Name: Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 54 s
Description: Poznaj metodę enzymatycznej deglikozylacji białek przy użyciu glikozydaz, analizowaną na przykładzie rekombinowanej HCG beta. Technika obejmuje SDS-PAGE oraz specyficzne barwienie ProQ Emerald 300 w celu identyfikacji glikanów N- i O-związanych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Enzymatyczna deglikozylacja
<ol>
 <li>Należy użyć probówek do PCR, aby zminimalizować utratę wody wskutek parowania. Jeden zestaw probówek należy oznakować numerami od 1 do 7.</li>
 <li>Rozmrozić 10X bufor G7, 10X bufor do denaturacji glikoprotein oraz 10% NP-40, a następnie delikatnie opukać probówki, aby wymieszać zawartość. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Fiolki zawierające enzymy należy umieścić na lodzie. Należy dążyć do zminimalizowania liczby cykli zamrażania i rozmrażania.</li>
 <li>Zawartość fiolki hCGβ (150 μg) należy rozpuścić w 600 μl dH2O i przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Przygotować 1 ml 1X buforu G7 poprzez rozcieńczenie zapasu 10X w dH2O.</li>
 <li>Rozcieńczyć 0,5 μl PNGase F w 25 μl 1X buforu G7 i przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Przygotować mieszaninę egzoglikozydaz (EG mix), łącząc po 2 μl α-N-acetylogalaktozaminidazy, α1-2 fukozydazy, β1-3 galaktozydazy oraz α1-3, 6 galaktozydazy.</li>
 <li>Przygotować probówki do PCR zgodnie z poniższymi wskazówkami:</li>
</ol>




