Kriokonserwacja i odzyskiwanie plemników myszy przy użyciu zestawu I·Cryo
12 grudnia 2011
W niniejszej pracy prezentujemy nowo opracowany zestaw I•Cryo do krio konserwacji plemników myszy. Dzięki zastosowaniu tego zestawu konsekwentnie poprawiono rozwój embrionów w stadium dwóchkomórkowym po rozmrożeniu plemników w 5 szczepach myszy. W okresie 1,5 roku zarchiwizowano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez krio konserwację plemników za pomocą zestawu I•Cryo, a następnie pomyślnie odzyskano je metodą IVF.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest kriokonserwacja plemników myszy. Jest to realizowane poprzez uprzednie pobranie plemników z naczyń rozpylnych (EPI) myszy do słomek do kriokonserwacji. Następnie słomki są mrożone w ciekłym azocie, w którym są przechowywane aż do momentu ich odzyskania poprzez rozmrożenie w ciepłej wodzie.
Odizolowane plemniki mysie są ostatecznie wykorzystywane do zapłodnienia in vitro. Główną zaletą tego zestawu w stosunku do istniejących metod jest fakt, że zawiera on wszystkie materiały niezbędne do kriokonserwacji i odzyskiwania plemników mysich. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą mieć trudności z obsługą i napełnianiem słomek. Należy rozpocząć od przygotowania 15 słomek do kriokonserwacji plemników na każdą linię myszy przeznaczoną do zamrożenia.
Najpierw podłącz każdą słomkę o pojemności 0,25 mililitra do strzykawki o pojemności jednego mililitra, tak aby bawełniana zaponka znajdowała się najbliżej strzykawki. Następnie wprowadź do każdej słomki 8 cm medium do IVF, a po nim 1 cm powietrza. W trzecim kroku opisz każdą z 15 słomek nazwą linii, która ma zostać kriokonserwowana dla każdej linii przeznaczonej do kriokonserwacji.
Napełnij dołek płytki czterodołkowej 240 µL środka krioprotekcyjnego. Do uchwytu pojemnika do zamrażania przymocuj pipetę o pojemności 1 ml, aby wydłużyć uchwyt. Na koniec nalej do dołączonego do zestawu pudełka z izolacją piankową 15 cm ciekłego azotu i zamknij pokrywę.
Dwa płodne, dorosłe samce myszy. W przypadku każdej linii przeznaczonej do kriokonserwacji i zabiegu chirurgicznego, należy usunąć ich EPI z okolic ogona. Umieść mysz w pozycji grzbietowej i otwórz brzuszną ścianę ciała.
Delikatnie pociągnij za deferent i usuń nadmiar tkanki tłuszczowej. Następnie zlokalizuj najduszek i usuń go w całości wraz z niewielkim fragmentem deferenta. Pod mikroskopem stereoskopowym umieść najduszki w dołku przygotowanej płytki czterodołkowej wypełnionej CPA.
W każdym najądrzu wykonaj od pięciu do siedmiu nacięć podłużnych. Następnie, używając pęsety, delikatnie uciśnij każdą różnicę. Aby wypchnąć plemniki, inkubuj mieszaninę CPA i najądrza w temperaturze pokojowej przez trzy do pięciu minut.
Podczas inkubacji delikatnie i ręcznie potrząśnij naczyniem dwa lub trzy razy. Pozwoli to plemnikom wypłynąć w procesie aspiracji. Do każdej przygotowanej słomki pobierz 5 mm zawiesiny plemników, a następnie pozostaw 1 cm powietrza.
Dla procesu mrożenia istotne jest, aby wszystkie słomki były napełnione równomiernie. Po napełnieniu wszystkich 15 słomek należy ostrożnie zgrzać termicznie oba końce każdej z nich. Aby zapewnić przeżywalność plemników, cały proces dla wszystkich 15 słomek należy przeprowadzić w ciągu 10 minut.
