Name: Kohodowla komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek trzustkowych wytwarzających insulinę w podejściu ukierunkowanym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Poznaj wieloetapową różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w komórki trzustkowe wytwarzające insulinę przy użyciu kohodowli z komórkami śródbłonka. Ta metoda zwiększa wydajność i dojrzewanie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy za wsparcie finansowe z ramienia NIH New Innovator Award DP2 116520 oraz ORAU Ralph Powe Junior Faculty Enhancement Award.

1. Hodowla komórek
<ol>
 <li>Komórki hESC H1 (WiCell) hodowano w studzienkach powlekanych Matrigelem kwalifikowanym dla hESC w pożywce mTeSR1, z codzienną wymianą pożywki. Studzienki powlekano rozcieńczonym roztworem Matrigelu, przygotowanym poprzez dodanie 300 μl Matrigelu dla hESC do 25 ml DMEM:F12. Do każdej studzienki płytki 6-studzienkowej dodawano 1 ml tego roztworu Matrigelu, lub 400 μl do każdej studzienki płytki 12-studzienkowej, po czym pozostawiano do powlekania przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Komórki pasażowano mechanicznie w stosunku rozdzielenia 1:4 poprzez zeskrobywanie kolonii, gdy osiągnęły średnicę od 1 do 1,5 mm.</li>
 <li>Komórki RHMVEC (VEC technologies) hodowano w pożywce MCDB-131 z wymianą pożywki co drugi dzień. Komórki rozdzielano poprzez trypsynizację w stosunku 1:3 po osiągnięciu 80% konfluencji. Do niniejszego badania wykorzystano komórki śródbłonka z pasażów od 3 do 7.</li>
</ol>
2. Przygotowanie roztworów zapasowych
<ol>
 <li>Aktywina A została zrekonstytuowana w stężeniu 50 μg/mL w sterylnym PBS zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej. Roztwór podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>EGF został zrekonstytuowany w stężeniu 500 μg/mL w sterylnym 10 mM kwasie octowym. Roztwór podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Insulinę zrekonstytuowano w stężeniu 10 mg/ml poprzez dodanie zakwaszonej wody H2O (pH ≤2), przygotowanej przez dodanie 0,1 ml lodowatego kwasu octowego do 10 ml wody.</li>
 <li>DAPT zrekonstytuowano w DMSO w stężeniu 18 mg/ml. Następnie rozcieńczono go do stężenia 300 μM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>KAAD-cyklopamina została zrekonstytuowana w DMSO w stężeniu 5mg/ml. Następnie rozcieńczono ją do stężenia 2 μM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>Kwas retinowy all-trans zrekonstytuowano w stężeniu 2,7 mg/ml w 95% etanolu. Następnie rozcieńczono go do stężenia 2mM w DMEM:F12, podzielono na aliquoty i przechowywano w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Indukcja ostatecznej endodermy (DE) i progenitorów trzustki (PP)
<ol>
 <li>Gdy kolonie hESC osiągnęły średnicę od 1 do 1,5 mm, przeprowadzono indukcję DE poprzez dodanie DMEM:F12 uzupełnionego o B27, 0,2% BSA, 100 ng/ml aktywiny A i 1 μM wortmanniny na 4 dni (Dzień 0-Dzień 4), przy codziennej wymianie pożywki.</li>
 <li>Po zakończeniu indukcji DE zaindukowano różnicowanie w kierunku progenitorów trzustki, zmieniając pożywkę na DMEM:F12 uzupełnioną o B27, 0,2% BSA oraz KAAD-cyklopaminę w stężeniu 0,2 μM na 24 godziny (Dzień 4-Dzień 5).</li>
 <li>Po 24 godzinach pożywkę zmieniono na DMEM:F12 uzupełnioną o B27, 0,2% BSA, KAAD-cyklopaminę w stężeniu 0,2 μM oraz all-trans kwas retinowy w stężeniu 2 μM na 3 dni, przy codziennej wymianie pożywki (Dzień 5-Dzień 8).</li>
</ol>
4. Dojrzewanie trzustki
<ol>
 <li>Po indukcji PP wszystkie grupy przeniesiono do pożywki dojrzewania składającej się z DMEM:F12 uzupełnionego o B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotynamidu, 25 μg/ml insuliny, 30 nM Na2SeO3 oraz 50 μg/ml transferryny na 2 dni, z codzienną wymianą pożywki (Dzień 8-Dzień 10).</li>
 <li>Po 2 dniach w pożywce dojrzewania, końcowy etap dojrzewania jest przeprowadzany równolegle w kilku różnych warunkach w celu porównania. Różnicowanie indukowano w następujących warunkach: (i) przy użyciu inhibitora notch DAPT (ii) przy użyciu wyłącznie pożywki do kokultury, bez komórek śródbłonka jako kontroli oraz (iii) przy użyciu kokultury kontaktowej z komórkami RHMVEC. Komórki utrzymywano w pożywce z DAPT lub pożywce do kokultury przez tydzień (Dzień 10-Dzień 17) z codzienną wymianą pożywki.
 <ol>
 <li>Pożywka z DAPT została przygotowana poprzez uzupełnienie pożywki dojrzewania o 30 μM DAPT. Komórki w tych grupach były najpierw eksponowane na pełną pożywkę MCDB131 przez 24 godziny, a następnie na pożywkę z DAPT przez 6 dni (Dzień 11-Dzień 17).</li>