<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nr probówki/próbki</td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>hCGβ (0.25mg/ml)</td>
 <td>9μl</td>
 <td>9μl</td>
 <td>9μl</td>
 <td>9μl</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X Bufor denaturujący glikoproteiny</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 <td>1μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>9μl</td>
 <td>9μl</td>
 <td>9μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="9">
 <li>Zakręć probówki, delikatnie wymieszaj i umieść w termocyklerze, zamknij pokrywę i zdenaturuj białka, inkubując przez 10 minut w 94°C, a następnie utrzymując temperaturę 4°C (użycie probówek do PCR w termocyklerze znacznie zapobiega odparowywaniu próbek o małej objętości).</li>
 <li>Wyjmij probówki z termocyklera i odwiruj, aby usunąć widoczną kondensację.</li>
 <li>Dodaj następujące odczynniki zgodnie z instrukcją:</li>
</ol>
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Próbka nr</td>
 <td>1</td>
 <td>2</td>
 <td>3</td>
 <td>4</td>
 <td>5</td>
 <td>6</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10% NP-40</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10X G7 Buffer</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 <td>2.5μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PNGase F rozcieńczenie 1:50</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina do deglikozylacji</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 <td>2μl</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 <td>2μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mieszanina EG</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 <td>--</td>
 <td>--</td>
 <td>2μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>dH2O</td>
 <td>10μl</td>
 <td>8μl</td>
 <td>8μl</td>
 <td>6μl</td>
 <td>8μl</td>
 <td>8μl</td>
 <td>6μl</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Całkowita objętość reakcji</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 <td>25μl</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol start="12">
 <li>Zamknąć probówki PCR nowymi nakrętkami (zużyte należy wyrzucić, ponieważ po jednym cyklu inkubacji nie przylegają prawidłowo).</li>
 <li>Wymieszać zawartość probówek, delikatnie opukując je 4 razy, a następnie odwirować osad na dno.</li>
 <li>Umieścić probówki w termocyklerze i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 godziny, a następnie schłodzić próbki do 4 °C.</li>
</ol>
2. SDS-PAGE próbek deglikozylowanych
<ol>
 <li>Przygotować 130 μl świeżego 3X redukującego buforu do ładowania SDS, dodając 4 μl 1,25M DTT.</li>
 <li>Do każdej próbki dodać 12,5 μl przygotowanego 3X redukującego buforu do ładowania SDS.</li>
 <li>Zamknąć probówki nowymi zakrętkami i delikatnie nimi wstrząsnąć w celu wymieszania zawartości.</li>
 <li>Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 94°C przez 5 minut, a następnie schłodzić do 4 °C.</li>
 <li>Nanieść 30 μl każdej próbki oraz 10 μl markera białkowego na żel Tris-Glicyna 10-20%. Pozostałą część próbki zachować do części 3.1. Nanieść 10μl markera białkowego ColorPlus Prestained Protein Marker.</li>
 <li>Przeprowadzić elektroforezę żelu przy napięciu 130 V w temperaturze pokojowej, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.</li>
 <li>Po zakończeniu elektroforezy wyjąć żel z formy i umieścić go w małym plastikowym pojemniku z wystarczającą ilością barwnika Coomassie blue, aby całkowicie pokrył żel.</li>
 <li>Barwić żel przez 1 godzinę przy delikatnym mieszaniu.</li>
 <li>Przemyć żel trzykrotnie przez 30 minut w 50 ml roztworu odbarwiającego.</li>
 <li>Wykonać dokumentację zdjęciową przy użyciu transiluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można wysuszyć w ramce pomiędzy arkuszami celofanu.</li>
</ol>
3. Barwnik Pro-Q Emerald 300 do wykrywania białek glikozylowanych w żelach SDS-PAGE
<ol>
 <li>Równolegle do żelu z punktu 2.1), nanieś pozostałą część próbek na żel Tris-Glycine 10-20%. Nanieś 10μl markera białek ColorPlus Prestained Protein Marker.</li>
 <li>Podczas prowadzenia elektroforezy rozpuść odczynnik Pro-Q Emerald w DMF i przygotuj roztwory zaprawiające (Fix), płuczące (Wash) oraz utleniające (Oxidizing) do barwienia Pro-Q Emerald 300 zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu.</li>
 <li>Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w plastikowym pojemniku.</li>
