Name: Techniki analityczne do oznaczania bioaktywności tlenku azotu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Poznaj metody wykrywania metabolitów tlenku azotu w próbkach biologicznych z wykorzystaniem pierścieni aortalnych i analiz biochemicznych. Technika ta umożliwia ocenę funkcji śródbłonka oraz identyfikację potencjalnych biomarkerów chorób.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować dr. Hong Jiang oraz Deepa Parathasarthy, MPH, BDS za pomoc techniczną.

1. Pobieranie krwi pełnej
<ol>
	<li>Pobrać krew żylną od ludzi lub zwierząt doświadczalnych do probówek zawierających NEM/EDTA.</li>
	<li>Natychmiast wirować krew w wirówce stołowej przy 14 300 rcf (względna siła odśrodkowa) przez 7 minut w celu przygotowania osocza oraz osadu erytrocytów.</li>
	<li>Przygotować próbki osocza do analizy metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz detekcji chemiluminescencyjnej (CLD). 
	HPLC: Do osocza dodać objętościowo 1:1 zimny metanol, wymieszać w wortexie, a następnie wirować przy 13 200 rpm przez 10 minut w celu wytrącenia białek osocza. Zebrać nadfiltr do analizy HPLC. 
	CLD: Odprowadzić alikwot próbki i przeprowadzić preinkubację z sulfanilamidem i chlorkiem rtutowego w celu specyficznego oznaczenia nitrosotioli.</li>
	<li>Przygotować osad erytrocytów do analizy HPLC i CLD. 
	HPLC: Do roztworu hipotonicznego do lizy zawierającego 10 mM NEM, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku dodać osad erytrocytów w stosunku 1:4. Dokładnie wymieszać w wortexie, a następnie dodać metanol w stosunku 1:1, wymieszać w wortexie i wirować przy 13 200 rpm przez 10 minut w celu wytrącenia białek. Zebrać nadfiltr do analizy HPLC. 
	CLD: Do roztworu hipotonicznego do lizy zawierającego 10 mM EDTA, 2,5 mM EDTA i 10 mM żelazocyjanku dodać osad erytrocytów w stosunku 1:4. Przenieść alikwoty próbek do probówek zawierających sulfanilamid i chlorek rtutowego w celu specyficznej detekcji nitrosotioli.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja i przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Aby oznaczyć poziom metabolitów NO w tkankach, w pierwszej kolejności należy pobrać tkankę pozbawioną krwi do przygotowania próbek zgodnie z opisaną powyżej procedurą. Pełna wymiana krwi zostanie przeprowadzona poprzez infuzję buforu fizjologicznego przez wierzchołek lewej komory. Po usunięciu całej krwi można pobrać interesujące nas tkanki.</li>
	<li>Zhomogenizować próbki tkanek i przygotować je do analizy HPLC oraz CLD zgodnie z opisem powyżej.</li>
</ol>
3. Izolacja pierścieni aorty do oceny funkcji śródbłonka
Kąpiel tkankowa
<ol>
	<li>Myszy zostaną znieczulone dietyloetrem do momentu utraty reakcji na uciśnięcie palca, a następnie poddane dyslokacji szyjnej przed operacją. Wykonuje się torakotomię w celu odsłonięcia aorty klatki piersiowej i brzusznej. Strzykawkę o rozmiarze 25 G wprowadza się do wierzchołka lewej komory i przepłukuje ją z krwi natlenionym buforem Krebsa-Henseleita.</li>
	<li>Przecina się prawy przedsionek, aby umożliwić odpływ krwi. Aortę brzuszną należy usunąć i oczyścić z osłonki zewnętrznej.</li>
	<li>Pierścienie naczyniowe zostaną pocięte na segmenty o długości 2 mm i umieszczone w czterokanałowej kąpieli tkankowej (DMT 720MO, AD Instruments) wypełnionej fizjologicznym roztworem buforowym.</li>
	<li>Pierścienie naczyń utrzymuje się w 10-ml kąpielach z natlenionym buforem Krebsa (95% O2 i 5% CO2) w temperaturze 37 °C. Na każdy pierścień aorty nakłada się wstępne napięcie 1 g (odpowiednie napięcie początkowe dla optymalnej funkcji naczynioruchowej, określone w poprzednich eksperymentach). Do rejestracji wszystkich pomiarów siły wykorzystuje się ośmiokanałowy mostek oktalny (Powerlab) oraz oprogramowanie do akwizycji danych (Chart wersja 5.2.2).</li>
	<li>Pierścienie pozostawia się do równowagi przez 80 minut, wymieniając bufor w każdej kąpieli co 20 min. Po 80-minutowej równowadze do każdego pierścienia dodaje się 1 μM fenylefryny w celu wywołania skurczu podmaksymalnego.</li>
	<li>Po stabilizacji dodaje się agonistę śródbłonkowego, taki jak acetylocholina, aby określić produkcję NO oraz stopień rozkurczu naczynia. Po badaniu zależności dawka-odpowiedź na acetylocholinę kąpiele zostaną wypłukane, naczynia ponownie skurczone, a następnie poddane działaniu zewnętrznego źródła tlenku azotu, nitroprusydu sodu, aby określić reaktywność mięśni gładkich i uzyskać wartość dla 100% rozkurczu.</li>