 <li>Pożywka do kokultury została przygotowana poprzez uzupełnienie pożywki MCDB-131 o B27, 0,2% BSA, 10 mM nikotynamidu, 10 ng/ml EGF, 1 μg/ml hydrokortyzonu, 10 mg EndoGro, 90 μg/ml heparyny. W warunkach kontroli pożywki różnicujące się komórki eksponowano na pełną pożywkę MCDB-131 przez 24 godziny (Dzień 10-Dzień 11), po czym pożywkę zmieniono na pożywkę do kokultury na 6 dni (Dzień 11-Dzień 17) (bez komórek śródbłonka).</li>
 <li>W przypadku kokultury kontaktowej jeden milion komórek RHMVEC dodano do różnicujących się komórek w pełnej pożywce MCDB-131 (VEC technologies) na 24 godziny (Dzień 10-Dzień 11), aby umożliwić ich przytwierdzenie. Po 24 godzinach pożywkę zmieniono na pożywkę do kokultury na 6 dni (Dzień 11-Dzień 17) z codzienną wymianą pożywki.</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. Analiza qRT-PCR
<ol>
 <li>Pod koniec każdego etapu różnicowania (endodermy, progenitora trzustki, dojrzałej wysepki) przeprowadzono lizę komórek i wyekstrahowano RNA za pomocą zestawu do ekstrakcji NucleoSpin RNA II zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
 <li>Jakość RNA analizowano poprzez pomiar absorbancji RNA przy 260 nm i 280 nm, a następnie przeprowadzono kwantyfikację RNA przy użyciu spektrofotometru SmartSpec Plus.</li>
 <li>Transkrypcję odwrotną przeprowadzono za pomocą zestawu do transkrypcji odwrotnej ImProm II zgodnie z instrukcjami producenta. Wszystkie reakcje przeprowadzono z użyciem 100 ng RNA.</li>
 <li>Reakcję qRT-PCR przeprowadzono przy użyciu systemu Mx3005P QPCR (Agilent) oraz mieszaniny Brilliant II SYBR Green QPCR master mix zgodnie z instrukcjami producenta. Użyte primery wymieniono w tabeli 1. Etap inicjalizacji przeprowadzono w temperaturze 50 °C przez 2 minuty, a następnie w 95 °C przez 10 minut. Przeprowadzono 50 cykli amplifikacji według następującego schematu: 95 °C przez 30 sekund, 54 °C przez 30 sekund i 72 °C przez 1 minutę.</li>
 <li>Krotność zmiany ekspresji docelowego mRNA względem komórek nieróżnicujących się obliczono z wartości CT, korzystając z następujących wzorów: 
 ΔCT(Markeri)= CT(Markeri) - CT (GAPDH) 
 Δ ΔCT(Markeri)= ΔCT(Markeri)(Próbka)- ΔCT(Markeri)(Komórki nieróżnicujące się) 
 Ekspresja względna (Markeri)= 2-ΔΔCT(markeri)</li>
</ol>
6. Immunocytochemia
<ol>
 <li>Na koniec każdego etapu różnicowania (endoderma, progenitorów trzustkowych, dojrzałych wysepek) komórki utrwalono w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Utrwalone komórki poddano permeabilizacji z użyciem 0,25% Triton X-100 (TX) przez 15 minut.</li>
 <li>Barwienie nieswoiste zablokowano poprzez inkubację w 10% surowicy osła w 0,05% TX przez 30 minut.</li>
 <li>Inkubację z przeciwciałem pierwszorzędowym przeprowadzono przez noc w temperaturze 4 °C w buforze blokującym, stosując zalecane rozcieńczenie przeciwciała (patrz tabela 1).</li>
 <li>Komórki przemyto trzykrotnie 0,05% TX przez 5 minut.</li>
 <li>Inkubację z przeciwciałem drugorzędowym przeprowadzono przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, w ciemności, stosując odpowiednie przeciwciała rozcieńczone w buforze blokującym.</li>
 <li>Komórki przemyto trzykrotnie 0,05% TX przez 5 minut.</li>
 <li>Barwienie jąder przeprowadzono poprzez inkubację z barwnikiem Hoescht w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS przez 5 minut, a następnie trzykrotnie przemyto komórki w PBS.</li>
 <li>Utrwalone i zabarwione komórki obrazowano przy użyciu odwróconego mikroskopu Olympus IX81 oraz oprogramowania do obrazowania Metamorph.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Dodatek aktywiny A oraz wortmanniny do niezróżnicowanych hESC przez 4 dni indukuje powstawanie endeodermy definitywnej, co potwierdzono analizą qRT-PCR dla markerów DE: Sox17, Cxcr4 i Foxa2 oraz barwieniem immunologicznym dla Sox17, jak przedstawiono na Rysunku 2. Różnicowanie do komórek progenitorowych trzustki po dodaniu cyklopaminy i kwasu retinowego potwierdzono za pomocą qRT-PCR dla markerów progenitorowych trzustki oraz barwienia immunologicznego dla Pdx1, jak pokazano na Rysunku 3.
W końcowej fazie różnicowania kontaktowa kokultura z komórkami RHMVEC silnie indukowała zwiększenie ekspresji insuliny w komórkach progenitorowych trzustki pochodzących z hESC. Efektywność różnicowania pośredniczonego przez kokulturę przeanalizowano poprzez porównanie z warunkiem kontrolnym z zastosowaniem DAPT. DAPT posłużył jako kontrola pozytywna, ponieważ jest obecnie jedną z najszerzej stosowanych metod osiągania dojrzewania trzustki. Ponieważ kokulturę przeprowadzono w zmodyfikowanym medium uzupełnionym o czynniki wspierające komórki śródbłonka, wykonano dodatkową kontrolę z użyciem medium bez komórek śródbłonka, aby zweryfikować wpływ medium na różnicowanie. Szczegóły tej analizy przedstawiono na Rysunku 4.