 <li>Utrwal żel, dodając 100 ml roztworu Fix i pozostawiając go na noc w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Przepłucz żel 100 ml roztworu Wash przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu. Powtórz płukanie przy użyciu świeżego roztworu Wash.</li>
 <li>Utlenij węglowodany, inkubując żel przez 30 minut w 25 ml roztworu Oxidizing przy łagodnym mieszaniu.</li>
 <li>Przepłucz żel zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
 <li>Podczas płukania żelu przygotuj świeży barwnik Pro-Q Emerald 300, dodając 500 μl roztworu odczynnika Pro-Q Emerald 300 rozpuszczonego w kroku 3.2 do 25 ml buforu do barwienia dołączonego do zestawu.</li>
 <li>Zabarw żel, dodając 25 ml barwnika przygotowanego w kroku 3.8 i inkubując w ciemności przy łagodnym mieszaniu przez 90 do 120 minut.</li>
 <li>Powtórz dwa etapy płukania opisane w kroku 3.5.</li>
 <li>Wykonaj dokumentację obrazową przy użyciu transiluminatora UV przy 300nm. Użyj markera 80 kDa, który jest znakowany Pro-Q Emerald Green, aby nałożyć obraz UV na zdjęcie żelu wykonane w świetle białym, ukazujące drabinę barwioną wstępnie.</li>
 <li>Porównaj obrazy żelu barwionego Coomassie z kroku 2.10 z obrazami żelu barwionego Pro-Q Emerald z kroku 3.11.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Zmiany w migracji białek po enzymatycznej deglikozylacji przedstawiono na rysunku 2. Porównano próbkę kontrolną (panel A, ścieżka 1) z próbką poddaną działaniu PNGase F (usuwanie glikanów N, ścieżka 2) oraz mieszanką do deglikozylacji (PNGase F oraz endo- i egzo-glikozydazy w celu usunięcia glikanów O, ścieżka 3). Po trawieniu dodatkowymi glikozydazami nie zaobserwowano dalszej redukcji masy (ścieżka 4). Poza zmianą masy, prążki stają się ostrzejsze w miarę usuwania glikanów. Prążek migrujący poniżej markera 17 kDa (gwiazdka) reprezentuje całkowicie deglikozylowany polipeptyd hCGβ (MW: 16 kDa). Inne prążki mogą wynikać z niepełnej deglikozylacji lub obecności wielu niezidentyfikowanych białek w próbce hCGβ (patrz ścieżka 1). Ścieżki od 5 do 7 (kontrole) pokazują prążki odpowiadające glikozydazom.
Barwienie glikoprotein za pomocą barwnika Emerald Green przedstawiono na panelu B. Odczynnik ten utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału maleje w miarę enzymatycznej deglikozylacji hCGβ (od ścieżki 1 do ścieżki 4). Sygnał resztkowy w ścieżkach 3 i 4 wskazuje na obecność motywów glikanowych odpornych na zastosowane enzymy. Dodatkowe glikozydazy użyte w ścieżce 4 usuwają kilka dodatkowych reszt cukrowych: migracja białka pozostaje taka sama, ale widoczny jest niewielki spadek intensywności barwienia. Odporne grupy cukrowe nie występowały we wszystkich gatunkach białek: niektóre prążki nie zostały wykryte przez Emerald Green (brak w obrazie UV, w nawiasach), co wskazuje na ich rozległą deglikozylację. Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że hCGβ jest heterogenicznie glikozylowane. Dolny prążek w ścieżce 2 (strzałka) jest słabo widoczny na obrazie Emerald Green, podczas gdy górny prążek w ścieżce 2 jest jasny, co wskazuje na wciąż obecne liczne grupy glikanów. Dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowane hCGβ ekspresjonowane w komórkach mysich zawiera wiele glikoform9. Różne glikoformy wynikają z immanentnej heterogeniczności glikozylacji, w której niektóre polipeptydy nie otrzymują glikanu w każdym miejscu konsensusowym i/lub niektóre glikany są wydłużone, podczas gdy inne, nawet w obrębie tego samego białka, nie są.
<img alt="Schemat struktur glikanów; O-glikany, N-glikany na błonie komórkowej, symbole monosacharydów." src="/files/ftp_upload/3749/3749fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Typowe wzorce glikozylacji dla białek glikoprotein wydzielanych lub znajdujących się na powierzchni komórki.
<img alt="Wyniki elektroforezy białek, żel z barwionymi prążkami i markerami masy cząsteczkowej, siedem ścieżek." src="/files/ftp_upload/3749/3749fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Żele SDS-PAGE wykazujące enzymatyczną deglikozylację hCGβ. Panel A przedstawia barwienie błękitem Coomassie, natomiast Panel B przedstawia wyniki barwienia Pro-Q Emerald 300 w celu wizualizacji białek glikozylowanych. Numery próbek: 1, kontrola hCGβ; 2, trawienie PNGase F; 3, trawienie mieszanką deglikozylującą (Deglycosylation Mix); 4, trawienie mieszanką deglikozylującą oraz egzo-glikozydazami; próbki od 5 do 7 to kontrole odczynników (O-Glyc, O-glikozydaza; GNA, β-N-acetyloglukozaminidaza; Gal/Fuc, β1-3 galaktozydaza, α1-3,6 galaktozydaza i α1-2 fukozydaza; GalNA, α-N-acetylgalaktozaminidaza; Neu, neuraminidaza; PNGase; PNGase F)

