Name: Analiza interakcji chromatyny z sekwencjonowaniem znaczników na sparowanych końcach (ChIA-PET) w celu mapowania interakcji chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 21 min 55 s
Description: Poznaj metodę ChIA-PET do analizy interakcji chromatyny i badania regulacji transkrypcji. Technika łączy immunoprecypitację chromatyny z sekwencjonowaniem nowej generacji, umożliwiając mapowanie interakcji na skalę genomową.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy otrzymali wsparcie od A*STAR z Singapuru. Ponadto M.J.F. otrzymała wsparcie w ramach A*STAR National Science Scholarship, L'Oreal For Women in Science National Fellowship oraz Lee Kuan Yew Post-Doctoral Fellowship. Y.R. jest wspierany przez granty NIH ENCODE (R01 HG004456-01 oraz R01 HG003521-01). Autorzy dziękują również zespołowi filmowców z 8 Pixels Productions w Singapurze, w szczególności panu Kelvinowi Isseyowi, panu Chang Kai Xiangowi i panu Sherwinowi Ganowi za nagranie scen, pani Siti Rahim za montaż wideo oraz pani Michelle Teo za lektora.

<ol><li>Cai, S., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SATB1+packages+densely+looped%2C+transcriptionally+active+chromatin+for+coordinated+expression+of+cytokine+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">SATB1 packages densely looped, transcriptionally active chromatin for coordinated expression of cytokine genes.</a> Nat. Genet. 38, 1278-1288 (2006).</li>
<li>Cook, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+organization+of+replication+and+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The organization of replication and transcription.</a> Science. 284, 1790-1795 (1999).</li>
<li>Das, P. M., Ramachandran, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation assay.</a> Biotechniques. 37, 961-969 (2004).</li>
<li>Deng, W., Blobel, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+chromatin+loops+provide+epigenetic+gene+expression+states%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Do chromatin loops provide epigenetic gene expression states.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 548-554 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Han, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+interaction+analysis+using+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromatin interaction analysis using paired-end tag sequencing.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 21, 21-25 (2010).</li>
<li>Fullwood, M. J., Liu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+oestrogen-receptor-alpha-bound+human+chromatin+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An oestrogen-receptor-alpha-bound human chromatin interactome.</a> Nature. 462, 58-64 (2009).</li>
<li>Jackson, D. A., Hassan, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+focal+sites+of+transcription+within+human+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of focal sites of transcription within human nuclei.</a> EMBO J. 12, 1059-1065 (1993).</li>
<li>Li, G., Fullwood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIA-PET+tool+for+comprehensive+chromatin+interaction+analysis+with+paired-end+tag+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">ChIA-PET tool for comprehensive chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing.</a> Genome Biol. 11, R22(2010).</li>
<li>Li, G., Ruan, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+Promoter-Centered+Chromatin+Interactions+Provide+a+Topological+Basis+for+Transcription+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive Promoter-Centered Chromatin Interactions Provide a Topological Basis for Transcription Regulation.</a> Cell. 148, 84-98 (2012).</li>
<li>Ng, P., Wei, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-end+diTagging+for+transcriptome+and+genome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Paired-end diTagging for transcriptome and genome analysis.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. Chapter 21, 12(2007).</li>
<li>Nowak, D. E., Tian, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+method+for+identification+of+NF-kappaB+gene+network+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 39, 715-725 (2005).</li>
<li>Osborne, C. S., Chakalova, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+genes+dynamically+colocalize+to+shared+sites+of+ongoing+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription.</a> Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).</li>
<li>Rippe, K., von Hippel, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+at+a+distance%3A+DNA-looping+and+initiation+of+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Action at a distance: DNA-looping and initiation of transcription.</a> Trends Biochem. Sci. 20, 500-506 (1995).</li>
<li>Schoenfelder, S., Sexton, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+associations+between+co-regulated+genes+reveal+a+transcriptional+interactome+in+erythroid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Preferential associations between co-regulated genes reveal a transcriptional interactome in erythroid cells.</a> Nat. Genet. 42, 53-61 (2010).</li>
<li>Zeng, P. Y., Vakoc, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+dual+cross-linking+for+identification+of+indirect+DNA-associated+proteins+by+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation.</a> Biotechniques. 41, 694-698 (2006).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