<img alt="Schemat różnicowania ludzkich komórek macierzystych do progenitorów trzustkowych; proces dojrzewania w kokulturze." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 1."> 
Rysunek 1. Wieloetapowy protokół różnicowania hESC w komórki wykazujące ekspresję insuliny.
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji genów i mikroskopia barwienia SOX17/DAPI; porównanie białek, wyniki badania komórek." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. Indukcja endeodermy definitywnej z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. A) Analiza qRT-PCR reprezentatywnych markerów DE w komórkach hESC poddanych działaniu Aktywiny A i wortmanniny przez 4 dni. Wyniki zostały znormalizowane względem nieróżniczkowanych hESC. B) Barwienie Sox17 (zielone) i DAPI (niebieskie) wykazuje jądrową ekspresję Sox17. Pasek skali: 50 μm.
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji genów i obraz mikroskopii fluorescencyjnej dla analizy PDX1/DAPI." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Indukcja progenitorów trzustki w komórkach endodermy pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych. A) Analiza qRT-PCR wczesnych markerów trzustkowych w komórkach endodermy pochodzących z hESC, poddanych działaniu cyklopaminy i kwasu retinowego przez 4 dni po indukcji DE. Wyniki znormalizowane względem niezróżnicowanych hESC. B) Barwienie Pdx1 (fiolet) i DAPI (niebieski) wykazuje jądrową ekspresję Pdx1. Pasek skali: 50 μm.
<img alt="Wykres ekspresji glukagonu i insuliny, mikroskopia immunofluorescencyjna C-peptydu, barwienie DAPI." src="/files/ftp_upload/3759/3759fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 4."> 
Rysunek 4. Etap dojrzewania trzustki. A) Analiza qRT-PCR hormonów trzustkowych w hESC po dojrzewaniu trzustki z użyciem DAPT, kokultury kontaktowej lub pożywek do kokultury (kontrola). Wyniki znormalizowane względem niedróżnicowanych hESC. Wartości p wyznaczone testem t-Studenta. B) Kokultura z RHMVEC znakowanymi Dil-Ac-LDL (kolor czerwony) pokazuje obszary, w których komórki śródbłonka (EC) przylegają do płytki w przypadku występowania pustych przestrzeni (góra); inne RHMVEC znajdują się w bezpośrednim kontakcie z różnicującymi się ESC (dół). C) Barwienie C-peptydu (kolor zielony) dla komórek różnicowanych metodą kokultury. Pasek skali: 12,5 μm (góra) i 50 μm (dół). D) Immunobarwienie RHMVEC wykazuje brak ekspresji insuliny w RHMVEC.
<table border="1">
 <tbody >
 <tr>
 <td>Marker</td>
 <td>Starter 1 (5' do 3')</td>
 <td>Starter 2 (5' do 3')</td>
 <td>Ref.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>SOX17</td>
 <td>CTCTGCCTCCTCCACGAA</td>
 <td>CAGAATCCAGACCTGCACAA</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CXCR4</td>
 <td>CACCGCATCTGGAGAACCA</td>
 <td>GCCCATTTCCTCGGTGTAGTT</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>FOXA2</td>
 <td>GGAGCGGTGAAGATGGAA</td>
 <td>TACGTGTTCATGCCGTTCAT</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PDX1</td>
 <td>AAGTCTACCAAAGCTCACGCG</td>
 <td>GTAGGCGCCGCCTGC</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PTF1</td>
 <td>CATAGAGAACGAAACCACCCTTTGAG</td>
 <td>GCACGGAGTTTCCTGGACAGAGTTC</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HLXB9</td>
 <td>CACCGCGGGCATGATC</td>
 <td>ACTTCCCCAGGAGGTTCGA</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HNF6</td>
 <td>TGTGGAAGTGGCTGCAGGA</td>
 <td>TGTGAAGACCAACCTGGGCT</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PAX6</td>
 <td>CGAATTCTGCAGGTGTCCAA</td>
 <td>ACAGACCCCCTCGGACAGTAAT</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NKX6.1</td>
 <td>AGACCCACTTTTTCCGGACA</td>
 <td>CCAACGAATAGGCCAAACGA</td>
 <td>5</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ISL1</td>
 <td>GATCTATGTCACCTCGCAAGG</td>
 <td>TACAACCACCATTTCACTG</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>GLUKAGON</td>
 <td>AGGCAGACCCACTCAGTGA</td>
 <td>AACAATGGCGACCTCTTCTG</td>
 <td>4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>INSULINA</td>
 <td>AAGAGGCCATCAAGCAGATCA</td>
 <td>CAGGAGGCGCATCCACA</td>
 <td>12</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1. Primery użyte do reakcji qPCR.

