Name: Wytwarzanie indukowanych regulatorowych limfocytów T z pierwotnych ludzkich naiwnych i pamięciowych limfocytów T (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania indukowanych regulatorowych limfocytów T z ludzkich limfocytów T CD4+. Technika umożliwia porównanie komórek Treg z innymi podzbiorami w obrębie jednego dawcy, zwiększając homogeniczność genetyczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Jennifer Strange i Gregowi Baumanowi za pomoc w analizie i sortowaniu metodą cytometrii przepływowej. Praca ta była wspierana przez grant NIH numer 2P20 RR020171 z NCRR oraz środki startowe University of Kentucky przyznane F.M.; G.I.E. potwierdza wsparcie w ramach Presidential Graduate Fellowship oraz Kentucky Opportunity Fellowship.

1. Izolacja mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) człowieka z warstwy buffy coat
<ol>
 <li>Nabyć jedną jednostkę warstwy leukocytarnej (buffy coat) ze szpitala lub pobliskiego centrum krwiodawstwa. Nasze centrum krwiodawstwa dostarcza około 40-60 mL warstwy leukocytarnej na jednostkę pobraną od zdrowych dawców krwi.</li>
 <li>Wlać krew do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 mL zawierającej sterylny PBS w celu rozcieńczenia warstwy leukocytarnej. Końcowa objętość PBS + warstwy leukocytarnej powinna wynosić 250 mL.</li>
 <li>Napełnić dziesięć stożkowych probówek o pojemności 50 mL, wlewając do każdej 20 mL roztworu Lymphoprep.</li>
 <li>Ostrożnie nanieść 25 mL rozcieńczonej warstwy leukocytarnej na powierzchnię roztworu Lymphoprep, dbając o to, aby nie zmieszać go z warstwą naddaną.</li>
 <li>Wirować probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 500 x g. Należy upewnić się, że hamulec wirówki jest wyłączony, aby nie zakłócić frakcji limfocytów.</li>
 <li>Zebrać PBMC za pomocą pipety z granicy rozdziału między warstwą Lymphoprep a warstwą osocza. Odessać osocze, pozostawiając około 1 mL nad warstwą leukocytarną zawierającą PBMC. Użyć pipety 10 mL, aby przenieść PBMC do nowej probówki 50 mL.</li>
 <li>Przemyć komórki dwukrotnie PBS, a następnie resuspendować je w 50 mL zimnego RPMI w celu policzenia na hemocytometrze. Typowa wydajność wynosi 8 x 108 - 1 x 109 PBMC.</li>
</ol>
Procedurę tę można przeskalować dla mniejszych objętości krwi. Rozcieńczenie próbek krwi pełnej wynosi 1:1 w PBS.
2. Magnetyczna selekcja negatywna całkowitych limfocytów T CD4+, naiwnych limfocytów T CD4+ CD45RA+ lub limfocytów T pamięci CD4+ CD45RO+ z PBMC przy użyciu zestawów do wzbogacania EasySep (Stem Cell Technologies)
Kroki należy wykonać dla 1 x 108 do 4,25 x 108 PBMC.
<ol>
 <li>Resuspenduj PBMC do końcowego stężenia 5 x 107 na mL w PBS zawierającym 2% FBS i 1mM EDTA. Przenieś komórki do nowej polipropylenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 14 mL.
 <ol class="lalpha">
 <li>Izolacja całkowitej populacji ludzkich limfocytów T CD4+ metodą selekcji negatywnej: dodaj koktajl przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Izolacja ludzkich naiwnych limfocytów T metodą selekcji negatywnej: dodaj 50 μL przeciwciała anty-CD45RO na mL zawiesiny komórek PBMC, wymieszaj i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Dodaj koktajl wzbogacający dołączony do zestawu (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Izolacja ludzkich limfocytów T pamięci metodą selekcji negatywnej: dodaj koktajl przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ pamięci (50 μL na mL PBMC), wymieszaj i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Dokładnie wymieszaj cząsteczki magnetyczne, aby równomiernie rozprowadzić je w roztworze. Nie mieszaj nanocząsteczek z zestawu do izolacji limfocytów naiwnych na wirówce typu vortex.</li>
 <li>Dodaj cząsteczki magnetyczne (100 μL na mL PBMC dla selekcji całkowitej populacji CD4+ i naiwnych limfocytów T, 50 μL na mL PBMC dla selekcji limfocytów T pamięci). Wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut w przypadku selekcji naiwnych limfocytów T lub przez 5 minut dla selekcji limfocytów pamięci lub całkowitej populacji T CD4+.</li>
 <li>Dodaj PBS zawierający 2% FBS i 1 mM EDTA, aby zwiększyć objętość do 10 mL na probówkę. Wymieszaj, delikatnie pipetując 2-3 razy, a następnie umieść niezatykaną probówkę w srebrnym magnesie EasySep na 5, 10 lub 2,5 minuty odpowiednio dla całkowitych limfocytów T CD4+, naiwnych oraz limfocytów pamięci.</li>
 <li>Trzymając probówkę w magnesie EasySep, przelej ciecz do nowej probówki 50 mL, aby wyizolować pożądane komórki.</li>
 <li>Powtórz kroki 2.5 i 2.6 w celu uzyskania lepszej wydajności odzysku.</li>
</ol>
3. Warunki hodowli komórkowej w celu indukcji limfocytów T regulatorowych
<ol>
 <li>Dzień przed wykonaniem kroków 1 i 2, pokryj płytki do hodowli tkanek, rozcieńczając najpierw przeciwciało anty-CD3 (klon OKT3) do stężenia 1 μg/mL w sterylnym PBS. W przypadku płytki 6-dołkowej dodaj 2 mL PBS + anty-CD3 na dołek, dla płytki 12-dołkowej dodaj 1 mL, a dla płytki 24-dołkowej dodaj 500 μL na dołek. Przechowuj pokrytą płytkę w temperaturze 4 °C do momentu użycia.</li>
 <li>Przygotuj pożywkę do polaryzacji, dodając 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny oraz 50 μM β-merkaptoetanolu do pożywki RPMI-1640 uprzednio uzupełnionej o 2,06 mM Glutamax-I i 25 mM bufor HEPES. Następnie dodaj 2 ng/mL TGF-β oraz 5 ng/mL IL-2. Na tym etapie do pożywki można dodać interesujące badacza ligandy lub inhibitory. Resuspenduj komórki z kroku 2 do stężenia 2 x 106 komórek/mL w pożywce do polaryzacji.</li>
 <li>Podgrzej płytki do temperatury 37 °C i odessaj PBS z dołków pokrytych anty-CD3 przed dodaniem komórek. Dodaj 4 mL zawiesiny komórkowej na dołek dla płytki 6-dołkowej, 2 mL komórek dla płytki 12-dołkowej lub 1 mL komórek dla płytki 24-dołkowej. Puste dołki wypełnij PBS, aby ograniczyć odparowywanie pożywki. Inkubuj przez 3 dni w temperaturze 37 °C / 5% CO2.</li>
 <li>W 3. dniu po wysianiu, odwiruj płytkę w wirówce przez 5 minut przy 500 x g. Nie naruszając osiadłych na dnie płytki limfocytów T, usuń połowę pożywki i zastąp ją świeżą pożywką. Alternatywnie, jeśli w dołku pojawi się zbyt duże zagęszczenie komórek (stężenie powyżej 3 x 106/mL), podziel objętość po równo do drugiej płytki pokrytej anty-CD3 i uzupełnij świeżą pożywką do objętości pierwotnej. Inkubuj przez kolejne dwa do trzech dni w temperaturze 37 °C / 5% CO2.</li>
</ol>
4. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) trzech populacji limfocytów T
<ol>
 <li>Przygotować bufor płuczący do FACS, dodając 0,5% (w/v) albuminy surowicy bydlęcej (BSA) oraz 2 mM EDTA do sterylnego PBS. Przechowywać bufor w temperaturze 4 °C w celu schłodzenia.</li>
 <li>Usunąć komórki z dołków hodowli komórkowej i przepłukać każdy dołek 2 mL PBS, aby zapewnić całkowity odzysk komórek. Przenieść wszystkie komórki do 50 mL polipropylenowych probówek i wirować przy 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Policzyć komórki za pomocą hemocytometru w celu określenia gęstości komórek.</li>
 <li>Do czterech oddzielnych 5 mL polistyrenowych probówek z dnem okrągłym, przeznaczonych do kontroli kompensacji, przenieść od 3-5 x 105 komórek na probówkę. Pozostałe komórki przenieść do 50 mL polipropylenowych probówek, nie przekraczając liczby 35 x 106 komórek na probówkę.</li>
 <li>Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odessać medium. Komórki przeznaczone do sortowania resuspendować w 90 μL zimnego buforu płuczącego na każde 1 x 106 komórek. Probówki do kontroli kompensacji resuspendować w 100 μL zimnego buforu płuczącego.</li>
 <li>Do komórek przeznaczonych do sortowania dodać 2 μL przeciwciał anti-CD25-PE, 3 μL anti-CD45RA-PE-Cy5 oraz 1 μL anti-CD127-APC na każde 1 x 106 komórek. Do pierwszej probówki kontroli kompensacji nie dodawać przeciwciał, do drugiej dodać 2 μL anti-CD25-PE, do trzeciej 3 μL anti-CD45RA-PE-Cy5, a do czwartej 1 μL anti-CD127-APC. Inkubować wszystkie probówki na lodzie przez 45 minut w ciemności.</li>