Po przygotowaniu wszystkich słomek, załaduj je do kolumny na nasienie w pojemniku do mrożenia. Najpierw umieść pojemnik w piankowej skrzyni i pozwól mu unosić się pionowo w ciekłym azocie. Pojemnik musi unosić się pionowo przez 10 minut, w przeciwnym razie szybkość mrożenia nasienia zostanie zaburzona.
Następnie zanurz pojemnik w ciekłym azocie. W ten sposób spermatozoa zostają kriokonserwowane i są gotowe do długotrwałego przechowywania w ciekłym azocie. Około 60 godzin przed planowanym odzyskiwaniem nasienia.
Należy postępować zgodnie z protokołem pisemnym w celu wywołania nadliczbowej owulacji u samic przed zabiegiem IVF. Dla każdej słomki przeznaczonej do rozmrożenia należy przygotować i inkubować wszystkie media przez co najmniej jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Materiały te obejmują 35 mm szalkę Petriego z 90 µl kroplą medium do obróbki nasienia przykrytą warstwą oleju.
Przygotuj 35-milimetrową szalkę Petriego z trzema mililitrami pożywki do IVF, która posłuży jako naczynie do cięcia; dodatkowo dla każdego pięciu superowulowanych samic przygotuj naczynie do IVF, czyli jedną studnię płytki czterostudniowej wypełnioną 500 mikrolitrami pożywki do IVF. Dla każdego naczynia do IVF przygotuj naczynie do płukania, którym jest 35-milimetrowa szalka Petriego z trzema mililitrami KSOM, oraz naczynie do hodowli embrionów, czyli 35-milimetrowa szalka Petriego z 50-mikrolitrowymi kroplami pożywki KSOM przykrytymi olejem. Po przygotowaniu wszystkich niezbędnych materiałów szybko wyjmij słomkę z miejsca przechowywania i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C na dwie do trzech minut.
Osusz słomkę. Następnie wykonaj skośne cięcie w kolumnie powietrza poniżej bawełnianego zatyczki. Na drugim końcu słomki wykonaj kolejne skośne cięcie nad drugą kolumną powietrza.
Należy unikać przerwania kolumny nasienia. Następnie, używając pipety 200 µL, aspirujemy zawiesinę plemników z końca słomki i przenosimy ją do centrum kropli medium do obróbki nasienia. Następnie inkubujemy szalkę przez 45 do 60 minut.
Podczas inkubacji plemników wyizoluj ujścia jajowodów (ucs) od superowulowanych samic i przenieś je do naczynia doyęcia. Użyj igły o rozmiarze 30 G lub pęsety, aby przerwać każdy jajowód, uwalniając kompleksy oocyt-cumulus. Przenieś kompleksy oocyt-cumulus od pięciu samic do każdego naczynia do IVF.
Napełnić z minimalną ilością pożywki. Należy unikać przenoszenia tłuszczu i krwi, ponieważ zanieczyszczona pożywka obniża wydajność zapłodnienia. Po inkubacji pobrać od 10 do 15 µL zawiesiny plemników z obwodu kropli STM i nanieść zawiesinę do jednej kropli IVF.
Następnie należy przeprowadzić kokulturę komórek przez cztery do sześciu godzin w celu zapłodnienia. Po zapłodnieniu embriony należy przepłukać co najmniej 2 razy w roztworze SOM w naczyniu do płukania. Następnie należy przystąpić do hodowli.
Zarodki przechowywano w pożywce KSOM aż do osiągnięcia pożądanego stadium rozwoju. Zamrożono plemniki pięciu inbredowych szczepów myszy Charles River. Współczynniki ochrony ruchliwości plemników oraz ruchliwości progresywnej w tych pięciu szczepach wynosiły od 81% do 47%.
