Name: Obrazowanie synapsy wirusologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 i sygnalizacji na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania synapsy wirusologicznej HIV-1 za pomocą mikroskopii TIRF na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych. Technika ta umożliwia wizualizację molekuł sygnałowych i białek LCK w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów NIH AI071815 (C.E.H.) oraz z funduszy przyznanych przez Roadmap Nanomedicine Development Center PN2EY016586 (M.L.D.).

<ol><li>Bastiani, L., Laal, S., Kim, M., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+cell-dependent+alterations+in+envelope+components+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+virions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host cell-dependent alterations in envelope components of human immunodeficiency virus type 1 virions.</a> J. Virol. 71, 3444-3450 (1997).</li>
<li>Dimitrov, D. S., Willey, R. L., Sato, H., Chang, L. J., Blumenthal, R., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of human immunodeficiency virus type 1 infection kinetics.</a> J. Virol. 67, 2182-2190 (1993).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Bond+Dynamics+in+Contacts+between+T+Lymphocytes+and+Glass-supported+Planar+Bilayers+Reconstituted+with+the+Immunoglobulin-related+Adhesion+Molecule+CD58%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Adhesive Bond Dynamics in Contacts between T Lymphocytes and Glass-supported Planar Bilayers Reconstituted with the Immunoglobulin-related Adhesion Molecule CD58.</a> J. Biol. Chem. 272, 15782-15788 (1997).</li>
<li>Fortin, J. F., Cantin, R., Lamontagne, G., Tremblay, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-derived+ICAM-1+glycoproteins+incorporated+on+human+immunodeficiency+virus+type+1+are+biologically+active+and+enhance+viral+infectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Host-derived ICAM-1 glycoproteins incorporated on human immunodeficiency virus type 1 are biologically active and enhance viral infectivity.</a> J. Virol. 71, 3588-3596 (1997).</li>
<li>Frank, I., Stoiber, H., Godar, S., Stockinger, H., Steindl, F., Katinger, H. W., Dierich, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+of+host+cell-surface-derived+molecules+by+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Acquisition of host cell-surface-derived molecules by HIV-1.</a> Aids. 10, 1611-1620 (1996).</li>
<li>Hioe, C. E., Bastiani, L., Hildreth, J. E., Zolla-Pazner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cellular+adhesion+molecules+in+HIV+type+1+infection+and+their+impact+on+virus+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Res.+Hum.+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Role of cellular adhesion molecules in HIV type 1 infection and their impact on virus neutralization.</a> AIDS Res. Hum. Retroviruses. 14, Suppl 3. S247-S254 (1998).</li>
<li>Hioe, C. E., Chien, P. C., Lu, C., Springer, T. A., Wang, X. H., Bandres, J., Tuen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1+expression+on+target+cells+promotes+human+immunodeficiency+virus+type+1+infection+and+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">LFA-1 expression on target cells promotes human immunodeficiency virus type 1 infection and transmission.</a> J. Virol. 75, 1077-1082 (2001).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J. Exp. Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Jolly, C., Mitar, I., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+an+intact+T-cell+actin+and+tubulin+cytoskeleton+for+efficient+assembly+and+spread+of+human+immunodeficiency+virus+type+1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Requirement for an intact T-cell actin and tubulin cytoskeleton for efficient assembly and spread of human immunodeficiency virus type 1.</a> J. Virol. 81, 5547-5560 (2007).</li>
<li>McDonald, D., Wu, L., Bohks, S. M., KewalRamani, V. N., Unutmaz, D., Hope, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIV+and+its+receptors+to+dendritic+cell-T+cell+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions.</a> Science. 300, 1295-1297 (2003).</li>