 <li>Dodać 10 mL zimnego buforu płuczącego do komórek przeznaczonych do sortowania oraz 1 mL do probówek kontroli kompensacji. Wirować wszystkie komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odessać bufor i resuspendować komórki do stężenia 1 x 107 komórek na mL buforu płuczącego. Przed filtrowaniem przez 40 μM nylonowy sitko do komórek dodać 1,5 μL DNase II na mL komórek. Przenieść komórki do kilku 5 mL polipropylenowych probówek z dnem okrągłym, nie przekraczając objętości 3,5 mL na probówkę. Komórki do kontroli kompensacji resuspendować w 300 μL buforu płuczącego.</li>
 <li>Ustawić kompensację w cytometrze przepływowym MoFlo, aby zminimalizować detekcję krzyżową przez filtry PE, APC i PE-Cy5. Ustawić bramki w celu sortowania iTregs (komórki CD25HiCD127-/LOWCD45RA-), naiwnych limfocytów T (CD25-CD45RA+) oraz limfocytów T pamięci (CD25-CD45RA-) do 5 mL polistyrenowych probówek z dnem okrągłym zawierających 1 mL surowicy cielęcej noworodka.</li>
</ol>
5. Test supresji
<ol>
 <li>Przygotować pożywkę do testu supresji, dodając do AIM-V 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 5 ng/mL IL-2 oraz 2 ng/mL TGF-β.</li>
 <li>W dniu przeprowadzenia testu oczyścić heterologiczne limfocyty T CD4+ z warstwy leukocytarnej (buffy coat), zgodnie z instrukcjami w krokach 1 i 2. Będą one stanowić komórki docelowe w teście supresji i nie zawierają komórek Treg CD25+, co przedstawiono na Rysunku 2, dzień 0.</li>
 <li>Znakować komórki za pomocą zestawu CellTrace zgodnie z instrukcjami producenta, z wyjątkiem zastosowania jedynie 1 μL roztworu stokowego 5 mM na 1 mL komórek zamiast 2 μL. Chroniąc przed bezpośrednim światłem, dodać 18 μL DMSO dostarczonego w zestawie CellTrace do jednej fiolki CFSE, aby przygotować roztwór stokowy 5 mM. Resuspendować wymaganą liczbę komórek docelowych (maksymalnie 1 x 107) w podgrzanym PBS + 0,1% (w/v) BSA do stężenia końcowego 1 x 106 komórek/mL. Dodać 1 μL 5 mM CFSE na 1 mL komórek i inkubować w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 5 objętości kompletnego, lodowatego RPMI z 10% FBS, aby przerwać barwienie, i inkubować na lodzie przez 5 minut. Przemyć komórki dwukrotnie zimnym kompletnym RPMI i resuspendować 1 x 105 komórek w 100 μL pożywki do testu supresji.</li>
 <li>Kuleczki kontrolne supresji Treg (Treg suppression inspector beads) znajdują się w stężeniu stokowym 2 x 107 kuleczek/mL. Odwirować liczbę kuleczek równą całkowitej liczbie komórek na eksperyment poprzez szybkie wirowanie w probówce typu Eppendorf. Przemyć kuleczki raz w RPMI i ponownie odwirować. Po odessaniu RPMI resuspendować kuleczki w taki sposób, aby odpowiednia liczba kuleczek na dołek znajdowała się w 8 μL pożywki do testu supresji.</li>
 <li>Do 96-dołkowej płytki hodowlanej z okrągłym dnem dodać komórki znakowane CFSE (1 x 105 komórek/mL), kuleczki kontrolne oraz spolaryzowane i posortowane komórki (1 x 105 komórek/mL) w świeżej pożywce do testu supresji, zachowując pożądany stosunek komórek docelowych (znakowanych CFSE) do efektorowych (posortowanych) w końcowej objętości 200 μL. Wszystkie warunki należy ustawić w trzech powtórzeniach.</li>
 <li>Przygotować pierwszy z dwóch wariantów kontrolnych, dodając do każdego dołka 100 μL komórek znakowanych CFSE, 8 μL kuleczek kontrolnych oraz 1 x 105 świeżych, nieznakowanych komórek w 92 μL pożywki do testu supresji. Drugą kontrolę przygotować z tymi samymi komponentami komórkowymi, ale bez kuleczek kontrolnych Treg.</li>
 <li>Przykryć płytkę folią aluminiową i inkubować w temperaturze 37 °C / 5% CO2 przez pięć dni.</li>
 <li>W ciemności zebrać komórki z każdego dołka za pomocą pipety i umieścić w 5 mL polistyrenowej probówce z okrągłym dnem. Wirować komórki przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, odessać pożywkę i resuspendować w 300 μL zimnego buforu do mycia FACS z kroku 4. Przeanalizować pierwsze 3 x 104 zdarzeń CFSE+ z bramki żywych limfocytów reprezentujących komórki docelowe na histogramie za pomocą oprogramowania Cell Quest.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przykład pseudokolorowych wykresów kropkowych z cytometrii przepływowej w pięciodniowym przebiegu czasowym, monitorujących różnicowanie iTreg na podstawie względnej koekspresji CD25 z FoxP3, CTLA-4 i CD45RA, przedstawiono na Rysunku 2. Histogram na Rysunku 3 obrazuje pomyślny test supresji, w którym posortowane iTreg (komórki CD25HiCD45RA- CD127-/LOW) są jedyną subpopulacją z pięciodniowej hodowli, która nabyła zdolności regulacyjnych/supresyjnych. Rysunek 4 przedstawia indukcję Tregs z puli naiwnych limfocytów T (panele górne) oraz puli pamięciowych limfocytów T (panele dolne) po pięciodniowej hodowli w standardowym medium do iTreg. Barwienie początkowych komórek CFSE wykazuje, że zarówno naiwne (panel prawy górny), jak i pamięciowe limfocyty T (panel prawy dolny) różnicują się w iTreg (komórki o najwyższej ekspresji FoxP3) dopiero po kilku rundach podziałów komórkowych.
<img alt="Schemat proliferacji i różnicowania limfocytów T z krwi obwodowej; zastosowanie FACS i testu supresji." src="/files/ftp_upload/3738/3738fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat procedury eksperymentalnej. PBMC są izolowane z ludzkiej krwi obwodowej za pomocą centryfugacji gradientowej przed magnetyczną selekcją negatywną limfocytów T CD4+CD25-. Po pięciu do sześciu dniach hodowli komórki są poddawane analizie FACS i inkubowane wspólnie z heterologicznymi komórkami docelowymi znakowanymi CFSE w celu pomiaru aktywności supresyjnej.
<img alt="Schemat analizy cytometrii przepływowej; ekspresja FoxP3, CTLA-4, CD45RA; różnicowanie iTreg w kolejnych dniach." src="/files/ftp_upload/3738/3738fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Oczyszczone ludzkie pierwotne limfocyty T CD4+CD25- są hodowane w pożywce do iTreg. Alikwoty komórek pobiera się bezpośrednio po izolacji (dzień 0) oraz w dniach 1, 3 i 5 hodowli komórkowej w celu monitorowania progresji markerów CD45RA, FoxP3, CTLA-4 i CD25. Profil iTreg odpowiada fenotypowi CD45RA-, FoxP3Hi, CTLA-4Hi i CD25Hi (wyróżniono w oknie na wykresie).
<img alt="Wykres cytometrii przepływowej komórek supresorowych: naiwnych, pamięci, iTregs; barwienie CFSE, analiza danych." src="/files/ftp_upload/3738/3738fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Oczyszczone komórki CD4+ oznakowane CFSE (1 x 105/dołek) hodowane są z Treg suppression inspector beads w obecności posortowanych naiwnych komórek T, komórek pamięci lub iTregs (3 x 104/dołek). Po pięciu dniach komórki są zbierane, a profil CFSE barwionych komórek analizowany za pomocą cytometrii przepływowej. Obecność komórek iTreg całkowicie znosi proliferację limfocytów T CD4+. Liczby wskazują procent komórek oznakowanych CFSE, które uległy podziałowi.
<img alt="Wykresy cytometrii przepływowej, naiwne/pamięciowe CD45RA, iTregi, CD25 vs. FoxP3, analiza markerów CFSE." src="/files/ftp_upload/3738/3738fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Oczyszczone ludzkie pierwotne naiwne (CD4+CD25-CD45RA+) i pamięciowe (CD4+CD25-CD45RO+) limfocyty T są barwione CFSE i hodowane w medium do iTreg. Po pięciu dniach przeprowadzono fenotypowanie komórek i oszacowano tempo podziałów komórkowych. Jak wskazano na Rycynie 2, podzbiór iTreg zróżnicowany z obu populacji odpowiada fenotypowi CD45RA-CD25Hi FoxP3Hi oraz CTLA-4Hi (dwóch ostatnich nie pokazano). Porównawcze profile barwienia CFSE identyfikują iTregi (tutaj jako limfocyty T o najwyższej ekspresji FoxP3) jako komórki o największej zdolności do proliferacji podczas pięciodniowej hodowli.