<ol><li>Spiro, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+glycosylation%3A+nature%2C+distribution%2C+enzymatic+formation%2C+and+disease+implications+of+glycopeptide+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds.</a> Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).</li>
<li>Ohtsubo, K., Marth, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycosylation+in+Cellular+Mechanisms+of+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Glycosylation in Cellular Mechanisms of Health and Disease.</a> Cell. 126, 855-867 (2006).</li>
<li>Arnold, J. N., Wormald, M. R., Sim, R. B., Rudd, P. M., Dwek, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+glycosylation+on+the+biological+function+and+structure+of+human+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins.</a> Annual Review of Immunology. 25, 21-50 (2007).</li>
<li>Mitra, N., Sinha, S., Ramya, T. N. C., Surolia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-linked+oligosaccharides+as+outfitters+for+glycoprotein+folding%2C+form+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">N-linked oligosaccharides as outfitters for glycoprotein folding, form and function.</a> Trends in Biochemical Sciences. 31, 156-163 (2006).</li>
<li>Carlsen, R. B., Bahl, O. P., Swaminathan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+chorionic+gonadotropin.+Linear+amino+acid+sequence+of+the+beta+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human chorionic gonadotropin. Linear amino acid sequence of the beta subunit.</a> Journal of Biological Chemistry. 248 (19), 6810-6812 (1973).</li>
<li>Tarentino, A. L., Plummer, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deglycosylation+of+Asparagine-linked+Glycans+by+PNGaseF%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Glycoscience+and+Glycotechnology%22%5BJournal%5D)">Deglycosylation of Asparagine-linked Glycans by PNGaseF.</a> Trends in Glycoscience and Glycotechnology. 5 (23), 163-170 (1993).</li>
<li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide-N4-%28N-acetyl-%CE%B2-glucosaminyl%29asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+%CE%B11-3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1-3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199, 647-652 (1991).</li>
<li>Koutsioulis, D., Landry, D., Guthrie, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+endo-%CE%B1-N-acetylgalactosaminidases+with+broader+substrate+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Novel endo-α-N-acetylgalactosaminidases with broader substrate specificity.</a> Glycobiology. 18 (10), 799-805 (2008).</li>
<li>Thakur, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+the+glycoforms+of+the+intact+alpha+subunit+of+recombinant+human+chorionic+gonadotropin+by+high-resolution+capillary+electrophoresis-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Profiling the glycoforms of the intact alpha subunit of recombinant human chorionic gonadotropin by high-resolution capillary electrophoresis-mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (2), 8900-8907 (2009).</li>
<li>Park, S., Lee, M. R., Shin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbohydrate+microarrays+as+powerful+tools+in+studies+of+carbohydrate-mediated+biological+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Carbohydrate microarrays as powerful tools in studies of carbohydrate-mediated biological processes.</a> Chemical Communications. 37, 4389-4399 (2008).</li>
<li>Zachara, N. E., Vosseller, K., Hart, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+proteins+modified+by+O-linked+N-acetylglucosamine%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of proteins modified by O-linked N-acetylglucosamine.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 95, 17-17 (2011).</li>
<li>Varki, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVarki%2C+A+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. , 2nd Ed, Clod Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
</ol>

Autorzy są zatrudnieni przez New England Biolabs, firmę produkującą wiele z odczynników wykorzystanych w niniejszym artykule.