<ol><li>De Vos, J., Assou, S., Tondeur, S., Dijon, M., Hamamah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+cellules+souches+embryonnaires+humaines+%3A+de+la+transgression+de+l%27embryon+humain+%C3%A1+la+m%C3%A9decine+r%C3%A9g%C3%A9n%C3%A9ratrice+de+demain%5BTitle%5D)+AND+%22Gyn%C3%A9cologie+Obst%C3%A9trique+%26+Fertilit%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Les cellules souches embryonnaires humaines : de la transgression de l'embryon humain á la médecine régénératrice de demain.</a> Gynécologie Obstétrique & Fertilité. 37, 620-626 (2009).</li>
<li>Murtaugh, L. C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes%2C+Signals%2C+and+Lineages+in+Pancreas+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genes, Signals, and Lineages in Pancreas Development.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).</li>
<li>Kubo, A., Shinozaki, K., Shannon, J. M., Kouskoff, V., Kennedy, M., Woo, S., Fehling, H. J., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+definitive+endoderm+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture.</a> Development. 131, 1651-1662 (2004).</li>
<li>D'Amour, K. A., Bang, A. G., Eliazer, S., Kelly, O. G., Agulnick, A. D., Smart, N. G., Moorman, M. A., Kroon, E., Carpenter, M. K., Baetge, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+pancreatic+hormone-expressing+endocrine+cells+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells.</a> Nat. Biotech. 24, 1392-1401 (2006).</li>
<li>Zhang, D., Jiang, W., Liu, M., Sui, X., Yin, X., Chen, S., Shi, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+differentiation+of+human+ES+cells+and+iPS+cells+into+mature+pancreatic+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Highly efficient differentiation of human ES cells and iPS cells into mature pancreatic insulin-producing cells.</a> Cell Res. 19, 429-438 (2009).</li>
<li>Basma, H., Soto-Gutiérrez, A., Yannam, G. R., Liu, L., Ito, R., Yamamoto, T., Ellis, E., Carson, S. D., Sato, S., Chen, Y., Muirhead, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+Transplantation+of+Human+Embryonic+Stem+Cell-Derived+Hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Differentiation and Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Hepatocytes.</a> Gastroenterology. 136, 990-999 (2009).</li>
<li>Phillips, B. W., Hentze, H., Rust, W. L., Chen, Q. -P., Chipperfield, H., Tan, E. -K., Abraham, S., Sadasivam, A., Soong, P. L., Wang, S. T., Lim, R., Sun, W., Colman, A., Dunn, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Human+Embryonic+Stem+Cells+into+the+Pancreatic+Endocrine+Lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into the Pancreatic Endocrine Lineage.</a> Stem Cells and Development. 16, 561-578 (2007).</li>
<li>Kim, S. K., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+development+is+promoted+by+cyclopamine%2C+a+Hedgehog+signaling+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreas development is promoted by cyclopamine, a Hedgehog signaling inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 95, 13036-13041 (1998).</li>
<li>Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+islets+of+Langerhans%3A+implications+for+the+treatment+of+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the islets of Langerhans: implications for the treatment of diabetes mellitus.</a> Current Opinion in Pharmacology. 1, 641-649 (2001).</li>
<li>Nikolova, G., Jabs, N., Konstantinova, I., Domogatskaya, A., Tryggvason, K., Sorokin, L., Fässler, R., Gu, G., Gerber, H. -P., Ferrara, N., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Vascular+Basement+Membrane%3A+A+Niche+for+Insulin+Gene+Expression+and+%5Bbeta%5D%3E+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The Vascular Basement Membrane: A Niche for Insulin Gene Expression and [beta]> Cell Proliferation.</a> Developmental Cell. 10, 397-405 (2006).</li>
<li>Yoshitomi, H., Zaret, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+interactions+initiate+dorsal+pancreas+development+by+selectively+inducing+the+transcription+factor+Ptf1a%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell interactions initiate dorsal pancreas development by selectively inducing the transcription factor Ptf1a.</a> Development. 131, 807-817 (2004).</li>
<li>Osafune, K., Caron, L., Borowiak, M., Martinez, R. J., Fitz-Gerald, C. S., Sato, Y., Cowan, C. A., Chien, K. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+differentiation+propensity+among+human+embryonic+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotech%22%5BJournal%5D)">Marked differences in differentiation propensity among human embryonic stem cell lines.</a> Nat. Biotech. 26, 313-315 (2008).</li>
<li>Banerjee, I., Sharma, N., Yarmush, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+co-culture+on+pancreatic+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of co-culture on pancreatic differentiation of embryonic stem cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5, 313-323 (2010).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podczas rozwoju trzustki różnicujące się komórki trzustkowe znajdują się w bliskim sąsiedztwie komórek śródbłonkowych aorty; ponadto wyspy trzustkowe są gęsto unaczynione, aby umożliwić szybką wymianę glukozy we krwi i hormonów wyspkowych. Biorąc pod uwagę te fakty, nie dziwi fakt, że komórki śródbłonkowe odgrywają ważną rolę w procesie organogenezy trzustki. Chociaż znaczenie komórek śródbłonkowych podczas rozwoju trzustki jest coraz bardziej doceniane, ich rola w różnicowaniu komórek embrionalnych in vitro jes...