Wskaźniki IVF przy użyciu rozmrożonych plemników różniły się w zależności od szczepu, wynosząc od 26 do 88% w ciągu półtora roku. Łącznie zarchiwizowano 49 linii myszy GM poprzez krio konserwację plemników, które następnie odzyskano za pomocą IVF w czterech różnych szczepach samic: C57BL/6, BC, DBA/1 oraz 129SV. Po opanowaniu techniki krio konserwacji plemników, procedura ta może zostać wykonana w 30 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia.
W tej procedurze ważne jest, aby przepływ do kanistra odbywał się pionowo i z użyciem ciekłego azotu.
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia zestaw I•Cryo do skutecznej kriokonserwacji plemników myszy, wykazując poprawę rozwoju embrionów u wielu szczepów myszy. Zestaw ten ułatwia archiwizację genetycznie zmodyfikowanych linii myszy poprzez kriokonserwację plemników i ich późniejsze odzyskanie za pomocą IVF.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozrodu
- Techniki krio konserwacji
- Zapłodnienie in vitro (IVF)
Wstęp
- Kriokonserwacja plemników myszy ma kluczowe znaczenie dla badań genetycznych.
- Istniejące metody mogą charakteryzować się niską wydajnością i brakiem łatwości w użyciu.
- Zestaw I•Cryo ma na celu usprawnienie procesu kriokonserwacji.
- Skuteczne odzyskanie plemników jest niezbędne dla rezultatów procedury IVF.
Cel badania
- Ocena skuteczności zestawu I•Cryo w kriokonserwacji plemników myszy.
- Ocena wpływu kriokonserwowanych plemników na rozwój zarodków.
- Archiwizacja genetycznie zmodyfikowanych linii myszy na potrzeby przyszłych badań.
Zastosowane metody
- Pobieranie plemników z najądrza myszy przy użyciu słomek do krio konserwacji.
- Zamrażanie plemników w ciekłym azocie do długoterminowego przechowywania.
- Rozmrażanie plemników do wykorzystania w procedurach IVF.
- Ocena ruchliwości plemników i wskaźników sukcesu IVF w różnych szczepach.
Główne wyniki
- Zaobserwowano poprawę rozwoju embrionów w 5 szczepach myszy z zastosowaniem zestawu I•Cryo.
- Pomyślnie zarchiwizowano i odzyskano 49 genetycznie zmodyfikowanych linii myszy.
- Wskaźniki ruchliwości plemników w poszczególnych szczepach wynosiły od 47% do 81%.
- Wskaźniki IVF w przypadku mrożonych i rozmrożonych plemników wahały się od 26% do 88%.
Wnioski
- Zestaw I•Cryo znacząco zwiększa efektywność kriokonserwacji plemników.
- Skuteczne odzyskanie linii genetycznie zmodyfikowanych potwierdza jego użyteczność w badaniach.
- Dalsza optymalizacja metody może skrócić czas przetwarzania.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Kriokonserwacja plemników myszy stanowi kosztową i skalowalną metodę archiwizowania szczepów modyfikowanych genetycznie, co pozwala ograniczyć zależność od żywych kolonii zwierząt i zminimalizować ryzyko utraty linii. Zestaw I•Cryo zwiększa pewność w zakresie zachowania szczepów poprzez poprawę ruchliwości plemników po rozmrożeniu oraz rozwoju embrionów uzyskanych drogą IVF w wielu liniach inbredowych. Wspiera to strategiczne zarządzanie portfolio w badaniach przedklinicznych, umożliwiając niezawodne długoterminowe przechowywanie i odzyskiwanie cennych modeli chorób na żądanie.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia walidację funkcjonalną modeli genetycznych poprzez zapewnienie możliwości odzyskania plemników do fenotypowego przesiewu opartego na IVF.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza obciążenie związane z hodowlą zwierząt oraz koszty utrzymywania żywych kolonii modeli o niskiej przepustowości lub modeli indukowalnych.