ChIA-PET to metoda opracowana w celu identyfikacji długozasięgowych oddziaływań w regulacji transkrypcji. Jednym z krytycznych czynników determinujących jakość biblioteki ChIA-PET jest jakość materiału ChIP.
Protokół przedstawiony w filmie obejmuje zastosowanie EGS i formaldehydu do sieciowania komórek. Użycie formaldehydu w połączeniu z drugim odczynnikiem sieciującym o dłuższym ramieniu łącznikowym może pomóc w wiązaniu białek, które nie mogłyby zostać związane samym formaldehydem 3,11,15. Za pomocą tej metody opracowaliśmy biblioteki, które wykazały obecność stabilnych miejsc wiązania oraz oddziaływań dalekiego zasięgu 9. Należy jednak zoptymalizować warunki sieciowania i ChIP dla każdego badanego czynnika; ważne jest, aby nie doprowadzić do nadmiernego sieciowania, ponieważ może ono spowodować trudności w fragmentacji metodą sonikacji oraz potencjalnie doprowadzić do powstania pozornych oddziaływań chromatyny. Oddziaływania chromatyny zidentyfikowane metodą ChIA-PET powinny zostać zweryfikowane inną metodą, taką jak fluorescencyjna hybrydyzacja in-situ 4.
Zalecamy użycie co najmniej 100 ng materiału chromatynowego. Choć udało nam się przygotować wysokiej jakości biblioteki z 50 ng materiału chromatynowego, zaobserwowaliśmy, że duże ilości materiału wyjściowego pozwoliły na konstrukcję bibliotek ChIA-PET przy zastosowaniu mniej niż 16 cykli PCR, co zminimalizowało powstawanie amplikonów i redundancję każdej biblioteki. Niższa redundancja korelowała z większą liczbą unikalnych zmapowanych tagów oraz wysokim odsetkiem użytecznych danych, co umożliwiło stworzenie bardziej kompleksowej mapy oddziaływań chromatyny przy mniejszej liczbie ścieżek sekwencjonowania. Końcowa objętość upakowanych kulek w każdej probówce powinna wynosić odpowiednio 50 μl dla kulek magnetycznych i 100 μl dla kulek Sepharose. Jeśli objętość upakowanych kulek jest mniejsza niż wskazano, należy uzupełnić ją do minimalnej objętości, stosując analogicznie oczyszczone puste kulki magnetyczne lub Sepharose, aby zminimalizować stratę kulek niosących DNA w kolejnych etapach. Do pipetowania kulek Sepharose należy używać końcówek o odciętym czubku lub końcówek z szerokim otworem (large-core tips). 
Wprowadzono następujące modyfikacje w odniesieniu do wcześniej opublikowanego protokołu ChIA-PET 5. Po pierwsze, zastosowano magnetyczne kulki G, aby zminimalizować ubytki próbki podczas etapów przemywania. Ponadto zidentyfikowano nieswoiste prążki o przybliżonych rozmiarach 100 bp i 138 bp jako amplikony samoligowanych półłączników i/lub adaptorów. W związku z tym zmniejszono stężenie biotynylowanych półłączników oraz adaptorów 454 GS20, aby zminimalizować powstawanie nieswoistych prążków podczas amplifikacji PCR. Objętość ligacji bliskościowej zmniejszono z 50 ml do 10 ml, aby ograniczyć straty próbki podczas kolejnych etapów oczyszczania oraz zredukować koszty odczynników. Wydłużono również czas inkubacji w celu unieruchomienia DNA ChIA-PET na kulkach, aby zapewnić maksymalne wychwycenie DNA ChIA-PET przez kulki streptawidynowe.
