Name: Kwantyfikacja kolonizacji grzybów, sporogenezy i produkcji mikotoksyn za pomocą testów biologicznych ziaren (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji biosyntezy mikotoksyn i wzrostu grzybów w ziarnach za pomocą testów biologicznych. Technika ta umożliwia standaryzację badań nad interakcjami nasion z patogenami grzybowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Brandonowi Hassettowi i Carlosowi Ortizowi za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów NSF IOB-0544428, IOS-0951272 oraz IOS-0925561 przyznanych dr. Michaelowi Kolomietsowi, a także z funduszy USDA National Institute of Food and Agriculture (NIFA), AFRI Plant Breeding and Education Grant #2010-85117-20539 przyznanego dr. Sethowi Murrayowi, dr. Thomasowi Isakeitowi i dr. Michaelowi Kolomietsowi.

1. Bioassay z użyciem ziaren kukurydzy
<ol>
	<li>Na dwa tygodnie przed badaniem hoduj patogeny grzybowe na agarze ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) w temperaturze 28 °C.</li>
	<li>Wybierz ziarna o podobnej wielkości i kształcie, najlepiej spłaszczone, aby leżały płasko na dnie fiolek do bioanalizy, i umieść je w probówkach typu falcon o pojemności 50 ml. Wybrane ziarna muszą zostać wyprodukowane jednocześnie w tym samym środowisku, aby zapewnić podobny wiek nasion i skład metabolitów.</li>
	<li>Zesterylizuj powierzchnię ziaren, wstrząsając probówkami w temperaturze pokojowej przez 5 minut z 70% etanolem, 1 minutę z wodą sterylną oraz 10 minut z 6% podchlorynem sodu. Trzykrotnie przepłucz ziarna wodą sterylną przez 5 minut podczas każdego płukania, kontynuując wstrząsanie. Osusz ziarna, odciskając je na autoklawowanych ręcznikach.</li>
	<li>Aby ułatwić infekcję Aspergillus flavus, wykonaj niewielką ranę po stronie zarodka za pomocą igły 18 G na głębokość 0,5 cm. Jednak w naszym doświadczeniu przy infekcji Fusarium verticillioides wymagana jest większa rana. W takim przypadku użyj żyletki, aby naciąć stronę zarodka na głębokość 0,5 mm.</li>
	<li>Przygotuj zawiesinę inokulum, zeskrobując zawartość płytek hodowlanych do około 5 ml autoklawowanego 0,01% roztworu Tween-20 w celu uwolnienia zarodników, a następnie usuń grzybnię poprzez filtrację grawitacyjną przez co najmniej 4 warstwy autoklawanej gazy. Oblicz stężenie zarodników za pomocą komory countingowej (hemocytometru) i dostosuj je do 106 spores /ml dla A. flavus lub F. verticillioides. W przypadku użycia innych gatunków patogenów lub gospodarzy ważne jest dobranie odpowiedniego stężenia inokulum dla właściwej infekcji.</li>
	<li>Utwórz komorę wilgotności w plastikowym pojemniku (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) wyłożonym pięcioma arkuszami ręczników papierowych i 100 ml sterylnej wody. Komora nie jest wodoszczelna ani powietrzeszczelna, dlatego w trakcie eksperymentu należy dolewać wody, aby utrzymać ręczniki papierowe w stanie wilgotnym.</li>
	<li>Umieść cztery ziarna w autoklawowanej szklanej fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml i zmierz ich masę. Zaszczep za pomocą 200 μl zawiesiny zarodników, zakręć i wymieszaj w wortexie, aby równomiernie pokryć ziarna zawiesiną. Poluzuj nakrętki, aby umożliwić swobodną wymianę powietrza, i umieść fiolki w komorze wilgotności.</li>
</ol>
Uwaga: W przypadku nasion lub grzybów innych niż opisane w niniejszych metodach, wymagana ilość inokulum może być inna i powinna zostać ustalona doświadczalnie.
<ol start="8">
	<li>Inkubować ziarna w fotoperiodzie 12 h światła/12 h ciemności w temperaturze 28 °C przez 7 dni lub do uzyskania pożądanego efektu.</li>
</ol>
2. Oliczanie konidiów
<ol>
	<li>Po okresie infekcji dodać 5 ml autoklawowanego 0,01% Tween-20 do fiolek scyntylacyjnych zawierających zainfekowane ziarna i mieszać intensywnie na wortexie przez 1 minutę.</li>
	<li>Używając końcówki do pipety o szerokim otworze, niezwłocznie rozcieńczyć zawiesinę, przenosząc dwie oddzielne aliquoty po 200 μl zawiesiny zarodników do probówek Eppendorfa o pojemności 2,0 ml zawierających 1,8 ml 0,01% Tween-20 (lub rozcieńczyć w razie potrzeby, w zależności od stopnia infekcji).</li>
	<li>Policzyć każdą aliquotę 200 μl dwukrotnie za pomocą hemocytometru4 i porównać liczbę konidiów pomiędzy próbami.</li>
</ol>
3. Oznaczanie ilości aflatoksyn
<ol>