	<li>Do kąpieli można dodać wychwytywacze NO, aby wyraźnie zobrazować uwalnianie NO i hamowanie rozkurczu naczyń.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Zastosowanie dedykowanego systemu HPLC ENO-20 zapewnia łatwą w obsłudze i wysokoprzepustową metodę specyficznego i czułego wykrywania azotynów i azotanów w matrycach biologicznych. Zasada detekcji oraz oryginalny chromatogram przedstawione są na Rysunku 1. Metodę tę można zastosować do dowolnej próbki biologicznej w celu oznaczenia azotynów i azotanów. Detekcja metabolitów NO oparta na CLD wymaga etapu derywatyzacji chemicznej w celu określenia molekularnego źródła NO. Układ eksperymentalny do jednoczesnej oksydacyjnej i redukcyjnej denitrozacji dla detektora chemiluminescencyjnego przedstawiono na Rysunku 2. Naczynie reakcyjne po prawej stronie wypełnione jest 800mM ferycyjanku w PBS pH 7.4, a naczynie reakcyjne po lewej stronie mieszaniną jodku potasu/jodu w kwasie octowym do denitrozacji redukcyjnej (Rysunek 2A). Cały układ przedstawiono na Rysunku 2B. Rysunek 3 ilustruje specyficzne dla grup analizy denitrozacji, które pozwalają wykryć i ilościowo określić azotyny, nitrozotiol, nitrozaminy oraz produkty nitrozylu hemu. Metoda ta została wcześniej opisana i zwalidowana4,5. Te istotne analizy biochemiczne można łatwo skorelować z badaniami funkcjonalnymi na wyizolowanych pierścieniach aorty w celu oznaczenia produkcji NO przez śródbłonek u zwierząt doświadczalnych. Ten klasyczny eksperyment farmakologiczny pozwala na łatwą i dokładną ocenę funkcji i produkcji NO w śródbłonku. Pomiar reaktywności naczyń na agoniści śródbłonkowi, takie jak acetylocholina, pozwala bezpośrednio określić produkcję NO przez śródbłonek, co następnie można skorelować z biomarkerami biochemicznymi wykrytymi we krwi i tkankach zwierząt doświadczalnych. Typowa reprezentacja odpowiedzi na dawkę acetylocholiny przedstawiona jest na Rysunku 4. Zdrowe myszy kontrolne z prawidłową funkcją śródbłonka reagują na acetylocholinę rozkurczem. Myszy z dysfunkcją śródbłonka (myszy hipercholesterolemiczne) wykazują zmniejszony rozkurcz ze względu na obniżoną produkcję NO w odpowiedzi na ten sam bodziec.
<img alt="Schemat chromatografii gazowej z układem reakcji diazotowania i wynikami chromatografii." src="/files/ftp_upload/3722/3722fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Zasada wykrywania azotynów i azotanów za pomocą ENO-20 oraz chromatogram próbki. (Góra) Schemat metody ENO-20 do wykrywania azotynów i azotanów. (Dół) Standardowy chromatogram 10 pmol azotynów i azotanów wstrzykniętych do ENO-20 (100 μl roztworu azotynów i azotanów o stężeniu 100 nM). Czułość wynosząca 1 nM dla każdego anionu przy objętości wtrysku 100 μl. Brak interferencji z białkami lub związkami barwnymi.
<img alt="Konfiguracja systemu chromatograficznego; analiza danych; oczyszczanie białek; sprzęt laboratoryjny; schemat." src="/files/ftp_upload/3722/3722fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Układ eksperymentalny CLD wykorzystujący zarówno utleniającą denitrozację za pomocą żelazocyjanku, jak i redukującą denitrozację z zastosowaniem analizy jodkowej/jodynowej z detekcją w fazie gazowej usuwanego tlenku azotu.
<img alt="Wykresy redukcyjnego i oksydacyjnego denitrozowania pokazujące poziomy NO, obejmujące analizę RSNO i azotynów." src="/files/ftp_upload/3722/3722fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. (Panel A) Detekcja chemiluminescencyjna azotynów, RSNO oraz RNNO w teście redukcyjnego denitrozowania poprzez preinkubację próbki z odczynnikami chemicznymi specyficznymi dla danej grupy. Odjęcie pól powierzchni pików umożliwia detekcję azotynów i RSNO. (Panel B) Chemiluminescencyjna detekcja gatunków nitrozylohemu przy użyciu roztworu ferycyjanku do oksydacyjnego denitrozowania. Metoda ta jest specyficzna dla produktów NO-hem i nie wykazuje reaktywności krzyżowej z RSNO (GSNO lub SNO-albuminą) ani RNNO (NO-pirolidyną i N-nitrozoalbuminą).
<img alt="Wykres odpowiedzi na dawkę acetylocholiny; myszy zdrowe vs z dysfunkcją śródbłonka; porównanie % rozkurczu." src="/files/ftp_upload/3722/3722fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Ex vivo badanie w kąpieli organowej na izolowanych pierścieniach aorty zapewnia bezpośredni pomiar produkcji NO przez śródbłonek, który można następnie skorelować z biomarkerami biochemicznymi wykrytymi za pomocą HPLC i CLD. Rysunek ten ilustruje zmniejszony rozkurcz u myszy z dysfunkcją śródbłonka wynikający ze zmniejszonej produkcji NO.

