Generowanie indukowanych limfocytów T regulatorowych z pierwotnych ludzkich naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie ludzkich limfocytów T regulatorowych z pierwotnych limfocytów T. Najpierw z próbek ludzkiej krwi izoluje się mononuklearne komórki krwi obwodowej. Następnie z mieszaniny PBMC oczyszcza się limfocyty T CD4+ i poddaje je hodowli.

Po sześciu dniach komórki zostają posortowane na podzbiory naiwnych, pamięciowych, efektorowych oraz indukowanych limfocytów T regulatorowych przy użyciu cytometru przepływowego, a następnie przeprowadzono testy supresji. Wykorzystując te komórki, wykazano, że metoda ta generuje ludzkie limfocyty T regulatorowe o aktywności supresyjnej. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami wykorzystującymi komórki mysie jest to, że nasza metoda ludzka ma większe znaczenie fizjologiczne i kliniczne oraz pozwala na porównanie Treg z innymi populacjami komórek u jednego dawcy.

Eliminacja zmienności w obrębie badanego osobnika. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące populacji komórek regulatorowych, takie jak: jakie zdarzenia regulacyjne modulują przejście między konwencjonalnymi limfocytami T a komórkami regulatorowymi lub jakie zdarzenia sygnalizacyjne i transkrypcyjne są specyficzne dla komórek regulatorowych? Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapie chorób autoimmunologicznych, stanów zapalnych i nowotworów ze względu na kluczową rolę, jaką komórki regulatorowe odgrywają w homeostazie immunologicznej.

Zazwyczaj osoby początkujące napotykają trudności techniczne ze względu na różnorodność stosowanych technik oraz, w niektórych etapach, wąski zakres optymalnych warunków hodowli komórkowej. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat rozwoju Treg, może być również wykorzystana do monitorowania plastyczności różnicowania linii komórek T lub do analizy zdolności określonych populacji komórek T do indukowania lub zapobiegania temu procesowi. Procedurę rozwoju Treg zademonstrują Andrea McCool oraz studenci studiów doktoranckich Marie Catherine Ranier, Gavin Ellis i Catalina Vale Ortega.

Rozpocznij tę procedurę od izolacji ludzkich mononuklearnych komórek krwi obwodowej z 40 do 60 litrów warstwy leukocytowej (Buffy coat). Aby rozcieńczyć warstwę leukocytową, przenieś ją do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 mililitrów zawierającej 150 mililitrów sterylnego PBS. Następnie dodaj więcej sterylnego PBS, aby zwiększyć objętość końcową do 250 mililitrów. W następnej kolejności napełnij 10 stożkowych probówek o pojemności 50 mililitrów, wlewając do każdej po 20 mililitrów roztworu lympho prep.

Następnie ostrożnie nanieś na powierzchnię roztworu do preparacji limfocytów 25 mililitrów rozcieńczonej warstwy leukocytarnej (buffy coat), uważając, aby nie zmieszać go z roztworem do preparacji. Wiruj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej przy 500 ×g. Upewnij się, że hamulec wirówki jest wyłączony, aby nie zaburzyć frakcji limfocytów.

Po wirowaniu PBM CS znajdzie się na granicy między warstwą preparatu limfocytów a warstwą medium plazmy, co umożliwi ich pobranie. Odessaj medium plazmy, pozostawiając około 1 ml nad warstwą białej krwi (buffy coat) zawierającą PBMC. Użyj pipety 10 ml, aby przenieść PBMC do nowej probówki o pojemności 50 ml.

Po dwukrotnym przemyciu komórek buforem PBS, resuspendować je w 50 mililitrach schłodzonego medium RPMI i policzyć za pomocą hematocytometru. Typowa wydajność wynosi od 8 × 10⁸ do 1 × 10⁹ pBMCs po określeniu stężenia. Resuspendować pBMCs do stężenia końcowego 5 × 10⁷ na mililitr w buforze PBS zawierającym 2% FBS oraz 1 milimol EDTA; następnie przenieść komórki do nowej 14-mililitrowej polipropylenowej probówki z okrągłym dnem.

Następnie zestaw EA zostanie użyty do negatywnej selekcji interesujących nas komórek. Koktajle do wzbogacania limfocytów T dostarczone w zestawie zawierają tetrameryczny kompleks przeciwciał, który posiada przeciwciało antydekstrynowe po jednej stronie oraz przeciwciało przeciwko niepożądanym antygenom powierzchniowym komórek po drugiej stronie. Po dodaniu koktajlu do komórek, tetrameryczny kompleks przeciwciał łączy niepożądane komórki.

Następnie dodaje się magnetyczne cząsteczki powlekane dekstranem, które wiążą się z tetramerycznym kompleksem przeciwciał, łącząc niepożądane komórki z cząsteczką magnetyczną. Następnie stosuje się magnes, aby oddzielić niepożądane komórki od komórek docelowych, które są następnie zbierane w celu izolacji limfocytów T CD4+. Do probówki stożkowej o pojemności 15 ml pipetuje się od 1×10⁸ do 4,25×10⁸ PBMC. Następnie dodaje się 50 µL koktajlu przeciwciał do wzbogacania ludzkich limfocytów T CD4+ na każdy 1 ml PBMC.

Wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Wymieszać cząstki magnetyczne, aby równomiernie rozprowadzić je w roztworze. Dodać 100 µL cząstek magnetycznych na każdy mililitr PBMC.

Wymieszaj, delikatnie pipetując dwa lub trzy razy, a następnie inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Dodaj PBS zawierający FBS i EDTA, aby zwiększyć objętość do 10 mililitrów na probówkę, mieszając poprzez delikatne pipetowanie dwa lub trzy razy. Następnie umieść otwartą probówkę w magnesie cept na pięć minut, pozostawiając probówkę w magnesie.

Przelej ciecz do nowej probówki o pojemności 50 ml, aby wyizolować interesujące komórki i zwiększyć ich odzysk. Powtórz ten proces, dodając do probówki dodatkowy P-B-S-F-B-S-E-D-T-A, mieszając i umieszczając próbkę ponownie w magnesie. Po wyizolowaniu komórek policz je, a następnie odwiruj przy 500 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Resuspender osad komórkowy w medium do polaryzacji, aby uzyskać stężenie 2×10⁶ komórek/ml. Następnie przejść do hodowli zgodnie z opisem w następnej sekcji filmu, aby indukować limfocyty T regulatorowe. Podgrzać do 37 °C 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowej powlekane przeciwciałami anty-CD3.

Po ogrzaniu płytek odessać PBS z dołków. Następnie do każdego z nich dodać cztery mililitry wzbogaconej zawiesiny komórek dodatnich CD four. Puste dołki wypełnić PBS, aby ograniczyć parowanie medium; inkubować przez trzy dni. Po inkubacji.

Wiruj płytkę przez pięć minut przy 500 ×g. Następnie, nie naruszając komórek osadzonych na dnie płytki, usuń połowę medium i zastąp je świeżym medium, po czym inkubuj przez kolejne dwa do trzech dni. Komórki można teraz posortować za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS), zgodnie z opisem w następnej sekcji, lub wykorzystać jako komórki docelowe w teście supresji, opisanym w dalszej części; po upływie dwóch do trzech dni przygotowuje się komórki oraz odpowiednie kontrole kompensacji do sortowania fluorescencyjnego. Aby oddzielić indukowane naiwne i pamięciowe limfocyty T regulatorowe, zbarw komórki przeznaczone do sortowania przeciwciałami anti-CD25 PE, anti-CD45RA PE-Cy5 oraz anti-CD127 APC, zgodnie z opisem w towarzyszącym dokumencie.

Należy również pamiętać o dodaniu przeciwciał do odpowiednich kontroli kompensacji do analizy FACS. Po barwieniu resuspenderć komórki do stężenia 1 × 10⁷ komórek na ml buforu do płukania, następnie dodać 1,5 µl DNAse II na ml komórek i przefiltrować komórki przez nylonowy sitko do komórek o oczkach 40 µm. Przenieść komórki do polipropylenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml, nie przekraczając objętości 3,5 ml na probówkę.

Resuspenduj komórki kontrolne do kompensacji w 300 µL buforu piorącego. Ustaw kompensację w cytometrze przepływowym tak, aby zminimalizować wzajemne wykrywanie przez filtry PE A PC oraz PE sci-fi. Ustaw bramki w celu posortowania komórek tregs, naiwnych limfocytów T oraz limfocytów T pamięci do 5 ml polistyrenowych probówek o dnie okrągłym zawierających 1 ml serum z noworodka cielęcego, aby ocenić, czy limfocyty T regulacyjne uzyskane w wyniku sortowania są w stanie hamować proliferację limfocytów T.

W niniejszej procedurze przeprowadzono test supresji. Jako komórki docelowe posłużą nieposortowane komórki wzbogacone w CD4+. Nie powinny one zawierać indukowanych regulatorowych limfocytów T CD25+.

Rozpocznij od znakowania komórek docelowych CFSE przy użyciu zestawu do śledzenia komórek zgodnie z instrukcjami producenta, stosując 1 µL 5 M roztworu zapasowego na 1 mL komórek zamiast 2 µL. Następnie osadź liczbę kulek do badania supresji Treg równą całkowitej liczbie komórek poprzez szybkie odwirowanie w probówce do mikrocentryfugi. Przepłucz kulek raz w RPMI i ponownie je osadź po wirowaniu.

Odsuń medium RPMI i resuspendu komórki do odpowiedniego stężenia w 8 µL medium do testu supresji na studzienkę w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z okrągłym dnem. Dodaj 8 µL komórek docelowych znakowanych CFSE. Sprawdź kuleczki i spolaryzowane, posortowane komórki do końcowej objętości świeżego medium do testu supresji.

