Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Analiza oddziaływań COMIN z wykorzystaniem sekwencjonowania proszków i tagów jest metodą analizy długozasięgowych oddziaływań COMIN w obrębie całego genomu. W skrócie nazywamy tę metodę magic share pad. Metoda ta obejmuje wiele etapów biologii molekularnej i może być skomplikowana.

W związku z tym w poniższym filmie przedstawimy kluczowe etapy immunoprecypitacji chromatyny oraz konstrukcji biblioteki do analizy ChIA-PET. Immunoprecypitacja chromatyny, znana jako ChIP, jest pierwszym krytycznym krokiem w tworzeniu biblioteki ChIA-PET. Na tym etapie próbki chromatyny z hodowli komórkowych są sieciowane, sonikowane i poddawane immunoprecypitacji.

Następnie oddzielne alikwoty DNA z chipa są ligowane z barkodowanymi pół-linkerami, a następnie przeprowadzana jest ligacja proksymalna. Fragmenty Pets są uwalniane poprzez trawienie restrykcyjne, oczyszczane na powlekanych koralikach magnetycznych i ligowane z adapterami do sekwencjonowania nowej generacji. Chimerowe fragmenty Pets są identyfikowane na podstawie składu linkera AB oraz flankujących tagów.

Sekwencje centralnego łącznika są odczytywane i mapowane do genomu. W tym filmie zaprezentujemy standardowy protokół ChIP rutynowo stosowany w naszym laboratorium na linii komórkowej raka piersi MCF7. Z naszych danych wynika, że wyższy stopień wzbogacenia w metodzie ChIP przy użyciu specyficznych przeciwciał pozwala uzyskać lepsze wyniki ChIP-seq. Dlatego stanowczo zalecamy optymalizację protokołu ChIP oraz walidację wzbogacenia za pomocą qPCR.

Przed przystąpieniem do konstrukcji biblioteki ChIP-seq, komórki CF7 są hodowane do około 75% konfluencji w naczyniu hodowlanym o powierzchni 500 cm², zawierającym około 20 milionów komórek przed sieciowaniem. Odrzucić pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki ciepłym PBS. Utrwalić komórki świeżo przygotowanym 1,5 mM EGS przez 45 minut na rotatorze w temperaturze pokojowej. Dodać 37% formaldehyd do końcowego stężenia 1% i inkubować przez 20 minut.

Wydajność sieciowania jest kluczowa i różni się w zależności od linii komórkowych oraz badanego białka. Należy zoptymalizować stężenie czynnika sieciującego, czas inkubacji oraz temperaturę. Reakcję sieciowania należy przerwać, dodając glicynę do stężenia końcowego 200 millimolar i inkubując przez 10 minut.

Usunąć zneutralizowane sieciujące i przemyć dwa razy zimnym PBS. Odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej z chłodzeniem, aby uzyskać osad komórkowy. Osad jest teraz gotowy do lizy komórek. Alternatywnie, zamrozić osad w temperaturze -80 °C. Jeśli osad komórkowy jest zamrożony, rozmrozić go na lodzie przed przystąpieniem do lizy komórek, a następnie resuspender osad w buforze do lizy z 0,1% SDS.

Wiruj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce chłodzącej, odlej supernatant i powtórz lizę komórek. Następnie przeprowadź lizę jąder w celu uwolnienia sieciowanej chromatyny przed jej fragmentacją. Brak błony jądrowej pozwala na sonikację sieciowanej chromatyny w łagodniejszych warunkach.

Resuspensować pellet jądrowy w 1% buforze lizującym SDS. Przenieść zawiesinę do probówki do wirówki wysokich prędkości. Wirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Usuń szczątki jądrowe za pomocą wirowania. Osad chromatyczny powinien wyglądać w ten sposób. Użyj końcówki do pipety P 1000, aby rozbić osad na mniejsze części, a następnie przemyj go dwukrotnie buforem do lizy z 0,1% SDS.

Wiruj probówkę w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem. Osad jądrowy jest teraz gotowy do sonikacji. Alternatywnie, zamroź osad w temperaturze -80 °C.

Przenieś pellet do przezroczystej probówki. Dodaj do pelletu bufor lizującego z 0,1% SDS i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza. Przez cały czas sonikacji utrzymuj próbki w niskiej temperaturze, aby zapobiec ich przegrzaniu. Na efektywność sonikacji mogą wpływać różne warunki, takie jak objętość buforu, głębokość zanurzenia sondy, moc sonikacji, liczba cykli oraz stopień sieciowania.