Podczas etapu ligacji bliskości nieuchronnie powstają ligacje chimeryczne, które nie reprezentują rzeczywistych oddziaływań chromatyny in vivo, a generowane są w sposób nieswoisty i losowy. Z tego powodu, aby ocenić jakość danych z dowolnego eksperymentu ChIA-PET, stopień chimeryzmu szacuje się przy użyciu dwóch różnych półlinkerów ze specyficznymi kodami kreskowymi nukleotydów TAAG i ATGT 5. Po sekwencjonowaniu wysokoprzepustowym sekwencje ChIA-PET są najpierw analizowane pod kątem składu kodów kreskowych linkerów, co pozwala na rozróżnienie sekwencji pochodzących ze specyficznych produktów ligacji od tych pochodzących z nieswoistych produktów ligacji 8. Procent znanych chimer (tj. heterodimerów linkerów AB) obecnych w naszych wewnętrznych bibliotekach ChIA-PET polimerazy RNA II dla linii MCF-7 wynosi mniej niż 15%.
Sekwencje ChIA-PET są następnie klasyfikowane w dwóch kategoriach: PET-ów samoligancyjnych (self-ligation PETs) oraz PET-ów interligancyjnych (inter-ligation PETs). PET-y samoligancyjne powstają w wyniku ligacji z samoczynną cyrkularyzacją fragmentów chromatyny, podczas gdy PET-y interligancyjne pochodzą z ligacji między dwoma różnymi fragmentami DNA. Te ostatnie są następnie dzielone na trzy różne kategorie w zależności od tego, czy odległość genomowa każdego tagu przypada na ten sam chromosom (intrachromosomalne PET-y interligancyjne), czy też oba tagi są mapowane na dwa różne chromosomy (interchromosomalne PET-y interligancyjne). Opracowaliśmy pakiet oprogramowania ChIA-PET tool do sortowania tych różnych kategorii 8. Proces ten opiera się na fragmentach DNA znajdujących się w bibliotece. Zazwyczaj mniejsze fragmenty ChIP zapewniają wyższą rozdzielczość, a wartość odcięcia dla tych bibliotek ChIA-PET polimerazy RNA II wynosi około 4 kb.
Ponadto rzeczywiste oddziaływania chromatyny można odróżnić od szumu losowego poprzez zliczenie liczby PET-ów interligacyjnych w klastrze oddziaływań; innymi słowy, przyjmuje się, że klaster o wysokiej liczbie PET-ów ma większe prawdopodobieństwo bycia rzeczywistym oddziaływaniem chromatyny 8.
Aby odfiltrować wyniki fałszywie dodatnie wynikające z silnie wzbogaconych kotwic, które mogą tworzyć między-ligacyjne PET w wyniku przypadku, sformułowano również ramy analizy statystycznej w celu uwzględnienia przypadkowego powstawania wszelkich między-ligacyjnych PET pomiędzy dwiema kotwicami 8.
Podsumowując, technika ChIA-PET pozwala na mapowanie sieci oddziaływań chromatyny w skali globalnej. Zastosowanie ChIP w metodzie ChIA-PET umożliwia redukcję złożoności biblioteki oraz szumu tła. Dodatkowo ChIP zwiększa specyficzność oddziaływań chromatyny, co pozwala na badanie konkretnych interakcji chromatynowych związanych z określonymi czynnikami transkrypcyjnymi 5.

analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (chia-pet) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Chromatin Interaction Analysis with Paired-End Tag Sequencing (ChIA-PET) for Mapping Chromatin Interactions and Understanding Transcription Regulation

Genomy są zorganizowane w struktury trójwymiarowe, przyjmując konformacje wyższego rzędu w obrębie mikroskopijnych przestrzeni jądrowych 7, 2, 12. Takie architektury nie są przypadkowe i obejmują oddziaływania między promotorami genów a elementami regulacyjnymi 13. Wiązanie czynników transkrypcyjnych do specyficznych sekwencji regulacyjnych prowadzi do powstania sieci regulacji i koordynacji transkrypcji 1, 14.
Metoda analizy oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania tagów końców parzystych (ChIA-PET) została opracowana w celu identyfikacji tych struktur chromatyny wyższego rzędu 5,6. Komórki są utrwalane, a oddziałujące loci są wychwytywane dzięki kowalencyjnym wiązaniom krzyżowym DNA-białko. Aby zminimalizować szum nieswoisty i zmniejszyć złożoność, a także zwiększyć swoistość analizy oddziaływań chromatyny, stosuje się immunoprecypitację chromatyny (ChIP) przeciwko specyficznym czynnikom białkowym w celu wzbogacenia fragmentów chromatyny budzących zainteresowanie przed ligacją bliskościową. Ligacja z udziałem pół-linkerów tworzy następnie kowalencyjne wiązania między parami fragmentów DNA powiązanych ze sobą w obrębie poszczególnych kompleksów chromatyny. Flankujące miejsca restrykcyjne enzymu MmeI w pół-linkerach umożliwiają ekstrakcję konstruktów tag-linker-tag końców parzystych (PET) po trawieniu enzymem MmeI. Ponieważ pół-linkery są biotynilowane, konstrukty PET są oczyszczane przy użyciu magnetycznych kulek z streptawidyną. Oczyszczone PET-y są ligowane z adaptorami do sekwencjonowania nowej generacji, a katalog oddziałujących fragmentów jest generowany za pomocą sekwenatorów nowej generacji, takich jak Illumina Genome Analyzer. Następnie przeprowadzana jest analiza mapowania i bioinformatyczna w celu identyfikacji miejsc wiązania wzbogaconych metodą ChIP oraz oddziaływań chromatyny wzbogaconych metodą ChIP 8.
Przygotowaliśmy materiał wideo, aby zaprezentować krytyczne aspekty protokołu ChIA-PET, w szczególności przygotowanie ChIP, ponieważ jakość ChIP odgrywa kluczową rolę w końcowym wyniku biblioteki ChIA-PET. Ze względu na bardzo długi charakter protokołów, w filmie przedstawiono jedynie najważniejsze etapy.

Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania parowanych końców (ChIA-PET) jest metodą detekcji oddziaływań chromatyny de novo, służącą lepszemu zrozumieniu kontroli transkrypcyjnej.

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Genomy są zorganizowane w struktury trójwymiarowe, przyjmując konformacje wyższego rzędu wewnątrz mikronowych przestrzeni jądrowych 7, 2, 12. Takie ...

