Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Celem tej metody jest wyizolowanie komórek macierzystych z przewodów gruczołów podślizówkowych tchawki myszy w celu badania ich właściwości, naprawy i regeneracji. W pierwszej kolejności tchawka jest wycinana z uśpionej myszy. Następnie tchawka jest oczyszczana, cięta i poddawana trawieniu.

Następnie nabłonek jest usuwany mechanicznie i poddawany dalszemu trawieniu w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki są następnie barwione, sortowane i ostatecznie przetwarzane do wykorzystania w analizach in vivo oraz in vitro. W ostateczności metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych szlaków regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych nabłonka dróg oddechowych.

Techniki te są istotne, ponieważ dostarczają modeli naprawy i regeneracji nabłonka dróg oddechowych in vitro oraz ex vivo. Pozwala to na badanie prawidłowej naprawy dróg oddechowych, jak również chorób układu oddechowego, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc, mukowiscydoza i astma. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy nie byliśmy w stanie znaleźć specyficznych markerów powierzchniowych pozwalających na oddzielenie komórek podstawnych od komórek macierzystych przewodowych, dlatego zdecydowaliśmy się usunąć nabłonek powierzchniowy wraz z komórkami podstawnymi, pozostawiając komórki przewodowe. Przedstawienie procedur preparowania tchawicy.

Zostanie przeprowadzone złuszczenie nabłonka dróg oddechowych, przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny oraz sortowanie komórek. Postdoc z mojego laboratorium, demonstrujący procedury przetwarzania sortowanych komórek w modelach in vitro oraz ex vivo, jest wspierany przez managera naszego laboratorium. Rozpocznij tę procedurę od rozcięcia ściany brzusznej uśpionej myszy.

Przesuń jelita na bok, aby odsłonić aortę brzuszną, a następnie ją wypreparuj. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę oraz wewnętrzną ścianę klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca. Kontynuuj cięcie w górę w stronę szyi, usuwając tłuszcz i ślinianki, aby za pomocą precyzyjnych nożyczek odsłonić tchawicę.

Usuń grasicę i oddziel płuco od tkanki łącznej znajdującej się pod i za nim. Następnie wprowadź pęsetę między tchawicę a przełyk, aby je rozdzielić. Przetnij tchawicę w jej górnej części, powyżej miejsca połączenia z krtanią.

Następnie za pomocą pęsety uchwyć tchawicę i odetnij ją od miejsca przyczepu. Kontynuując usuwanie tchawicy wraz z blokiem serca i płuc, wytnij serce oraz płuca w pobliżu wnęki, tak aby objąć większość prawego i lewego oskrzela głównego. Umieść tchawicę na lodzie pod mikroskopem stereoskopowym w małej szalce Petriego zawierającej medium zbierające.

Używając pęsety chirurgicznej nr 5, pęsety naczyniowej oraz nożyczek, usuń wszelkie tkanki przywierające do tchawicy. Należy usunąć węzły chłonne, tłuszcz wokół nerwu krtaniowego wstecznego, tarczycę oraz pozostałe naczynia płucne. Szczególną uwagę należy zwrócić na górną część tchawicy, aby usunąć duże fragmenty chrząstek krtaniowych, nie uszkadzając przy tym największego skupiska gruczołów podśluzowych, które znajduje się pomiędzy chrząstką pierścienowatą a pierwszym pierścieniem chrzęstnym tchawicy C1.

Następnie przetnij tchawicę na część górną i dolną między C4 a C5, a następnie wykonaj cięcie. Otwórz obie części wzdłuż światła tchawicy. Przenieś dolną część tchawicy do probówek do mikrowirowania o pojemności 1 ml, a górną część tchawicy do probówki stożkowej o pojemności 15 ml w celu trawienia enzymatycznego i przygotowania jednokomórkowych zawiesin.

W kolejnej części procedury dolny i górny odcinek tchawicy są poddawane obróbce w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek. Choć procesy te powinny być prowadzone równolegle, obie metody zostaną zaprezentowane sekwencyjnie. Aby opracować dolną część tchawicy, należy umieścić ją w jednej mililitrze 16 unit dis space w probówce do mikrocentryfugi i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.