Przeprowadzić odwrócenie sieciowania i alikwotowanie chromatyny przy użyciu proteinazy K, a następnie wykonać elektroforezę w żelu agarozowym. W celu weryfikacji efektywności fragmentacji zaleca się optymalizację, aby uzyskać pożądany zakres wielkości DNA między 200 a 600 pz. Usunąć resztki komórkowe poprzez wirowanie.

Chromatyna jest teraz gotowa do wstępnego oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych. Alternatywnie proces można zatrzymać w temperaturze -80 °C do czasu zebrania odpowiedniej ilości chromatyny. Aby rozpocząć procedurę ChIP, należy przemyć kulki trzykrotnie buforem do przemywania kulek; ten oraz wszystkie kolejne etapy przemywania z użyciem magnetycznych kulek białkowych obejmują następujące kroki.

Dodaj sonikowaną chromatynę do wstępnie przemytych kulek i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w oddzielnej probówce. Pokryj wstępnie przemyte kulki przeciwciałem i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyj kulki pokryte przeciwciałem dwukrotnie buforem do przemywania kulek.

Wysoka złożoność substratu dla ligacji bliskościowej nieuchronnie prowadzi do znacznego szumu nieswoistego, co zwiększa koszt sekwencjonowania. Poza redukcją poziomu złożoności i szumu tła, wykorzystaliśmy monoklonalne przeciwciało przeciwko polimerazie RNA II mysiej w celu zidentyfikowania oddziaływań chromatyny zaangażowanych w regulację transkrypcji.

Umożliwia to badanie aktywnych promotorów i odpowiadających im regionów regulacyjnych, co pozwala na zrozumienie wydajnej i prawdopodobnie kooperatywnej transkrypcji. Usunąć bufor płuczący z kulek powlekanych przeciwciałami. Połączyć oczyszczoną chromatynę z kulkami powlekanymi przeciwciałami i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji nocnej kulki poddać serii płukań w celu usunięcia niezwiazanej chromatyny, a następnie zawiesić kulki w buforze TE. Odobrać niewielką ilość do ilościowej kontroli wzbogacenia. Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania pad i tag jest techniką opracowaną do wielkoskalowej analizy de novo oddziajujących struktur chromatyny wyższego rzędu.

Fragmenty DNA wzbogacone poprzez immunoprecypitację chromatyny są przechwytywane za pomocą ligacji bliskościowej. Strategia z wykorzystaniem „padów” i „tagów” (pad and tag) jest stosowana do konstrukcji bibliotek CHI-PET, które są sekwencjonowane przy użyciu wysokoprzepustowych technologii sekwencjonowania nowej generacji. W tym filmie przedstawimy kluczowe aspekty eksperymentalne konstrukcji biblioteki CHI-PET.

Pierwsza połowa procesu tworzenia biblioteki polega na manipulowaniu kuleczkami białka A lub G, do których przyłączone są fragmenty DNA, w celu usunięcia enzymów i soli buforowej. Po każdej reakcji enzymatycznej, na każdym etapie przemywania, należy zastosować delikatne wirowanie oraz lekkie uderzanie dnem probówki. Aspiruj naddestydat pipetą kilka razy, aby maksymalnie odzyskać kuleczki po ich przyciągnięciu przez magnes.

Koncentrator do wszystkich etapów inkubacji zawierających kuleczki w mieszaninie reakcyjnej. Przygotuj wcześniej master mix i dodaj enzym na samym końcu, po jednorodnym resuspensowaniu kuleczek. Upewnij się, że kuleczki są dobrze wymieszane przez cały czas trwania inkubacji. Połowiczne oligonukleotydy łącznikowe są zaprojektowane z wewnętrznym kodem kreskowym składającym się z czterech nukleotydów oraz sekwencją rozpoznawczą dla enzymu restrykcyjnego typu II MME1.

Po ligacji półłączników do przytwierdzonych fragmentów DNA w kompleksach chromatyny C, oddziałujące fragmenty DNA zostaną połączone pełną sekwencją łącznika. Półłączniki te generują sekwencje z heterodimerycznymi łącznikami ab pochodzącymi z niespecyficznych produktów ligacji lub sekwencje z homodimerami, łącznikami AA lub BB pochodzącymi ze specyficznych produktów ligacji. Zatem zastosowanie dwóch półłączników z różnymi kodami kreskowymi nukleotydowymi umożliwia specyfikację różnych eksperymentów lub powtórzeń, a także monitorowanie szybkości niespecyficznych ligacji chimerycznych pomiędzy różnymi kompleksami na chipie.

