Techniki analityczne do oznaczania bioaktywności tlenku azotu

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pokazanie, jak dokładnie i specyficznie wykrywać metabolity tlenku azotu w próbkach biologicznych. Osiąga się to poprzez pierwsze przetworzenie próbek krwi natychmiast po pobraniu, aby zapobiec utracie metabolitów lub tworzeniu się artefaktów. Jednocześnie przeprowadza się szybkie i wydajne pobieranie tkanek w celu zminimalizowania wpływu niedotlenionego środowiska na metabolity tlenku azotu.

Pierścienie aortalne są zbierane i zawieszane w kąpieli narządowej w celu oceny ich funkcji śródbłonka. Ponadto testy biochemiczne są stosowane do ilościowego oznaczania poziomów azotanów, poziomów azotynów oraz względnych poziomów nitrotioli i innych produktów nasyconych nitro w tkance. Korzystając z tych testów, właściwe porównanie zwierząt doświadczalnych i kontrolnych może dostarczyć cennych informacji na temat produkcji i metabolizmu tlenku azotu.

Główną zaletą stosowania tego wielosystemowego podejścia w porównaniu z pojedynczymi metodami lub testami jest to, że pozwoliłoby to na uzyskanie szerszego obrazu biochemii tlenku azotu w wielu układach narządowych. Dzięki temu możemy zacząć rozumieć, które z tych metabolitów mogą mieć użyteczność prognostyczną, lub diagnostyczną, oraz w jaki sposób repertuar metabolitów tlenku azotu odzwierciedla śródbłonkowe tworzenie i dostępność tlenku azotu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ każdy etap procesu ma kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności próbki.

Niektóre z tych kroków nie są oczywiste po przeczytaniu sekcji metod w typowym czasopiśmie ze względu na drobne szczegóły pobierania próbek i ekstrakcji tkanek. Tę procedurę zademonstruje dr Hong Jing. Starszy naukowiec w moim laboratorium W ramach tego protokołu należy udostępnić osobę lub zwierzę doświadczalne do pobrania krwi dla zwierząt doświadczalnych, których tkanki również zostaną zbadane.

Najpierw zbierz krew pełną, wprowadzając igłę o rozmiarze 25 do żyły głównej dolnej. Po zebraniu od 500 do 1000 mikrolitrów należy dokonać perfuzji zwierzęcia z pozostałej krwi, podając bufor fizjologiczny przez wierzchołek lewej komory i pozwalając na pełną wymianę krwi w postaci wyjścia krwi i buforu przez dolną ven cva. Krew żylną należy pobrać do 1,5 mililitrowych probówek wirówkowych zawierających NEM i EDTA natychmiast po pobraniu.

Odwiruj krew w temperaturze 14 300 RCF przez siedem minut po odwirowaniu. Odessać osocze z osadu RBC za pomocą pipety i przenieść je do oddzielnej probówki. Przygotować izolowane próbki osocza do HPLC, najpierw dodając objętość zimnego metanolu jeden do jednego do 50 mikrolitrów kolekcji osocza.

Mieszaj mieszaninę energicznie przez trzy do pięciu sekund, aż stanie się mętna. Następnie odwirować mieszaninę w temperaturze 14 300 RCF przez siedem minut. Aby wytrącić białka osocza, zbierz supernat do oddzielnej probówki o pojemności 1,5 mililitra i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będzie można go przeanalizować.

Aby przygotować osocze do analizy chemiluminescencyjnej, weź pozostałą objętość osocza, która powinna wynosić około 200 do 400 mikrolitrów i podziel ją na dwie objętości. Przygotuj połowę osocza, dodając 10% objętości 5% zakwaszonego siarczku i odczekaj 10 minut. Ta próbka jest teraz gotowa do analizy CLD.

Przygotuj drugą połowę osocza, dodając 10% objętości 2% chlorku rtęci po pięciu minutach. W temperaturze pokojowej dodać 10% objętości zakwaszonego sulfonamidu. Odczekaj kolejne 10 minut i wstrzyknij tę próbkę do CLD, tak jak plazmę.

Osad RBC można przygotować do HPLC i CLD do dowolnej analizy. Zacznij od zmieszania jednej części osadu komórkowego z czterema częściami hipotonicznego roztworu do lizy. Dokładnie wymieszać mieszaninę w celu analizy CLD.

Przygotowanie komórek jest takie samo, jak w przypadku osocza. Zacznij od dodania równej objętości metanolu. Następnie energicznie wiruj mieszaninę przez trzy do pięciu sekund, a następnie obracaj ją przez siedem minut w temperaturze 14 300 RCF.

Teraz odpipetować supernatant i przechowywać go w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu, aż będzie można go przeanalizować za pomocą HPLC w celu określenia poziomów metabolitów tlenku azotu w tkankach. W tkankach będących przedmiotem zainteresowania zwierząt doświadczalnych krew powinna być najpierw pobrana i przygotowana w sposób opisany w poprzednim rozdziale, pobieranie tkanek powinno odbywać się jak zwykle, ze szczególnym uwzględnieniem szybkości i wydajności, aby tkanki nie uległy niedotlenieniu. Po zebraniu homogenizuj próbki tkanek w stosunku od jednego do pięciu N-E-M-E-D-T-A zawierającego PBS.