<ol><li>Powrie, F., Correa-Oliveira, R., Mauze, S., Coffman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+interactions+between+CD45RBhigh+and+CD45RBlow+CD4%2B+T+cells+are+important+for+the+balance+between+protective+and+pathogenic+cell-mediated+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Regulatory interactions between CD45RBhigh and CD45RBlow CD4+ T cells are important for the balance between protective and pathogenic cell-mediated immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 179, 589-600 (1994).</li>
<li>Tarbell, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-expanded%2C+islet-specific+CD4%2B+CD25%2B+CD62L%2B+regulatory+T+cells+restore+normoglycemia+in+diabetic+NOD+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-expanded, islet-specific CD4+ CD25+ CD62L+ regulatory T cells restore normoglycemia in diabetic NOD mice.</a> The Journal of Experimental Medicine. 204, 191-201 (2007).</li>
<li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+treatment+of+collagen-induced+arthritis+by+adoptive+transfer+of+CD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+and+Rheumatism%22%5BJournal%5D)">Effective treatment of collagen-induced arthritis by adoptive transfer of CD25+ regulatory T cells.</a> Arthritis and Rheumatism. 52, 2212-2221 (2005).</li>
<li>Taylor, P. A., Lees, C. J., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infusion+of+ex+vivo+activated+and+expanded+CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immune+regulatory+cells+inhibits+graft-versus-host+disease+lethality%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The infusion of ex vivo activated and expanded CD4(+)CD25(+) immune regulatory cells inhibits graft-versus-host disease lethality.</a> Blood. 99, 3493-3493 (2002).</li>
<li>Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXP3%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">FOXP3: of mice and men.</a> Annual Review of Immunology. 24, 209-226 (2006).</li>
<li>Riley, J. L., June, C. H., Blazar, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T+regulatory+cell+therapy%3A+take+a+billion+or+so+and+call+me+in+the+morning%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning.</a> Immunity. 30, 656-6565 (2009).</li>
<li>Morgan, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+FOXP3+mRNA+is+not+confined+to+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of FOXP3 mRNA is not confined to CD4+CD25+ T regulatory cells in humans.</a> Human Immunology. 66, 13-20 (2005).</li>
<li>Wang, J., Huizinga, T. W. J., Toew, R. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+Novo+Generation+and+Enhanced+Suppression+of+Human+CD4%2BCD25%2B+Regulatory+T+Cells+by+Retinoic+Acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">De Novo Generation and Enhanced Suppression of Human CD4+CD25+ Regulatory T Cells by Retinoic Acid.</a> Journal of Immunology. 183, 4119-4126 (2009).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science (New York, N.Y.). 299, 1057-1061 (2003).</li>
<li>McHugh, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%28%2B%29CD25%28%2B%29+immunoregulatory+T+cells%3A+gene+expression+analysis+reveals+a+functional+role+for+the+glucocorticoid-induced+TNF+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD4(+)CD25(+) immunoregulatory T cells: gene expression analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor.</a> Immunity. 16, 311-323 (2002).</li>
<li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+Self-Tolerance+Maintained+by+Cd25%2BCd4%2BRegulatory+T+Cells+Constitutively+Expressing+Cytotoxic+T+Lymphocyte-Associated+Antigen+4%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Immunologic Self-Tolerance Maintained by Cd25+Cd4+Regulatory T Cells Constitutively Expressing Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen 4.</a> The Journal of Experimental Medicine. 192, 303-310 (2000).</li>
<li>Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD127+expression+inversely+correlates+with+FoxP3+and+suppressive+function+of+human+CD4%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells.</a> The Journal of Experimental Medicine. 203, 1701-1711 (2006).</li>
<li>Schraven, B., Kalinke, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+superagonists%3A+what+makes+the+difference+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD28 superagonists: what makes the difference in humans.</a> Immunity. 28, 591-595 (2008).</li>
<li>Reneer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripherally+induced+human+Regulatory+T+cells+uncouple+Kv1.3+activation+from+TCR-associated+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Peripherally induced human Regulatory T cells uncouple Kv1.3 activation from TCR-associated signaling.</a> European Journal of Immunology. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Choć transfer komórek Treg daje ogromne nadzieje terapeutyczne w walce z autoimmunizacją, odrzucaniem przeszczepów oraz innymi zaburzeniami o podłożu immunologicznym lub zapalnym, nie opracowano jeszcze metod ich efektywnego generowania i stabilnego utrzymania. Ponieważ tylko 1-5% krążących ludzkich limfocytów T to komórki Treg, ich kontrolowana ekspansja i różnicowanie pozwalają przezwyciężyć ten niedobór, który stanowi główną przeszkodę we wdrażaniu komórek Treg do praktyki klinicznej. Z drugiej strony, jak wyciągnięto...

