Name: Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodu podśluzówkowego z tchawicy myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek podstawowych i komórek przewodu podśluzówkowego z tchawicy myszy. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów samoodnawiania i różnicowania komórek macierzystych dróg oddechowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Chcielibyśmy podziękować Broad Stem Cell Research Center FACS, a w szczególności Jessice Scholes i Felicii Codrea za pomoc w sortowaniu komórek. Praca została sfinansowana przez CIRM RN2-00904-1, K08 HL074229, American Thoracic Society/COPD Foundation ATS-06-065, The Concern Foundation, UCLA Jonsson Comprehensive Cancer Center Thoracic Oncology Program/Lung Cancer SPORE, University of California Cancer Research Coordinating Committee oraz Gwynne Hazen Cherry Memorial Laboratories (BG).

Krótki opis etapów
1. Disekcja tchawicy
2. Oczyszczanie i wycinanie tchawicy
3. Trawienie enzymatyczne i przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
4. Barwienie do FACS i sortowanie
5. Przetwarzanie posortowanych komórek do modeli in vivo i in vitro
1. Disekcja tchawki
<ol>
	<li>Uśmierć mysz poprzez dostarczenie dootrzewnowe 0,1 mg/0,2 cc pentobarbitalu.</li>
	<li>Nacinij ścianę brzucha i odsuń jelita na bok, aby odsłonić aortę brzuszną, a następnie przeprowadź jej wycięcie.</li>
	<li>Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę oraz przednią ścianę klatki piersiowej po obu stronach, aby odsłonić serce i płuca. Kontynuuj nacinanie w górę w stronę szyi, usuwając tłuszcz i ślinianki, aby odsłonić tchawicę.</li>
	<li>Usuń grasicę i odetnij płuca w miejscach ich połączeń poniżej i za nimi. Oddziel tchawicę od przełyku, wsuwając między nie pęsetę, a następnie przetnij tchawicę w jej najwyższej części, powyżej połączenia z krtanią. Następnie uchwyć tchawicę pęsetą, odseparuj ją od tkanek i kontynuuj preparację w dół, aby usunąć ją wraz z sercem i płucami w bloku. Odetnij serce i płuca w pobliżu wnęki, aby objąć większą część prawnego i lewego oskrzela głównego.</li>
	<li>Umieść tchawicę w małej szalce Petriego zawierającej medium do zbierania, na lodzie.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie i wycinanie tchawicy
<ol>
	<li>Pod mikroskopem stereowym użyj pęsety o bardzo cienkich końcach (nr 5) oraz nożyczek Vannasa Tubingen (FST 15003-08 finescience.com), aby oczyścić tchawicę ze wszystkich przylegających do niej tkanek. Należą do nich: węzły chłonne, nerw krtaniowy wsteczny, tkanka tłuszczowa, tarczyca oraz pozostałe naczynia płucne. Górna część tchawicy wymaga szczególnej uwagi podczas usuwania dużych chrząstek krtani, aby nie uszkodzić największego skupiska SMG, które znajduje się między chrząstką pierścienowatą a pierwszym pierścieniem chrzęstnym tchawicy (C1)4.</li>
	<li>Przetnij tchawicę na część górną i dolną pomiędzy C4 a C5, a następnie rozetnij obie części wzdłuż światła tchawicy.</li>
</ol>
3. Trawienie enzymatyczne i przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny (SCS)
<ol>
	<li>Inkubować dolną część tchawicy w 1 ml 16 U dyspazy w probówce Eppendorf w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 min, zgodnie z wcześniejszym opisem 5. Następnie dodać 0,5 mg/ml DNazy I w DMEM i inkubować przez kolejne 20 min w RT.</li>
	<li>Przenieść trawioną tchawicę do świeżego medium zbierającego w sterylnej płytce Petriego i usunąć nabłonek powierzchniowy pod mikroskopem dissectingowym. Za pomocą pipety przenieść medium zawierające usunięty nabłonek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować usunięty nabłonek przy 1 000 x g w temperaturze 4 °C. Usunąć nadsącz, dodać 0,1% trypsyny/EDTA i inkubować w inkubatorze wytrząsowym w temperaturze 37 °C (200 rpm) przez 30 min. Po inkubacji, używając końcówki 1 000 μl, pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić grudki i utworzyć jednokomórkową zawiesinę.</li>
	<li>Umieścić górną część tchawicy w probówce stożkowej zawierającej 1 ml 0,15% pronazy. Następnie inkubować w temperaturze 4 °C przez 4 h.</li>
	<li>Delikatnie wymieszać probówkę w wortexie, a następnie przenieść tchawicę do świeżego medium zbierającego i potwierdzić pod mikroskopem dissectingowym całkowite oddzielenie nabłonka powierzchniowego (SE).</li>
	<li>Posiekać tchawicę drobnymi nożyczkami, aby otworzyć przedziały SMG, a następnie inkubować przez kolejną godzinę w pronazie w RT przy powolnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Odwirować tkankę tchawicy, usunąć pronazę, dodać 0,1% trypsyny/EDTA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min z wstrząsaniem jak opisano wyżej.</li>
	<li>Przepuścić strawione komórki, grudki i pozostałe fragmenty gruczołów przez igły 20G, 23G i 26G, używając strzykawki 10 ml. Powtórzyć pasażowanie kilka razy dla każdego rozmiaru igły przed przejściem do mniejszej średnicy. Na tym etapie większość komórek powinna znajdować się w formie SCS.</li>
	<li>Przefiltrować zawiesinę przez sito 40 μM, następnie przemyć sito i odwirować komórki. Następnie resuspendować komórki w odpowiedniej objętości medium, policzyć komórki i bezzwłocznie przystąpić do barwienia i sortowania metodą FACS. Nie pozostawiać komórek w temperaturze 4 °C ani na lodzie przez kilka godzin, ponieważ stwierdzono, że wpływa to na żywotność i znacznie zmniejsza wydajność tworzenia sfer.</li>
</ol>
4. Barwienie do FACS i sortowanie
<ol>
	<li>Odłożyć odpowiednią liczbę komórek do przygotowania probówek kontrolnych (niebarwionych i barwionych pojedynczo) do kompensacji, a pozostałe komórki zabarwić przeciwciałami pierwotnymi (kozio Trop2 i szczur ITGA6) przez 15 min w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć PBS-em lub medium zbierającym, bardzo ostrożnie usunąć nadsącz i rozbić osad komórkowy.</li>