Następnie przenieś tchawicę do nowej probówki zawierającej 0,5 mg/mL DNAzy I w DMM na dodatkowe 20 minut w temperaturze pokojowej; po trawieniu za pomocą precyzyjnej pęsety przenieś tkankę do sterylnej szalki Petriego zawierającej świeże medium zbierające. Następnie pod mikroskopem stereoskopowym usuń nabłonek powierzchniowy, delikatnie pociągając za płaty nabłonka, aby oddzielić je od leżącej pod nimi błony podstawnej. W dalszej kolejności za pomocą pipety przenieś medium zawierające usunięty nabłonek do stożkowej probówki o pojemności 50 mL i odwiruj przy 1000 G w temperaturze 4 °C.

Po wirowaniu usuń SNAT i dodaj 0,1%trypsyny EDTA, a następnie inkubuj probówkę w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Po inkubacji, używając pipety z końcówką 1000 µL, pipetuj zawiesinę w górę i w dół wielokrotnie, aby rozbić skupiska komórek i zapewnić uzyskanie jednokomórkowej zawiesiny. Górną część tchawicy umieść w probówce stożkowej zawierającej 1 ml 0,15%pronazy, a następnie inkubuj w temperaturze 4 °C przez cztery godziny. Dolną część tchawicy przenieś do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1 ml zawierającej 1 ml medium z dodatkiem 16 jednostek disc base.

Po inkubacji delikatnie wymieszaj zawartość probówki w wirówce typu vortex, a następnie przenieś tchawicę do świeżej pożywki zbierającej. Pod mikroskopem stereoskopowym potwierdź całkowite oddzielenie nabłonka powierzchniowego. Używając precyzyjnych nożyczek, posiekaj tchawicę i otwórz przestrzenie gruczołów podśluzówkowych.

Inkubować przez kolejną godzinę w 0,15% pronazie w temperaturze pokojowej przy powolnym wstrząsaniu. Po usunięciu pronazy odwirować tkankę tchawicy. Dodać 0,1% trypsyny z EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut przy wstrząsaniu.

Następnie odfiltruj duże fragmenty za pomocą sita o oczkach 70 μm. Potem wypłucz sito medium. Przepuść grudki strawionych komórek oraz wszelkie pozostałe fragmenty gruczołów przez igły o rozmiarach 20G, 23G i 26G, używając strzykawki o pojemności 10 ml.

Powtórz proces rozdrabniania kilkukrotnie dla każdego rozmiaru igły przed przejściem do kolejnego, mniejszego rozmiaru. Obecnie większość komórek powinna znajdować się w zawiesinie pojedynczych komórek. Przefiltruj zawiesinę przez sitko o oczkach 40 µm, następnie przemyj sitko pożywką i odwiruj komórki.

Następnie resuspenduj komórki w odpowiedniej objętości medium, dokonaj odliczania komórek i bezzwłocznie przystąp do barwienia oraz sortowania. Odseparuj ilość komórek wystarczającą do przygotowania probówek niebarwionych oraz barwionych pojedynczo do kompensacji. Pozostałe komórki obarw przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko trop tube i I TGA six przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyj komórki buforem PBS lub medium zbierającym, bardzo ostrożnie usuwając nadsącz.

Przenieś osad komórkowy do barwienia odpowiednim przeciwciałem wtórnym. Inkubuj w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie przemyj i usuń barwnik, a potem rozbij osad.

Komórki można teraz poddać fluorescencyjnemu sortowaniu komórek (FACS). Po posortowaniu komórki mogą zostać wykorzystane do badania mechanizmów naprawy i regeneracji w celu wytworzenia in vitro kultur sferoidalnych. Wymieszaj 100 µL Matrigelu o zredukowanej zawartości czynników wzrostu z 100 µL pożywki kompletnej zawierającej do 50 000 posortowanych komórek.

Pipetuj tę mieszaninę do górnej komory płytki transwell z 24 dołkami, a do komory dolnej pipetuj 400 µL kompletnego medium; inkubuj w temperaturze 37 °C. Wymieniaj medium w dolnej komorze co drugi dzień i dodawaj dodatkowe 100 µL Matrigelu co tydzień lub częściej, jeśli warstwa stanie się zbyt cienka.

Sferoidy zazwyczaj formują się po siedmiu dniach; mogą być hodowane przez kilka tygodni lub poddawane pasażowaniu seryjnemu. W przypadku modelu in vivo, resuspenduj sortowany osad komórkowy w pożywce kompletnej zmieszanej w stosunku jeden do jednego z matri gelem, przy stężeniu od 5 000 do 10 000 komórek na 50 µL. Po znieczuleniu myszy biorcy szczepu C 57 black six, wysterylizuj i ogol jej grzbiet, a następnie górną część pleców.