Analiza oddziaływań COMIN z wykorzystaniem sekwencjonowania proszków i tagów jest metodą analizy długozasięgowych oddziaływań COMIN w obrębie całego genomu. W skrócie nazywamy tę metodę magic share pad. Metoda ta obejmuje wiele etapów biologii molekularnej i może być skomplikowana.W związku z tym w poniższym filmie przedstawimy kluczowe etapy immunoprecypitacji chromatyny oraz konstrukcji biblioteki do analizy ChIA-PET. Immunoprecypitacja chromatyny, znana jako ChIP, jest pierwszym krytycznym krokiem w tworzeniu biblioteki ChIA-PET. Na tym etapie próbki chromatyny z hodowli komórkowych są sieciowane, sonikowane i poddawane immunoprecypitacji.Następnie oddzielne alikwoty DNA z chipa są ligowane z barkodowanymi pół-linkerami, a następnie przeprowadzana jest ligacja proksymalna. Fragmenty Pets są uwalniane poprzez trawienie restrykcyjne, oczyszczane na powlekanych koralikach magnetycznych i ligowane z adapterami do sekwencjonowania nowej generacji. Chimerowe fragmenty Pets są identyfikowane na podstawie składu linkera AB oraz flankujących tagów.Sekwencje centralnego łącznika są odczytywane i mapowane do genomu. W tym filmie zaprezentujemy standardowy protokół ChIP rutynowo stosowany w naszym laboratorium na linii komórkowej raka piersi MCF7. Z naszych danych wynika, że wyższy stopień wzbogacenia w metodzie ChIP przy użyciu specyficznych przeciwciał pozwala uzyskać lepsze wyniki ChIP-seq. Dlatego stanowczo zalecamy optymalizację protokołu ChIP oraz walidację wzbogacenia za pomocą qPCR.Przed przystąpieniem do konstrukcji biblioteki ChIP-seq, komórki CF7 są hodowane do około 75% konfluencji w naczyniu hodowlanym o powierzchni 500 cm², zawierającym około 20 milionów komórek przed sieciowaniem. Odrzucić pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki ciepłym PBS. Utrwalić komórki świeżo przygotowanym 1,5 mM EGS przez 45 minut na rotatorze w temperaturze pokojowej. Dodać 37% formaldehyd do końcowego stężenia 1% i inkubować przez 20 minut.Wydajność sieciowania jest kluczowa i różni się w zależności od linii komórkowych oraz badanego białka. Należy zoptymalizować stężenie czynnika sieciującego, czas inkubacji oraz temperaturę. Reakcję sieciowania należy przerwać, dodając glicynę do stężenia końcowego 200 millimolar i inkubując przez 10 minut.Usunąć zneutralizowane sieciujące i przemyć dwa razy zimnym PBS. Odwirować komórki w wirówce laboratoryjnej z chłodzeniem, aby uzyskać osad komórkowy. Osad jest teraz gotowy do lizy komórek. Alternatywnie, zamrozić osad w temperaturze -80 °C. Jeśli osad komórkowy jest zamrożony, rozmrozić go na lodzie przed przystąpieniem do lizy komórek, a następnie resuspender osad w buforze do lizy z 0,1% SDS.Wiruj probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza w wirówce chłodzącej, odlej supernatant i powtórz lizę komórek. Następnie przeprowadź lizę jąder w celu uwolnienia sieciowanej chromatyny przed jej fragmentacją. Brak błony jądrowej pozwala na sonikację sieciowanej chromatyny w łagodniejszych warunkach.Resuspensować pellet jądrowy w 1% buforze lizującym SDS. Przenieść zawiesinę do probówki do wirówki wysokich prędkości. Wirować probówkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Usuń szczątki jądrowe za pomocą wirowania. Osad chromatyczny powinien wyglądać w ten sposób. Użyj końcówki do pipety P 1000, aby rozbić osad na mniejsze części, a następnie przemyj go dwukrotnie buforem do lizy z 0,1% SDS.Wiruj probówkę w temperaturze 4 °C w wirówce z chłodzeniem. Osad jądrowy jest teraz gotowy do sonikacji. Alternatywnie, zamroź osad w temperaturze -80 °C.Przenieś pellet do przezroczystej probówki. Dodaj do pelletu bufor lizującego z 0,1% SDS i usuń wszystkie pęcherzyki powietrza. Przez cały czas sonikacji utrzymuj próbki w niskiej temperaturze, aby zapobiec ich przegrzaniu. Na efektywność sonikacji mogą wpływać różne warunki, takie jak objętość buforu, głębokość zanurzenia sondy, moc sonikacji, liczba cykli