	<li>Zabarwić odpowiednim przeciwciałem wtórnym, inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 min, przemyć, usunąć nadsącz, a następnie rozbić osad.</li>
	<li>W urządzeniu FACS ARIA, po dostrojeniu napięcia i kompensacji, wykluczyć (gate out) debris, bardzo małe komórki, dublety oraz martwe komórki. Większość komórek z SE powinna być TROP2-dodatnia, podczas gdy 20-50% komórek SMG będzie TROP2+ 6.</li>
	<li>Ustawić bramkę sortowania (sorting gate) dla komórek Trop2+ITGA6+ z SE (komórki podstawowe) oraz dla komórek Trop2+ (komórki +/-ITGA6 dodatnie) z SMG (komórki przewodowe).</li>
</ol>
5. Przetwarzanie posortowanych komórek do hodowli in vitro oraz modelu in vivo
5.1 Hodowla sfer In vitro 5-9
<ol>
	<li>Wymieszać 100 μl „Growth Factor reduced Matrigel” z 100 μl pełnej pożywki 10,11 (patrz Tabela 1) zawierającej do 50 000 posortowanych komórek, a następnie umieścić tę mieszaninę w górnej komorze wkładu trans-well w płytce 24-dołkowej. Następnie wlać 400 μl pełnej pożywki do dolnej komory i inkubować w temperaturze 37 °C. Wymieniać pożywkę w dolnej komorze co drugi dzień i dodawać dodatkowe 100 μl Matrigeluy co tydzień lub wcześniej, jeśli warstwa stanie się zbyt cienka.</li>
</ol>
5.2 Model in vivo
<ol>
	<li>Resuspender osad posortowanych komórek w pełnym medium zmieszanym w stosunku 1:1 z matrigelem, przy stężeniu 5 000-10 000 komórek na 50 μl.</li>
	<li>Zznieczylić myszy biorcy szczepu C57/BL6. Podać podskórnie karprofen (5 mg/kg) jako lek przeciwbólowy. Zsterylizować i ogolić grzbiet, a następnie wykonać centralne podłużne nacięcie skóry w górnej części grzbietu. Nacięcie powinno być wystarczająco duże, aby zidentyfikować miejsce wstrzyknięcia w tkance tłuszczowej oraz pęcherzyk powstający po iniekcji. Użyć tępego końca nożyczek, aby rozszerzyć przestrzenie między skórą a tylną ścianą klatki piersiowej po obu stronach, w celu maksymalizacji dostępu i widoczności.</li>
	<li>Zidentyfikować przyśrodkową krawędź łopatki, przesuwając przednią kończynę myszy do góry i do tyłu, aby zaobserwować ruch łopatki. Nabrać 50 μl zawiesiny komórkowej do strzykawki insulinowej BD o pojemności 300 μl i wstrzyknąć ją do tkanki tłuszczowej przyśrodkowo w stosunku do łopatki i bocznie w stosunku do kręgów. Powinien być widoczny pęcherzyk; w przeciwnym razie igła została wprowadzona zbyt głęboko. Powtórzyć tę samą procedurę po drugiej stronie, a następnie zapiąć lub zszyć nacięcie skóry. Monitorować myszy i podawać karprofen (5 mg/kg, SC) raz dziennie przez 48 h.</li>
	<li>Po 3 tygodniach uśpić myszy pentobarbitalem (0,1 mg/0,2 cc, IP), otworzyć skórę w opisany wcześniej sposób i wyciąć całą tkankę tłuszczową z obu stron z marginesem bezpieczeństwa, aby uniknąć pominięcia jakichkolwiek struktur tkankowych, które mogły powstać i rozprzestrzenić się w okolicy. Utrwalić w PFA i zalać do parafiny 12. Podczas przycinania i krojenia bloku należy zachować szczególną ostrożność, aby nie pominąć żadnej struktury. Najlepszą praktyką jest jednorazowe przycięcie 40 μm, a następnie wycięcie plastra o grubości 4 μm, umieszczenie go na szkiełku i zbadanie pod mikroskopem w celu potwierdzenia, czy w tej części bloku znajdują się „struktury nabłonkowe”. Jeśli nic nie zostanie zaobserwowane, należy ponownie przyciąć blok i powtórzyć ten krok.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Usunięcie tkanek z tchawic mysich doprowadzi do uzyskania oczyszczonej tchawicy, widocznej w mikroskopii światła, co przedstawiono na Rysunku 1A. Rysunek 1B przedstawia obraz w jasnym polu tchawicy po usunięciu nabłonka, gdzie gruczoły podmukozowe zostały uwolnione z tkanek i przypominają grona winogron.
Pronaza usuwa epitop ITGA6, dlatego komórki przewodowe TROP2 nie mogą zostać rozdzielone na populacje ITGA6+ i -. Jednakże dispaza, która zachowuje epitop ITGA6, trawi cały nabłonek powierzchniowy oraz komórki przewodowe nawet przy bardzo krótkim czasie inkubacji, i dlatego nie może być używana do oddzielania komórek przewodowych od podstawnych3. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek powinna wykazać wykresy rozproszenia przedniego i bocznego przedstawione na Rysunku 2A. Dobra separacja komórek przewodowych od pozostałych komórek tchawicy powinna być widoczna przy użyciu przeciwciała Trop2 w cytometrii przepływowej do fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), co pokazano na Rysunku 2B. Sfery powinny być widoczne w matrigelu po około 1 tygodniu hodowli i mają gęsty wygląd, jak pokazano na Rysunku 3. Wydajność tego procesu wynosi około 1-2% i w matrigelu nadal będą obecne pojedyncze komórki, które prawdopodobnie reprezentują komórki z przewodów gruczołów podśluzowych niewykazujące zdolności do samoodnowy. Wstrzyknięcie macierzystych komórek przewodowych do tkanki tłuszczowej myszy skutkuje powstaniem struktur przypominających gruczoły podśluzowe, przedstawionych na Rysunku 4. Są one widoczne w blokach nawet bez barwienia H&amp;E. Mają one kształt sferyczny i posiadają centralny światło. Należy wykonać wiele przekrojów przez tkankę tłuszczową, aby nie przeoczyć tych struktur nabłonkowych.
<img alt="Histologia, porównanie traktowania enzymatycznego; dyspaza 30 min vs pronaza 4 godz.; trawienie tkanki." src="/files/ftp_upload/3731/3731fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Trawienie enzymatyczne nabłonka tchawki. Usuwanie powierzchniowych komórek nabłonka zaznaczono czarnymi strzałkami, a usuwanie komórek w przewodach gruczołów podśluzowych zielonymi strzałkami. Ogołocone tchawki widoczne w mikroskopii świetlnej przedstawiono po 30 min trawienia dyspazą oraz po 4 godz. trawienia pronazą.
 