<table><tbody><tr><td>Lymphoprep</td><td>Axis-Shield</td><td>1114547</td><td>Przechowywać w temperaturze pokojowej</td></tr><tr><td>Stołowa wirówka chłodząca</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr Bright-Line</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Zestaw do wzbogacania limfocytów T</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>19052</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Memory CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Zestaw do wzbogacania limfocytów T </td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>19157</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Human Na&amp;#239;ve CD4&lt;sup&gt;+&lt;/sup&gt; Zestaw do wzbogacania limfocytów T</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>Magnes Big Easy EasySep</td><td>Technologie komórek macierzystych</td><td>18001</td><td>Srebro</td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe o okrągłym dnie o pojemności 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe z polipropylenu 15 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-368</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polipropylenowe o okrągłym dnie 14 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówki z polipropylenu 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89004-364</td><td></td></tr><tr><td>Ludzki przeciwciało anty-CD3</td><td>Bio X Cell</td><td>BE0001-2</td><td>Klon: OKT3</td></tr><tr><td>24-dołkowa polistyrenowa płytka do hodowli komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płytka do hodowli tkankowej z okrągłym dnem</td><td>Greiner Bio-One</td><td>650180</td><td></td></tr><tr><td>pożywka RPMI 1640 z Glutamax-I i buforem HEPES</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>72400</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapt-&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki TGF-&amp;#946;1</td><td>eBioscience</td><td>14-8348-62</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana ludzka IL-2</td><td>eBioscience</td><td>14-8029-63</td><td></td></tr><tr><td>Seryjna albumina bydlęca (BSA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>810531</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD25-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-024</td><td>Klon: 4E3</td></tr><tr><td>przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD45RA-PE-Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0458-42</td><td>Klon: HI100</td></tr><tr><td>Przeciwciało mysie przeciwko ludzkiemu CD127-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-890</td><td>Klon: MB15-18C9</td></tr><tr><td>DNaza II</td><td>MP Biomedicals</td><td>190370</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy MoFlo</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie FlowJo</td><td>Tree Star, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Cell Quest Pro</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Surowica z noworodka cielęcia </td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16010</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>AIM-V</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>0870112</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do badania proliferacji komórek CellTrace CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki do badania supresji komórek Treg</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-909</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;Sito nylonowe średniej wielkości do odcedzania komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie indukowanych limfocytów t regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów t oraz limfocytów t pamięci