<li>Pearce-Pratt, R., Malamud, D., Phillips, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+cytoskeleton+in+cell-to-cell+transmission+of+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Role of the cytoskeleton in cell-to-cell transmission of human immunodeficiency virus.</a> J. Virol. , 682898-682905 (1994).</li>
<li>Rasband, W. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRasband%2C+WS+%22ImageJ%22">ImageJ</a>. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. (1997).</li>
<li>Rizzuto, C. D., Sodroski, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+virion+ICAM-1+to+human+immunodeficiency+virus+infectivity+and+sensitivity+to+neutralization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Contribution of virion ICAM-1 to human immunodeficiency virus infectivity and sensitivity to neutralization.</a> J. Virol. 71, 4847-4851 (1997).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Cho, M. W., Hioe, C. E., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120-induced+partial+T-cell+receptor+signaling+creates+an+F-actin-depleted+zone+in+the+virological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120-induced partial T-cell receptor signaling creates an F-actin-depleted zone in the virological synapse.</a> J. Virol. 83, 11341-11355 (2009).</li>
<li>Vasiliver-Shamis, G., Tuen, M., Wu, T., Starr, T., Cameron, T., Thomson, R., Kaur, G., Liu, J., Visciano, M., Li, H., Kumar, R., Ansari, R., Han, D., Cho, M., Dustin, M. L., Hioe, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1+envelope+gp120+induces+a+stop+signal+and+virological+synapse+formation+in+noninfected+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1 envelope gp120 induces a stop signal and virological synapse formation in noninfected CD4+ T cells.</a> J. Virol. 82, 9445-9457 (2008).</li>
<li>Zhu, P., Liu, J., Bess, J., Chertova, E., Lifson, J., Grise, H., Ofek, G., Taylor, K., Roux, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+three-dimensional+structure+of+AIDS+virus+envelope+spikes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distribution and three-dimensional structure of AIDS virus envelope spikes.</a> Nature. 441, 847-852 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Poprzednie badania pozwoliły na wizualizację VS w systemie koniugatów komórka-komórka; jednak badania te nie dostarczyły obrazów o wystarczająco wysokiej rozdzielczości, aby zwizualizować struktury supramolekularne w synapsie. W naszym laboratorium wykorzystaliśmy system płaskich dwuwarstw lipidowych na podłożu szklanym do reprezentacji powierzchni zainfekowanych komórek wykazujących ekspresję białka otoczki wirusa gp120 oraz cząsteczki adhezyjnej komórki ICAM-1. Dzięki zastosowaniu mikroskopii TIRF, która wykrywa sygnały fluorescencyjne w odległości 100-200 nm od powierzchni dwuwarstwy z wysokim stosunkiem sygnału do szumu, byliśmy w stanie wykryć supramolekularną segregację gp120 od ICAM-1 w obrębie VS. Ponadto standardowa metoda immunobarwienia może być zastosowana w systemie dwuwarstwowym i została tutaj wykorzystana do wykrycia i ilościowego oznaczenia specyficznej rekrutacji aktywnego białka Lck, ale nie Fyn, do obszaru kontaktu z gp120 w VS 15. Zatem płaska dwuwarstwa stanowi system eksperymentalny do obrazowania interfejsu synaptycznego w wysokiej rozdzielczości w płaszczyźnie 2D za pomocą mikroskopii TIRF, a także metod oświetlenia szerokopolowego lub konfokalnego. System ten posiada jednak ograniczenia, ponieważ płaskie dwuwarstwy nie oddają regulacji mobilności ligandów, zgięć poza płaszczyzną oraz fluktuacji błon biologicznych. Ponadto jest to system in-vitro, co wiąże się z innymi ograniczeniami, takimi jak brak pozostałych cząsteczek błonowych, które występowałyby w zainfekowanej komórce, oraz brak aparatu cytoszkieletowego regulującego mobilność molekularną i ruchliwość komórkową. Również dynamika i rozmieszczenie cząsteczek, takich jak trimery w przeciwieństwie do monomerów gp120, mogą nie być reprezentowane na dwuwarstwie w sposób fizjologiczny. Niemniej jednak, mimo tych ograniczeń, system ten jest nadal bardzo wartościowy w badaniu oddziaływań wirus-komórka lub komórka-komórka, a opisane metody mogą służyć jako przydatny przewodnik dla badaczy poszukujących obrazów o wysokiej rozdzielczości w celu wykrycia organizacji supramolekularnej, która nie jest dostrzegalna w konwencjonalnym systemie koniugatów komórka-komórka.