<ol><li>Kelm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+metabolism+and+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide metabolism and breakdown.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1411, 273-289 (1999).</li>
<li>Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+obligatory+role+of+endothelial+cells+in+the+relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+acetycholine%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetycholine.</a> Nature. 288, 373-376 (1980).</li>
<li>Ignarro, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelium-derived+relaxing+factor+produced+and+released+from+artery+and+vein+is+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelium-derived relaxing factor produced and released from artery and vein is nitric oxide.</a> Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 84, 9265-9269 (1987).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+S-%2C+N-%2C+and+heme-nitrosylation+in+biological+tissues+and+fluids%3A+implications+for+the+fate+of+NO+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Concomitant S-, N-, and heme-nitrosylation in biological tissues and fluids: implications for the fate of NO in vivo.</a> FASEB J. 16, 1775-1785 (2002).</li>
<li>Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+nitric+oxide+levels+in+the+red+cell%3A+validation+of+tri-iodide-based+chemiluminescence+with+acid-sulfanilamide+pretreatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Measurement of nitric oxide levels in the red cell: validation of tri-iodide-based chemiluminescence with acid-sulfanilamide pretreatment.</a> J. Biol. Chem. 281, 26994-27002 (2006).</li>
<li>Angelo, M., Singel, D. J., Stamler, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+S-nitrosothiol+%28SNO%29+synthase+function+of+hemoglobin+that+utilizes+nitrite+as+a+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An S-nitrosothiol (SNO) synthase function of hemoglobin that utilizes nitrite as a substrate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 8366-8371 (2006).</li>
<li>Bryan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bound+NO+in+human+red+blood+cells%3A+fact+or+artifact%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Bound NO in human red blood cells: fact or artifact.</a> Nitric Oxide. 10, 221-228 (2004).</li>
<li>Feelisch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Processing+of+Nitrite+in+Hypoxia%3A+An+Intricate+Interplay+of+Nitric+Oxide-Generating+and+-Scavenging+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Tissue Processing of Nitrite in Hypoxia: An Intricate Interplay of Nitric Oxide-Generating and -Scavenging Systems.</a> J. Biol. Chem. 283, 33927-33934 (2008).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic. Biol. Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NO+generation+from+inorganic+nitrate+and+nitrite%3A+Role+in+physiology%2C+nutrition+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">NO generation from inorganic nitrate and nitrite: Role in physiology, nutrition and therapeutics.</a> Arch. Pharm. Res. 32, 1119-1126 (2009).</li>
<li>Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nitrate-nitrite-nitric+oxide+pathway+in+physiology+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Drug.+Discov%22%5BJournal%5D)">The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics.</a> Nat. Rev. Drug. Discov. 7, 156-157 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Metody opisane tutaj w celu ilościowego oznaczenia istotnych metabolitów NO w wielu przedziałach biologicznych pozwolą na stworzenie profilu biologii NO w zdrowiu i chorobie, który można skorelować z funkcjonalnymi pomiarami NO w śródbłonku. Metody te wymagają prostego przygotowania próbek z potencjałem do adaptacji w systemach wysokoprzepustowych. Względna ilość tych cząsteczek może pomóc w zrozumieniu produkcji NO i jego losów metabolicznych w szeregu eksperymentalnych modeli chorób, a nawet w próbkach seryjnych pobran...