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

Rozwój i utrzymanie immunosupresyjnych regulacyjnych limfocytów T (Tregs) CD4+ przyczyniają się do tolerancji obwodowej niezbędnej do zachowania homeostazy immunologicznej w obliczu ogromnej ilości antygenów własnych i komensalnych w organizmie człowieka i na jego powierzchni. Zaburzenia równowagi między komórkami Tregs a zapalnymi konwencjonalnymi limfocytami T mogą prowadzić do immunopatologii lub nowotworów. Choć terapeutyczna iniekcja komórek Tregs okazała się skuteczna w mysich modelach colitis1, cukrzycy typu I2, reumatoidalnego zapalenia stawów oraz choroby przeszczep przeciw gospodarzowi,4 kilka fundamentalnych różnic w biologii komórek Treg u ludzi i myszy5 do tej pory uniemożliwiało zastosowanie kliniczne. Brak odpowiedniej liczby, czystości, stabilności oraz specyficzności homingu terapeutycznych komórek Tregs wymusił stworzenie dynamicznej platformy rozwoju ludzkich komórek Treg, która pozwoliłaby zoptymalizować warunki ich ekspansji ex vivo6.
Opisujemy tutaj metodę różnicowania indukowanych limfocytów T regulatorowych (iTregs) z krwi obwodowej jednego dawcy człowieka, którą można podzielić na cztery etapy: izolację mononuklearnych komórek krwi obwodowej, selekcję magnetyczną limfocytów T CD4+, hodowlę komórkową in vitro oraz sortowanie komórek metodą FACS (fluorescence activated cell sorting) w celu wyodrębnienia subpopulacji limfocytów T. Ponieważ charakterystyczny dla Treg czynnik transkrypcyjny forkhead box P3 (FoxP3) jest u ludzi czynnikiem indukowanym aktywacją7 i nie istnieje inny unikalny marker, do identyfikacji limfocytów T o aktywności supresyjnej należy zastosować kombinacyjny panel markerów. Po sześciu dniach hodowli komórki w naszym systemie mogą zostać podzielone na naiwne limfocyty T, limfocyty T pamięci lub iTregs na podstawie względnej ekspresji CD25 i CD45RA. Ze względu na to, że limfocyty T pamięci i naiwne wykazują różne raportowane wymagania dotyczące polaryzacji oraz różną plastyczność8, wstępne sortowanie początkowej populacji limfocytów T na subpopulacje CD45RA+ i CD45RO+ może posłużyć do zbadania tych różnic. Zgodnie z innymi doniesieniami, nasze iTregs CD25HiCD45RA- wykazują wysoką ekspresję FoxP39 , GITR i CTLA-411 oraz niską ekspresję CD12712 . Po przeprowadzeniu sortowania FACS każdej populacji, uzyskane komórki można wykorzystać w teście supresji, który ocenia względną zdolność do hamowania proliferacji autologicznych limfocytów T znakowanych karboksyfluoresceiną sukcynimidyloestrem (CFSE).