<table><tbody><tr><td>HIV gp120 z tagiem His</td><td>Prezent od dr Cho</td><td></td><td>DH12</td></tr><tr><td>HIV gp120 z oczkiem His</td><td>Technologia immunologiczna</td><td></td><td>Różne tropizmy X4 lub R5</td></tr><tr><td>HSA (albumina ludzka)</td><td>Williams Medical Company</td><td>521302</td><td>Albumina ludzka 25%</td></tr><tr><td>Wirówki odśrodkowe Amicon Ultra</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC803024</td><td>Ultracel-30K</td></tr><tr><td>przeciwciało królika mAb przeciwko Lck</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>2787</td><td></td></tr><tr><td>p-Lck królicze pAb</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-101728</td><td>Tyr 394</td></tr><tr><td>przeciwciało królika mAb przeciwko Fyn</td><td>EMD Millipore</td><td>04-353</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 2&amp;#x00B0; Ab</td><td>Sondy molekularne, Life Technologies</td><td>A11034</td><td>przeciwciało kozie przeciwko IgG królika (H+L)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A-20000</td><td>estrym sukkunimidylowym kwasu karboksylowego </td></tr><tr><td>Komora FCS2</td><td>Bioptechs</td><td>060319-2-03</td><td></td></tr><tr><td>Przesuwnik mikroakweduktu</td><td>Bioptechs</td><td>130119-5</td><td></td></tr><tr><td>Okrągły 30 mm z otworami</td><td>Bioptechs</td><td>1907-08-750</td><td>o grubości 0,75 mm</td></tr><tr><td> Uszczelka prostokątna</td><td>Bioptechs</td><td>1907-1422-250</td><td>14x24 o grubości 0,25 mm</td></tr><tr><td>Przewody Tygon</td><td>Bioptechs</td><td>20202275</td><td>1/16&quot; (25 stóp)</td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny</td><td>Bio-Rad</td><td>7328103</td><td></td></tr><tr><td>Kurek trójdrożny</td><td>Bio-Rad</td><td>7328102</td><td></td></tr><tr><td>Przesuwnik przylepny I &lt;sup&gt;0.2&lt;/sup&gt; Luer</td><td>Ibidi</td><td>80168</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>DOGS-NTA</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>790404C</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipid, Inc</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Kapturek szklany</td><td>Bioptechs</td><td>40-1313-0319</td><td>40 mm</td></tr><tr><td>Mikroskop TIRF</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki hiv-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Imaging of HIV-1 Envelope-induced Virological Synapse and Signaling on Synthetic Lipid Bilayers