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające analizę danych SSC vs. FSC oraz rozkład TROP2; wykres z wynikami." src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2A.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2A"> 
Rysunek 2A. i. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek przedstawiająca reprezentatywne wykresy rozprosiania przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter) z tchawic myszy po usunięciu nabłonka powierzchniowego. ii. Reprezentatywne wykresy FACS dla ekspresji TROP2 w komórkach przewodowych z tchawic myszy.
<img alt="Schematy analizy cytometrii przepływowej; wykresy rozrzutu SSC vs FSC, TROP2, ITGA6; wyniki sortowania komórek." src="/files/ftp_upload/3731/3731fig2B.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2B"> 
Rysunek 2B. i. Cytometria przepływowa zawiesin pojedynczych komórek z oddzielonego nabłonka powierzchniowego dolnych dwóch trzecich tchawicy myszy, przedstawiająca reprezentatywne wykresy rozproszenia przedniego (forward scatter) i bocznego (side scatter). ii. Typowy wykres FACS ekspresji ITGA6 w nabłonku powierzchniowym. iii. Inny reprezentatywny wykres FACS rozproszenia przedniego i bocznego z nabłonka powierzchniowego, pokazujący wsteczne bramkowanie (back gating) populacji komórek podstawowych w kolorze zielonym. iv. Typowa populacja komórek wykazujących ekspresję ITGA6 i TROP2 w kolorze zielonym.
<img alt="Schemat przebiegu czasowego wzrostu sfer przewodowych i podstawnych myszy w ciągu kolejnych dni, obrazy mikroskopowe." src="/files/ftp_upload/3731/3731fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 3. Przebieg czasowy rozwoju sfer. A. Sfery przewodowe. Sfery powinny być widoczne w matrigelu po około 1 tygodniu hodowli i niemal wszystkie mają gęsty wygląd. Widoczne są również pojedyncze komórki, które nie tworzą sfer (pasek skali = 50 μm). B. Sfery podstawne są większe i mają wygląd luminalny. Widoczne są również pojedyncze komórki, które nie tworzą sfer (pasek skali = 50 μm).
<img alt="Obrazy z mikroskopii histologicznej przedstawiające próbki tkanek w skali 100 µm; analiza morfologii komórek." src="/files/ftp_upload/3731/3731fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Wstrzyknięcie komórek macierzystych przewodu do tkanki tłuszczowej myszy prowadzi do powstania struktur przypominających gruczoły podśluzowe. Reprezentatywne struktury pokazano w tkance tłuszczowej, a niektóre z nich wykazują produkcję mucyny (jasnoniebieski kolor) po zabarwieniu błękitem Alcian i Periodic Acid Schiff.