Opisana tutaj metoda z wykorzystaniem enzymatycznej deglikozylacji i SDS-PAGE może dostarczyć cennych informacji o stanie glikozylacji badanego białka, natomiast odczynniki specyficzne dla glikanów ułatwiają interpretację danych. Niniejszy protokół jest przeznaczony do wstępnych badań glikozylacji białek i jest szczególnie odpowiedni dla glikoprotein wydzielniczych i błonowych z komórek ssaków: wybrane w tym przypadku enzymy specyficznie usuną wszystkie glikany N, oraz glikany N wraz z najpowszechniejszymi cukrami rozbudowującymi i tworzącymi rdzeń glikanów O. Glikozydazy mają dodatkową zaletę w postaci łagodnego działania w porównaniu z chemicznymi metodami deglikozylacji, co pozwala zachować integralność zarówno cukrów, jak i szkieletu białkowego.
Aby wyjaśnić stopień zajętości (które aminokwasy są glikozylowane), zakres glikozylacji lub określić strukturę szczegółową glikanów, wymagane są bardziej zaawansowane techniki, takie jak spektrometria mas, chromatografia cieczowa lub NMR.
Ze względu na swoją prostotę, kilka kroków w niniejszym protokole można dostosować, zastąpić i/lub połączyć, aby sprostać różnym potrzebom eksperymentalnym. Jednakże, aby uzyskać wyniki, które można jednoznacznie zinterpretować, ważne jest zrozumienie jego mocnych i słabych stron. Po pierwsze, kluczowa jest specyficzność i czystość glikozydaz: należy używać wyłącznie dobrze scharakteryzowanych enzymów, które zostały przetestowane pod kątem braku proteaz i innych zanieczyszczeń o aktywności enzymatycznej. Niestety, nie istnieje standardowa definicja jednostki enzymatycznej dla glikozydaz; użytkownik powinien określić odpowiednie przeliczenie zgodnie ze specyfikacją producenta. Po drugie, niezbędny jest staranny wybór metody detekcji: a) Odczynniki do barwienia białek są użyteczne tylko wtedy, gdy deglikozylacja prowadzi do znacznej zmiany masy cząsteczkowej. Tak jednoznaczny wynik, jak pokazano tutaj, nie zawsze jest uzyskiwany. W innych przypadkach obserwowaliśmy nieprawidłową migrację po deglikozylacji (daleką od przewidywanej masy cząsteczkowej, a nawet wolniejszą migrację). Zjawisko to nie jest dobrze zrozumiane, ale można stwierdzić, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało poddane deglikozylacji. b) Detekcja cukrów za pomocą przeciwciał wiąże się z unikalnymi wyzwaniami ograniczającymi ich stosowalność. Generowanie ogólnych przeciwciał antyglikanowych jest bardzo trudne; są one zazwyczaj wytwarzane przeciwko złożonemu celowi glikanowemu, co ogranicza ich zastosowanie. Ponadto kilka monoklonalnych przeciwciał antyglikanowych wykazuje niepożądaną reaktywność krzyżową10. c) Lektyny (białka o wrodnym powinowactwie do cukrów) dobrze nadają się do detekcji cukrów, a dodatkowo dostarczają informacji o strukturze glikanu. Jednak nie wszystkie z nich charakteryzują się wąską specyficznością, a wiele jest jedynie częściowo scharakteryzowanych (co oznacza, że mogą one posiadać nieznane powinowactwa). W konsekwencji pozytywne barwienie lektynami stanowi wskazanie, a nie dowód obecności danego cukru. d) Zestawy do znakowania chemicznego (oparte na utlenianiu cukrów jodynianem) są metodą z wyboru do barwienia wszystkich glikoprotein, a zatem dobrze nadają się do monitorowania procesu deglikozylacji.
Podczas przetwarzania nieznanej próbki dobrą praktyką jest uwzględnienie kontroli glikoprotein. Fetuina jest łatwo dostępną glikoproteiną N- i O-zależną; dobrym wyborem jest również gonadotropina kosmiczna (obie podjednostki). Jako kontrolę negatywną można zastosować albuminę surowicy bydlęcej (BSA). Należy jednak zauważyć, że niektóre białka nieglikozylowane reagują słabo z Pro-Q Emerald 300, szczególnie w wysokich stężeniach. Standardy masy cząsteczkowej białek nieglikozylowanych, takie jak wstępnie zabarwiony marker białek użyty w tym protokole, mają tę zaletę, że tworzą wyraźne prążki. Jedno z tych białek (80 kDa) reaguje z Pro-Q Emerald 300 jedynie przypadkowo. W związku z tym użytkownik może chcieć zastosować zamiast niego drabinę standardów glikoprotein, np. Candy-Cane firmy Invitrogen.
Wreszcie, prosta detekcja glikoprotein nukleocytozolowych (zmodyfikowanych jedną cząsteczką O-GlcNAc) w żelu jest możliwa przy użyciu przeciwciała monoklonalnego, wraz z β-N-acetyloglukozaminidazą w celu kontroli specyficzności 11. Opis tej techniki wykracza poza zakres niniejszego artykułu, jednak należy o niej wspomnieć, ponieważ glikozydazy są użytecznymi narzędziami w badaniu wielu innych glikoprotein i glikokoniugatów występujących w komórkach. Kompleksowe omówienie wszystkich znanych form glikozylacji znajduje się w drugim wydaniu „Essentials of Glycobiology”, dostępnym bezpłatnie online w NCBI Bookshelf (Bookshelf ID: NBK1908; PMID: 20301239)12.