<table><tbody><tr><td>mTeSR1 (z suplementem)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>matrigel kwalifikowany dla hESC</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>DMEM:F12</td><td>Invitrogen</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131</td><td>Invitrogen</td><td>10372019</td><td></td></tr><tr><td>MCDB-131 (kompletne)</td><td>VEC Technologies</td><td>MCDB-131</td><td></td></tr><tr><td>Suplement B27</td><td>Invitrogen</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Aktywina A</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rndsystems.com/pdf/338-ac.pdf">338-AC&lt;/a&gt;</td><td>100ng/ml</td></tr><tr><td>Wortmannina</td><td>Invitrogen</td><td>W3144</td><td>1&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>KAAD-Cyclopamie</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4116</td><td>0.2&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>All-trans kwas retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td>2&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5942</td><td>30&amp;#x03BC;M</td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Selinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5261</td><td>30 nM</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1882</td><td>25 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Transferyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>50 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>EGF</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.rndsystems.com/pdf/236-eg.pdf">236-EG&lt;/a&gt;</td><td>10ng/ml</td></tr><tr><td>EndoGro</td><td>VEC Technologies</td><td>ENDOGRO</td><td>10mg</td></tr><tr><td>Heparyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td>90&amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Hydrokortyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0888</td><td>1&amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>NucleoSpin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955</td><td></td></tr><tr><td>System odwrotnej transkrypcji ImProm II</td><td>Promega Corp.</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>Brilliant II SYBR Green QPCR master mix</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>600548</td><td></td></tr><tr><td>Sox17 kozia poliklonalna IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-17355</td><td>1/500</td></tr><tr><td>PDX1 kozia poliklonalna IgG</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-14662</td><td>1/500</td></tr><tr><td>C-Peptyd króliczy poliklonalny</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4593</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 osiołkowy anty-króliczy IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 osiołkowy anty-kozi IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A-21447</td><td>1/1000</td></tr><tr><td colspan="4">Tabela 2. Odczynniki i zestawy</td></tr></tbody></table>

kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Komórki macierzyste zarodkowe (ESC) charakteryzują się dwiema głównymi cechami: mogą być propagowane w nieskończoność in vitro w stanie niedróżnicowanym i są pluripotencjalne, co oznacza, że mają potencjał do różnicowania się w wiele linii komórkowych. Takie właściwości sprawiają, że ESC są niezwykle atrakcyjne w zastosowaniach w terapii komórkowej oraz leczeniu regeneracyjnym 1Jednak aby w pełni wykorzystać ich potencjał, komórki muszą zostać zróżnicowane w dojrzałe i funkcjonalne fenotypy, co stanowi ogromne wyzwanie. Obiecującym podejściem w indukowaniu różnicowania komórkowego jest ścisłe naśladowanie przebiegu organogenezy w in vitro Kontekst. Wiadomo, że rozwój trzustki przebiega w określonych etapach 2zaczynając od endodermy, która może przekształcić się w kilka organów, w tym w wątrobę i trzustkę. Indukcję endodermy można osiągnąć poprzez modulację szlaku nodal za pomocą dodania aktywiny A 3 w połączeniu z kilkoma czynnikami wzrostu 4-7Komórki ostatecznej endodermy przechodzą następnie w proces różnicowania w kierunku trzustki poprzez hamowanie szlaku sygnałowego białka sonic hedgehog, co można osiągnąć in vitro poprzez dodanie cyklopaminy 8Dojrzewanie trzustki jest mediowane przez kilka równoległych procesów, do których należą między innymi: hamowanie sygnalizacji notch, agregacja prekursorów trzustki w klastry trójwymiarowe oraz indukcja unaczynienia. Do tej pory najskuteczniejszym in vitro dojrzalanie komórek progenitorowych trzustki pochodzących z ESC osiągnięto poprzez hamowanie sygnalizacji Notch za pomocą suplementacji DAPT 9Mimo że metoda ta jest skuteczna, skutkuje ona niską wydajnością uzyskiwania dojrzałego fenotypu o obniżonej funkcjonalności. Mniej zbadanym obszarem jest wpływ sygnalizacji komórek śródbłonka na dojrzewanie trzustki, co jest coraz częściej uznawane za istotny czynnik przyczyniający się do dojrzewania wysepek trzustkowych in vivo. 10,11.
Niniejsze badanie analizuje wpływ sygnalizacji komórek śródbłonka na dojrzewanie ludzkich komórek progenitorowych trzustki pochodzących z hESC w insulinotwórcze komórki przypominające wyspy trzustkowe. Przedstawiamy wieloetapowy protokół ukierunkowanej dyferencjacji, w którym hESC są najpierw indukowane w kierunku endodermy za pomocą aktywiny A przy jednoczesnym hamowaniu szlaku PI3K. Specyfikacja trzustkowa komórek endodermy jest osiągana poprzez hamowanie sygnalizacji białka sonic hedgehog za pomocą cyklopaminy oraz indukcję retinoidową poprzez dodanie kwasu retinowego. Końcowy etap dojrzewania jest indukowany przez sygnalizację komórek śródbłonka, osiągniętą dzięki konfiguracji kokultury. Choć w kokulturze testowano kilka rodzajów komórek śródbłonka, w niniejszej pracy prezentujemy dane uzyskane z wykorzystaniem mikro naczyniowych komórek śródbłonka serca szczura (RHMVEC), przede wszystkim ze względu na łatwość analizy.