	<li>Do kubka blendera o pojemności 50 ml dodać ziarna z 1 próbki, 20 ml 80% metanolu oraz 0,05 g NaCl, przykryć i blendować z wysoką prędkością przez 1 min.</li>
	<li>Umieścić plisowany papier filtracyjny nad czystym naczyniem zbiorczym i przelać ekstrakt przez filtr.</li>
	<li>Przenieść 10 ml filtratu do czystego naczynia, dodać 20 ml destylowanej H2O i dokładnie wymieszać.</li>
	<li>Przefiltrować próbkę przez szklany filtr z mikrowłókien o wielkości porów 1,5 μm do czystego kubka.</li>
	<li>Nanieść 1 ml przefiltrowanego ekstraktu na kolumnę Afla Test i za pomocą sprężonego powietrza przepchnąć ekstrakt przez kolumnę z prędkością 1-2 kropli/sekundę aż do całkowitego opróżnienia.</li>
	<li>Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml destylowanej H2O, przepuszczając ciecz z prędkością 1-2 kropli/sekundę, aż do pojawienia się powietrza.</li>
	<li>Eluować kolumnę 1 ml 100% metanolu klasy HPLC z prędkością 1-2 kropli/sekundę, zbierając eluat do szklanej kuwety.</li>
	<li>Do eluatu dodać 1 ml odczynnika Afla Test Developer i dokładnie wymieszać. Umieścić kuwetę w skalibrowanym fluorometrze i odczytać wynik po 60 sek.</li>
</ol>
Uwaga: Podczas stosowania protokołu Aflatest FGIS pomiar z fluorometru jest obliczany na podstawie początkowych 50 gramów próbki ekstrahowanych w 100 ml. Uwzględniając rozcieńczenie próbki wodą, 1 ml naniesiony na kolumnę odpowiada 0,166 gramom próbki. Zatem przy modyfikacji protokołu należy wziąć pod uwagę różnice w wielkości próbki i początkowym roztworze ekstrakcyjnym. Na przykład 2 gramy ziaren są ekstrahowane w 20 ml 80% methanolu. Daje to 0,1 gramów/ml. Gdy 1 ml tej próbki zostanie zmieszany z 2 ml wody, proporcja próbki w cieczy wynosi teraz 0,033 gramów/ml. Jeśli ta próbka daje odczyt z fluorometru wynoszący 100 ppb, rzeczywiste stężenie opiera się na proporcji próbki do 0,166, czyli ppb = (0,166 gram X 100 ppb)/ 0,1 gram), czyli 166 ppb. Alternatywne metody ilościowego oznaczania aflatoksyn opisano w referencji 7.
4. Analiza fumonizyny B1 (FB1)
<ol>
	<li>W przypadku grzyba hodowanego na ziarnach kukurydzy, próbki ekstrahować przez noc z użyciem 10 ml acetonitrylu/wody (50/50, v/v) w temperaturze pokojowej bez mieszania. Następnie zmieszać ekstrakt (2 ml) z wodą dejonizowaną (6 ml) i taką mieszaninę (8 ml) nanieść bezpośrednio na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej C-18.</li>
	<li>Przed nałożeniem próbki przygotować kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej C-18, płucząc ją 2 ml acetonitrylu, a następnie 2 ml wody.</li>
	<li>Po nałożeniu próbki kolumnę przemyć 2 ml wody, a następnie 2 ml acetonitrylu/wody (15/85, v/v). Próbkę do analizy HPLC (zawierającą FB1) eluować za pomocą 2 ml acetonitrylu/wody (70/30, v/v).</li>
	<li>Przeprowadzić derywatyzację FB1 za pomocą o-ftalaldehydu (OPA), przenosząc 0,1 ml eluatu z kolumny do fiolki zawierającej 0,1 ml buforu boranowego (0,05 M kwas borowy/0,05 M boran sodu [50/50, v/v], pH 8,5) oraz 0,1 ml OPA (0,1 mg/ml w acetonitrylu z 0,5% mercaptoetanolem).</li>
	<li>Przerwać reakcję po 10 min, dodając 0,5 ml acetonitrylu/0,01 M kwasu borowego (40/60, v/v).</li>
	<li>FB1 analizować na systemie Shimadzu HPLC LC-20AT wyposażonym w analityczną kolumnę Zorbax ODS (4,6 150 mm) oraz detektor fluorescencyjny Shimatzu RF-10Axl o zmiennej długości fali (pobudzenie 335 nm/emisja 440 nm).</li>
	<li>Zastosować gradient liniowy (rozpuszczalnik A: acetonitryl/0,1 M fosforan sodu (40/60), pH 3,3; rozpuszczalnik B: acetonitryl/ 0,1 M fosforan sodu (60/40), pH 3,3), a program gradientu ustawić następująco: od 100% A do 100% B w 10 min, 100% B przez 5 min.</li>
	<li>Standardy FB1 analizować metodą HPLC, a pomiary pól powierzchni pików wykorzystać do wykreślenia krzywej wzorcowej. Następnie oznaczyć stężenie FB1 w próbce, porównując pola powierzchni pików z krzywą wzorcową dla FB1.</li>
</ol>
5. Analiza ergosterolu
<ol>
	<li>Hodować grzyba na ziarnach kukurydzy przez 7-14 dni.</li>
	<li>Po okresie inkubacji do każdej fiolki dodać 10 ml mieszaniny chloroformu i metanolu (2:1, v/v). Po dodaniu dokładnie wstrząsnąć próbkami, a następnie inkubować fiolki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 h.</li>
	<li>Po 24 h odwirować próbki, zebrać nadsącz i przefiltrować go przez membranę nylonową o rozmiarze porów 0.45 um.</li>