<ol><li>Bartlett, J. A., Fischer, A. J., McCray, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+functions+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Contrib.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Innate immune functions of the airway epithelium.</a> Contrib. Microbiol. 15, 147-163 (2008).</li>
<li>Finkbeiner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiology+and+pathology+of+tracheobronchial+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Physiology and pathology of tracheobronchial glands.</a> Respir. Physiol. 118, 77-83 (1999).</li>
<li>Hegab, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Stem%2FProgenitor+Cell+Population+from+Murine+Tracheal+Submucosal+Gland+Ducts+with+Multipotent+Regenerative+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">A Novel Stem/Progenitor Cell Population from Murine Tracheal Submucosal Gland Ducts with Multipotent Regenerative Potential.</a> Stem Cells. , (2011).</li>
<li>Jeffery, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+features+of+airway+surface+epithelial+cells+and+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Rev.+Respir.+Dis%22%5BJournal%5D)">Morphologic features of airway surface epithelial cells and glands.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, S14-S20 (1983).</li>
<li>Rock, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+cells+as+stem+cells+of+the+mouse+trachea+and+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 12771-12775 (2009).</li>
<li>Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+identifies+a+subpopulation+of+murine+and+human+prostate+basal+cells+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Trop2 identifies a subpopulation of murine and human prostate basal cells with stem cell characteristics.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20882-20887 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>McQualter, J. L., Yuen, K., Williams, B., Bertoncello, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+an+epithelial+stem%2Fprogenitor+cell+hierarchy+in+the+adult+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Evidence of an epithelial stem/progenitor cell hierarchy in the adult mouse lung.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1414-1419 (2010).</li>
<li>Inayama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+growth+and+differentiation+of+clones+of+tracheal+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo growth and differentiation of clones of tracheal basal cells.</a> Am. J. Pathol. 134, 539-549 (1989).</li>
<li>You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells%3A+selection+of+a+proliferative+population%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung.+Cell.+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population.</a> Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 283, L1315-L1321 (2002).</li>
<li>Wu, X., Peters-Hall, J. R., Bose, S., Pena, M. T., Rose, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Bronchial+Epithelial+Cells+Differentiate+to+3D+Glandular+Acini+on+Basement+Membrane+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Bronchial Epithelial Cells Differentiate to 3D Glandular Acini on Basement Membrane Matrix.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. , (2010).</li>
<li>Ooi, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+a+putative+tumor-initiating+progenitor+cell+population+predicts+poor+prognosis+in+smokers+with+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Presence of a putative tumor-initiating progenitor cell population predicts poor prognosis in smokers with non-small cell lung cancer.</a> Cancer Res. 70, 6639-6648 (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Niniejsza technika izolacji komórek przewodowych i podstawkowych z dróg oddechowych jest istotna dla pogłębienia wiedzy na temat naprawy i regeneracji dróg oddechowych oraz chorób tych dróg. Opisane tutaj metody obejmują kilka kluczowych etapów. Pierwszym z nich jest zoptymalizowany czas trawienia enzymatycznego. Drugim jest przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek poprzez seryjne pasażowanie z użyciem igieł o progresywnie mniejszej średnicy (wyższym numerze G), co zapobiega ścinaniu komórek, a jednocześnie pozwala n...