Następnie należy przygotować homogenizowane tkanki do analizy HPLC i CLD, jak opisano w poprzednich rozdziałach dla krwinek czerwonych. Po znieczuleniu dorosłej myszy eterem dathyl i potwierdzeniu, że nie reaguje ona na szczypanie palca u nogi, wykonaj torakotomię. Wykonuje się nacięcie w linii środkowej od mostka do okolicy łonowej w celu odsłonięcia jamy klatki piersiowej i jamy brzusznej.

Następnie należy przeprowadzić perfuzję zwierzęcia za pomocą natlenionego buforu Krebs Alite. Za pomocą strzykawki o rozmiarze 25 wstrzyknąć bufor w wierzchołek lewej komory. Prawy przedsionek jest rozcięty, aby zapewnić ujście krwi.

Po perfuzji należy odizolować aortę brzuszną, odcinając i usuwając wątrobę, płuca i inne tkanki, które mogą pokrywać aortę. Następnie przytrzymaj serce kleszczami i delikatnie odetnij aortę od tylnej ściany zwierzęcia. Umieść serce i aortę na szalce Petriego wypełnionej lodem.

Zimny bufor Krebs w naczyniu. Ostrożnie odetnij i oczyść tłuszcz i przydanki z aorty. Unikaj uszkodzenia śródbłonka wewnątrz naczynia podczas czyszczenia.

Utrzymuj powolny metabolizm aorty, aby zapobiec niedotlenieniu, przenosząc je do świeżego, lodowato natlenionego buforu co pięć minut. Teraz użyj skalpela, aby przeciąć aortę na trzymilimetrowe segmenty w kształcie pierścienia. Przenieś segmenty do czterokanałowej 10-mililitrowej kąpieli tkankowej narządowej wypełnionej natlenionym buforem Krebsa.

Za pomocą pokrętła przetwornika nałóż 1.5 grama naprężenia wstępnego na każdy pierścień aorty. Zgodnie z ustaleniami empirycznymi. 1,5 grama to odpowiednie napięcie początkowe dla optymalnej funkcji naczynioruchowej.

W monitorze myszy i rejestruj pomiar siły za pomocą ośmiokanałowego mostka ósemkowego i oprogramowania do akwizycji danych, pozwól pierścieniom zrównoważyć się przez 80 minut, zmieniając bufor co 20 minut, a następnie kontynuuj eksperymentowanie. Po wyrównaniu napięcia tkanki dodaj 100 nanomolowych kopru włoskiego do każdego pierścienia, aby uzyskać submaksymalny skurcz. Gdy napięcie pierścienia ustabilizuje się i utrzyma się stały poziom tonu, należy przeprowadzić analizę odpowiedzi na dawkę agonisty śródbłonka, takiego jak acetylocholina.

To określi produkcję tlenku azotu i stopień relaksacji naczynia. Po reakcji na dawkę acetylocholiny, przepłukać kąpiele buforem Krebsa i dodać 100 nanomolowego kopru włoskiego do każdej kąpieli narządowej, aby skurczyć naczynia. Ponownie, a następnie określ reakcję pierścieni mięśni gładkich na egzogenne źródło tlenku azotu, takie jak strona nitroprasowa sodu z i bez ODQ, inhibitora rozpuszczalnej cyklazy podstępnej.

Ten rodzaj podejścia określi 100% wartość relaksacji dla naczyń, a także pokaże zasadniczą naturę rozpuszczalnej cyklazy podstępnej w pośredniczeniu w odpowiedzi tlenku azotu na relaksację naczyniową. Ponieważ ODQ zapobiegnie relaksacji nitro sodu IDE w odpowiedzi na acetylocholinę, pierścienie aortalne ze zdrowej kontroli, myszy zrelaksowały się, podczas gdy pierścienie aortalne myszy z dysfunkcją śródbłonka wykazywały zmniejszoną relaksację z powodu zmniejszenia produkcji tlenku azotu. Przeprowadzono również specyficzne dla grupy testy de nitro sacji na zwierzętach kontrolnych chemiluminescencja azotynów.

RSNO i RNNO wykryto za pomocą redukcyjnego testu de nitros. Odejmując powierzchnie pików, zmierzono poziomy azotynów i r sno. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie tlenku azotu i biologii naczyniowej, takie jak to, w jaki sposób krążące poziomy tych metabolitów tlenku azotu odzwierciedlają poziomy tkanek i jak zmieniają się metabolity choroby w różnych stanach chorobowych?

Określenie stężeń w stanie stacjonarnym i okresu półtrwania tych istotnych metabolitów tlenku azotu w wielu układach narządowych i w całym krążeniu pojedynczego zwierzęcia pozwoli na identyfikację specyficznych sygnatur molekularnych procesów chorobowych i pomoże nam zdefiniować nowe metody leczenia oparte na tlenku azotu, co pozwoli klinicyście uzbroić się w lepsze biomarkery ciężkości lub progresji choroby. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w dziedzinie kwasu azotowego, będą miały problemy, ponieważ wiele z nich minimalizuje wystarczająco czułe, aby wykryć i określić ilościowo te niskie poziomy metabolizmu kwasu trynowego znajdujące się w próbkach biologicznych. Po pierwsze, jedna nieumiejętność w sztuce prawdopodobnie stworzy artefakty podczas przetwarzania próbki, które będą musiały błędnie wprowadzić dane i błędnie zinterpretować dane.