	<li>Próbkę wstrzyknąć bezpośrednio do systemu Shimadzu HPLC LC-20AT wyposażonego w kolumnę 4.6 U ODS-C18 (200 Å, 250 ± 4.6 mm) oraz detektor Shimadzu SPD-20A UV/VIS ustawiony na monitorowanie przy 282 nm.</li>
	<li>Jako fazę ruchomą zastosować metanol (100%) przy przepływie 1.5 mL/min. Wyznaczyć ilość ergosterolu w próbkach poprzez porównanie pól powierzchni pików próbek z krzywą wzorcową sporządzoną z ergosterolu klasy HPLC.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Po inokulacji i inkubacji w komorze wilgotnościowej przez dwa do trzech dni, na ziarnach powinien zacząć pojawiać się wzrost grzyba. Siedem dni po zabiegu wzrost wegetatywny na roślinach traktowanych powinien być wyraźnie widoczny, podczas gdy kontrole pozorowane powinny pozostać niezinfekowane (Rysunek 1B, góra). Dłuższe okresy inkubacji sprzyjają bardziej obfitemu wzrostowi wegetatywnemu (Rysunek 1B, dół). W warunkach opisanych w niniejszym opracowaniu (Rysunek 2G), dziki typ A. flavus NRRL 3357 wykazał maksymalne wartości kolonizacji, akumulacji aflatoksyn i produkcji konidiów odpowiednio w 8, 6 i 8 dniu (Rysunek 2, A-C). Jednakże, gdy zanieczyszczenie mikotoksynami i konidiacja zostały porównane w przeliczeniu na jednostkę ergosterolu, najwyższe poziomy zaobserwowano odpowiednio w 4 i 6 dniu (Rysunek 2, D-E). Rysunek 2F podsumowuje te obserwacje dotyczące wartości maksymalnych zależnych od biomasy grzyba. Co ciekawe, między 4 a 6 dniem po inokulacji w ziarnach zachodzi degradacja kwasów nukleinowych, co widać na podstawie całkowitego RNA z próbek pobranych w trakcie badania czasowego (Rysunek 2H, dół).
Wiele badań, w tym nasze własne, analizowało infekcję F. verticilliodies w ziarnach kukurydzy2,8,9,10,11,12, wykazując, że okres od 7 do 13 dni jest odpowiednim punktem czasowym dla obserwacji. Stosując opisane w niniejszym opracowaniu metody, poziomy fumonizyn wynoszą od 3 500-8 000 ng/g ziarna4,13, a poziomy ergosterolu wynoszą od 5 000-10 000 ng/g ziarna14,13. Rysunek 3 przedstawia reprezentatywne piki dla fumonizyn (góra) i ergosterolu (dół) z chromatogramów HPLC. Pomiar ergosterolu można również przeprowadzić za pomocą widm absorbancji 15.
<img alt="Schemat doświadczenia z zakażaniem ziaren i mikrografie; analiza produkcji biomasy i mikotoksyn." src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat ilościowego oznaczania biomasy grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn oraz reprezentatywne wyniki wzrostu wegetatywnego z bioanaliz na ziarnach. A) Schemat przedstawiający opisaną metodę ilościowego oznaczania podstawowych parametrów biologicznych wykorzystywanych do oceny patogenezy grzybów na ziarnach kukurydzy. B) Reprezentatywne wyniki bioanaliz na ziarnach. Góra, wzrost wegetatywny A. flavus (NRRL3357) na ziarnach kukurydzy w tle genetycznym B73. Nasiona zaszczepiono 200 μl zawiesiny o stężeniu 106 zarodników/mL, a zdjęcia wykonano 7 dni po inokulacji. Dół, zaszczepione ziarna F. verticillioides w tle B73 13 dni po zakażeniu. Ziarna zaszczepiono 200 μl zawiesiny o stężeniu 106 zarodników/mL.
<img alt="Wykresy i obrazy z bioanalizy kukurydzy i Aspergillus przedstawiające wzrost grzyba, akumulację aflatoksyn i postęp infekcji." src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Przebieg czasowy bioanalizy ziaren kukurydzy z Aspergillus flavus. Ziarna B73 zostały zainokulowane 200 μl zawiesiny konidiów Aspergillus flavus o stężeniu 106 spor/ml i inkubowane przez 2-8 dni (G). Wszystkie wartości wyznaczono na podstawie średniej masy suchej 4 ziaren (n = 3-4; średnia ± SE). A) Kolonizację (na podstawie ergosterolu), (B) aflatoksyny i (C) konidiację ilościowo określono za pomocą opisanych powyżej metod. E) Aflatoksyny i (F) konidiację przedstawiono jako funkcję biomasy grzyba mierzonej poprzez h ergosterol. F) Maksymalne wartości dla ergosterolu, akumulacji aflatoksyn i konidiacji jako funkcja biomasy grzyba – maksymalne zaobserwowane wartości dla każdej wielkości przyjęto jako 100%. (H) 1 μg na ścieżkę całkowitego RNA z przebiegu czasowego.
<img alt="Wykres chromatograficzny pokazujący piki detekcji fumonizyny B1 i ergosterolu; zawarto analizę danych." src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Reprezentatywne chromatogramy wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) dla fumonizyny B1 (góra) i ergosterolu (dół) wyizolowanych z ziaren zainfekowanych Fusarium verticillioides (M3125).