<table><tbody><tr><td>N-etylomaleimid</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>23030</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocyjanek potasu</td><td>Fluka</td><td>60299</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Eicom Corp</td><td>ENO-20</td><td></td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Alcott</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Miograf DMT</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLab</td><td>ADInstruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Detektor chemiluminescencyjny</td><td>EcoPhysics</td><td>CLD 88Y</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>Acetylocholina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6625</td><td></td></tr><tr><td>R-(-)-fenylefryna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6126</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Analytical Techniques for Assaying Nitric Oxide Bioactivity

Tlenek azotu (NO) jest dwuatomowym wolnym rodnikiem, który jest niezwykle krótkotrwały w systemach biologicznych (mniej niż 1 sekunda we krwi krążącej)1. NO można uznać za jedną z najważniejszych cząsteczek sygnałowych produkowanych w naszym organizmie, regulującą kluczowe funkcje, w tym między innymi regulację ciśnienia krwi, odpowiedź immunologiczną i komunikację neuronalną. Dlatego jego dokładne wykrywanie i ilościowe oznaczanie w matrycach biologicznych jest krytyczne dla zrozumienia roli NO w zdrowiu i chorobie. Ze względu na tak krótki fizjologiczny okres półtrwania NO, opracowano alternatywne strategie wykrywania produktów reakcji biochemii NO. Ilościowe oznaczanie odpowiednich metabolitów NO w wielu przedziałach biologicznych dostarcza cennych informacji dotyczących produkcji NO in vivo, jego biodostępności i metabolizmu. Samo pobieranie próbek z jednego przedziału, takiego jak krew lub osocze, nie zawsze może zapewnić dokładną ocenę stanu NO w całym organizmie, szczególnie w tkankach. Możliwość porównania krwi z wybranymi tkankami u zwierząt doświadczalnych pomoże wypełnić lukę między nauką podstawową a medycyną kliniczną w zakresie użyteczności diagnostycznej i prognostycznej biomarkerów NO w zdrowiu i chorobie. Z tego powodu ekstrapolacja stanu NO w osoczu lub krwi na konkretne tkanki nie jest już uznawana za właściwe podejście. W rezultacie stale opracowywane i walidowane są metody pozwalające na wykrywanie i ilościowe oznaczanie NO oraz produktów/metabolitów związanych z NO w wielu przedziałach zwierząt doświadczalnych in vivo. Ustanowiony paradygmat biochemii NO – od produkcji przez syntazy NO, przez aktywację rozpuszczalnej cyklazy guanylowej (sGC), aż po końcowe utlenienie do azotynów (NO2-) i azotanów (NO3-) – może reprezentować jedynie część efektów NO in vivo. Oddziaływanie NO i pochodnych metabolitów NO z tiolami białkowymi, aminami wtórnymi i metalami w celu tworzenia odpowiednio S-nitrozotioli (RSNO), N-nitrozamin (RNNO) i nitrosylohemu reprezentuje efekty NO niezależne od cGMP i prawdopodobnie są one fizjologicznie równie ważne jak aktywacja sGC przez NO. Prawdziwe zrozumienie roli NO w fizjologii wynika z eksperymentów in vivo polegających na jednoczesnym pobieraniu próbek z wielu przedziałów. Metodyka badania tlenku azotu (NO) jest złożoną i często mylącą dziedziną nauki, będącą przedmiotem wielu debat i dyskusji dotyczących biochemii NO. Wyjaśnienie nowych mechanizmów i szlaków sygnałowych z udziałem NO zależy od naszej zdolności do specyficznego, selektywnego i czułego wykrywania oraz ilościowego oznaczania NO oraz wszystkich istotnych produktów i metabolitów NO w złożonych matrycach biologicznych. Przedstawiamy tutaj metodę szybkiej i czułej analizy azotynów i azotanów za pomocą HPLC, a także wykrywanie wolnego NO w próbkach biologicznych z wykorzystaniem chemiluminescencji opartej na ozonie in vitro z derywatyzacją chemiczną w celu określenia molekularnego źródła NO, a także metodą ex vivo z wykorzystaniem miografii w kąpieli organowej.