Wykonaj centralne podłużne nacięcie skóry. Używając tępej strony ostrza nożyczek, poszerz kieszenie między skórą a tylną ścianą klatki piersiowej po obu stronach. Odsuń przednią kończynę myszy do góry i do tyłu, aby odsłonić i zidentyfikować przyśrodkową krawędź łopatki.

Następnie, używając strzykawki insulinowej o pojemności 300 µL, wstrzyknij 50 µL zawiesiny komórkowej do poduszki tłuszczowej znajdującej się przyśrodkowo względem łopatki i bocznie względem kręgów. Powinien powstać pęcherzyk. Powtórz wstrzyknięcie po drugiej stronie, a następnie po trzech tygodniach zszyj lub zabezpiecz klipsem nacięcie skóry. Rozpruj skórę uśpionej myszy w ten sam sposób co wcześniej i wypreparuj całą poduszki tłuszczową z obu stron, zachowując margines bezpieczeństwa.

Aby uniknąć pominięcia jakichkolwiek struktur tkankowych, które mogły powstać i rozprzestrzenić się wokół, utrwal wypreparowaną tkankę tłuszczową w PFA i zatop ją w parafinie, aby zapobiec pominięciu lub przeoczeniu struktur podczas cięcia bloku. Wykonaj jedno przycięcie na 40 µm, a następnie wykonaj skrawki o grubości 4 µm.

Umieść preparat na szkiełku przedmiotowym, a następnie zbadaj go pod mikroskopem, aby ustalić, czy obecne są struktury nabłonkowe. Jeśli nic nie jest widoczne, należy ponownie przyciąć tkankę i powtórzyć ten krok. Usunięcie nabłonka z tchawicy myszy, zgodnie z opisem w tym filmie, doprowadzi do uzyskania tchawicy pozbawionej nabłonka, co jest widoczne w mikroskopii świetlnej, jak pokazano tutaj denuded tracheas.

Po 30 minutach trawienia, procesy trawienia są widoczne po lewej stronie w odrzuconych tchawicach. Po czterech godzinach trawienia pronazą efekty są widoczne po prawej stronie. Po usunięciu nabłonka gruczoły podsieplne zostają uwolnione z tkanek i przypominają kiście winogron.

Usuwanie komórek nabłonkowych powierzchni zaznaczono czarnymi strzałkami. Usuwanie komórek w przewodach gruczołów podśluzówkowych zaznaczono zielonymi strzałkami. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek powinna wykazać wykresy rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter), tak jak przedstawiono tutaj.

Dobra separacja komórek przewodowych od pozostałych. Jeśli komórki tchawicze są widoczne z przeciwciałem Trop two w cytometrii przepływowej w celu fluorescencyjnego sortowania komórek, to po około jednym tygodniu hodowli w matrigelu powinny być widoczne sfery; są one luminalne, gdy pochodzą z komórek podstawnych, i mają inny wygląd, gdy pochodzą z komórek przewodowych. Wydajność tego procesu wynosi od 1 do 2%, a w matrigelu wciąż będą obecne pojedyncze komórki, które prawdopodobnie reprezentują komórki z przewodów gruczołów podśluzowych, nieposiadające zdolności do samoodnowy.

Sfery podstawowe są większe i mają wygląd luminalny. Wstrzyknięcie komórek macierzystych przewodowych do podskórnej tkanki tłuszczowej myszy prowadzi do powstania struktur przypominających gruczoły podśluzowe, które są sferyczne i posiadają centralne światło. Są one widoczne w blokach tkanek nawet bez barwienia H&E.

Aby uzyskać przekrój zawierający te struktury nabłonkowe, konieczne jest wykonanie wielu cięć poprzecznych przez poduszkę tłuszczową. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować populację komórek macierzystych z komórek przewodowych gruczołu podsutarczy; po opanowaniu tej techniki cały proces można zrealizować w ciągu 10 godzin. Po zastosowaniu tej procedury można zmienić warunki hodowli, aby odpowiedzieć na kilka różnych pytań dotyczących tworzenia sfer oraz czynników wzrostu stymulujących regenerację.