<table><tbody><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmówkowa &amp;#946;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6572</td><td> </td></tr><tr><td>Probówki do PCR</td><td>VWR international</td><td>20170-004</td><td> </td></tr><tr><td>Termocykler do PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359659</td><td> </td></tr><tr><td>PNGaza F</td><td>New England Biolabs</td><td>P0704</td><td>Dostarczana z buforami</td></tr><tr><td>Mieszanina do deglikozylacji białek</td><td>New England Biolabs</td><td>P6039</td><td>Dostarczana z buforami</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-N-acetylgalaktosaminidaza</td><td>New England Biolabs</td><td>P0734</td><td>Dostarczana z buforem</td></tr><tr><td>&amp;alpha;1-2 fukozydaza</td><td>New England Biolabs</td><td>P0724</td><td>Dostarczana z buforem</td></tr><tr><td>&amp;alpha;1-3,6 galaktozydaza</td><td>New England Biolabs</td><td>P0731</td><td>Dostarczana z buforem</td></tr><tr><td>&amp;#946;1-3 galaktozydaza</td><td>New England Biolabs</td><td>P0726</td><td>Dostarczana z buforem</td></tr><tr><td>Bufor G7 10X (500 mM fosforanu sodu)</td><td>New England Biolabs</td><td>---</td><td>Dostarczany z PNGazą F lub mieszaniną do deglikozylacji</td></tr><tr><td>Bufor denaturujący glikoproteiny 10X (5% SDS, 400 mM DTT)</td><td>New England Biolabs</td><td>---</td><td>Dostarczany z PNGazą F lub mieszaniną do deglikozylacji</td></tr><tr><td>10% NP-40</td><td>New England Biolabs</td><td>---</td><td>Dostarczany z PNGazą F lub mieszaniną do deglikozylacji</td></tr><tr><td>Bufor do nakładania próbek z SDS 3X (187,5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% SDS, 30% glicerolu, 0,03% błękitu bromofenolowego)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7703</td><td>Dostarczany z 1,25M DTT</td></tr><tr><td>Marker białkowy wstępnie barwiony ColorPlus</td><td>New England Biolabs</td><td>P7709</td><td> </td></tr><tr><td>Multigel Tris-glicyna 10-20%</td><td>Cosmo Bio Co.</td><td>DCB-414893</td><td> </td></tr><tr><td>Kasetowa jednostka elektroforetyczna</td><td>Cosmo Bio Co.</td><td>DCB-303111</td><td> </td></tr><tr><td>Zasilacz do elektroforezy EPS 301</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1130-01</td><td> </td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia glikoprotein Pro-Q Emerald 300</td><td>Invitrogen</td><td>P-21857</td><td> </td></tr><tr><td>Brilliant Blue R</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0149</td><td> </td></tr><tr><td>System AlphaImager HP</td><td>Cell Biosciences</td><td>92-13823-00</td><td> </td></tr></tbody></table>

identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glikozylacja, czyli kowalencyjne przyłączanie cukrów, jest główną modyfikacją potranslacyjną białek, która może znacząco wpływać na takie procesy jak adhezja komórek, transport molekularny, klirens oraz transdukcja sygnału1-4. U eukariontów najczęstszymi modyfikacjami glikozylacyjnymi w szlaku wydzielniczym są przyłączenia do konsensusowych reszt asparaginy (wiązania N) lub do reszt seryny lub treoniny (wiązania O) (Rycina 1). Inicjacja syntezy N-glikanów jest wysoce konserwatywna u eukariontów, podczas gdy produkty końcowe mogą się znacznie różnić w zależności od gatunku, tkanki lub białka. Niektóre glikany pozostają niemodyfikowane („N-glikany wysokomannozowe”) lub są dalej przetwarzane w aparacie Golgiego („N-glikany złożone”). Większa różnorodność występuje w przypadku O-glikanów, które w komórkach zwierząt rozpoczynają się od wspólnej reszty N-acetylogalaktozaminy (GalNAc), lecz różnią się u organizmów niższych1.
Szczegółowa analiza glikozylacji białek stanowi odrębną dziedzinę i wymaga rozległych zasobów oraz specjalistycznej wiedzy do prawidłowego wykonania. Jednakże dostępność wielu enzymów usuwających cukry (glikozydaz) umożliwia uzyskanie ogólnego obrazu stanu glikozylacji białka w warunkach standardowego laboratorium. W niniejszej pracy ilustrujemy zastosowanie glikozydaz do analizy modelowej glikoproteiny: rekombinowanej ludzkiej beta-podjednostki gonadotropiny kosmórkowej (hCGβ), która posiada dwa N-glikany i cztery O-glikany 5. Technika ta wymaga jedynie prostej aparatury i typowych materiałów eksploatacyjnych, a może być łatwo dostosowana do analizy wielu próbek glikoprotein.
Do badania glikoproteiny można równolegle zastosować kilka enzymów. PNGase F jest w stanie usunąć niemal wszystkie rodzaje glikanów sprzężonych z N6,7. W przypadku glikanów sprzężonych z O nie istnieje dostępny enzym, który mógłby odciąć nienaruszony oligosacharyd od szkieletu białkowego. Zamiast tego glikany sprzężone z O są skracane przez egzosydazy do krótkiego rdzenia, który następnie jest łatwo usuwany przez O-glikozydazę. Mieszanina do deglikozylacji białek (Protein Deglycosylation Mix) zawiera PNGase F, O-glikozydazę, neuraminidazę (sjalidazę), β1-4 galaktozydazę oraz β-N-acetylglukozaminidazę. Jest ona stosowana do jednoczesnego usuwania glikanów sprzężonych z N oraz niektórych glikanów sprzężonych z O8. Ostatecznie mieszanina do deglikozylacji została uzupełniona o zestaw innych egzosydaz (α-N-acetylgalaktozaminidazę, α1-2 fukozydazę, α1-3,6 galaktozydazę oraz β1-3 galaktozydazę), które pomagają w usuwaniu w przeciwnym razie opornych monosacharydów, mogących występować w niektórych glikanach sprzężonych z O.
Metoda SDS-PAGE/barwienie Coomassie blue jest wykorzystywana do wizualizacji różnic w migracji białek przed i po traktowaniu glikozydazami. Dodatkowo specyficzna dla cukrów metoda barwienia, ProQ Emerald-300, wykazuje osłabienie sygnału w miarę sukcesywnego usuwania glikanów. Protokół ten został opracowany do analizy niewielkich ilości glikoprotein (0,5 do 2 μg), choć enzymatyczną deglikozylację można przeskalować w celu przetworzenia większych ilości białka, jeśli jest to wymagane.