<table><tbody><tr><td>Pożywka kompletna &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt;:&lt;br/&gt; DMEM-F-12, 50/50, 1X) </td><td>Mediatech</td><td>15-090-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hepes (15 mM)</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (3,6 mM lub 0,03%)</td><td>Invitrogen</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina (4 mM)</td><td>Mediatech</td><td>25-005-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina (100 J/ml)</td><td>Mediatech</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna (100 &amp;mu;g/m)</td><td>Mediatech</td><td>30-001-CI</td><td></td></tr><tr><td>Insulina (10 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Transferryna (5 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>Toksyna cholery (0,1 &amp;mu;g/ml)</td><td>Sigma</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>czynnik wzrostu naskórka (25 ng/ml)</td><td>BD</td><td>354001</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt z przysadki bydlęcej (30 &amp;mu;g/ml)</td><td>Invitrogen</td><td>13028-014</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (5%)</td><td>Fisher</td><td>SH3008803HI</td><td></td></tr><tr><td>Kwas retinowy (0,05 &amp;mu;M)</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel o zredukowanej zawartości czynników wzrostu</td><td>BD</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 1. &lt;/strong&gt; Składniki pełnej pożywki.&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>Pronaza</td><td>Roche</td><td>10165921001</td><td>Stężenie użyte: 0,15%:&lt;br/&gt; -o/n w temperaturze 4°C &amp;deg;Trawienie enzymatyczne w celu izolacji całkowitej populacji komórek tchawicy (do hodowli ALI) &lt;br/&gt; - 4-godzinne trawienie 4 &amp;deg;Izolacja SMG</td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>BD Biosciences</td><td>354235</td><td>Zastosowano w ilości 16 jednostek: 30 min w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>DNaza I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td>Stosowane w stężeniu 0,5 mg/ml:&lt;br/&gt; 20–30 min w temp. pokojowej </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Duże drogi oddechowe pozostają w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem, przez co są podatne na uszkodzenia wywołane przez toksyny i czynniki zakaźne, które wdychamy. W związku z tym duże drogi oddechowe wymagają wydajnego mechanizmu naprawczego w celu ochrony organizmu. Proces naprawy ten zachodzi dzięki komórkom macierzystym obecnym w drogach oddechowych, a ich izolacja jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów naprawy i regeneracji. Jest to również istotne dla zrozumienia nieprawidłowych procesów naprawczych, które mogą prowadzić do chorób dróg oddechowych. Celem niniejszej metody jest izolacja nowej populacji komórek macierzystych z przewodów gruczołów podśluzowych tchawicy myszy oraz umieszczenie tych komórek w modelach in vitro i in vivo w celu zidentyfikowania mechanizmów naprawy i regeneracji gruczołów podśluzowych. Niniejsza publikacja przedstawia metody, które można wykorzystać do izolacji i analizy komórek macierzystych przewodowych i bazalnych z dużych dróg oddechowych. Pozwoli to na badanie chorób dróg oddechowych, takich jak mukowiscydoza, astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Obecnie nie istnieją metody izolacji komórek przewodowych gruczołów podśluzowych ani modele in vivo służące do badania regeneracji gruczołów podśluzowych.&quot;&gt;&lt;strong&gt;Tabela 2. &lt;/strong&gt; Enzymy stosowane do trawienia enzymatycznego tchawicy.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Isolation of Basal Cells and Submucosal Gland Duct Cells from Mouse Trachea