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) zachodzi najefektywniej poprzez transmisję z komórki do komórki2,10,11. Ten transfer z komórki do komórki pomiędzy limfocytami T CD4+ wiąże się z tworzeniem synapsy wirogicznej (VS), która jest zależnym od F-aktyny połączeniem międzykomórkowym, powstającym w wyniku oddziaływania białka otoczki gp120 HIV-1 na zainfekowanej komórce z cząsteczką CD4 oraz receptorem chemokin (CKR) CCR5 lub CXCR4 na komórce docelowej 8. Oprócz gp120 i jego receptorów, istotną rolę w tworzeniu VS i transmisji wirusa odgrywają inne białka błonowe, w szczególności cząsteczka adhezyjna LFA-1 i jej ligandy z rodziny ICAM, ponieważ występują one na powierzchni zainfekowanych wirusem komórek dawców i komórek docelowych, a także na otoczce wirionów HIV-11,4,5,6,7,13. Tworzeniu VS towarzyszą również wewnątrzkomórkowe zdarzenia sygnalizacyjne, które są indukowane w wyniku wiązania gp120 z jego receptorami. Rzeczywiście, wykazaliśmy niedawno, że interakcja limfocytów T CD4+ z gp120 indukuje rekrutację i fosforylację cząsteczek sygnałowych związanych z sygnalosomem TCR, w tym Lck, CD3ζ, ZAP70, LAT, SLP-76, Itk i PLCγ15.
W niniejszym artykule przedstawiamy metodę wizualizacji nadorganizacji supramolekularnej oraz zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących w pobliżu błony podczas formowania się VS. Wykorzystujemy system planarnej dwuwarstwy lipidowej na podłożu szklanym jako redukcjonistyczny model reprezentujący powierzchnię zainfekowanych HIV komórek, zawierającą wirusową kopertę gp120 oraz cząsteczkę adhezyjną komórki ICAM-1. Protokół opisuje ogólne procedury monitorowania montażu VS indukowanego przez HIV-1 gp120 oraz zdarzeń aktywacji sygnałowej, które obejmują: i) przygotowanie i montaż dwuwarstwy w komorze przepływowej, ii) wtryskiwanie komórek i barwienie immunofluorescencyjne w celu wykrycia wewnątrzkomórkowych cząsteczek sygnalizacyjnych w komórkach oddziałujących z HIV-1 gp120 i ICAM-1 na dwuwarstwach, iii) akwizycję obrazów za pomocą mikroskopii TIRF oraz iv) analizę danych. System ten pozwala na generowanie obrazów interfejsu VS o wysokiej rozdzielczości, przewyższającej tę uzyskiwaną w konwencjonalnym systemie komórka-komórka, ponieważ umożliwia wykrycie odrębnych klastrów pojedynczych komponentów molekularnych VS wraz ze specyficznymi cząsteczkami sygnalizacyjnymi rekrutowanymi do tych subdomen.

Niniejszy artykuł opisuje metodę wizualizacji tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 na płaskich dwuwarstwach wspieranych szkłem za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF). Metodę tę można również połączyć z barwieniem immunofluorescencyjnym w celu wykrycia aktywacji i redystrybucji cząsteczek sygnałowych, które zachodzą podczas tworzenia synapsy wirologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności typu 1 (HIV-1) zachodzi najskuteczniej poprzez transmisję z komórki do komórki2,10,11. Ten transfer z komórki do komórki pomiędzy ...