oraz stopień sieciowania.Przeprowadzić odwrócenie sieciowania i alikwotowanie chromatyny przy użyciu proteinazy K, a następnie wykonać elektroforezę w żelu agarozowym. W celu weryfikacji efektywności fragmentacji zaleca się optymalizację, aby uzyskać pożądany zakres wielkości DNA między 200 a 600 pz. Usunąć resztki komórkowe poprzez wirowanie.Chromatyna jest teraz gotowa do wstępnego oczyszczania za pomocą kulek magnetycznych. Alternatywnie proces można zatrzymać w temperaturze -80 °C do czasu zebrania odpowiedniej ilości chromatyny. Aby rozpocząć procedurę ChIP, należy przemyć kulki trzykrotnie buforem do przemywania kulek; ten oraz wszystkie kolejne etapy przemywania z użyciem magnetycznych kulek białkowych obejmują następujące kroki.Dodaj sonikowaną chromatynę do wstępnie przemytych kulek i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w oddzielnej probówce. Pokryj wstępnie przemyte kulki przeciwciałem i inkubuj przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przemyj kulki pokryte przeciwciałem dwukrotnie buforem do przemywania kulek.Wysoka złożoność substratu dla ligacji bliskościowej nieuchronnie prowadzi do znacznego szumu nieswoistego, co zwiększa koszt sekwencjonowania. Poza redukcją poziomu złożoności i szumu tła, wykorzystaliśmy monoklonalne przeciwciało przeciwko polimerazie RNA II mysiej w celu zidentyfikowania oddziaływań chromatyny zaangażowanych w regulację transkrypcji.Umożliwia to badanie aktywnych promotorów i odpowiadających im regionów regulacyjnych, co pozwala na zrozumienie wydajnej i prawdopodobnie kooperatywnej transkrypcji. Usunąć bufor płuczący z kulek powlekanych przeciwciałami. Połączyć oczyszczoną chromatynę z kulkami powlekanymi przeciwciałami i inkubować przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji nocnej kulki poddać serii płukań w celu usunięcia niezwiazanej chromatyny, a następnie zawiesić kulki w buforze TE. Odobrać niewielką ilość do ilościowej kontroli wzbogacenia. Analiza oddziaływań chromatyny za pomocą sekwencjonowania pad i tag jest techniką opracowaną do wielkoskalowej analizy de novo oddziajujących struktur chromatyny wyższego rzędu.Fragmenty DNA wzbogacone poprzez immunoprecypitację chromatyny są przechwytywane za pomocą ligacji bliskościowej. Strategia z wykorzystaniem „padów” i „tagów” (pad and tag) jest stosowana do konstrukcji bibliotek CHI-PET, które są sekwencjonowane przy użyciu wysokoprzepustowych technologii sekwencjonowania nowej generacji. W tym filmie przedstawimy kluczowe aspekty eksperymentalne konstrukcji biblioteki CHI-PET.Pierwsza połowa procesu tworzenia biblioteki polega na manipulowaniu kuleczkami białka A lub G, do których przyłączone są fragmenty DNA, w celu usunięcia enzymów i soli buforowej. Po każdej reakcji enzymatycznej, na każdym etapie przemywania, należy zastosować delikatne wirowanie oraz lekkie uderzanie dnem probówki. Aspiruj naddestydat pipetą kilka razy, aby maksymalnie odzyskać kuleczki po ich przyciągnięciu przez magnes.Koncentrator do wszystkich etapów inkubacji zawierających kuleczki w mieszaninie reakcyjnej. Przygotuj wcześniej master mix i dodaj enzym na samym końcu, po jednorodnym resuspensowaniu kuleczek. Upewnij się, że kuleczki są dobrze wymieszane przez cały czas trwania inkubacji. Połowiczne oligonukleotydy łącznikowe są zaprojektowane z wewnętrznym kodem kreskowym składającym się z czterech nukleotydów oraz sekwencją rozpoznawczą dla enzymu restrykcyjnego typu II MME1.Po ligacji półłączników do przytwierdzonych fragmentów DNA w kompleksach chromatyny C, oddziałujące fragmenty DNA zostaną połączone pełną sekwencją łącznika. Półłączniki te generują sekwencje z heterodimerycznymi łącznikami ab pochodzącymi z niespecyficznych produktów ligacji lub sekwencje z homodimerami, łącznikami AA lub BB pochodzącymi ze specyficznych produktów ligacji. Zatem zastosowanie dwóch półłączników z różnymi kodami kreskowymi nukleotydowymi umożliwia