Opisujemy metodę generowania limfocytów T regulatorowych, pamięci oraz naiwnych od jednego ludzkiego dawcy krwi. Spolaryzowane limfocyty Treg mogą być następnie porównywane z innymi subpopulacjami w różnych zastosowaniach genetycznych i funkcjonalnych przy zachowaniu homogeniczności genetycznej, w tym w teście supresji, który również został tutaj szczegółowo opisany.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Rozwój i utrzymanie immunosupresyjnych regulacyjnych limfocytów T CD4+ (Tregs) przyczyniają się do tolerancji obwodowej niezbędnej do pozostania w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych z pierwotnych limfocytów T. Najpierw z próbek ludzkiej krwi izoluje się mononuklearne komórki krwi obwodowej. Następnie z mieszaniny PBMC oczyszcza się limfocyty T CD4+ i poddaje je hodowli.Po sześciu dniach komórki zostają posortowane na podzbiory naiwnych, pamięciowych, efektorowych oraz indukowanych limfocytów T regulatorowych przy użyciu cytometru przepływowego, a następnie przeprowadzono testy supresji. Wykorzystując te komórki, wykazano, że metoda ta generuje ludzkie limfocyty T regulatorowe o aktywności supresyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami wykorzystującymi komórki mysie jest to, że nasza metoda ludzka ma większe znaczenie fizjologiczne i kliniczne oraz pozwala na porównanie Treg z innymi populacjami komórek u jednego dawcy.Eliminacja zmienności w obrębie badanego osobnika. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące populacji komórek regulatorowych, takie jak: jakie zdarzenia regulacyjne modulują przejście między konwencjonalnymi limfocytami T a komórkami regulatorowymi lub jakie zdarzenia sygnalizacyjne i transkrypcyjne są specyficzne dla komórek regulatorowych? Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapie chorób autoimmunologicznych, stanów zapalnych i nowotworów ze względu na kluczową rolę, jaką komórki regulatorowe odgrywają w homeostazie immunologicznej.Zazwyczaj osoby początkujące napotykają trudności techniczne ze względu na różnorodność stosowanych technik oraz, w niektórych etapach, wąski zakres optymalnych warunków hodowli komórkowej. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju Treg, może być również wykorzystana do monitorowania plastyczności różnicowania linii komórek T lub do analizy zdolności określonych populacji komórek T do indukowania lub zapobiegania temu procesowi. Procedurę rozwoju Treg zademonstrują Andrea McCool oraz studenci studiów doktoranckich Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis i Catalina Vale Ortega.Rozpocznij tę procedurę od izolacji ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej z 40 do 60 litrów warstwy leukocytowej (Buffy coat). Aby rozcieńczyć warstwę leukocytową, przenieś ją do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 mililitrów zawierającej 150 mililitrów sterylnego PBS. Następnie dodaj więcej sterylnego PBS, aby zwiększyć objętość końcową do 250 mililitrów. W następnej kolejności napełnij 10 stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów, wlewając do każdej po 20 mililitrów roztworu lympho prep.Następnie ostrożnie nanieś na powierzchnię roztworu do preparacji limfocytów 25 mililitrów rozcieńczonej warstwy leukocytarnej (buffy coat), uważając, aby nie zmieszać go z roztworem do preparacji. Wiruj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 500 ×g. Upewnij się, że hamulec wirówki jest wyłączony, aby nie zaburzyć frakcji limfocytów.Po wirowaniu PBM CS znajdzie się na granicy między warstwą preparatu limfocytów a warstwą medium plazmy, co umożliwi ich pobranie. Odessaj medium plazmy, pozostawiając około 1 ml nad warstwą białej krwi (buffy coat) zawierającą PBMC. Użyj pipety 10 ml, aby przenieść PBMC do nowej probówki o pojemności 50 ml.Po dwukrotnym przemyciu komórek buforem PBS, resuspendować je w 50 mililitrach schłodzonego medium RPMI i policzyć za pomocą hematocytometru. Typowa wydajność wynosi od 8 × 10⁸ do 1 × 10⁹ pBMCs po określeniu stężenia. Resuspendować pBMCs do stężenia końcowego 5 × 10⁷ na mililitr w buforze PBS zawierającym 2% FBS oraz 1 milimol EDTA; następnie przenieść komórki do nowej 14-mililitrowej polipropylenowej probówki z okrągłym dnem.Następnie zestaw EA zostanie użyty do negatywnej selekcji interesujących nas komórek. Koktajle do wzbogacania limfocytów T dostarczone w zestawie zawierają tetrameryczny kompleks przeciwciał, który posiada przeciwciało antydekstrynowe po jednej stronie oraz przeciwciało przeciwko niepożądanym antygenom powierzchniowym komórek po drugiej stronie. Po dodaniu koktajlu do komórek, tetrameryczny kompleks przeciwciał łączy niepożądane komórki.Następnie dodaje się magnetyczne cząsteczki powlekane dekstranem, które wiążą się z tetramerycznym kompleksem przeciwciał, łącząc niepożądane komórki z cząsteczką magnetyczną. Następnie stosuje się magnes, aby oddzielić niepożądane komórki od komórek docelowych, które są następnie zbierane w celu izolacji limfocytów T CD4+. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml pipetuje się od 1×10⁸ do 4,25×10⁸ PBMC. Następnie dodaje się 50 µL koktajlu przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ na każdy 1 ml PBMC.Wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać cząstki magnetyczne, aby równomiernie rozprowadzić je w roztworze. Dodać 100 µL cząstek magnetycznych na każdy mililitr PBMC.Wymieszaj, delikatnie pipetując dwa lub trzy razy, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj PBS zawierający FBS i EDTA, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów na probówkę, mieszając poprzez delikatne pipetowanie dwa lub trzy razy. Następnie umieść otwartą probówkę w magnesie cept na pięć minut, pozostawiając probówkę w magnesie.Przelej ciecz do nowej probówki o pojemności 50 ml, aby wyizolować interesujące komórki i zwiększyć ich odzysk. Powtórz ten proces, dodając do probówki dodatkowy P-B-S-F-B-S-E-D-T-A, mieszając i umieszczając próbkę ponownie w magnesie. Po wyizolowaniu komórek policz je, a następnie odwiruj przy 500 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Resuspender osad komórkowy w medium do polaryzacji, aby uzyskać stężenie 2×10⁶ komórek/ml. Następnie przejść do hodowli zgodnie z opisem w następnej sekcji filmu, aby indukować limfocyty T regulatorowe. Podgrzać do 37 °C 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej powlekane przeciwciałami anty-CD3.Po ogrzaniu płytek odessać PBS z dołków. Następnie do każdego z nich dodać cztery mililitry wzbogaconej zawiesiny komórek dodatnich CD four. Puste dołki wypełnić PBS, aby ograniczyć parowanie medium; inkubować przez trzy dni. Po inkubacji.Wiruj płytkę przez pięć minut przy 500 ×g. Następnie, nie naruszając komórek osadzonych na dnie płytki, usuń połowę medium i zastąp je świeżym medium, po czym inkubuj przez kolejne dwa do