Metoda ta pozwala na tworzenie lipidowych dwuwarstw naśladujących powierzchnię zainfekowanej komórki. Aby zbadać synapsę wirusologiczną HIV tworzoną z pierwotnymi ludzkimi limfocytami T CD4, należy najpierw znakować interesujące białka barwnikami fluorescencyjnymi, następnie utworzyć dwuwarstwy lipidowe i pozwolić komórkom na utworzenie synaps, a następnie utrwalić i barwić komórki przeciwciałami fluorescencyjnymi w celu wizualizacji cząsteczek sygnałowych. Następnie, wykorzystując mikroskopię fluorescencyjną z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF), należy uzyskać obrazy cząsteczek sygnałowych w obrębie tworzących synapsę komórek.Przeanalizuj obrazy turf, aby określić lokalizację aktywnych cząsteczek sygnałowych w odniesieniu do struktury synapsy wirologicznej. To podejście eksperymentalne może wskazać, czy białka komórkowe, takie jak limfocytarna swoista kinaza białkowa LCK, są rekrutowane do synapsy wirologicznej HIV. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu wirologii i immunologii HIV, takie jak to, które komponenty komórkowe biorą udział w synapsie wirologicznej.Jaka jest rola w formowaniu synaps i w jaki sposób może ona wpływać na transfer HIV z komórki do komórki. Ten system bier zapewnia widok końcowy synapsy z zaletą wizualizacji synapsy w wysokiej rozdzielczości przestrzennej w jednej płaszczyźnie. Wyniki wyraźnie obrazują strukturę synaptyczną; formowanie bier i montaż celi przepływowej to kinter, swoista forma sztuki.W niniejszym materiale prezentujemy przygotowanie bilaru w bio-optycznej komorze przepływowej do badań z wykorzystaniem wirusów zakaźnych lub zainfekowanych komórek, a także w sytuacjach, gdy ze względu na ograniczoną ilość odczynników konieczne jest użycie niewielkich objętości. Jednorazowe komory przepływowe OB mogą być wykorzystywane w tej samej procedurze przygotowania bilaru. Michael Kramer oraz ja zaprezentujemy procedurę znakowania białek.Należy wybrać barwniki fluorescencyjne, takie jak LOR 4 88, które skutecznie wiążą się z białkami, są wystarczająco fotostabilne do obrazowania mikroskopowego i odpowiadają długościom fal wzbudzenia laserów dostępnych w urządzeniu mikroskopowym. Należy rozpocząć od oczyszczonego białka GP one 20 DH 12 z tagiem His. Wymień bufor białkowy na sterylny PBS, używając wirówkowej jednostki filtrującej o progu odcięcia masy cząsteczkowej 50 kilodaltons.Następnie należy sprawdzić pH i dodać wodorowęglan sodu o pH 9,0, aby uzyskać końcowe stężenie wodorowęglanu sodu wynoszące 50 millimolar i pH wynoszące około 8,5. Następnie należy dodać fluorescencyjny barwnik LOR 4 88 z nadmiarem dziesięciokrotnym w stosunku molowym. Mieszaninę tę należy inkubować w ciemności od 45 minut do jednej godziny.Następnie usuń nadmiar barwnika za pomocą jednostki filtracji odśrodkowej. Dodaj świeży sterylny PBS do kolumny i kontynuuj przemywanie białka w celu usunięcia wolnego barwnika. Następnie zagęść białko GP one 20 do stężenia około 1 mg/mL.Zmierz stężenie barwnika fluorescencyjnego przy 488 nanometrach. Wyznacz również stężenie białka za pomocą spektrofotometru NanoDrop, korzystając z ustawienia dla białek i znaczników.Podziel dwie liczby, aby wyznaczyć intensywność fluorescencji na jedną cząsteczkę białka. Przygotuj roztwór piraniny, składający się z 45 mililitrów kwasu siarkowego i 15 mililitrów 30% nadtlenku wodoru, używając plastikowych zacisków. Zanurz szkiełka nakrywki na 15 minut.Przenieś szkiełka przykrywowe do zlewki wypełnionej wodą oczyszczoną z systemu PIKA. Płucz każde szkiełko pod bieżącą wodą przez dwie minuty (po minucie na każdą stronę), a następnie umieść na statywie do wyschnięcia. Przystąp do montażu dwóch komór optycznych F CS zgodnie z opisem Varony i wspólników z 2008 roku. Następnie przechwyć i zaprezentuj hiss GP one 20 na powierzchni dwuwarstwowej, nie dotykając końcówką szkła.Nanieś pipetą pięć kropli po 1 µL mieszaniny liposomów na szkiełko z mikrokanalikami, aby przygotować pięć dwuwarstw na każdą komorę przepływową. Następnie umieść na lipidach szkiełko podstawowe. Na koniec zabezpiecz biały pierścień mocujący za pomocą podstawy zacisku ze stali nierdzewnej.Odwróć cały aparat i uszczelnij go. Następnie zaznacz położenie dwuwarstw i inkubuj przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie podłącz rurkę z dwudrożnym kurkiem do lewej rurki perfuzyjnej.Napełnij dren podłączony do trójdrożnego kurka odcinającego 1% albuminą surowicy ludzkiej w roztworze soli buforowanej HEPS i upewnij się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza. Następnie podłącz ten dren do prawej rurki perfuzyjnej i wytwórz dodatni menisk. Delikatnie przepchnij bufor przez celę przepływową, aby zablokować dwuwarstwę.Przymocuj strzykawkę o pojemności 1 ml zawierającą 300 µL 100 µM chlorku niklu ENC casein do trójdrożnego zaworu, delikatnie przepchnij bufor, a następnie zamknij oba zawory przed odłączeniem. Strzykawkę inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej.Następnie należy załadować 250 cząsteczek LOR 4 88 znakowanego GP120 z tagiem His w zagęszczeniu 20 na mikron, aby odwzorować lokalną gęstość klastrów end znalezionych na powierzchni HIV V1. Inkubować przez 30 minut w ciemności w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć warstwowo 5 mL buforu H-B-S-H-S-A. Przystąpić do wyrównania temperatury w komorze przepływowej do 37 °C.Używając strzykawki o pojemności 1 ml, dodać aktywowane ludzkie limfocyty T CD4+ w 400 µL 1% roztworu albuminy surowicy ludzkiej i inkubować przez 45 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C, aby umożliwić przyleganie komórek do warstw lipidowych. Następnie, w celu utrwalenia komórek, wstrzyknąć 2% paraldehyd i inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Przemyć trzy razy 1 ml roztworu.Następnie przepłukać PBS, a potem przeprowadzić permeabilizację komórek, dodając 0,1% Triton X 100 na pięć minut w temperaturze pokojowej, po uprzednim trzykrotnym przemyciu 1 mL PBS. Zablokować kazeiną zawierającą 5% surowicy koziej przez 25 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć trzykrotnie PBS. Następnie dodać przeciwciało pierwszorzędowe i 300 µL buforu na komórkę przepływową na okres od 20 minut do jednej godziny.W temperaturze pokojowej, po trzykrotnych płukaniach w PBS, dodać odpowiednie przeciwciało wtórne znakowane fluorescencyjnie w buforze. W doświadczeniu próbkę kontrolną warstwy traktuje się wyłącznie przeciwciałem wtórnym, aby określić poziom niespecyficznego sygnału pochodzącego z tego odczynnika. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie płukać trzykrotnie jednym mililitrem.Należy pozyskać obrazy wszystkich próbek w PBS za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Następnie należy przeprowadzić analizę ilościową obrazów przy użyciu pakietu aplikacji do analizy obrazu, takiego jak ImageJ, korzystając z karty Analyze Set Measurements.Zaznacz pola dotyczące powierzchni (area) i średniej wartości szarości (mean gray value). Wybierz na obrazie obszar zainteresowania w formie wielokąta lub zamkniętego kształtu wyrysowanego odręcznie. Następnie wybierz zakładkę pomiarów analizy (analyze measure), aby oprogramowanie zarejestrowało dane z tego pomiaru.W tabeli wyników ustaw pomiary na średnią (mean) i powierzchnię (area), a następnie otwórz obrazy dla jednego warunku eksperymentalnego dla każdego śladu komórki; zmierz obszar zainteresowania (ROI) oraz ślad, a także zmierz obszar tła dla każdego warunku eksperymentalnego. Skopiuj pomiary i wklej je do programu Excel. Po zebraniu wszystkich danych oblicz średnią intensywność w jednostkach arbitralnych.Odejmij intensywność tła od wartości średniej, a następnie pomnóż przez powierzchnię, aby uzyskać zintegrowaną intensywność białka w jednostkach dowolnych w celu pomiaru aktywacji i rekrutacji początkowych cząsteczek sygnałowych położonych blisko błony. W wyniku interakcji z GP120 w synapsie wirogicznej ludzkie pierwotne limfocyty T CD4+ zostały naniesione na dwuwarstwy zawierające GP120 i ICAM-1; komórki naniesione na dwuwarstwy zawierające tylko ICAM-1 posłużyły jako kontrola do określenia podstawowych poziomów sygnalizacji. Po interakcji komórek z dwuwarstwami zawierającymi GP120 i ICAM-1 białko LCK zostało zrekrutowane do interfejsu synapsy wirogicznej i skolosalizowało się z GP120.Średnia intensywność całkowitego LCK była wyższa w warstwie lipidowej zawierającej zarówno GP one 20 i ICAM one, niż w warstwie zawierającej samo ICAM one. Co ciekawe, zintegrowane poziomy intensywności były podobne. Podsumowując.Dane te sugerują, że LCK ulega redystrybucji do centralnego klastra po związaniu limfocytów T CD4+ z GP120. Tutaj zobrazowano i określono ilościowo średnie oraz zintegrowane intensywności fosfo-LCK tyrozyna 394 wykryte za pomocą mikroskopii TURF.Wyniki wskazują, że wiązanie GP120 zwiększyło fosforylację reszty tyrozyny 394 w pętli aktywacyjnej LCK. Z kolei w obszarze kontaktu komórek na samych dwuwarstwach ICAM1 obecnych było więcej fin niż na dwuwarstwach zawierających zarówno GP120, jak i ICAM1. Zatem Finn nie został zrekrutowany do synapsy wirologicznej.W związku z powyższym wyciągamy wniosek, że aktywną kinazą w synapsie wirusologicznej indukowanej przez HIV-1 gp120 jest LCK, a nie Fyn. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotowywać biwarstwy obciążone specyficznymi białkami, przeprowadzać barwienie immunofluorescencyjne w komorze przepływowej, obrazować interakcje biwarstwowe za pomocą mikroskopii odbicia całkowitego oraz wykonywać podstawową analizę. System biwarstwowy jest również użyteczny w obrazowaniu żywych komórek, co pozwala na monitorowanie dynamiki formowania się synaps wirusologicznych.Ponadto komórki można transfekować białkami znakowanymi fluorescencyjnie, takimi jak GFP Z 70. Umożliwia to śledzenie w czasie rzeczywistym zmian w dystrybucji i rekrutacji cząsteczek sygnałowych do synapsy.