Endogenna produkcja tlenku azotu (NO) reguluje szeroki wachlarz funkcji biologicznych. Coraz wyraźniej staje się jasne, że zaburzenia lub dysregulacja sygnalizacji opartej na NO są zaangażowane w wiele ludzkich chorób. Metody ilościowego oznaczania odpowiednich metabolitów NO mogą dostarczyć nowych diagnostycznych lub prognostycznych biomarkerów chorób ludzkich.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Tlenek azotu (NO) jest dwuatomowym rodnikiem o niezwykle krótkim czasie życia w systemach biologicznych (mniej niż 1 sekunda we krwi krążącej)1. NO może być...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zaprezentowanie sposobu dokładnego i specyficznego wykrywania metabolitów tlenku azotu w próbkach biologicznych. Osiąga się to poprzez przetwarzanie próbek krwi bezpośrednio po pobraniu, aby zapobiec utracie metabolitów lub powstawaniu artefaktów. Równolegle przeprowadza się szybki i wydajny pobór tkanek, aby zminimalizować wpływ środowiska hipoksyjnego na metabolity tlenku azotu.Pierścienie aorty są pobierane i zawieszane w kąpieli organowej w celu oceny funkcji śródbłonka. Ponadto stosuje się analizy biochemiczne do ilościowego oznaczenia poziomu azotanów, azotynów oraz względnych poziomów nitrotioli i innych produktów nitrowania w tkance. Wykorzystanie tych analiz do prawidłowego porównania zwierząt doświadczalnych i kontrolnych pozwala na uzyskanie cennych informacji na temat produkcji i metabolizmu tlenku azotu.Główną zaletą zastosowania tego podejścia wielosystemowego w porównaniu z pojedynczymi metodami lub analizami jest możliwość uzyskania szerszego obrazu biochemia tlenku azotu w wielu układach narządowych. Dzięki temu możemy zacząć rozumieć, które z tych metabolitów mogą mieć znaczenie prognostyczne lub diagnostyczne oraz w jaki sposób zestaw metabolitów tlenku azotu odzwierciedla tworzenie i dostępność tlenku azotu w śródbłonku. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ każdy etap procesu ma krytyczne znaczenie dla zachowania integralności próbki.Niektóre z tych etapów nie są oczywiste po przeczytaniu sekcji metod w typowych czasopismach ze względu na szczegółowość procesu pobierania próbek i ekstrakcji tkanek. Procedurę tę zademonstruje dr Hong Jing, starszy naukowiec w moim laboratorium. Na potrzeby tego protokołu należy zapewnić osobę lub zwierzę doświadczalne do pobrania krwi, przy czym w przypadku zwierząt doświadczalnych badane będą również ich tkanki.Najpierw pobierz krew pełną, wprowadzając igłę o rozmiarze 25 G do żyły głównej dolnej. Po zebraniu od 500 do 1000 µL wypłucz organizm zwierzęcia z pozostałej krwi, wprowadzając bufor fizjologiczny przez wierzchołek lewej komory, i poczekaj do całkowitej wymiany krwi, podczas gdy krew i bufor wypływają przez żyłę główną dolną. Krew żylną należy zebrać do probówek wirówkowych o pojemności 1,5 ml zawierających NEM i EDTA bezpośrednio po pobraniu.Po odwirowaniu krew należy wirować przy 14 300 RCF przez siedem minut. Osocze należy odessać pipetą z osadu erytrocytów i przenieść do oddzielnej probówki. Próbki wyizolowanego osocza należy przygotować do analizy HPLC, dodając najpierw objętość zimnego metanolu w stosunku jeden do jednego do 50 µL pobranego osocza.Mieszaninę energicznie mieszaj w wortexie przez