<ol><li>Tsitsigiannis, D. I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxylipins+as+developmental+and+host-fungal+communication+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oxylipins as developmental and host-fungal communication signals.</a> Trends Microbiol. 15, 109-118 (2007).</li>
<li>Gao, X., Shim, W. -B., Göbel, C., Kunze, S., Feussner, I., Meeley, R., Balint-Kurti, P., Kolomiets, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+a+maize+9-lipoxygenase+results+in+increased+resistance+to+fungal+pathogens+and+reduced+levels+of+contamination+with+mycotoxin+fumonisin%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Disruption of a maize 9-lipoxygenase results in increased resistance to fungal pathogens and reduced levels of contamination with mycotoxin fumonisin.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 20, 922-933 (2007).</li>
<li>Brodhagen, M., Tsitsigiannis, D. I., Hornung, E., Goebel, C., Feussner, I., Keller, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+oxylipin-mediated+cross-talk+in+the+Aspergillus+-+seed+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reciprocal oxylipin-mediated cross-talk in the Aspergillus - seed pathosystem.</a> Mol. Microbiol. 67, 378-391 (2008).</li>
<li>Gao, X., Brodhagen, M., Isakeit, T., Brown, S. H., Göbel, C., Betran, J., Feussner, I., Keller, N. P., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+lipoxygenase+ZmLOX3+increases+susceptibility+of+maize+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the lipoxygenase ZmLOX3 increases susceptibility of maize to Aspergillus spp.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 22, 222-231 (2009).</li>
<li>Gao, X. Q., Kolomiets, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+lipids+and+oxylipins+are+crucial+signals+in+modulating+mycotoxin+production+by+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Toxin+Rev%22%5BJournal%5D)">Host-derived lipids and oxylipins are crucial signals in modulating mycotoxin production by fungi.</a> Toxin Rev. 28, 79-88 (2009).</li>
<li>Mukherjee, M., Kim, J. -E., Park, Y. -S., Kolomiets, M. V., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulators+of+G+protein+signaling+in+F.+verticillioides+mediate+differential+host-pathogen+responses+on+non-viable+versus+viable+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Regulators of G protein signaling in F. verticillioides mediate differential host-pathogen responses on non-viable versus viable maize kernels.</a> Mol. Plant Pathol. 12, 479-491 (2011).</li>
<li>Zheng, M. Z., Richard, J. L., Binder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+rapid+methods+for+the+analysis+of+mycotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">A review of rapid methods for the analysis of mycotoxins.</a> Mycopathologia. 161, 261-273 (2006).</li>
<li>Bacon, C. W., Bennett, R. M., Hinton, D. M., Voss, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Fusarium+moniliforme+within+asymptomatic+maize+kernels+and+kernels+associated+with+equine+leukoencephalomalacia%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Fusarium moniliforme within asymptomatic maize kernels and kernels associated with equine leukoencephalomalacia.</a> Plant Dis. 76, 144-148 (1992).</li>
<li>Munkvold, G. P., Hellmich, R. L., Rice, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fumonisin+concentrations+in+kernels+of+transgenic+Bt+maize+hybrids+and+nontransgenic+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of fumonisin concentrations in kernels of transgenic Bt maize hybrids and nontransgenic hybrids.</a> Plant Dis. 83, 130-138 (1999).</li>
<li>Sagaram, U. S., Shaw, B. D., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusarium+verticillioides+GAP%21%2C+a+gene+encoding+a+putative+glycolipid-anchored+surface+protein%2C+participates+in+conidiation+and+cell+wall+structure+but+not+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fusarium verticillioides GAP!, a gene encoding a putative glycolipid-anchored surface protein, participates in conidiation and cell wall structure but not virulence.</a> Microbiol. 153, 2850-2861 (2007).</li>
<li>Shim, W. -B., Flaherty, J. E., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+Fumonisin+B1+biosynthesis+in+maize+germ+and+degermed+kernels+by+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Food+Protect%22%5BJournal%5D)">Comparison of Fumonisin B1 biosynthesis in maize germ and degermed kernels by Fusarium verticillioides.</a> J. Food Protect. 66, 2116-2122 (2003).</li>
<li>Shim, W. -B., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+fumonisin+B1+biosynthesis+and+conidiation+in+Fusarium+verticillioides+by+a+cyclin-like+%28C-type%29+gene%2C+FCC1%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Micrbiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of fumonisin B1 biosynthesis and conidiation in Fusarium verticillioides by a cyclin-like (C-type) gene, FCC1.</a> Appl. Environ. Micrbiol. 67, 1607-1612 (2001).</li>
<li>Conversation with: Won-Bo Shim. , (2011).</li>
<li>Shin, J. -H., Shim, W. -B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+PPR1+and+PPR2%2C+genes+encoding+regulatory+subunits+of+protein+phosphatase+2A+in+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Characterization of PPR1 and PPR2, genes encoding regulatory subunits of protein phosphatase 2A in Fusarium verticillioides.</a> Phytopathol. 99, S119(2009).</li>
<li>Breivik, O. N., Owades, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Semimicrodetermination+of+Ergosterol+in+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast.+Agric.+and+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Semimicrodetermination of Ergosterol in Yeast.</a> Yeast. Agric. and Food Chem. 5, 360-363 (1957).</li>
</ol>