trzech dni. Komórki można teraz posortować za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), zgodnie z opisem w następnej sekcji, lub wykorzystać jako komórki docelowe w teście supresji, opisanym w dalszej części; po upływie dwóch do trzech dni przygotowuje się komórki oraz odpowiednie kontrole kompensacji do sortowania fluorescencyjnego. Aby oddzielić indukowane naiwne i pamięciowe limfocyty T regulatorowe, zbarw komórki przeznaczone do sortowania przeciwciałami anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 oraz anti-CD127 APC, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.Należy również pamiętać o dodaniu przeciwciał do odpowiednich kontroli kompensacji do analizy FACS. Po barwieniu resuspenderć komórki do stężenia 1 × 10⁷ komórek na ml buforu do płukania, następnie dodać 1,5 µl DNAse II na ml komórek i przefiltrować komórki przez nylonowy sitko do komórek o oczkach 40 µm. Przenieść komórki do polipropylenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, nie przekraczając objętości 3,5 ml na probówkę.Resuspenduj komórki kontrolne do kompensacji w 300 µL buforu piorącego. Ustaw kompensację w cytometrze przepływowym tak, aby zminimalizować wzajemne wykrywanie przez filtry PE A PC oraz PE sci-fi. Ustaw bramki w celu posortowania komórek tregs, naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci do 5 ml polistyrenowych probówek o dnie okrągłym zawierających 1 ml serum z noworodka cielęcego, aby ocenić, czy limfocyty T regulacyjne uzyskane w wyniku sortowania są w stanie hamować proliferację limfocytów T.W niniejszej procedurze przeprowadzono test supresji. Jako komórki docelowe posłużą nieposortowane komórki wzbogacone w CD4+. Nie powinny one zawierać indukowanych regulatorowych limfocytów T CD25+.Rozpocznij od znakowania komórek docelowych CFSE przy użyciu zestawu do śledzenia komórek zgodnie z instrukcjami producenta, stosując 1 µL 5 M roztworu zapasowego na 1 mL komórek zamiast 2 µL. Następnie osadź liczbę kulek do badania supresji Treg równą całkowitej liczbie komórek poprzez szybkie odwirowanie w probówce do mikrocentryfugi. Przepłucz kulek raz w RPMI i ponownie je osadź po wirowaniu.Odsuń medium RPMI i resuspendu komórki do odpowiedniego stężenia w 8 µL medium do testu supresji na studzienkę w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z okrągłym dnem. Dodaj 8 µL komórek docelowych znakowanych CFSE. Sprawdź kuleczki i spolaryzowane, posortowane komórki do końcowej objętości świeżego medium do testu supresji.Pożywka w objętości 200 µL. Wszystkie warunki są wysiewane w trzech powtórzeniach. Aby przygotować kontrole, należy dodać 100 µL komórek znakowanych CFSE, 8 µL kulek kontrolnych (inspector beads) oraz 1×10⁵ świeżych, nieznakowanych komórek w 92 µL medium do testu supresji (suppressor assay).Pożywkę do pierwszych dwóch studzienek kontrolnych. Następnie dodać 100 µL komórek znakowanych CFSE oraz 1 × 10⁵ świeżych nieznakowanych komórek w 92 µL pożywki do testu supresji. Pożywkę do kolejnych dwóch studzienek kontrolnych.Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw w inkubatorze na pięć dni w ciemności. Zbierz komórki z każdej studni za pomocą pipety i przenieś je do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Wirowarkuj komórki przy 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.Odssać medium, a następnie resuspender komórki w 300 µL zimnego buforu piorącego fax. Aby monitorować postęp indukowanego różnicowania limfocytów T regulatorowych, oczyszczone ludzkie pierwotne limfocyty T CD4+ CD25- hodowano w medium iTreg. Alikwoty pobrane w dniach 0, 1, 3 i 5 analizowano metodą cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji markerów CD45RA, FoxP3, CTLA4 i CD25. Jak widać na tych pseudokolorowych wykresach kropkowych, w ciągu pięciu dni komórki proliferują i różnicują się in vitro w odpowiedzi na sieciowanie CD3 w obecności TGF-β i IL-2, co ostatecznie prowadzi do uzyskania profilu CD45RA- FoxP3-high CTLA4-high i CD25-high. Wskazuje to na rozwój indukowanych tregów z konwencjonalnych prekursorów limfocytów T. Aby ocenić względną zdolność wygenerowanych tregów do supresji proliferacji limfocytów T.Komórki znakowane CFSE hodowano z koralikami treg suppression inspector w obecności posortowanych naiwnych komórek pamięci oraz komórek iTreg, co przedstawiono na tym histogramie. Komórki CD25 high, CD45RA negative, CD127 negative. Low indukowane limfocyty T regulatorowe są jedyną subpopulacją z pięciodniowej hodowli, która nabyła zdolność do supresji regulatorowej.Wskazuje to, że komórki generowane w tym systemie są pod względem fenotypowym i funkcjonalnym supresorowymi limfocytami T regulatorowymi, a nie aktywowanymi konwencjonalnymi limfocytami T, które mogą przejściowo wykazuje ekspresję FOX P3 i CD 25, lecz nie posiadają właściwości immunosupresyjnych. Obecność indukowanych limfocytów T regulatorowych całkowicie znosi proliferację limfocytów T CD4+. Liczby wskazują procent komórek znakowanych CFSE, które uległy podziałowi, aby potwierdzić, że ta sama zależność zachodzi w przypadku oczyszczonych subpopulacji limfocytów T.Pierwotne ludzkie naiwne oraz pamięciowe limfocyty T zabarwiono CFSE i hodowano w medium dla Treg. Po pięciu dniach wykonano fenotypowanie komórek i oszacowano tempo ich podziałów, jak przedstawiono. W tym przypadku komórki Treg indukowano z puli naiwnych limfocytów T oraz puli pamięciowych limfocytów T po pięciodniowej hodowli.W standardowym medium IT reg, barwienie CFSE początkowych komórek wykazuje, że zarówno naiwne, jak i pamięciowe limfocyty T różnicują się w limfocyty T regulatorowe dopiero po kilku rundach podziałów komórkowych. Porównawcze profile barwienia CFSE identyfikują indukowane limfocyty T regulatorowe jako komórki o największej proliferacji podczas pięciodniowej hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak uzyskać indukowane limfocyty Treg z populacji naiwnych, pamięciowych lub wszystkich limfocytów T pochodzących od jednego dawcy podczas próby przeprowadzenia tej procedury.Ważne jest zachowanie sterylnych warunków przez cały czas trwania procedury oraz zapobieganie wystawianiu CFSE na działanie światła podczas jej wykonywania. W celu uzyskania odpowiedzi na inne pytania, takie jak różnice w tempie podziałów komórkowych, specyficzna synteza cytokin oraz wykorzystanie kanałów jonowych pomiędzy regulacyjnymi a konwencjonalnymi limfocytami T, można przeprowadzić inne metody, np. testy funkcjonalne, po zakończeniu procesu rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu immunologii do zgłębiania chorób autoimmunologicznych oraz innych patologii związanych z treg u pacjentów.Należy pamiętać, że praca z ludzką krwią wiąże się z bardzo dużym ryzykiem, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie badania w banku krwi oraz prawidłowa utylizacja materiałów.