trzy do pięciu sekund, aż stanie się mętna. Następnie odwiruj mieszaninę z prędkością 14 300 RCF przez siedem minut. Aby wytrącić białka osocza, przelej nadsącz do osobnej probówki o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu analizy.Aby przygotować osocze do analizy chemiluminescencyjnej, należy pobrać pozostałą objętość osocza, która powinna wynosić około 200 do 400 µL, i podzielić ją na dwie części. Jedną połowę osocza przygotowuje się poprzez dodanie 10% objętości 5% zakwaszonego siarczku i odczekanie 10 minut. Ta próbka jest teraz gotowa do analizy CLD.Przygotuj pozostałą połowę osocza, dodając po pięciu minutach 10% objętości 2% chlorku rtęci. W temperaturze pokojowej dodaj 10% objętości zakwaszonego sulfonamidu. Odczekaj kolejne 10 minut i wstrzyknij tę próbkę do CLD w taki sam sposób jak w przypadku osocza.Osad RBC można przygotować do analizy HPLC lub CLD. Należy rozpocząć od zmieszania jednej części osadu komórkowego z czterema częściami hipotonicznego roztworu lizującego. W przypadku analizy CLD mieszaninę należy dokładnie wymieszać za pomocą vortexa.Przygotowanie komórek przebiega w ten sam sposób, co w przypadku osocza. Należy rozpocząć od dodania równiej objętości metanolu. Następnie mieszaninę należy energicznie wymieszać w wibratorze (vortex) przez trzy do pięciu sekund, a następnie wirować przez siedem minut przy 14 300 RCF.Następnie odpipetuj naddestrat i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu analizy metodą HPLC w celu oznaczenia poziomów metabolitów tlenku azotu w tkankach. W przypadku wybranych tkanek pobranych od zwierząt doświadczalnych, w pierwszej kolejności należy pobrać i przygotować krew zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji; pobieranie tkanek powinno odbywać się w sposób standardowy, ze szczególnym uwzględnieniem szybkości i wydajności, aby zapobiec wystąpieniu hipoksji w tkankach. Po pobraniu próbki, homogenizuj tkanki w stosunku jeden do pięciu w PBS zawierającym N-E-M-E-D-T-A.Następnie przygotuj zhomogenizowane tkanki do analizy HPLC i CLD zgodnie z opisem w poprzednich sekcjach dla erytrocytów. Po znieczuleniu dorosłej myszy eterem dathylowym i potwierdzeniu braku reakcji na uciśnięcie palca u nogi, wykonaj torakotomie. Nacięcie w linii pośrodkowej wykonuje się od mostka w dół do okolicy łonowej, aby odsłonić jamę klatki piersiowej i jamią brzuszną.Następnie przeprowadź perfuzję zwierzęcia natlenionym buforem Krebsa-Henselepa. Użyj strzykawki o rozmiarze 25 G, aby wstrzyknąć bufor do wierzchołka lewej komory. Prawy przedsionek musi zostać przecięty, aby umożliwić odpływ krwi.Po perfuzji wyizoluj aortę brzuszną, odcinając i usuwając wątrobę, płuca oraz inne tkanki, które mogą zasłaniać aortę. Następnie, trzymając serce pęsetą, ostrożnie odetnij aortę od tylnej ściany ciała zwierzęcia. Umieść serce i aortę w szalce Petriego wypełnionej lodem.Zimny bufor Krebsa w spodku. Ostrożnie wyciąć i usunąć tłuszcz oraz osierdzie z aorty. Podczas oczyszczania należy unikać uszkodzenia śródbłonka wewnątrz naczynia.Aby zapobiec hipoksji, należy utrzymać spowolniony metabolizm aorty, przenosząc ją co pięć minut do świeżego, lodowatego, natlenionego buforu. Następnie za pomocą skalpela należy pociąć aortę na pierścieniowate segmenty