Nie mam nic do ujawnienia.

Opisane tutaj metody zostały szeroko przetestowane i okazały się niezawodne w generowaniu mierzalnych wyników w zakresie kolonizacji grybiczej, sporogenezy oraz produkcji mikotoksyn. Co więcej, metody te powinny mieć zastosowanie do nasion innych gatunków roślin podatnych na zanieczyszczenie grzybami produkującymi mikotoksyny (np. araki-fistaszki, pszenicy, bawełny, pistacji itp.). Dla przeprowadzenia kompetentnych analiz interakcji między rośliną a patogenem niezbędne jest utrzymanie nasion przy życiu. Małe miejsce zra...

<table><tbody><tr><td>Agar z ekstraktem ziemniaczanym i glukozą (PDA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71659A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowy pojemnik do inkubacji</td><td>Sterilite</td><td>1713LAB06</td><td></td></tr><tr><td>Blender</td><td>Vicam</td><td>20200</td><td></td></tr><tr><td>Karbowny papier filtracyjny 24 cm</td><td>Vicam</td><td>31240</td><td></td></tr><tr><td>Szklane mikrowłókno 1,5 &amp;mu;m</td><td>Vicam</td><td>31955</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Afla Test</td><td>Vicam</td><td>G1024</td><td></td></tr><tr><td>Developer Afla Test</td><td>Vicam</td><td>32010</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Vicam</td><td>35016</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC14952-0025</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC39769-0025</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna do ekstrakcji w fazie stałej C-18 (Prep SEP SPE C18 Column)</td><td>Fisher Scientific</td><td>60108-304</td><td></td></tr><tr><td>O-ftalaldehyd (OPA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79760-5g</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP168-500</td><td></td></tr><tr><td>Boran sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>RDCS0330500</td><td></td></tr><tr><td>Mercapto&amp;#8211;etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-000-231</td><td></td></tr><tr><td>Pompa Shimadzu HPLC LC-20AT</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>LC-20AT</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna Zorbax ODS (4,6x150 mm)</td><td>Agilent Technologies</td><td>443905-902</td><td></td></tr><tr><td>Detektor fluorescencyjny Shimadzu RF-10Axl</td><td>Shimadzu Corporation</td><td>RF-10AXL</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38987-0010</td><td></td></tr><tr><td>Standardy FB1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1147-1mg</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>VWR international</td><td>MK444410</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 13 mm z membraną nylonową 0,45 µm (HPLC)</td><td>Pall Corporation</td><td>4426</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>45480-50G-F</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki scyntylacyjne</td><td>VWR international</td><td>66021-602</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Vicam</td><td>G1124</td><td></td></tr></tbody></table>

ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

Gnicie zbóż wywoływane przez grzyby infekujące nasiona stanowi jedno z największych wyzwań ekonomicznych dla produkcji zbożowej na całym świecie, nie wspominając o poważnym ryzyku dla zdrowia ludzi i zwierząt. Wśród upraw zbożowych kukurydza jest prawdopodobnie najbardziej dotkniętą rośliną, ze względu na straty w integralności ziaren oraz kontaminację nasion mikotoksynami indukowaną przez patogeny. Dwiema najpowszechniejszymi i najbardziej problematycznymi mikotoksynami dla producentów kukurydzy oraz przetwórców żywności i pasz są aflatoksyna i fumonizyna, produkowane odpowiednio przez Aspergillus flavus i Fusarium verticillioides.
Niedawne badania nad molekularnymi interakcjami między roślinami a patogenami wykazały potencjał w zrozumieniu specyficznych mechanizmów związanych z odpowiedziami roślin na infekcje grzybowe i skażenie mikotoksynami1,2,3,4,5,6. Ponieważ wiele laboratoriów wykorzystuje testy na ziarnach do badania interakcji roślina-patogen, istnieje potrzeba opracowania zestandaryzowanej metody ilościowego oznaczania różnych parametrów biologicznych, aby wyniki z różnych laboratoriów mogły być wzajemnie interpretowane. W celu zapewnienia solidnego i powtarzalnego sposobu przeprowadzania analiz ilościowych na nasionach, opracowaliśmy laboratoryjne testy na ziarnach oraz następujące po nich metody ilościowego oznaczania wzrostu grzybów, biomasy i skażenia mikotoksynami. Cztery sterylizowane ziarna kukurydzy są inokulowane w szklanych fiolkach zawiesiną grzybową (106) i inkubowane przez określony czas. Następnie wybierane są fiolki z próbkami w celu zliczenia konidiów za pomocą hemocytometru, analizy biomasy opartej na ergosterolu metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), oznaczania ilości aflatoksyn metodą fluorometrii AflaTest oraz oznaczania ilości fumonizyn metodą HPLC.