specyfikację różnych eksperymentów lub powtórzeń, a także monitorowanie szybkości niespecyficznych ligacji chimerycznych pomiędzy różnymi kompleksami na chipie.Ważne jest, aby przygotować reakcję w lodzie oraz delikatnie rozmrozić pół-linkery (half linkers) w lodzie. Dokładnie połącz pół-linkery z wodą, a następnie z PEG zawierającym bufor ligazowy. Przed resuspensją upewnij się, że master mix został dobrze wymieszany.Do zawiesiny chip DNA dodaj ligazę DNA T4 dopiero po dokładnym wymieszaniu półlinkerów i fragmentów chip DNA, aby zapobiec konkatenacji półlinkerów. Zamknij probówkę parafimem. Inkubuj przez noc w temperaturze 16 °C przy jednoczesnej rotacji. Kompleksy nienaruszonej chromatyny są następnie eluowane z koralików poprzez dodanie SDS w buforze EB. Aby obniżyć stężenie SDS, do eluatowego DNA dodano Triton X 100 w celu zneutralizowania SDS. Cyrkularyzacja kompleksów chromatyny jest ułatwiona przez ligację dwóch półlinkerów, co tworzy pełną sekwencję linkera w miejscu połączenia interakcji. Liguj eluowane kompleksy chromatyny w warunkach ekstremalnie niskiego stężenia, aby zminimalizować ligacje między różnymi kompleksami DNA-białko, dodając ligazę DNA T4 dopiero po dokładnym rozcieńczeniu eluowanych kompleksów chromatyny w mieszaninie reakcyjnej. Po odwróceniu sieciowania (reverse cross-linking), w celu usunięcia białek związanych z DNA, oczyść cyrkularyzowane fragmenty DNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Do łatwej separacji zastosuj system żelowy KaiGen PhaseLock.Po ekstrakcji fenolem użyj nośnika DNA glyco blue A, aby zwiększyć masę i widoczność osadu. Połowy oligonukleotydów łączących zawierają flankujące miejsca rozpoznawania MME1. Typ II enzymu restrykcyjnego MME1 przecina sekwencję 18 i 20 par zasad w kierunku downstream od swoich miejsc wiązania docelowego, aby wygenerować krótkie tagi fragmentu chromatyny, tworząc konstrukty tagu łączącego PET, skrócone jako pets.Dodatkowo, każdy z połowicznych łączników jest modyfikowany biotyną, aby umożliwić oczyszczanie konstruktów pet za pomocą magnetycznych kulek powlekanych streptawidyną. Przeprowadź jedno trawienie MME w celu uwolnienia konstruktów z tagiem Linker. Oczyść pet poprzez selektywne wiązanie z kuleczkami streptawidyny, a następnie liguj konstrukty pet z adapterami do sekwencjonowania wysokoprzepustowego.Użyj polimerazy DNA typu fusion do amplifikacji fuzji biblioteki CHI PET. Polimeraza DNA jest wykorzystywana do generowania matryc z wysoką dokładnością i wydajnością. Przygotuj reakcję PCR w warunkach chłodniczych, dodając polimerazę DNA typu fusion na samym końcu.Ponieważ enzym wykazuje aktywność egzonukleazy 3'→5', która może degradować primery w przypadku braku dNTP, należy zachować ostrożność. Jeśli biblioteka Charpet została zbudowana pomyślnie, powinien pojawić się wyraźny, dobrze zdefiniowany prążek o wielkości około 223 par zasad. Podczas wycinania prążka o wielkości 223 par zasad z żelu należy unikać prążków nieswoistych, a następnie oczyścić wycięty prążek zgodnie z protokołem Gel Crush.Przed sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym należy przeprowadzić kontrolę jakości za pomocą bioanalizatora Agilent 2100 z zestawem DNA 1000. Przedstawiliśmy procedurę CHI PET do bezstronnej detekcji oddziaływań chromatyny w całym genomie. Jakość danych CHI PET zależy od skuteczności zastosowanego przeciwciała na chipie oraz głębokości sekwencjonowania.W niniejszej procedurze wykorzystujemy od 18 do 20 milionów odczytów do mapowania oddziaływań. Ten konkretny protokół został z powodzeniem zastosowany do charakterystyki sieci oddziaływań chromatyny wiązanych przez receptor estrogenowy i polimerazę RNA w genomie ludzkim. Przewidujemy, że badanie to będzie potężnym narzędziem w przyszłych studiach nad trójwymiarową architekturą biologii transkrypcji w kontekście całego genomu.Mamy nadzieję, że ten film okaże się dla Państwa pomocny. Dziękujemy za oglądanie.I.