Ważne jest, aby przygotować reakcję w lodzie oraz delikatnie rozmrozić pół-linkery (half linkers) w lodzie. Dokładnie połącz pół-linkery z wodą, a następnie z PEG zawierającym bufor ligazowy. Przed resuspensją upewnij się, że master mix został dobrze wymieszany.

Do zawiesiny chip DNA dodaj ligazę DNA T4 dopiero po dokładnym wymieszaniu półlinkerów i fragmentów chip DNA, aby zapobiec konkatenacji półlinkerów. Zamknij probówkę parafimem. Inkubuj przez noc w temperaturze 16 °C przy jednoczesnej rotacji. Kompleksy nienaruszonej chromatyny są następnie eluowane z koralików poprzez dodanie SDS w buforze EB. Aby obniżyć stężenie SDS, do eluatowego DNA dodano Triton X 100 w celu zneutralizowania SDS. Cyrkularyzacja kompleksów chromatyny jest ułatwiona przez ligację dwóch półlinkerów, co tworzy pełną sekwencję linkera w miejscu połączenia interakcji. Liguj eluowane kompleksy chromatyny w warunkach ekstremalnie niskiego stężenia, aby zminimalizować ligacje między różnymi kompleksami DNA-białko, dodając ligazę DNA T4 dopiero po dokładnym rozcieńczeniu eluowanych kompleksów chromatyny w mieszaninie reakcyjnej. Po odwróceniu sieciowania (reverse cross-linking), w celu usunięcia białek związanych z DNA, oczyść cyrkularyzowane fragmenty DNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Do łatwej separacji zastosuj system żelowy KaiGen PhaseLock.

Po ekstrakcji fenolem użyj nośnika DNA glyco blue A, aby zwiększyć masę i widoczność osadu. Połowy oligonukleotydów łączących zawierają flankujące miejsca rozpoznawania MME1. Typ II enzymu restrykcyjnego MME1 przecina sekwencję 18 i 20 par zasad w kierunku downstream od swoich miejsc wiązania docelowego, aby wygenerować krótkie tagi fragmentu chromatyny, tworząc konstrukty tagu łączącego PET, skrócone jako pets.

Dodatkowo, każdy z połowicznych łączników jest modyfikowany biotyną, aby umożliwić oczyszczanie konstruktów pet za pomocą magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną. Przeprowadź jedno trawienie MME w celu uwolnienia konstruktów z tagiem Linker. Oczyść pet poprzez selektywne wiązanie z kuleczkami streptawidyny, a następnie liguj konstrukty pet z adapterami do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.

Użyj polimerazy DNA typu fusion do amplifikacji fuzji biblioteki CHI PET. Polimeraza DNA jest wykorzystywana do generowania matryc z wysoką dokładnością i wydajnością. Przygotuj reakcję PCR w warunkach chłodniczych, dodając polimerazę DNA typu fusion na samym końcu.

Ponieważ enzym wykazuje aktywność egzonukleazy 3'→5', która może degradować primery w przypadku braku dNTP, należy zachować ostrożność. Jeśli biblioteka Charpet została zbudowana pomyślnie, powinien pojawić się wyraźny, dobrze zdefiniowany prążek o wielkości około 223 par zasad. Podczas wycinania prążka o wielkości 223 par zasad z żelu należy unikać prążków nieswoistych, a następnie oczyścić wycięty prążek zgodnie z protokołem Gel Crush.

Przed sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym należy przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 z zestawem DNA 1000. Przedstawiliśmy procedurę CHI PET do bezstronnej detekcji oddziaływań chromatyny w całym genomie. Jakość danych CHI PET zależy od skuteczności zastosowanego przeciwciała na chipie oraz głębokości sekwencjonowania.

W niniejszej procedurze wykorzystujemy od 18 do 20 milionów odczytów do mapowania oddziaływań. Ten konkretny protokół został z powodzeniem zastosowany do charakterystyki sieci oddziaływań chromatyny wiązanych przez receptor estrogenowy i polimerazę RNA w genomie ludzkim. Przewidujemy, że badanie to będzie potężnym narzędziem w przyszłych studiach nad trójwymiarową architekturą biologii transkrypcji w kontekście całego genomu.

Mamy nadzieję, że ten film okaże się dla Państwa pomocny. Dziękujemy za oglądanie.I.