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

embrionalne komórki macierzyste (ESC) charakteryzują się dwiema głównymi cechami: mogą być w nieskończoność propagowane in vitro w stanie nieróżnicowania oraz są...

Niniejszy protokół przedstawia wieloetapowe różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych jako skuteczną metodę otrzymywania komórek produkujących insulinę, zapewniającą wyższą wydajność niż wcześniej opracowane protokoły. W pierwszej kolejności indukuje się ostateczną endodermę przy użyciu aktywnego Activin A oraz inhibitora PI3K. Następnie, aby wspomóc indukcję progenitorów trzustkowych, komórki poddaje się działaniu dopaminy A i kwasu retinowego. W kolejnym kroku stosuje się kokulturę z komórkami śródbłonka w celu pośredniczenia w dojrzewaniu progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.Przejdź do analiz funkcjonalnych za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i QPCR, aby wykazać ekspresję C-peptydu oraz zwiększenie regulacji insuliny. Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod jest to, że pozwala ona na silniejszą nadekspresję insuliny, a także wyższą wydajność cpep w hodowli komórek ekspresyjnych. Hoduj kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H1 do rozmiaru od 1 do 1,5 mm średnicy, a następnie przenieś komórki do CO 12.Płytka wielodołkowa zawierająca po jednym mililitrze matrigelu HESC rozcieńczonego w pożywce D-M-E-M-F 12 na dołek; w międzyczasie odessać pożywkę z HSC i zastąpić ją pożywką mTR-1. Następnie zebrać komórki poprzez zeskrobanie. Przenieść je do probówki typu conical 15 ml, dodać świeżą pożywkę mTR-1, a następnie wysiać w stosunku rozcieńczenia 1:4 do uprzednio pokrytych matrigelem dołków płytki 12-dołkowej.Gdy komórki propagacyjne osiągną średnicę od 1 do 1,5 milimetra, indukuje się różnicowanie poprzez dodanie pożywki do indukcji ostatecznej endodermy zawierającej aktywny białko A oraz inhibitor PI3K. Hodowlę prowadzi się przez cztery dni.Codziennie uzupełniaj pożywkę. Przejdź do indukcji progenitorów trzustki, najpierw hodując komórki w pełnym medium D-M-E-M-F 12 zawierającym 0,2 µM KAAD, cyklodopaminy przez 24 godziny. Następnie wymień pożywkę na pełne D-M-E-M-F 12 zawierające 0,2 µM KAAD, cyklodopaminy oraz 2 µM kwasu retinowego (all-trans), inkubując przez trzy dni i codziennie uzupełniając pożywkę hodowlaną.Komórki inkubowano w pożywce do dojrzewania przez dwa dni przed wykonaniem końcowego etapu dojrzewania, jako kontrolę pozytywną dla dojrzewania in vivo komórek progenitorowych trzustki pochodzenia ESC z zastosowaniem inhibitora notch DAPT przed rozdzieleniem. Poddać komórki śródbłonkowe inspekcji pod mikroskopem, a następnie poddać je trypsynizacji i policzyć w celu przygotowania warunku kokultury kontaktowej. Dodać 1 milion szczurzych mikro naczyniowych komórek śródbłonka serca do różnicujących się komórek w kompletnej pożywce MCDB 1 31.Przygotuj również kulturę kontrolną składającą się z samych mediów do kokultury z komórkami śródbłonka. Umieść wszystkie warunki traktowania w inkubatorze na sześć dni, wymieniając media. Codziennie pobieraj próbki komórek po zakończeniu każdego etapu procesu różnicowania.Wyizoluj RNA z komórek endotelialnych, progenitorów trzustkowych i ekstraktu z dojrzałych wysepek za pomocą zestawu do ekstrakcji nucleus spin E-R-R-N-A zgodnie z instrukcjami producenta. Za pomocą spektrofotometru smart spec plus i kuwety kwarcowej określ jakość RNA na podstawie stosunku absorbancji przy 260 nanometrach do 280 nanometrów. Oblicz również stężenia próbek, przyjmując 100 nanogramów matrycy RNA na próbkę.Przeprowadź reakcje RT, korzystając z zestawu do odwrotnej transkrypcji impromptu. Następnie przygotuj reakcję QPCR, używając wskazaznych starterów; nanieś reakcje na termocykler i uruchom program QPCR. Następnie, na podstawie wartości CT, oblicz krotność zmiany ekspresji docelowego mRNA w stosunku do komórek niezróżnicowanych na koniec każdego etapu różnicowania.Komórki utrwalono w 4% formaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przeprowadzono permeabilizację przy użyciu 0,25% Triton X 100 przez 10 minut w celu zablokowania niespecyficznego barwienia. Dodano 10% surowicy osła w 0,05% TX na 30 minut.Następnie dodaj przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyj próbki roztworem 0,05% Triton X przez pięć minut. Następnie dodaj przeciwciało drugorzędowe rozcieńczone w buforze blokującym i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.Przeprowadź trzy pięciominutowe płukania nuclei z wykorzystaniem 0.05%x, a następnie przeprowadź barwienie nuclei w rozcieńczeniu 1:1000 w PBS; inkubuj przez pięć minut, a następnie wykonaj trzy płukania PBS. Uzyskaj obrazy utrwalonych i zbarwionych komórek, używając mikroskopu odwróconego oraz oprogramowania do obrazowania.Dodanie aktywiny A i Wnt3a do niezróżnicowanych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przez cztery dni indukuje powstanie endeodermy ostatecznej. Analiza qRT-PCR potwierdziła obecność oczekiwanych markerów endeodermy ostatecznej: SOX17, CXCR4 i FoxA2.Immunobarwienie na SOX 17 w kolorze zielonym wykazuje tutaj kolokalizację z jądrem zabarwionym na niebiesko przy użyciu DPI. Różnicowanie w kierunku komórek progenitorowych trzustki po dodaniu cyklosporyny, aminy i kwasu retinowego potwierdzono za pomocą Q-R-T-P-C-R markerów progenitorów trzustki oraz poprzez immunobarwienie na PDX 1. Na końcowym etapie różnicowania kontaktowa kokultura z mikro naczyniowymi komórkami śródbłonka serca szczura silnie indukowala upregulację ekspresji insuliny w komórkach progenitorowych trzustki pochodzących z HESC.Współhodowle L z AC LDL znakowanymi RHM VEC wykazują obszary, w których ECS przylgnęły do płytki. W przypadku występowania wolnych przestrzeni, inne RHM VEC znajdują się w bezpośrednim kontakcie z różnicującymi się ESC, zgodnie z oczekiwaniami. Barwienie immunocytochemiczne RHM VEC nie wykazuje wykrywalnej ekspresji insuliny.Barwienie eptydem jest również użytecznym markerem dla komórek różnicowanych metodą kokultury po jej opracowaniu. Technika ta umożliwiła badanie oddziaływań międzykomórkowych w procesie różnicowania komórek macierzystych, co wyraźnie zwiększa funkcjonalność dojrzałego fenotypu.