imaging-hiv-1-envelope-induced-virological-synapse-signaling-on

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie synapsy wirusologicznej indukowanej przez otoczkę HIV-1 i sygnalizacji na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.<br...

Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Protokół opisuje wysokoprzepustowe podejście do wyznaczania struktur białek błonowych z wykorzystaniem krio-tomografii elektronowej oraz trójwymiarowego przetwarzania obrazów. Obejmuje on szczegóły przygotowania preparatów, gromadzenia danych, ich przetwarzania i interpretacji, a kończy się opracowaniem reprezentatywnego celu dla tej metody, jakim jest glikoproteina otoczki HIV-1. Procedury obliczeniowe zostały zaprojektowane w sposób umożliwiający badaczom i studentom pracę zdalną oraz wkład w...

Wyznaczanie struktur molekularnych glikoprotein otoczki HIV z wykorzystaniem krioelektronowej tomografii i zautomatyzowanego uśredniania subtomogramów

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Ten film demonstruje technikę wizualizacji powstawania synapsy immunologicznej w komórkach NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej (SLB). SLB jest najpierw znakowany ligandem receptora aktywującego komórki NK znakowanym fluoroforem, a następnie inkubacją z komórkami NK. Następnie komórki są barwione pod kątem spolimeryzowanych granulek litycznych aktyny i perforyno-dodatniej. Takie podejście umożliwia wizualizację powstawania synaps za pomocą mikroskopii wymuszonego zubożenia emisji (STED).