o długości 3 mm. Segmenty należy przenieść do czterokanałowej kąpieli tkankowej o pojemności 10 ml, wypełnionej natlenionym buforem Krebsa.Używając pokrętła przetwornika, zastosuj 1,5 g wstępnego napięcia do każdego pierścienia aorty. Zgodnie z ustaleniami empirycznymi, 1,5 g jest odpowiednim napięciem początkowym dla optymalnej funkcji naczynioruchowej.U myszy monitoruj i rejestruj pomiar siły za pomocą ośmiokanałowego mostka oktalnego oraz oprogramowania do akwizycji danych; pozwól pierścieniom na equilibrację przez 80 minut, wymieniając bufor co 20 minut, a następnie przystąp do eksperymentu. Po wyrównaniu się napięcia tkanki dodaj 100 nM fenylryny do każdego pierścienia w celu wywołania podmaksymalnego skurczu. Gdy napięcie pierścienia się ustabilizuje i osiągnie stały poziom tonusu, przeprowadź analizę zależności dawka-odpowiedź na agonistę śródbłonka, taki jak acetylocholina.Pozwoli to określić produkcję tlenku azotu oraz stopień rozkurczu naczyń. Po zbadaniu odpowiedzi dawka-reakcja na acetylocholinę, należy wypłukać kąpiele buforem Krebsa i dodać 100 nM rine z kopru do każdej kąpieli z organem w celu skurczenia naczyń. Następnie ponownie należy określić reaktywność pierścieni mięśni gładkich na egzogenne źródło tlenku azotu, takie jak nitroprusyd sodu, w obecności i bez ODQ, inhibitora rozpuszczalnej cyklazy guanylowej.Taki sposób podejścia pozwoli wyznaczyć wartość 100% rozkurczu naczyń, a także wykaże kluczową rolę rozpuszczalnej cyklazy guanylowej w pośredniczeniu odpowiedzi tlenku azotu prowadzącej do rozkurczu naczyniowego. Ponieważ ODQ zapobiega rozkurczowi indukowanemu przez nitroprusjan sodu w odpowiedzi na acetylocholinę, pierścienie aorty myszy zdrowej kontrolnej uległy rozkurczowi, podczas gdy pierścienie aorty myszy z dysfunkcją śródbłonka wykazały zmniejszony rozkurcz wynikający z obniżonej produkcji tlenku azotu. U zwierząt z grupy kontrolnej przeprowadzono również specyficzne dla grupy analizy denitrozacji w oparciu o chemiluminescencję azotynów.RSNO oraz RNNO wykryto za pomocą redukcyjnego testu denitrozowania. Po odjęciu powierzchni piku zmierzono poziomy azotynów oraz r sno. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie biologii tlenku azotu i naczyń krwionośnych, takie jak: w jaki sposób krążące poziomy tych metabolitów tlenku azotu odzwierciedlają poziomy tkankowe oraz jak zmieniają się metabolity w zależności od różnych stanów chorobowych?Wyznaczenie stężeń stanu stacjonarnego oraz okresu półtrwania tych istotnych metabolitów tlenku azotu w wielu układach organów oraz w całym krwiobiegu jednego zwierzęcia pozwoli na identyfikację specyficznych sygnatur molekularnych procesów chorobowych i pomoże nam zdefiniować nowe metody leczenia oparte na tlenku azotu, co wyposaży klinicystów w lepsze biomarkery ciężkości lub progresji choroby. Zazwyczaj osoby nowo zajmujące się dziedziną tlenku azotu napotykają trudności, ponieważ wiele metod nie jest wystarczająco czułych, aby wykryć i skwantyfikować te niskie poziomy metabolitów tlenku azotu występujących w próbkach biologicznych. Przede wszystkim, osoba nieposiadająca wprawy w tej technice prawdopodobnie stworzy artefakty podczas przetwarzania próbek, co prowadzi do błędnych danych i błędnej interpretacji wyników.