Przesiewanie i rozwój testów
- Wartość naukowa: Zapewnia standaryzowane źródło plemników dla spójnych testów IVF, wspierając odtwarzalną ocenę wpływu związków na zapłodnienie i wczesny rozwój embrionalny.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przygotowanie testów dzięki wykorzystaniu kriobankowanych plemników, eliminując zmienność wynikającą z różnic między osobnikami męskimi lub między partiami przy pobieraniu świeżych próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Pozwala na zachowanie integralności genetycznej modeli chorobowych w czasie, co umożliwia prowadzenie badań podłużnych oraz zapewnienie ciągłości eksperymentalnej między pokoleniami.
- Wartość operacyjna: Wspiera współpracę wieloośrodkową poprzez umożliwienie dystrybucji kriosuplementowanych plemników zamiast żywych zwierząt, co zmniejsza stopień skomplikowania transportu oraz problemy związane z bezpieczeństwem biologicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z procesem odkrywania – od wczesnego tworzenia modeli po walidację przedkliniczną – stanowiąc pomost między inżynierią genetyczną a fenotypowaniem funkcjonalnym za pomocą IVF.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez umożliwienie odzyskiwania kriokonserwowanych plemników do IVF, co pozwala na ocenę wpływu modyfikacji genetycznych na płodność i wczesną embriogenezę.
- Przesiewy: Umożliwia prowadzenie standaryzowanych analiz opartych na IVF z wykorzystaniem rozmrożonych plemników, co poprawia powtarzalność oceny funkcji plemników, ich kapacytacji oraz zdolności do zapłodnienia.
- Analityka: Generuje ilościowe odczyty, takie jak ruchliwość plemników (% progresywna), szybka ruchliwość progresywna oraz tempo rozwoju embrionów, co pozwala na podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań w zależności od stabilności modelu.
- Badania translacyjne: Łączy modyfikacje genetyczne z efektami rozwojowymi poprzez umożliwienie IVF z wykorzystaniem kriokonserwowanych plemników, wspierając przesiewy fenotypowe powiązane z biomarkerami w embrionach przedimplantacyjnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę kriobankowania do ciągłego archiwizowania i odzyskiwania linii GM, co ogranicza redundantne wysiłki związane z ponowną derywacją w ramach różnych projektów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie zachowania modelu, wykazując poprawę ruchliwości i rozwoju zarodków w porównaniu z podstawowymi metodami CPA.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje proces krio konserwacji dzięki komponentom w formie zestawów, co redukuje zmienność wynikającą z działań użytkownika oraz czas szkolenia.
- Wartość strategiczna: Obniża długoterminowe koszty utrzymania szczepów i zmniejsza ryzyko nieodwracalnej utraty linii z powodu niepowodzeń w rozrodzie, dryfu genetycznego lub wybuchu patogenu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację linii GM do archiwizacji w oparciu o wartość strategiczną z uwzględnieniem ryzyka, zapewniając pewność co do możliwości ich przyszłej regeneracji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymagana jest biegłość techniczna w zakresie pobierania nasienia, obchodzenia się ze słomkami oraz zgrzewania termicznego w celu zapewnienia integralności próbek.
- Procedura zależy od dostępu do przechowywania w ciekłym azocie oraz sprzętu do kontrolowanego rozmrażania (kąpiel wodna 37°C) w celu uzyskania spójnych wyników po rozmrożeniu.
- Niezbędne są zestandaryzowane pożywki do IVF oraz protokoły superowulacji dla zapewnienia niezawodnych wyników zapłodnienia i hodowli zarodków.
- Efektywność może się różnić w zależności od tła genetycznego, co wymaga optymalizacji etapów inkubacji i płukania specyficznej dla danej linii.
- Metoda jest ograniczona koniecznością zapewnienia płodnych samic oraz wiedzy eksperckiej z zakresu IVF w celu odzyskania plemników, co ogranicza bezpośrednie zastosowanie w testach opartych na naturalnym kojeniu.