Użycie specyficznych glikozydaz do usuwania cukrów z glikoprotein, a następnie przeprowadzenie elektroforezy SDS-PAGE, jest cenną metodą wykrywania modyfikacji glikanowych w próbkach białek i stanowi dobry wybór do wstępnych badań z zakresu glikobiologii. Zmiany występujące po deglikozylacji można wykryć jako przesunięcia w mobilności w żelu lub poprzez barwienie odczynnikami wrażliwymi na glikany.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Glikozylacja, czyli dołączanie kowalencyjnie związanych cukrów, jest główną modyfikacją potranslacyjną białek, która może znacząco wpływać na procesy ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zilustrowanie zastosowania glikozydaz do enzymatycznego deglikozylacji oraz analizy glikozylacji typu N i O na modelowym glikoproteinie. Osiąga się to poprzez traktowanie glikoproteiny enzymem PGA's F lub mieszaniną do deglikozylacji białek. Ponadto mieszanina do deglikozylacji białek została uzupełniona o mieszaninę dodatkowych egzo-glikozydaz, które czasami pomagają w usunięciu cukrówOtherwise opornych na hydrolizę.Metodę tę ilustrujemy na przykładzie modelowej glikoproteiny – rekombinowanej ludzkiej beta-podjednostki gonadotropiny kosmórkowej (HCG beta), następnie przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE, po której następuje barwienie błękitem Coomassie oraz specyficzne barwienie cukrów metodą Pro Q Emerald 300 w celu analizy glikozylacji. Uzyskane wyniki dla próbki HCG beta wykazują, że HCG beta jest heterogennie glikozylowana i zawiera wiele glikoform, co wynika z różnic w migracji białka z traktowaniem glikozydazą i bez niego, a także ze zmniejszenia sygnału w barwieniu ProQ w miarę sukcesywnego usuwania glikanów.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrometrią mas, jest jej prostota, wykorzystanie powszechnego wyposażenia laboratoryjnego oraz odpowiedniość dla początkujących glikobiologów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii, na przykład czy badane białko jest glikozylowane. Aby rozpocząć enzymatyczną deglikozylację, należy rozmrozić bufory dostarczone w zestawie do deglikozylacji białek.Dokładnie wymieszać zawartość probówek i przechowywać w temperaturze pokojowej. Probowki zawierające enzymy umieścić w lodu, zawartość fiolki HCG beta rozpuścić w 600 µL wody destylowanej i utrzymywać w lodu. Po przygotowaniu 1 mL buforu 1X G7 poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 10X w wodzie destylowanej, użyć 25 µL buforu do rozcieńczenia 0,5 µL PGA's f.Przygotuj mieszaninę exo glikozydaz, łącząc po dwa mikrolitry każdej z czterech exo glikozydaz. Następnie do siedmiu ponumerowanych probówek PCR dodaj HCG beta oraz 10x bufor denaturujący glikoprotein zgodnie z instrukcją w protokole pisemnym, zamknij probówki i delikatnie wymieszaj. Zdenaturuj białka w termocyklerze, inkubując przez 10 minut w temperaturze 94 °C, a następnie w temperaturze 4 °C. Po wyjęciu probówek z termocyklera odwiruj je w wirówce, aby usunąć widoczną kondensację. Do każdej probówki z reakcją dodaj pozostałe odczynniki zgodnie z protokołem pisemnym. Zamknij probówki PCR za pomocą nowych zakrętek.Następnie wymieszaj zawartość probówek, delikatnie stukując je cztery razy po odwirowaniu zawartości, umieść probówki w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Następnie schłodź próbki do temperatury 4 °C. Aby przygotować elektroforezę SDS-PAGE, sporządź świeży 3x redukcyjny bufor do nakładania próbek SDS.Do każdej próbki z DTT należy dodać 12,5 µL przygotowanego trzykrotnego redukującego buforu do ładowania SDS, zamknąć probówki nowymi nakrętkami i delikatnie nimi potrząsnąć, aby wymieszać zawartość. Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 94 °C przez pięć minut, a następnie schłodzić do 4 °C. Po inkubacji na żel tri-glicynowy 10–20% nałożyć 30 µL każdej próbki oraz 10 µL markera białek, zachowując pozostałą część każdej próbki.Przeprowadź elektroforezę żelu przy napięciu 130 V, aż front barwnika dotrze do dolnej części żelu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w małym plastikowym pojemniku z wystarczającą ilością barwnika Coomassie Blue, aby całkowicie go przykryć. Barw żel przez jedną godzinę przy delikatnym mieszaniu. Po zakończeniu barwienia żelu.Przemyć trzy razy przez 30 minut. W 50 mililitrach roztworu detain zarejestrować obrazy, używając transluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można wysuszyć pomiędzy arkuszami celofanu.W jednej ramce, podczas prowadzenia elektroforezy, rozdziel pozostałe części każdej próbki oraz marker białek na żelu 10-20% Tri-glicynowym. Rozpuść odczynnik ProQ emerald w DMF i przygotuj roztwory stokowe do utrwalania, przemywania oraz utleniania zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w plastikowym pojemniku.Utrwal żel, dodając 100 milliliters przygotowanego roztworu utrwalającego. Pozostaw żel przez noc w temperaturze pokojowej, a następnego dnia poddaj go delikatnemu mieszaniu. Przemyj żel 100 milliliters przygotowanego roztworu piorącego przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej przy delikatnym mieszaniu, powtarzając czynność płukania drugi raz ze świeżą porcją roztworu piorącego.Następnie utlenij węglowodany, inkubując żel przy łagodnym mieszaniu przez 30 minut w 25 mililitrach przygotowanego roztworu utleniającego, a po inkubacji wykonaj dwa dodatkowe płukania żelu. Przygotuj świeżą barwnik ProQ emerald 300, dodając 500 mikrolitrów roztworu odczynnika ProQ Emerald 300 do 25 mililitrów buforu do barwienia dostarczonego w zestawie. Wybarw żel, inkubując go w przygotowanym barwniku w ciemności przy łagodnym mieszaniu przez 90 do 120 minut.Powtórz dwa etapy płukania zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zarejestruj obrazy przy użyciu transiluminatora UV przy 300 nanometrach. W końcowym kroku porównaj obrazy żelu barwionego kumasi z obrazami żelu barwionego ProQ emerald.Zmiany w migracji białka po enzymatycznej deglikozylacji są widoczne przy porównaniu próbki kontrolnej z próbką poddaną działaniu PGA's F. W celu usunięcia glikanów typu N stosuje się mieszaninę do deglikozylacji, a w celu usunięcia glikanów typu N i O – odpowiednią obróbkę; po trawieniu dodatkową glikozydazą nie obserwuje się dalszego zmniejszenia rozmiaru. Oprócz zmiany masy, pasma stają się ostrzejsze wraz z usuwaniem glikanów.Prążek znajdujący się poniżej markera 17 kilodalton prawdopodobnie reprezentuje w pełni deglikozylowany polipeptyd beta HCG. Ścieżki od piątej do siódmej pokazują prążki odpowiadające Glyco. Inne prążki mogą wynikać z niepełnej deglikozylacji lub z obecności wielu niezidentyfikowanych białek w próbce beta HCG.Odczynnik emerald green utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału spada w miarę enzymatycznej deglikozylacji beta-HCG. Sygnał szczątkowy w ścieżce trzeciej i czwartej wskazuje na obecność motywów glikanowych, które są odporne na zastosowane enzymy.Dodatkowy glikosylan zastosowano w czwartej ścieżce. Usunięto kilka dodatkowych reszt cukrowych. Migracja białka pozostaje taka sama, jednak widoczny jest niewielki spadek intensywności barwienia.Odporne reszty cukrowe nie występowały we wszystkich gatunkach białek. Niektóre prążki nie zostały wykryte przez emerald Green, co wskazuje na to, że zostały one w znacznym stopniu deglikozylowane. Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że HCG beta jest heterogennie glikozylowane. Dolny prążek w ścieżce drugiej jest słabo widoczny na obrazie emerald green.Podczas gdy górny prążek w ścieżce drugiej jest jasny, co wskazuje na obecność wielu grup GLYCAN, dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowany HCG beta ekspresowany w komórkach mysich zawiera wiele glikoform ze względu na naturalną heterogenność glikozylacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jaki jest stopień zajętości? Jaki jest zakres glikozylacji lub jaka jest struktura szczegółowa glikanów?Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak wykorzystać glycosylate do enzymatycznej deglikozylacji oraz analizy glikanów typu N-linked w glikoproteinach. Wybór metody detekcji może być trudny, ponieważ barwienie białek jest przydatne tylko wtedy, gdy deglikozylacja powoduje znaczną zmianę masy cząsteczkowej w przypadku innych białek.Zaobserwowaliśmy nieprawidłowe migracje po deglikozylacji i stwierdziliśmy, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało deglikozylowane.