analytical-techniques-for-assaying-nitric-oxide-bioactivity

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analityczne techniki badania bioaktywności tlenku azotu

Poziomy cząsteczki sygnalizacji komórkowej stanu zapalnego, tlenku azotu (NO), są powszechnie oznaczane za pomocą odczynnika Griess. W tym protokole stworzyliśmy zmodyfikowany test Griessa wykorzystujący żywą tkankę mózgową Drosophila w celu wykrycia wydzielania NO w prostej, wymiernej i wysoce powtarzalnej metodzie.

Nowatorskie badanie ilościowe poziomu tlenku azotu w odpowiedzi neurozapalnej na całej pulce

W tym artykule opisujemy dostosowaną, stosunkowo łatwą metodę wykorzystującą barwnik fluorescencyjny diaminofluoresceiny-2 dioctan (DAF-2DA) i dihydroetydyd (DHE) do jednoczesnego wykrywania i wizualizacji wewnątrz komórkowego tlenku azotu (NO) i anionu ponadtlenkowego (O2.−) w świeżo wyizolowanych nienaruszonych aortach mysiego modelu otyłości.

En Face Wykrywanie tlenku azotu i ponadtlenku w warstwie śródbłonka nienaruszonych tętnic

Tlenek azotu (NO) jest ważną cząsteczką sygnałową w homeostazie naczyń krwionośnych. Produkcja in vivo NIE jest zbyt niska do bezpośredniego pomiaru. Chemiluminescencja dostarcza użytecznych informacji na temat cyklu NO poprzez pomiar jego prekursorów i produktów utleniania, azotynów i azotanów. Wyjaśniono oznaczanie azotynów / azotanów w tkankach i płynach ustrojowych.

Pomiar azotynów i azotanów, metabolitów na szlaku tlenku azotu, w materiałach biologicznych metodą chemiluminescencji

Poprzednie prace sugerują, że skład izotopowy atmosferycznych tlenków azotu może rozróżniać wpływ różnych źródeł w środowisku. Przedstawiamy zautomatyzowaną, mobilną, opartą na terenie metodę zapewniającą wysoką skuteczność zbierania atmosferycznej analizy izotopowej NOx dla N w rozdzielczości godzinowej.

Zautomatyzowany, mobilny system zbierania o wysokiej rozdzielczości do analizy izotopowej azotu NOx

Ten artykuł opisuje protokoły fumigacji tlenkiem azotu (NO) do zwalczania szkodników po zbiorach. Komory fumigacyjne przepłukuje się azotem (N2) w celu ustalenia warunków bardzo niskiego poziomu tlenu przed wstrzyknięciem NO. Na koniec komory przepłukuje sięN2 w celu rozcieńczenia NO przed wystawieniem produktów na działanie powietrza atmosferycznego, aby zapobiec narażeniu na NO2.

Procedury fumigacji laboratoryjnej w celu zwalczania szkodników gazowym tlenkiem azotu

Tutaj prezentujemy protokół dotyczący potencjalnego zastosowania płytek krwi jako bardzo czułego czujnika tlenku azotu we krwi. Opisano w nim wstępne przygotowanie płytek krwi oraz zastosowanie azotynów i odtlenionych krwinek czerwonych jako generatorów tlenku azotu.

Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP

Przedstawiamy protokoły dla trzech różnych metod homogenizacji czterech różnych grup mięśni szkieletowych tkanki mięśniowej szczura do pomiaru i porównania poziomów azotanów i azotynów. Ponadto porównujemy różne masy próbek, aby zbadać, czy wielkość próbki tkanki wpływa na wyniki homogenizacji.

Przygotowanie homogenatów mięśni szkieletowych szczurów do pomiarów azotanów i azotynów

Tutaj prezentujemy protokoły wykrywania tlenku azotu i jego biologicznie istotnych pochodnych za pomocą testów opartych na chemiluminescencji o wysokiej czułości.

Testy oparte na chemiluminescencji do wykrywania tlenku azotu i jego pochodnych z autooksydacji i związków nitrozowanych

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Opisujemy technikę znakowania i śledzenia komórek macierzystych przy użyciu zatwierdzonego przez FDA superparamagnetycznego tlenku żelaza (SPIO), ferumoksytolu (Feraheme). Ta technika obrazowania komórkowego, wykorzystująca obrazowanie metodą rezonansu magnetycznego (MR) do wizualizacji, jest łatwo dostępna w celu długoterminowego monitorowania i diagnozowania pomyślnych lub nieudanych przeszczepów komórek macierzystych u pacjentów.

Znakowanie komórek macierzystych za pomocą ferumoksytolu, zatwierdzonej przez FDA nanocząsteczki tlenku żelaza

Poznaj metody wykrywania metabolitów tlenku azotu w próbkach biologicznych z wykorzystaniem pierścieni aortalnych i analiz biochemicznych. Technika ta umożliwia ocenę funkcji śródbłonka oraz identyfikację potencjalnych biomarkerów chorób.

Techniki analityczne do badania bioaktywności tlenku azotu

Przeglądaj więcej filmów