Duże drogi oddechowe są w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem, a zatem są podatne na uszkodzenia spowodowane toksynami i czynnikami zakaźnymi, które wdychamy 1. W związku z tym duże drogi oddechowe wymagają wydajnego mechanizmu naprawczego w celu ochrony organizmu. Proces ten odbywa się dzięki komórkom macierzystym dróg oddechowych, a izolacja tych komórek jest kluczowa dla zrozumienia mechanizmów naprawy i regeneracji. Jest to również istotne dla zrozumienia nieprawidłowych procesów naprawczych, które mogą prowadzić do chorób dróg oddechowych 2. Celem niniejszej metody jest wyizolowanie nowej populacji komórek macierzystych z przewodów gruczołów podśluzowych tchawicy myszy oraz umieszczenie tych komórek w modelach in vitro i in vivo w celu zidentyfikowania mechanizmów naprawy i regeneracji gruczołów podśluzowych 3. Niniejszy materiał prezentuje metody, które mogą być wykorzystane do izolacji i analizy komórek macierzystych przewodowych i podstawnych z dużych dróg oddechowych 3. Pozwoli to na badanie chorób dróg oddechowych, takich jak mukowiscydoza, astma i przewlekła obturacyjna choroba płuc. Obecnie nie istnieją metody izolacji komórek przewodowych gruczołów podśluzowych oraz nie opracowano modeli in vivo do badania regeneracji gruczołów podśluzowych.