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Gnicie ziaren wywołane przez grzyby infekujące nasiona stanowi jedno z największych wyzwań ekonomicznych dla produkcji zbóż na całym świecie, nie mówiąc już o poważnych zagrożeniach...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne ilościowe określenie biosyntezy mikotoksyn, psucia oraz wzrostu w celu zbadania molekularnych interakcji grzybów z nasionami. Jest to realizowane poprzez uprzednie przygotowanie bioanalizy ziarna. Następnie przeprowadza się zliczenie kolonii, a w dalszej kolejności oznaczana jest ilość mikotoksyn.Na koniec dokonuje się pomiaru biomasy grzybni. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące wpływ fizjologii nasion na rozwój reprodukcyjny i metabolizm wtórny grzybów mykotoksynogennych poprzez kwantyfikację biomasy oraz metabolitów wtórnych z wykorzystaniem technik liczenia zarodników w połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową. Główną zaletą upowszechnienia tej techniki jest standaryzacja metod w wielu ośrodkach, co pozwoli na wzajemną interpretację wyników pochodzących z różnych laboratoriów.Niniejsza metoda może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu molekularnych oddziaływań między mikroorganizmami a nasionami, takich jak sposób, w jaki grzyby patogenne przejmują kontrolę nad metabolizmem lipidów rośliny w ramach strategii wirulencji. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ różne szczepy grzybów wykazują odmienne wzorce wzrostu i rozwoju. Dlatego niezbędna jest optymalizacja warunków dla badanego oddziaływania grzyb-nasiono na dwa tygodnie przed przeprowadzeniem testu w labiryncie.Hodowla do bioanalizy ziarna. Patogeny grzybowe na agarze ziemniaczano-dekstrozowym (PDA) w temperaturze 28 °C. Po osiągnięciu gotowości do rozpoczęcia procedury, należy wybrać ziarna o podobnym wieku, kształcie i rozmiarze, a następnie umieścić je w probówkach o pojemności 50 ml. Powierzchnia.Zasiewy należy wysterylizować, dodając 70% etanol i wstrząsając probówkami w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Następnie należy wstrząsać z wodą sterylną przez jedną minutę oraz z 6% podchlorynem sodu przez 10 minut. Płukać wodą sterylną trzy razy, wstrząsając przez pięć minut przy każdym płukaniu.Następnie osusz ziarna za pomocą ręczników autoklawowanych przed zakażeniem grzybem *Aspergillus flavus*. Użyj igły o rozmiarze 18 G, aby stworzyć niewielką ranę o głębokości 0,5 centymetra po stronie zarodka każdego ziarna. W przypadku zakażenia *Fusarium verticillioides*, użyj żyletki, aby wykonać nacięcie o głębokości 0,5 milimetra.Przygotować zawiesinę inokulacyjną, dodając pięć mililitrów autoklawowanego 0,1% roztworu tween 20 do płytek z hodowlą, a następnie użyć rozprzestrzeniacza komórkowego do zeskrobania zarodników. Usunąć grzybnię poprzez filtrację grawitacyjną roztworu przez co najmniej cztery warstwy autoklawowanej gazy. Użyć komory licznikowej (hemocytometru) do obliczenia stężenia zarodników i dostosować je do poziomu sześciu zarodników na mililitr.W przypadku obu gatunków grzybów. Stwórz komorę wilgotnościową w plastikowym pojemniku, wyściełając go pięcioma arkuszami ręczników papierowych i dodając 100 mililitrów sterylnej wody. Następnie umieść po cztery ziarna w każdym autoklawie.Fiolki szklane o pojemności 20 mililitrów w instalacji. Zważyć je i zapisać ich masę. Do nakrętki każdej fiolki dodać 200 mikrolitrów zawiesiny zarodników i wymieszać w wstrząsacu typu vortex, aby równomiernie pokryć ziarna zawiesiną.Następnie poluzuj zakrętki, aby umożliwić swobodną wymianę powietrza, i umieść probówki w komorze wilgotnościowej. Inkubuj ziarna w cyklu świetlnym 12 godzin światła i 12 godzin ciemności w temperaturze 28 °C przez siedem dni lub do uzyskania pożądanego efektu. Po okresie infekcji dodaj 5 mm autoklawowanego roztworu 0,01% Tween 20 do probówek symulacyjnych zawierających zainfekowane ziarna i dokładnie mieszaj w wstrząsarce wortex przez jedną minutę. Używając szerokiej końcówki pipety VRE, natychmiast rozcieńcz zawiesinę zarodników, przenosząc dwie oddzielne alikwoty o objętości 200 µL do probówek typu Eppendorf o pojemności 2 ml zawierających 1,8 ml 0,01% Tween 20.Użyj hemocytometru, aby dwukrotnie przeliczyć każdą porcję. W celu ilościowego oznaczenia aflatoksyny, umieść ziarna z jednej próbki w 50 mililitrowym kielichu blendera, dodając 20 mililitrów 80% metanolu oraz 0,05 grama chlorku sodu. Przykryj i blenduj z wysoką prędkością przez jedną minutę.Umieść