Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zilustrowanie zastosowania glikozatu do enzymatycznej deglikozylacji oraz analiza glikozylacji sprzężonej z n i O na modelowej glikoproteinie. Osiąga się to poprzez traktowanie glikoproteiny F PGA lub mieszanką deglikozylacji białek. Ponadto mieszanka deglikozylacji białek została uzupełniona mieszanką dodatkowych egzogliko-gliko, które czasami pomagają usunąć cukry, które w przeciwnym razie byłyby oporne.

Ilustrujemy tę metodę za pomocą modelowej rekombinowanej ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej beta lub HCG beta na następnej stronie SDS, a następnie barwienia niebieskim Kumasi i metody barwienia specyficznego dla cukru. Pro Q Emerald 300 są używane do analizy glikozylowanej D. Uzyskuje się wyniki próbek HCG beta, które pokazują, że HCG beta jest niejednorodnie glikozylowany i zawiera wiele form glikozy w oparciu o różnice w migracji białek z traktowaniem glikozatem i bez niego oraz zmniejszony sygnał barwienia ProQ w miarę sukcesywnego usuwania glikanów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrometrii mas, jest to, że jest prosta, wykorzystuje zwykły sprzęt laboratoryjny i jest dobra dla początkujących biologów glikologicznych. Ta metoda może odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikotechniki, takie jak to, czy moje białko jest glikozylowane. Aby rozpocząć deglikozylację enzymatyczną, należy rozmrozić dostarczone z zestawu do deglikozylacji białek.

Dokładnie wymieszaj probówki i utrzymuj temperaturę pokojową. Umieścić fiolki zawierające enzym na lodzie, rozpuścić zawartość fiolki HCG beta w 600 mikrolitrach wody destylowanej i trzymać na lodzie. Po przygotowaniu jednego mililitra jednego buforu XG seven poprzez rozcieńczenie 10 x bulionu w wodzie destylowanej, użyj 25 mikrolitrów do rozcieńczenia 0,5 mikrolitra f PGA.

Przygotuj mieszankę egzoglikozy, łącząc dwa mikrolitry, z których każdy ma cztery choroby egzoglikologiczne. Następnie dodaj HCG beta i 10 x bufor denaturujący glikoproteinę do siedmiu ponumerowanych probówek PCR, jak wskazano w pisemnym protokole, zakryj probówki i delikatnie wymieszaj denaturację białek w termocyklerze, inkubując 10 minut w temperaturze 94 stopni Celsjusza, a następnie cztery stopnie Celsjusza Przytrzymaj Po wyjęciu probówek z wirówki termocyklera w celu usunięcia widocznej kondensacji z każdej probówki reakcyjnej, Dodać pozostałe odczynniki zgodnie z pisemnym protokołem. Zamknąć probówki PCR za pomocą nowych nakrętek.

Następnie wymieszaj probówki, delikatnie stukając cztery razy po odwirowaniu zawartości, umieść probówki w termocyklerze inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie schładzaj próbki do czterech stopni Celsjusza. Aby skonfigurować stronę SDS, przygotuj nowy bufor ładowania SDS o pojemności trzech razy.

W przypadku naziemnej telewizji cyfrowej dodaj 12,5 mikrolitra przygotowanego bufora ładującego trzy x redukcyjne SDS Do każdej próbki zamknij probówki nowymi nakrętkami i delikatnie postukaj w probówki, aby wymieszać. Inkubować probówki w termocyklerze w temperaturze 94 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schłodzić do czterech stopni Celsjusza Po załadowaniu inkubacji 30 mikrolitrów każdej próbki i 10 mikrolitrów markera białkowego Na 10 do 20% żelu triglicyny. Zapisywanie pozostałej części każdej próbki.

Elektrolitycznie podajemy żel napięciem 130 woltów, aż przód D znajdzie się w pobliżu dna żelu. Kiedy żel skończy płynąć, usuń żel z odlewu i umieść go w małym plastikowym pudełku z wystarczającą ilością niebieskiej plamy kumasi, aby pokryć plamę z żelu. Żel przez godzinę z delikatnym mieszaniem Po zabarwieniu żelu.

Umyj trzy razy przez 30 minut. W 50 mililitrach roztworu detain zapisz obrazy za pomocą transluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można suszyć między arkuszami celofanu.

