Identyfikacja i charakterystyka glikozylacji białek przy użyciu specyficznych endo- i egzoglikozydaz

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zilustrowanie zastosowania glikozydaz w enzymatycznej deglikozylacji oraz analizie glikozylacji typu N i O na modelowym glikoproteinie. Jest to realizowane poprzez traktowanie glikoproteiny PGA's F lub mieszanką do deglikozylacji białek. Ponadto mieszankę do deglikozylacji białek uzupełniono o zestaw dodatkowych egzoglikozydaz, które czasami pomagają w usunięciu cukrów opornych na standardowe działanie enzymów.

Ilustrujemy tę metodę, wykorzystując modelową glikoproteinę — rekombinowaną ludzką beta-gonadotropinę kosmologiczną (HCG beta) — następnie przeprowadzając elektroforezę SDS-PAGE, a następnie barwienie błękitem Coomassie oraz metodę barwienia specyficznego dla cukrów. W celu analizy glikozylacji wykorzystano Pro Q Emerald 300. Uzyskane wyniki dla próbek HCG beta wykazują, że HCG beta jest heterogennie glikozylowana i zawiera wiele glikoform, co wynika z różnic w migracji białka z traktowaniem glikozydazą i bez niego, a także ze zmniejszenia sygnału w barwieniu ProQ w miarę sukcesywnego usuwania glikanów.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza spektrometrią mas, jest jej prostota, wykorzystanie powszechnego sprzętu laboratoryjnego oraz przydatność dla początkujących glikobiologów. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii, takie jak to, czy dane białko jest glikozylowane. Aby rozpocząć enzymatyczną deglikozylację, należy rozmrozić bufory dostarczone w zestawie do deglikozylacji białek.

Dokładnie wymieszaj zawartość probówek i przechowuj je w temperaturze pokojowej. Umieść fiolki zawierające enzymy na lodzie, rozpuść zawartość fiolki HCG beta w 600 µl wody destylowanej i przechowuj na lodzie. Po przygotowaniu 1 mL buforu one XG seven poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 10 x w wodzie destylowanej, użyj 25 µl do rozcieńczenia 0,5 µl PGA's f.

Przygotować mieszaninę egzoglikozydaz, łącząc po dwa mikrolitry każdego z czterech enzymów egzoglikozydaz. Następnie, do siedmiu ponumerowanych probówek PCR dodać HCG beta oraz 10 x bufor denaturujący glikoproteiny, zgodnie ze wskazówkami w protokole pisemnym; zamknąć probówki i delikatnie wymieszać. Zadenaturować białka w termocyklerze, inkubując przez 10 minut w 94 °C, a następnie zastosować hold w 4 °C. Po wyjęciu probówek z termocyklera odwiruć je, aby usunąć widoczną kondensację. Do każdej probówki z reakcją dodać pozostałe odczynniki zgodnie z protokołem pisemnym. Zamknąć probówki PCR za pomocą nowych zakrętek.

Następnie wymieszaj zawartość probówek, delikatnie stukając w nie cztery razy po odwirowaniu osadu, a następnie umieść probówki w termocyklerze i inkubuj w temperaturze 37 °C przez cztery godziny. Następnie schłodź próbki do 4 °C. W celu przygotowania elektroforezy SDS-PAGE, sporządź świeży 3x redukujący bufor do nakładania próbek SDS.

Do każdej próbki z DTT należy dodać 12,5 µL przygotowanego trzykrotnego redukującego buforu do ładowania SDS, zamknąć probówki nowymi nakrętkami i delikatnie nimi opukać, aby wymieszać zawartość. Probówki inkubować w termocyklerze w temperaturze 94 °C przez pięć minut, a następnie schłodzić do 4 °C. Po inkubacji nanieść 30 µL każdej próbki oraz 10 µL markera białkowego na żel tri-glicynowy o stężeniu 10-20%. Pozostałą część każdej próbki należy zachować.

Prowadź elektroforezę żelu przy napięciu 130 V, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w małym plastikowym pojemniku z wystarczającą ilością barwnika Coomassie Blue, aby całkowicie go przykryć. Barw żel przez jedną godzinę przy łagodnym mieszaniu.

Przemyć trzykrotnie przez 30 minut. W 50 mililitrach roztworu odbarwiającego zarejestrować obrazy, korzystając z transluminatora światła białego lub skanera. Alternatywnie żel można wysuszyć pomiędzy arkuszami celofanu.