W niniejszym materiale prezentujemy protokół izolacji komórek podstawnych oraz komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy. Przedstawiamy również metodę wstrzykiwania komórek macierzystych do grzbietowej poduszki tłuszczowej myszy w celu stworzenia modelu in vivo regeneracji gruczołów podśluzowych.

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Duże drogi oddechowe są w bezpośrednim kontakcie ze środowiskiem, a zatem są podatne na uszkodzenia spowodowane toksynami i czynnikami zakaźnymi, które wdychamy 1. ...

Celem tej metody jest wyizolowanie komórek macierzystych z przewodów gruczołów podślizówkowych tchawki myszy w celu badania ich właściwości, naprawy i regeneracji. W pierwszej kolejności tchawka jest wycinana z uśpionej myszy. Następnie tchawka jest oczyszczana, cięta i poddawana trawieniu.Następnie nabłonek jest usuwany mechanicznie i poddawany dalszemu trawieniu w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek. Komórki są następnie barwione, sortowane i ostatecznie przetwarzane do wykorzystania w analizach in vivo oraz in vitro. W ostateczności metoda ta może pomóc w zidentyfikowaniu kluczowych szlaków regulujących samoodnawianie i różnicowanie komórek macierzystych nabłonka dróg oddechowych.Techniki te są istotne, ponieważ dostarczają modeli naprawy i regeneracji nabłonka dróg oddechowych in vitro oraz ex vivo. Pozwala to na badanie prawidłowej naprawy dróg oddechowych, jak również chorób układu oddechowego, takich jak przewlekła obturacyjna choroba płuc, mukowiscydoza i astma. Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy nie byliśmy w stanie znaleźć specyficznych markerów powierzchniowych pozwalających na oddzielenie komórek podstawnych od komórek macierzystych przewodowych, dlatego zd

isolation-basal-cells-submucosal-gland-duct-cells-from-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podslizizny z tchawicy myszy

Komórki nabłonka płuc można wyizolować z dróg oddechowych myszy i hodować na granicy fazy powietrze-ciecz jako model zróżnicowanego nabłonka oddechowego. Opisano protokół izolacji, hodowli i narażania tych komórek na dym papierosowy z głównego strumienia w celu zbadania odpowiedzi molekularnych na tę toksynę środowiskową.

Izolacja komórek nabłonka dróg oddechowych myszy i ekspozycja na eksperymentalny dym tytoniowy w układzie interfejsu powietrze-ciecz

Opisujemy metodę szybkiej izolacji pierwotnych pęcherzykowych komórek nabłonkowych typu II (AECII) myszy za pomocą negatywnej selekcji cytometrycznej. Uzyskane komórki AECII wykazują wysoką żywotność oraz czystość i nadają się do szerokiego zakresu badań funkcjonalnych i molekularnych dotyczących ich roli w schorzeniach układu oddechowego, takich jak choroby autoimmunologiczne lub zakaźne.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonkowych pęcherzyków płucnych typu II myszy metodą cytometrii przepływowej do badań funkcjonalnych i molekularnych

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Opisana jest łatwa i niezawodna technika wizualizacji i ilościowego określania ruchliwości rzęsek w drogach oddechowych oraz przepływu generowanego przez rzęski za pomocą tchawicy myszy.  Technikę tę można zmodyfikować w celu określenia, w jaki sposób szeroki zakres czynników wpływa na ruchliwość rzęsek, w tym czynniki farmakologiczne, czynniki genetyczne, narażenie środowiskowe i/lub czynniki mechaniczne, takie jak obciążenie śluzem.