zwilżony papier filtracyjny nad czystym naczyniem zbiorczym i wlej ekstrakt na filtr. Przenieś 10 ml filtrate do czystego naczynia. Dodaj 20 ml wody destylowanej i dokładnie wymieszaj.Przefiltruj próbkę przez szklany filtr z mikrowłókien o porach 1,5 micron do czystego kubka. Nanieś 1 mL przefiltrowanego ekstraktu na kolumnę testową ALE i za pomocą sprężonego powietrza przepuść ekstrakt przez kolumnę z prędkością od jednej do dwóch kropli na sekundę. Przemyj kolumnę dwukrotnie 1 mL wody destylowanej, przepuszczając ją przez kolumnę z prędkością jednej do dwóch kropli na sekundę, aż do pojawienia się pęcherzyków powietrza.Przepłucz kolumnę jednym mililitrem 100% metanolu klasy HPLC z szybkością jednej do dwóch kropli na sekundę, zbierając eluat do szklanego naczynia Q Vet. Do EIT dodaj jeden mililitr odczynnika wywołującego test ale i dokładnie wymieszaj. Umieść naczynie Q VET w skalibrowanym fluorymetrze i odczytaj wynik po 60 sekundach. W przypadku analizy acin B one lub FB one, do każdej próbki bioanalizy ziarna dodaj 10 mililitrów roztworu acetonidu trialu w wodzie w proporcji 50:50 i pozostaw do ekstrakcji przez noc w temperaturze pokojowej bez mieszania.Wymieszać ekstrakt z sześcioma mililitrami wody dejonizowanej i nałożyć go na kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej C 18, uprzednio przygotowaną dwoma mililitrami acetonitrylu, a następnie dwoma mililitrami wody. Po nałożeniu próbki przemyć kolumnę dwoma mililitrami wody, a następnie dwoma mililitrami acetonitrylu w wodzie. Eluować frakcję FB1 zawierającą próbkę do analizy HPLC za pomocą dwóch mililitrów acetonitrylu w wodzie.Przeprowadź derywatyzację FB 1, przenosząc 1 ml eluatedu z kolumny EIT do fiolki zawierającej 0,1 ml buforu boratowego i 0,1 ml aldehydu, a następnie inkubuj przez 10 minut. Przerwij reakcję, dodając 0,5 ml acetonitrylu oraz 0,01 M roztworu kwasu borowego. Przeanalizuj FB 1 metodą HPLC, stosując liniowy gradient acetonitrylu i 0,1 M fosforanu sodu.Porównaj próbki z jedną krzywą standardową FB, aby przeanalizować kulturę steroli grzyba na kukurydzy przez okres od 7 do 14 dni. Po okresie inkubacji dodaj 10 mililitrów chloroformu z metanolem do każdej probówki. Dobrze wstrząśnij próbki, a następnie inkubuj probówki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 24 godziny.Odwiruj próbki przy 5, 000 RPM przez trzy minuty. Następnie przefiltruj nadsącz przez membranę nylonową o rozmiarze porów 0.45 micron. Wstrzyknij próbkę bezpośrednio do kolumny HPLC i eluuj 100% metanolem przy szybkości przepływu 1.5 milliliters per minute.Ilościowo określ zawartość próbek, porównując powierzchnie pików do krzywej wzorcowej przygotowanej ze standardu klasy HPLC lub wysokiej czystości. Po inokulacji i inkubacji w komorze wilgotnościowej przez dwa do trzech dni na ziarnach powinien zacząć pojawiać się wzrost grzybni, jak pokazano tutaj.Wzrost wegetatywny na zaszczepionych ziarnach po potraktowaniu powinien być wyraźnie widoczny, podczas gdy kontrole pozorowane powinny pozostać niezinfekowane; dłuższe okresy inkubacji sprzyjają bardziej obfitemu wzrostowi wegetatywnemu. Rysunek ten pokazuje, że dziki typ flavus NR RL 3 3 5 7 wykazał maksymalne wartości kolonizacji, akumulacji aflatoksyn i produkcji kedia odpowiednio w czwartym, szóstym i ósmym dniu. Jednakże, po porównaniu skażenia mikotoksynami i tion w przeliczeniu na jednostkę rol, najwyższe poziomy zaobserwowano odpowiednio w czwartym i szóstym dniu.Przedstawiono tutaj reprezentatywne chromatogramy HPLC dla fumonizyny i rol, uzyskane przy użyciu metod zaprezentowanych w tym filmie. Poziomy fumonizyny wahają się od 3 500 do 8 000 nanogramów na gram ziarna, a poziomy rol od 5 000 do 10 000 nanogramów na gram ziarna. Po przeprowadzeniu bioanaliz ziarna, stężenia mikotoksyn oraz biomasa grzybowa mogą zostać zmierzone w ciągu od dwóch do czterech dni, w zależności od liczby próbek eksperymentalnych.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o przeprowadzeniu wszystkich etapów w jak najbardziej sterylnym środowisku. W celu uzyskania odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak to, które geny, białka i szlaki hormonalne są zaangażowane w te istotne interakcje między królestwami, można zastosować inne metody, takie jak fitohormonika, lipidomika, proteomika, transkryptomika lub inne techniki omiksowe.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Określanie ilościowej kolonizacji grzybów, sporogenezy i produkcji mykotoksyn za pomocą biotestów na ziarnach