Pożywka w objętości 200 µL. Wszystkie warunki są wysiewane w trzech powtórzeniach. Aby przygotować kontrole, należy dodać 100 µL komórek znakowanych CFSE, 8 µL kulek kontrolnych (inspector beads) oraz 1×10⁵ świeżych, nieznakowanych komórek w 92 µL medium do testu supresji (suppressor assay).

Pożywkę do pierwszych dwóch studzienek kontrolnych. Następnie dodać 100 µL komórek znakowanych CFSE oraz 1 × 10⁵ świeżych nieznakowanych komórek w 92 µL pożywki do testu supresji. Pożywkę do kolejnych dwóch studzienek kontrolnych.

Przykryj płytkę folią aluminiową i pozostaw w inkubatorze na pięć dni w ciemności. Zbierz komórki z każdej studni za pomocą pipety i przenieś je do polistyrenowej probówki o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Wirowarkuj komórki przy 500 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C.

Odssać medium, a następnie resuspender komórki w 300 µL zimnego buforu piorącego fax. Aby monitorować postęp indukowanego różnicowania limfocytów T regulatorowych, oczyszczone ludzkie pierwotne limfocyty T CD4+ CD25- hodowano w medium iTreg. Alikwoty pobrane w dniach 0, 1, 3 i 5 analizowano metodą cytometrii przepływowej w celu oceny ekspresji markerów CD45RA, FoxP3, CTLA4 i CD25. Jak widać na tych pseudokolorowych wykresach kropkowych, w ciągu pięciu dni komórki proliferują i różnicują się in vitro w odpowiedzi na sieciowanie CD3 w obecności TGF-β i IL-2, co ostatecznie prowadzi do uzyskania profilu CD45RA- FoxP3-high CTLA4-high i CD25-high. Wskazuje to na rozwój indukowanych tregów z konwencjonalnych prekursorów limfocytów T. Aby ocenić względną zdolność wygenerowanych tregów do supresji proliferacji limfocytów T.

Komórki znakowane CFSE hodowano z koralikami treg suppression inspector w obecności posortowanych naiwnych komórek pamięci oraz komórek iTreg, co przedstawiono na tym histogramie. Komórki CD25 high, CD45RA negative, CD127 negative. Low indukowane limfocyty T regulatorowe są jedyną subpopulacją z pięciodniowej hodowli, która nabyła zdolność do supresji regulatorowej.

Wskazuje to, że komórki generowane w tym systemie są pod względem fenotypowym i funkcjonalnym supresorowymi limfocytami T regulatorowymi, a nie aktywowanymi konwencjonalnymi limfocytami T, które mogą przejściowo wykazuje ekspresję FOX P3 i CD 25, lecz nie posiadają właściwości immunosupresyjnych. Obecność indukowanych limfocytów T regulatorowych całkowicie znosi proliferację limfocytów T CD4+. Liczby wskazują procent komórek znakowanych CFSE, które uległy podziałowi, aby potwierdzić, że ta sama zależność zachodzi w przypadku oczyszczonych subpopulacji limfocytów T.

Pierwotne ludzkie naiwne oraz pamięciowe limfocyty T zabarwiono CFSE i hodowano w medium dla Treg. Po pięciu dniach wykonano fenotypowanie komórek i oszacowano tempo ich podziałów, jak przedstawiono. W tym przypadku komórki Treg indukowano z puli naiwnych limfocytów T oraz puli pamięciowych limfocytów T po pięciodniowej hodowli.

W standardowym medium IT reg, barwienie CFSE początkowych komórek wykazuje, że zarówno naiwne, jak i pamięciowe limfocyty T różnicują się w limfocyty T regulatorowe dopiero po kilku rundach podziałów komórkowych. Porównawcze profile barwienia CFSE identyfikują indukowane limfocyty T regulatorowe jako komórki o największej proliferacji podczas pięciodniowej hodowli. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak uzyskać indukowane limfocyty Treg z populacji naiwnych, pamięciowych lub wszystkich limfocytów T pochodzących od jednego dawcy podczas próby przeprowadzenia tej procedury.

Ważne jest zachowanie sterylnych warunków przez cały czas trwania procedury oraz zapobieganie wystawianiu CFSE na działanie światła podczas jej wykonywania. W celu uzyskania odpowiedzi na inne pytania, takie jak różnice w tempie podziałów komórkowych, specyficzna synteza cytokin oraz wykorzystanie kanałów jonowych pomiędzy regulacyjnymi a konwencjonalnymi limfocytami T, można przeprowadzić inne metody, np. testy funkcjonalne, po zakończeniu procesu rozwoju. Technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu immunologii do zgłębiania chorób autoimmunologicznych oraz innych patologii związanych z treg u pacjentów.

Należy pamiętać, że praca z ludzką krwią wiąże się z bardzo dużym ryzykiem, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy stosować środki ostrożności, takie jak odpowiednie badania w banku krwi oraz prawidłowa utylizacja materiałów.