W jednej ramce przeprowadź elektroforezę pozostałości z każdej próbki oraz markera białek na żelu Tri-glicynowym o stężeniu od 10 do 20%, podczas gdy żel jest w toku. Rozpuść odczynnik ProQ Emerald w DMF i przygotuj roztwór utrwalający, płuczący oraz utleniający do barwienia zgodnie z instrukcją produktu dołączoną do zestawu. Po zakończeniu elektroforezy wyjmij żel z formy i umieść go w plastikowym pudełku.

Utrwal żel, dodając 100 milliliters przygotowanego roztworu utrwalającego. Pozostaw żel na noc w temperaturze pokojowej, a następnego dnia poddaj go łagodnemu mieszaniu. Przemyj żel 100 milliliters przygotowanego roztworu płuczącego przez 10 do 20 minut w temperaturze pokojowej przy łagodnym mieszaniu, powtarzając proces płukania drugi raz ze świeżym roztworem płuczącym.

Następnie utlenij węglowodany, inkubując żel przy delikatnym mieszaniu przez 30 minut w 25 mililitrach przygotowanego roztworu utleniającego, a po inkubacji wykonaj dwa dodatkowe płukania żelu. Przygotuj świeży barwnik ProQ Emerald 300, dodając 500 mikrolitrów roztworu odczynnika ProQ Emerald 300 do 25 mililitrów buforu do barwienia dołączonego do zestawu. Zabarw żel, inkubując go w przygotowanym barwniku w ciemności przy delikatnym mieszaniu przez 90 do 120 minut po etapie barwienia żelu.

Powtórz dwa etapy płukania zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie zarejestruj obrazy przy użyciu transiluminatora UV przy 300 nanometrach. W ostatnim kroku porównaj obrazy żelu barwionego kumasy z obrazami żelu barwionego ProQ emerald.

Zmiany w migracji białka po enzymatycznej deglikozylowaniu są widoczne podczas porównania próbki kontrolnej z próbką poddaną działaniu PGA's F. W celu usunięcia glikanów typu n zastosowano mieszaninę do deglikozylowania w celu usunięcia glikanów typu n i O; po trawieniu dodatkową glikozydazą nie zaobserwowano dalszego zmniejszenia rozmiaru. Oprócz zmiany masy, pasma stają się wyraźniejsze w miarę usuwania glikanów.

Prążek znajdujący się poniżej markera 17 kilodalton prawdopodobnie reprezentuje całkowicie deglikozylowany polipeptyd beta HCG. Ścieżki od piątej do siódmej pokazują prążki odpowiadające Glyco. Pozostałe prążki mogą wynikać z niepełnej deglikozylacji lub z obecności wielu niezidentyfikowanych białek w próbce beta HCG.

Odczynnik szmaragdowej zieleni utlenia i barwi wszystkie glikany obecne w cząsteczce białka. W związku z tym intensywność sygnału maleje w miarę enzymatycznej deglikozylacji HCG beta. Sygnał szczątkowy w ścieżkach trzeciej i czwartej wskazuje na obecność motywów glikanowych, które są odporne na zastosowane enzymy.

Dodatkowy glikozylo aparat jest użyty w ścieżce czwartej. Usunięto kilka dodatkowych reszt cukrowych. Migracja białka jest taka sama, lecz widoczny jest niewielki spadek intensywności barwienia.

Odporne grupy cukrowe nie występowały we wszystkich gatunkach białek. Niektóre prążki nie zostały wykryte przez barwnik Emerald Green, co wskazuje na ich rozległą deglikozylację. Dodatkowe dane potwierdzają wniosek, że HCG beta jest heterogennie glikozylowane. Dolny prążek w ścieżce drugiej jest słabo widoczny na obrazie z barwieniem Emerald Green.

Chociaż górny prążek w ścieżce drugiej jest jasny, co wskazuje na obecność wielu grup GLYCAN, dane te potwierdzają wniosek, że rekombinowane HCG beta wyrażane w komórkach mysich zawiera wiele glikoform ze względu na immanentną heterogeniczność glikozylacji. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak spektrometria mas, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. jaki jest stopień zajętości, jaki jest zakres glikozylacji lub jaka jest struktura subtelna glikanów?

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania preparatu glycosylate do enzymatycznej deglikozylacji i analizy glikanów typu N-linked w glikoproteinach. Wybór metody detekcji może być trudny, ponieważ barwienie białek jest użyteczne tylko wtedy, gdy deglikozylacja prowadzi do znaczącej zmiany masy cząsteczkowej białek.

Zaobserwowaliśmy nieprawidłowe migracje po deglikozylacji i stwierdziliśmy, że każda zmiana w migracji jest dowodem na to, że białko zostało deglikozylowane.