generation-induced-regulatory-t-cells-from-primary-human-nave-memory

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wytwarzanie indukowanych komórek T regulacyjnych z pierwotnych ludzkich naiwnych i pamięciowych komórek T

Ten film demonstruje test do generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych CD8αβ+ pochodzących z indukowanych komórek macierzystych (iPSC) specyficznych dla antygenu nowotworowego. Specyficzne dla antygenu nowotworowego iPSC są hodowane na monowarstwie komórek zrębu i różnicowane w hematopoetyczne komórki progenitorowe (HPC). HPC są różnicowane w podwójnie dodatnie limfocyty T CD4 + CD8 + przy użyciu pożywki różnicowej. Komórki te są następnie stymulowane do generowania...

Generowanie pojedynczych dodatnich limfocytów T CD8 z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Limfocyty T regulatorowe CD4+ są silnymi modulatorami immunologicznymi i pełnią ważne funkcje w homeostazie immunologicznej. Niedobór tych komórek we krwi obwodowej sprawia, że badania funkcjonalne są trudne, szczególnie w kontekście zakażenia HIV-1. Opisujemy tutaj metodę izolowania i namnażania funkcjonalnych limfocytów Treg CD4 + z krwi obwodowej od osób zakażonych wirusem HIV-1.

Nowe narzędzia do ekspansji limfocytów T regulatorowych od osób zakażonych wirusem HIV-1

Transfer genu adenowirusowego do naiwnych limfocytów T CD4 z transgeniczną ekspresją receptora adenowirusa Coxsackie umożliwia molekularną analizę różnicowania regulatorowych limfocytów T in vitro.

Transdukcja adenowirusowa naiwnych limfocytów T CD4 w celu zbadania różnicowania limfocytów Treg

Ten artykuł opisuje metodę generowania i rozmnażania klonów ludzkich limfocytów T, które specyficznie reagują na zdefiniowany alloantygen. Protokół ten można dostosować do klonowania ludzkich limfocytów T specyficznych dla różnych ligandów peptyd-MHC.

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T specyficznych dla alloantygenu z krwi obwodowej

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Ten protokół opisuje powtarzalne wytwarzanie i fenotypowanie ludzkich indukowanych regulatorowych limfocytów T (iTreg) z naiwnych limfocytów T CD4+ in vitro. Różne protokoły indukcji FOXP3 pozwalają na badanie określonych fenotypów iTreg uzyskanych za pomocą odpowiednich protokołów.

In vitro Różnicowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych indukowanych CD4 + FOXP3 + (iTreg) od naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu protokołu zawierającego TGF-β

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę generowania indukowanych indukowanych pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z komórek macierzystych (iTE) za pomocą trójwymiarowego (3D) systemu hodowli grasicy. iTE to jednorodny podzbiór limfocytów T blisko spokrewniony z naiwnymi limfocytami T ze zdolnością do proliferacji, tworzenia pamięci i supresji guza.

Trójwymiarowy system hodowli grasicy do generowania indukowanych przez mysie pluripotencjalnych emigrantów grasicy pochodzących z antygenu nowotworowego specyficznych dla antygenu macierzystego

Ten artykuł opisuje metodę generowania funkcjonalnych, specyficznych dla antygenu nowotworowego, indukowanych, indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z CD8αβ+ dodatnich limfocytów T przy użyciu systemu kohodowli OP9/DLL1.

Wykorzystanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do wytwarzania limfocytów T specyficznych dla antygenu nowotworowego

Prezentowany tutaj jest protokół skutecznego tłumienia replikacji wirusa zapalenia wątroby typu B (HBV) u myszy poprzez wykorzystanie adoptywnego transferu komórek (ACT) limfocytów T specyficznych dla antygenu wirusowego (Ag) pochodzących z komórek macierzystych. Procedura ta może być dostosowana do potencjalnej immunoterapii zakażenia HBV opartej na ACT.

Limfocyty T specyficzne dla wirusa Ag pochodzące z komórek macierzystych hamują replikację HBV u myszy

Ten protokół zapewnia usprawniony przepływ pracy do generowania i testowania ludzkich limfocytów regulatorowych receptora antygenu chimerycznego (Treg CAR).

Wytwarzanie ludzkich limfocytów T regulatorowych receptora antygenu chimerycznego

Poznaj metodę wytwarzania indukowanych regulatorowych limfocytów T z ludzkich limfocytów T CD4+. Technika umożliwia porównanie komórek Treg z innymi podzbiorami w obrębie jednego dawcy, zwiększając homogeniczność genetyczną.

Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Przeglądaj więcej filmów