Obrazowanie w superrozdzielczości tworzenia synaps immunologicznych komórek NK na podpartej dwuwarstwie lipidowej

Ten film demonstruje technikę in vitro do badania tworzenia synaps immunologicznych między pierwotnymi ludzkimi limfocytami T a wspieranymi dwuwarstwami lipidowymi (SLB). Białka powierzchniowe limfocytów T oddziałują z odpowiednimi ligandami unieruchomionymi na SLB, tworząc synapsę immunologiczną, po której następuje ruch granulek litycznych w kierunku synapsy, co jest wizualizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Technika in vitro do badania interakcji limfocytów T z obsługiwanymi płaskimi dwuwarstwami lipidowymi

Ten film demonstruje obrazowanie na żywych komórkach topologii synaps immunologicznych, badając interakcje między limfocytami T a komórkami nabłonkowymi przenoszącymi antygeny fluorescencyjne. Mikroskopia fluorescencyjna ujawnia przemieszczenie czerwonej cytoplazmy i żółte pierścienie błonowe w komórkach śródbłonka, co wskazuje na tworzenie się synaps immunologicznych.

Ocena topologii synaps immunologicznych za pomocą obrazowania żywych komórek

Zrozumienie konformacji antygenów powierzchniowych wirusa jest niezbędne do oceny neutralizacji przeciwciał i kierowania projektem skutecznych immunogenów szczepionkowych. W tym miejscu opisujemy komórkowy test ELISA, który umożliwia badanie rozpoznawania trimerycznego HIV-1 Env ulegającego ekspresji na powierzchni transfekowanych komórek przez specyficzne przeciwciała anty-Env.

Ocena konformacyjna glikoprotein otoczki trymerowej HIV-1 przy użyciu komórkowego testu ELISA

Opisujemy tutaj połączenie techniki tworzenia synaps immunologicznych z wykorzystaniem dwuwarstwowego lipidu na wspartym szkłem z techniką obrazowania w superrozdzielczości mikroskopii STED (Stimulated emission depletion). Celem tego protokołu jest dostarczenie użytkownikom instrukcji niezbędnych do pomyślnego przeprowadzenia tych dwóch technik.

Obrazowanie w superrozdzielczości synapsy immunologicznej komórek NK na płaskiej dwuwarstwie lipidowej na podłożu szklanym

Odporność adaptacyjna jest kontrolowana przez dynamiczne 'synapsy immunologiczne' utworzone między limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Protokół ten opisuje metody badania komórek śródbłonka zarówno jako niedostatecznie zbadane fizjologiczne APC, jak i jako nowy typ "płaskiego komórkowego modelu APC".

Model płaskiej komórki śródbłonka do obrazowania dynamiki synaps immunologicznych

Ilustrujemy tutaj test wiązania błon in vitro, w którym interakcje między HIV-1 Gag a błonami lipidowymi są wizualnie analizowane za pomocą znakowanego YFP Gag syntetyzowanego w systemie translacji in vitro opartym na kiełkach pszenicy i GUV przygotowanych techniką elektroformacji.

Wizualizacja wiązania knebla HIV-1 z błonami gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych (GUV)

Ten protokół obrazuje zarówno powstawanie synaps immunologicznych, jak i późniejszy spolaryzowany ruch wydzielniczy w kierunku synapsy immunologicznej. Koniugaty komórkowe utworzono między komórką Raji impulsową superantygenem (działającą jako komórka prezentująca antygen) a klonem Jurkat (działającym jako limfocyt T wspomagający efektor).

Obrazowanie ludzkiej synapsy immunologicznej

Poznaj metodę obrazowania synapsy wirusologicznej HIV-1 za pomocą mikroskopii TIRF na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych. Technika ta umożliwia wizualizację molekuł sygnałowych i białek LCK w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie synapsy wirologicznej i sygnalizacji indukowanej przez białko otoczki HIV-1 na syntetycznych dwuwarstwach lipidowych

Przeglądaj więcej filmów