inkubujemy szalkę przez 45 do 60 minut.Podczas inkubacji plemników wyizoluj ujścia jajowodów (ucs) od superowulowanych samic i przenieś je do naczynia doyęcia. Użyj igły o rozmiarze 30 G lub pęsety, aby przerwać każdy jajowód, uwalniając kompleksy oocyt-cumulus. Przenieś kompleksy oocyt-cumulus od pięciu samic do każdego naczynia do IVF.Napełnić z minimalną ilością pożywki. Należy unikać przenoszenia tłuszczu i krwi, ponieważ zanieczyszczona pożywka obniża wydajność zapłodnienia. Po inkubacji pobrać od 10 do 15 µL zawiesiny plemników z obwodu kropli STM i nanieść zawiesinę do jednej kropli IVF.Następnie należy przeprowadzić kokulturę komórek przez cztery do sześciu godzin w celu zapłodnienia. Po zapłodnieniu embriony należy przepłukać co najmniej 2 razy w roztworze SOM w naczyniu do płukania. Następnie należy przystąpić do hodowli.Zarodki przechowywano w pożywce KSOM aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Zamrożono plemniki pięciu inbredowych szczepów myszy Charles River. Współczynniki ochrony ruchliwości plemników oraz ruchliwości progresywnej w tych pięciu szczepach wynosiły od 81% do 47%.Wskaźniki IVF przy użyciu rozmrożonych plemników różniły się w zależności od szczepu, wynosząc od 26 do 88% w ciągu półtora roku. Łącznie zarchiwizowano 49 linii myszy GM poprzez krio konserwację plemników, które następnie odzyskano za pomocą IVF w czterech różnych szczepach samic: C57BL/6, BC, DBA/1 oraz 129SV. Po opanowaniu techniki krio konserwacji plemników, procedura ta może zostać wykonana w 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia.W tej procedurze ważne jest, aby przepływ do kanistra odbywał się pionowo i z użyciem ciekłego azotu.

mouse-sperm-cryopreservation-and-recovery-using-the-icryo-kit

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krioprezerwacja plemników mysich i odzyskiwanie za pomocą zestawu I·Cryo

W niniejszym artykule wideo przedstawiamy szczegółową instrukcję krok po kroku, jak pobierać i krio konserwować oocyty chomika, aby uzyskać wysoki wskaźnik przeżywalności po rozmrożeniu. Tę samą procedurę można zastosować do skutecznego zamrażania i rozmrażania zarodków myszy na różnych etapach rozwoju przedimplantacyjnego.

Pozyskiwanie i kriokonserwacja oocytów chomika oraz embrionów myszy

Jest to protokół wysokoprzepustowej krio konserwacji plemników rybek zebrafish. Plemniki krio konserwowane zgodnie z tym protokołem wykazują średnią płodność na poziomie 25% podczas późniejszego zapłodnienia in vitro i pozostają stabilne przez wiele lat.

Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Opisano metodę witryfikacji zarodków myszy opartą na glikolu etylenowym. Jest ona korzystniejsza od innych metod ze względu na prostotę i niską toksyczność dla zarodków, dzięki czemu może znaleźć szerokie zastosowanie u wielu szczepów myszy, w tym u myszy inbredowych i modyfikowanych genetycznie.

Kriokonserwacja embrionów myszy metodą witryfikacji z użyciem glikolu etylenowego

Podejście oparte na porównaniu gatunków pozwala neurobiologom behawioralnym badać różne czynniki neurobiologiczne związane z określonymi zachowaniami, uznawanymi za charakterystyczne dla danego modelu zwierzęcego. Wykorzystując naturalnie występujące różnice w zachowaniu między blisko spokrewnionymi gatunkami, technika ta nie wymaga stosowania inwazyjnych metod w celu manipulacji ekspresją danego zachowania.

Wykorzystanie podejścia porównawczego gatunków do badania neurobiologii reakcji ojcowskich

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

MicroSecure Vitrification został opracowany jako niekomercyjny, aseptyczny system zamkniętych urządzeń do witryfikacji, który jest zgodny z dobrymi praktykami FDA w zakresie produkcji i obchodzenia się z tkankami. Ze względu na wycofanie z przemysłu hydrofobowych słomek zarodkowych, procedura witryfikacji została zmodyfikowana tak, aby obejmowała wewnętrzną uszczelkę przed standardową wewnętrzną zatyczką bawełnianą.

Zmodyfikowana witryfikacja MicroSecure: bezpieczna, prosta i wysoce skuteczna procedura kriokonserwacji ludzkich blastocyst

Głównym celem tego badania było dostosowanie procedury witryfikacji zanurzonej w igłach (NIV) do kriokonserwacji całych jąder danio pręgowanego. Dodatkowo przetestowano powtarzalność metody w pięciu różnych szczepach danio pręgowanego.

Kriokonserwacja spermatogonii danio pręgowanego za pomocą ultraszybkiego chłodzenia zanurzonego w całej igle jądra

Protokoły dojrzewania europejskiego węgorza i kriokonserwacji plemników zostały ulepszone w ciągu ostatnich lat. W tym artykule opisano najlepszy dostępny protokół wykorzystujący ludzką gonadotropinę kosmówkową (hCG) do indukowania dojrzewania i metanol jako krioprotektant.

Postępowanie z samcami węgorza europejskiego (Anguilla anguilla) i ich leczenie w celu dojrzewania hormonalnego i kriokonserwacji nasienia

Tutaj prezentujemy zmodyfikowaną metodę kriokonserwacji jednokomórkowych zarodków, a także protokół, który łączy użycie zamrożonych i rozmrożonych embrionów z elektroporacją w celu efektywnego generowania genetycznie modyfikowanych myszy.

Wykorzystanie zamrożonych i rozmrożonych zarodków do wysokowydajnej produkcji genetycznie zmodyfikowanych myszy

Ten protokół opisuje półautomatyczną ścieżkę mającą na celu poprawę wydajności i zdolności przetwarzania oraz kriokonserwacji plemników zagrożonych gatunków koralowców, mającą na celu zabezpieczenie różnorodności genetycznej i wsparcie wysiłków na rzecz odbudowy rafy.

Półautomatyczny przepływ pracy do krioprezerwacji nasienia koralowców w celu wsparcia biobankowania i akwakultury

Poznaj metodę kriokonserwacji nasienia myszy za pomocą zestawu I·Cryo Kit. Technika ta umożliwia archiwizację linii genetycznie modyfikowanych myszy poprzez zamrażanie w ciekłym azocie i odzyskiwanie przez zapłodnienie in vitro.

Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo

Przeglądaj więcej filmów