endothelial-cell-co-culture-mediates-maturation-human-embryonic-stem

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Współhodowla komórek śródbłonkowych pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich komórek macierzystych zarodkowych do komórek trzustki wytwarzających insulinę w kierowanym podejściu różnicowania

Opisano protokół izolacji, hodowli i obrazowania klastrów komórek wysp trzustkowych (ICC) pochodzących z ludzkich komórek trzustki płodu. Metoda szczegółowo opisuje kroki niezbędne do wygenerowania ICC z tkanki, hodowli jako monowarstw lub w zawiesinie jako agregatów, oraz obrazu dla markerów proliferacji i decyzji o losie komórek trzustki.

Izolacja, hodowla i obrazowanie klastrów ludzkich płodowych komórek trzustkowych

Tutaj prezentowana jest nowa metoda, która pozwala na przekształcenie dorosłych fibroblastów skóry w komórki wydzielające insulinę. Technika ta opiera się na konwersji epigenetycznej, nie wiąże się z użyciem wektorów retrowirusowych ani nabyciem stabilnego stanu pluripotencjalnego. Jest zatem bardzo obiecujący w zastosowaniach medycyny translacyjnej.

Konwersja epigenetyczna jako bezpieczna i prosta metoda pozyskiwania komórek wydzielających insulinę z fibroblastów skóry dorosłych

Tutaj opisujemy 4-etapowy protokół różnicowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek progenitorowych trzustki NKX6-1+ in vitro. Protokół ten może być stosowany do różnych linii ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Skuteczne różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych do progenitorów trzustki NKX6-1+

Opisano protokoły do generowania linii mutantów hPSC za pomocą platformy iCRISPR i różnicowania hPSC na komórki podobne do β reagujące na glukozę. Połączenie technologii edycji genomu z różnicowaniem ukierunkowanym na hPSC stanowi potężną platformę do systematycznej analizy roli determinantów linii w rozwoju człowieka i postępie choroby.

Edycja genomu i ukierunkowane różnicowanie hPSC w celu badania determinantów linii w rozwoju trzustki człowieka

Ten protokół przedstawia porównanie dwóch różnych protokołów indukcji różnicowania ludzkich komórek macierzystych miazgi zębowej (hDPSC) w kierunku linii trzustki in vitro: protokół integracyjny i protokół nieintegracyjny. Protokół integracyjny generuje więcej komórek produkujących insulinę (IPC).

Metody in vitro Indukcja komórek macierzystych ludzkiej miazgi zębowej w kierunku linii trzustki

Obecny protokół opisuje ulepszoną metodę zwiększania koekspresji czynników transkrypcyjnych PDX1 i NKX6.1 w progenitorach trzustki pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w płaskich monowarstwach. Osiąga się to poprzez uzupełnienie świeżej macierzy, manipulowanie gęstością komórek i dysocjację komórek endodermalnych.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w prekursory komórek beta trzustki w systemie hodowli 2D

Różnicowanie komórek macierzystych w komórki wysp trzustkowych stanowi alternatywne rozwiązanie dla konwencjonalnego leczenia cukrzycy i modelowania chorób. Opisujemy szczegółowy protokół hodowli komórek macierzystych, który łączy komercyjny zestaw różnicujący z wcześniej zwalidowaną metodą, aby pomóc w wytwarzaniu wysp trzustkowych wydzielających insulinę pochodzących z komórek macierzystych w naczyniu.

Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w klastry wysp trzustkowych wytwarzających insulinę

Ten artykuł przedstawia protokół ukierunkowanego różnicowania i analizy funkcjonalnej komórek podobnych do komórek β. Opisujemy optymalne warunki hodowli i pasażki dla ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przed wytworzeniem komórek trzustki produkujących insulinę. Sześcioetapowe różnicowanie postępuje od ostatecznego tworzenia endodermy do funkcjonalnych komórek podobnych do komórek β wydzielających insulinę w odpowiedzi na glukozę.

Zoptymalizowany protokół generowania funkcjonalnych komórek wydzielających insulinę trzustkową z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

W tym filmie pokazujemy, jak w naszym laboratorium rutynowo fragmenty barwy linii ludzkich zarodkowych komórek macierzystych, z trypsyny.

Barwy Pasażowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych linii Trypsyna

Poznaj wieloetapową różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w komórki trzustkowe wytwarzające insulinę przy użyciu kohodowli z komórkami śródbłonka. Ta metoda zwiększa wydajność i dojrzewanie.

Kohodowla komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do komórek trzustkowych wytwarzających insulinę w podejściu ukierunkowanym (Wideo) | JoVE Journal

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

Przeglądaj więcej filmów