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Ekstrakcja białek do analiz proteomicznych u gatunków grzybów wymaga wysokiego poziomu standaryzacji, aby została przeprowadzona zgodnie z wytycznymi dotyczącymi minimalnych informacji o eksperymencie proteomicznym (MIAPE). Przedstawiamy protokół wideo, który obejmuje procedurę minimalizacji błędów doświadczalnych podczas indukcji toksyn i ekstrakcji białek z Fusarium spp.

Indukcja toksyn i ekstrakcja białek z kultur Fusarium spp. do badań proteomicznych

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Tutaj opisujemy protokół do określania obciążenia grzybami płuc u myszy z inwazyjną aspergilozą poprzez ilościowe zabarwienie srebrem zmodyfikowanej metanaminy Gomoriego w przekrojach histologicznych. Zastosowanie tej metody przyniosło porównywalne wyniki przy mniejszej liczbie zwierząt w porównaniu z oceną obciążenia grzybami za pomocą ilościowej reakcji PCR DNA grzyba płuc.

Kwantyfikacja histologiczna w celu określenia obciążenia grzybicą płuc w eksperymentalnej aspergilozie

Tutaj prezentujemy protokół do analizy wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w ziarnach kukurydzy wyrażających białko przeciwgrzybicze. Używając szczepu A. flavus wykazującego ekspresję GFP, monitorowaliśmy infekcję i rozprzestrzenianie się grzyba w dojrzałych ziarnikach w czasie rzeczywistym. Test jest szybki, wiarygodny i powtarzalny.

Hamowanie wzrostu Aspergillus flavus i produkcji aflatoksyn w transgenicznej kukurydzy z ekspresją inhibitora α-amylazy z Lablab purpureus L.

Opisujemy zmodyfikowaną metodę opartą na agarze, zaprojektowaną do ilościowego określenia przeciwgrzybiczego działania produktów pochodzenia roślinnego. Za pomocą tego protokołu można ocenić zarówno lotny, jak i nielotny wkład w aktywność przeciwgrzybiczą. Ponadto skuteczność przeciwko grzybom można zmierzyć na kluczowych etapach rozwoju w jednym zestawie eksperymentalnym.

Pomiar lotnej i nielotnej aktywności przeciwgrzybiczej produktów kontroli biologicznej

Prezentujemy protokół obrazowania na żywo bez znaczników, wykorzystujący techniki mikroskopii światła przechodzącego do przechwytywania obrazów, analizy i ilościowego określania kinetyki wzrostu nitkowatego grzyba A. nidulans zarówno w kulturach zanurzonych, jak i w podłożach stałych. Protokół ten może być stosowany w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną.

Analiza ilościowa tempa wzrostu Aspergillus nidulans przy użyciu mikroskopii na żywo i oprogramowania typu open source

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Ten protokół ma na celu dostarczenie szczegółowych procedur zbierania, utrwalania i utrzymywania próbek roślin mykoheterotroficznych, stosując różne techniki mikroskopowe, takie jak skaningowa i transmisyjna mikroskopia elektronowa, mikroskopia świetlna, konfokalna i fluorescencyjna do badania kolonizacji grzybów w tkankach roślinnych i nasionach kiełkujących z grzybami mikoryzowymi.

Techniki mikroskopowe interpretacji kolonizacji grzybów w tkankach roślin mykoheterotroficznych i symbiotycznego kiełkowania nasion

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Poznaj metodę kwantyfikacji biosyntezy mikotoksyn i wzrostu grzybów w ziarnach za pomocą testów biologicznych. Technika ta umożliwia standaryzację badań nad interakcjami nasion z patogenami grzybowymi.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Przeglądaj więcej filmów