Ex vivo Metoda obrazowania w wysokiej rozdzielczości ruchliwości rzęsek w nabłonku dróg oddechowych gryzoni

Komórki szczoteczki to rzadkie cholinergiczne komórki nabłonka chemosensorycznego znalezione w naiwnej tchawicy myszy. Ze względu na ich ograniczoną liczbę, ocena ex vivo ich funkcjonalnej roli w odporności i przebudowie dróg oddechowych jest trudna. Opisano metodę izolacji komórek szczoteczki tchawicy za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja i ocena ilościowa komórek szczoteczki z tchawicy myszy

Gruczoł łzowy (LG) ma dwa typy komórek wyrażających aktynę α mięśni gładkich (αSMA): komórki mioepitelialne (MEC) i perycyty. MEC są pochodzenia ektodermalnego, znajdują się w wielu tkankach gruczołowych, podczas gdy perycyty to komórki mięśni gładkich naczyń krwionośnych pochodzenia endodermalnego. Protokół ten izoluje MEC i perycyty od mysich LG.

Izolacja komórek mioepitelialnych z dorosłych mysich gruczołów łzowych i podżuchwowych

Ten artykuł zawiera szczegółową metodologię metod dysocjacji tkanek i frakcjonowania komórkowego, umożliwiając wzbogacenie żywotnych komórek nabłonkowych z bliższych i dalszych obszarów ludzkiego płuca. W tym przypadku podejścia te są stosowane do analizy funkcjonalnej komórek progenitorowych nabłonka płuc poprzez wykorzystanie modeli hodowli organoidów 3D.

Izolacja i wzbogacanie ludzkich komórek progenitorowych nabłonka płuc do hodowli organoidów

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mysich mezenchymów jelitowych, w tym telocytów. Mogą one być wykorzystywane do kilku zastosowań, takich jak współhodowla z organoidami pochodzącymi od myszy lub ludzi, w celu wsparcia wzrostu i lepszego odzwierciedlenia sytuacji w oryginalnej tkance.

Izolacja mysiej mezenchymy jelitowej skutkująca wysoką wydajnością telocytów

Przedstawiona tutaj jest powtarzalna, przystępna cenowo i solidna metoda izolacji i ekspansji pierwotnych komórek nabłonka oskrzeli do długoterminowego biobankowania i generowania zróżnicowanych komórek nabłonkowych przez hodowlę na granicy powietrze-ciecz.

Izolowanie komórek nabłonka oskrzeli z wyciętej tkanki płucnej w celu biobankowania i tworzenia dobrze zróżnicowanych kultur granicy faz powietrze-ciecz

Tutaj opisujemy model in vitro do izolowania i różnicowania mysich komórek nabłonka dróg oddechowych, skupiając się na ich aklimatyzacji do przewlekłego ekstraktu z dymu papierosowego (CSE). Model może zostać wykorzystany do kompleksowego scharakteryzowania multiomicznego wpływu CSE, co może dostarczyć informacji na temat reakcji komórkowych na przewlekłe narażenie na dym tytoniowy.

Model in vitro do badania różnicowania i zmian multiomiki na mysich komórkach nabłonka dróg oddechowych stymulowanych ekstraktem z dymu papierosowego

Ten protokół opisuje metodę ilościowego określania produkcji tlenku azotu (NO) w kulturach nabłonka dróg oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-ciecz (ALI) poprzez pomiar azotynów w sekretach wierzchołkowych za pomocą testu chemiluminescencyjnego opartego na trijodku.

Ocena produkcji tlenku azotu w kulturach ludzkich komórek nabłonkowych przewodów oddechowych zróżnicowanych na granicy powietrze-płyn

Poznaj metodę izolacji komórek podstawowych i komórek przewodu podśluzówkowego z tchawicy myszy. Technika ta umożliwia badanie mechanizmów samoodnawiania i różnicowania komórek macierzystych dróg oddechowych.

Izolacja komórek podstawnych i komórek przewodów gruczołów podśluzowych z tchawki myszy

Przeglądaj więcej filmów