identification-characterization-protein-glycosylation-using-specific

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Identyfikacja i Charakterystyka Glikozylacji Białek za pomocą Specyficznych Endo- i Eksoglikozydaz

Opisujemy metodę analizy zmian w glikanach typu N w początkowej fazie życia glikoprotein po ich biosyntezie w komórkach ssaków. Jest to realizowane poprzez analizę pulse-chase metabolicznie znakowanych glikanów, ich enzymatyczne uwalnianie z glikoprotein oraz badanie za pomocą HPLC.

Analiza typu pulse-chase łańcuchów cukrowych wiązanych glikozydowo do azotu (N-glikanów) w glikoproteinach komórek ssaków

Opisano specyficzną i czułą metodę pozwalającą na poznanie profilu ekspresji antygenów glikosfingolipidowych w organach i komórkach układu odpornościowego. Metoda ta wykorzystuje spektrometrię mas z pułapką jonową, umożliwiając etapową fragmentację cząsteczek glikosfingolipidów w celu analizy strukturalnej w porównaniu ze standardami otrzymanymi drogą syntezy chemicznej.

Analiza spektrometryczna glikosfingolipidowych antygenów

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Protokół o wysokiej przepustowości został opracowany dla połączonego oczyszczania proteomiki i glikomiki oraz kwantyfikacji LC-MS/MS w osoczu. Analiza deamidacji motywów glikozylacji sprzężonych z N była specyficzna dla miejsc deglikozylowanych. Dokładne oznaczanie ilościowe N-glikanów osiągnięto poprzez sprzężenie separacji N-glikanów wspomaganej filtrem z normalizacją indywidualności podczas znakowania strategią znaczników hydrazydu glikanów.

Ilościowa glikomika i proteomika połączone ze strategią oczyszczania

Ten artykuł opisuje metodologię przygotowania próbek tkanek sercowo-naczyniowych do analizy MS, która pozwala na (1) analizę składu białka ECM, (2) identyfikację miejsc glikozylacji oraz (3) charakterystykę składu form glikanów. Metodologia ta może być zastosowana, z niewielkimi modyfikacjami, do badania ECM w innych tkankach.

Glikoproteomika macierzy zewnątrzkomórkowej: metoda analizy nienaruszonego glikopeptydu przy użyciu spektrometrii mas

Otwarte wyszukiwanie umożliwia identyfikację glikopeptydów ozdobionych nieznanymi wcześniej kompozycjami glikanów. W tym artykule przedstawiono uproszczone podejście do podejmowania otwartych poszukiwań i późniejszych poszukiwań glikopeptydów skoncentrowanych na glikanie dla próbek bakteryjnych na przykładzie Acinetobacter baumannii.

Zastosowanie otwartych podejść opartych na poszukiwaniach do identyfikacji glikopeptydów Acinetobacter baumannii sprzężonych z O

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę glikoproteomiki sterowaną przez glikomikę, zintegrowaną technologię omiczną, która oferuje wszechstronny wgląd w heterogeniczny glikoproteom w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych, niezbędny do lepszego zrozumienia glikobiologii nowotworów.

Glikoproteomika sterowana glikomiką ułatwia kompleksowe profilowanie glikoproteomu w złożonych mikrośrodowiskach nowotworowych

W niniejszej pracy opisujemy nową ilościową technikę proteomiczną służącą do identyfikacji kompleksów białkowych u Saccharomyces cerevisiae. W badaniu tym wykorzystaliśmy metodę SILAC wraz z oczyszczaniem powinowactwowym, a następnie tandemową spektrometrią mas, aby z wysoką specyficznością zidentyfikować partnerów wiążących białko ER, Scs2p.

Identyfikacja kompleksów białkowych z wykorzystaniem proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Opisano krótki protokół barwienia białek Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 w żelach poliakrylamidowych, który nie wymaga użycia rozpuszczalników organicznych ani kwasu octowego, stosowanych w klasycznych procedurach barwienia CBB.

Barwienie białek w żelach Coomassie G-250 bez użycia rozpuszczalników organicznych i kwasu octowego

Dołączony film opisuje sposób wykorzystania systemu frakcjonowania GELFREE 8100, który rozdziela złożone próbki białek na podstawie masy cząsteczkowej i odzyskuje frakcje w fazie ciekłej. Film wyjaśnia zasadę działania tej technologii, sposób jej zastosowania oraz przedstawia uzyskane dane z analizy frakcjonowanego homogenatu wątroby bydlęcej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym.

Wykorzystanie systemu frakcjonowania GELFREE 8100 do frakcjonowania w oparciu o masę cząsteczkową z odzyskiem w fazie ciekłej

Poznaj metodę enzymatycznej deglikozylacji białek przy użyciu glikozydaz, analizowaną na przykładzie rekombinowanej HCG beta. Technika obejmuje SDS-PAGE oraz specyficzne barwienie ProQ Emerald 300 w celu identyfikacji glikanów N- i O-związanych.

Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Przeglądaj więcej filmów