W ramce uruchom pozostałą część z każdej próbki i marker białkowy na 10 do 20% żelu Tri glicyny, gdy żel jest uruchomiony. Rozpuść odczynnik szmaragdowy ProQ za pomocą DMF i przygotuj roztwory utrwalające, myjące i utleniające do plamy, postępując zgodnie z instrukcją produktu dołączoną do zestawu. Po zakończeniu elektroforezy usuń żel z odlewu i umieść go w plastikowym pudełku.

Utrwal żel, dodając 100 mililitrów przygotowanego roztworu utrwalonego. Następnego dnia pozostaw żel na noc w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem. Płukać żel 100 mililitrami przygotowanego roztworu myjącego przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym mieszaniem, powtarzając pranie po raz drugi ze świeżym roztworem myjącym.

Następnie utlenić węglowodany, inkubując żel z delikatnym mieszaniem przez 30 minut w 25 mililitrach przygotowanego roztworu utleniającego, a następnie wykonać inkubację z dwoma dodatkowymi płukaniami podczas mycia żelu. Przygotuj świeżą plamę ProQ emerald 300, dodając 500 mikrolitrów roztworu odczynnika ProQ Emerald 300 do 25 mililitrów buforu barwiącego dostarczonego w zestawie. Wybarwić żel przez inkubację w przygotowanej barwie w ciemnych warunkach z delikatnym mieszaniem przez 90 do 120 minut po barwieniu żelem.

Powtórz dwa kroki prania zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie nagraj obrazy za pomocą oświetlacza UV trans o długości fali 300 nanometrów. Na koniec porównaj zdjęcia żelu barwionego kumasi z żelem do szmaragdowych plam ProQ.

Zmiany w migracji białek po deglikozylacji enzymatycznej można zaobserwować, gdy próbka kontrolna jest porównywana z traktowaniem F PGA. W celu usunięcia n glikanów i poddania działaniu mieszaniny deglikozylacji w celu usunięcia glikanów n i O, nie obserwuje się dalszego zmniejszenia wielkości po trawieniu dodatkowym glikozatem. Oprócz zmiany masy, pasma stają się ostrzejsze, gdy glikany są usuwane.

Pasma biegnąca pod markerem 17 kilodaltonów prawdopodobnie reprezentuje w pełni deglikozylanowy polipeptyd beta HCG. Pasy od piątego do siódmego pokazują pasma odpowiadające Glyco. Inne prążki mogą pochodzić z niepełnej deglikozylacji lub z wielu niezidentyfikowanych białek obecnych w próbce HCG beta.

Szmaragdowozielony odczynnik utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału zmniejsza się, ponieważ HCG beta jest enzymatycznie d glikozylowany. Sygnał szczątkowy na pasie trzecim i czwartym wskazuje na obecność motywów glikanowych, które są odporne na zastosowane enzymy.

Dodatkowy glikozat jest używany na czwartym torze. Usuń kilka dodatkowych resztek cukru. Migracja białek jest taka sama, ale można zauważyć niewielkie zmniejszenie intensywności barwienia.

Oporne grupy cukrowe nie były obecne we wszystkich gatunkach białek. Niektóre prążki nie zostały wykryte przez szmaragdową zieleń, co wskazuje, że były one w znacznym stopniu de glikozylowane Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że HCG beta jest niejednorodnie glikozylowany. Dolny pas na drugim pasie jest słaby na szmaragdowozielonym obrazie.

Podczas gdy górne pasmo na drugim pasie jest jasne, co wskazuje, że wiele grup GLYCAN jest nadal obecnych, dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowany HCG beta wyrażany w komórkach myszy zawiera wiele form glikozy ze względu na nieodłączną heterogeniczność glikozylacji. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak: jaki jest wskaźnik obłożenia? Jaki jest zakres glikozylacji lub jaka jest drobna struktura glikanów?

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać glikozylanu do enzymatycznej deglikozylacji i analizy glikanów sprzężonych z NNO. Na glikoproteinach. Wybór metody wykrywania może być trudny, ponieważ regiony barwienia białek są przydatne tylko wtedy, gdy deglikozylacja powoduje znaczne przesunięcie masy cząsteczkowej innych białek.

Zaobserwowaliśmy nieprawidłowe migracje po de glikozylacji i stwierdziliśmy, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało de glikozylowane.