chromatin-interaction-analysis-with-paired-end-tag-sequencing-chia

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza interakcji chromatinu z sekwencjonowaniem znaków końcowych (ChIA-PET) do odwzorowywania interakcji chromatinu i rozumienia regulacji transkrypcji

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Pytanie o to, jak regulatory chromatyny i stany chromatyny wpływają na genom in vivo, jest kluczowe dla naszego zrozumienia, jak wcześnie podejmowane są decyzje dotyczące losu komórki w rozwijającym się zarodku. ChIP-Seq – najpopularniejsze podejście do badania cech chromatyny na poziomie globalnym – zostało przedstawione tutaj dla zarodków Xenopus.

Migawka całego genomu regulatorów i stanów chromatyny w zarodkach Xenopus za pomocą ChIP-Seq

Immunoprecypitacja chromatyny to potężna technika identyfikacji miejsc wiązania DNA białek Arabidopsis in vivo. Procedura ta obejmuje sieciowanie i fragmentację chromatyny, immunoprecypitację selektywnymi przeciwciałami przeciwko białku będącemu przedmiotem zainteresowania oraz analizę qPCR związanego DNA. Opisujemy prosty test ChIP zoptymalizowany dla roślin Arabidopsis.

Test immunoprecypitacji chromatyny do identyfikacji interakcji białko-DNA Arabidopsis in vivo

Opisujemy endogenne rozszczepienie chromatyny połączone z sekwencjonowaniem wysokoprzepustowym (ChEC-seq), ortogonalną metodą immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) do mapowania miejsc wiązania białek w całym genomie za pomocą białek fuzyjnych nukleazy mikrokokowej (MNazy).

Mapowanie całego genomu interakcji białko-DNA z sekwencją ChEC u Saccharomyces cerevisiae

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół sekwencjonowania ChIP o wysokiej przepustowości oraz potok analiz obliczeniowych do określania wzorców stanu chromatyny w całym genomie z zamrożonych tkanek nowotworowych i linii komórkowych.

Zintegrowana platforma do mapowania stanów chromatyny w całym genomie przy użyciu wysokoprzepustowego sekwencjonowania ChIP w tkankach nowotworowych

Tutaj opisujemy metody wykonywania ChIP-Seq i CARIP-Seq, w tym przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania nowej generacji, do generowania globalnych epigenomicznych i związanych z chromatyną map RNA w komórkach ES.

CARIP-Seq i ChIP-Seq: Metody identyfikacji RNA związanych z chromatyną i interakcji białko-DNA w embrionalnych komórkach macierzystych

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Opisujemy krok po kroku protokół sekwencjonowania immunoprecypitacji chromatyny tandemowej (tChIP-Seq), który umożliwia analizę specyficznej dla typu komórki modyfikacji histonów w całym genomie.

TChIP-Seq: Profilowanie epigenomu specyficzne dla typu komórki

Precyzyjne określenie miejsc wiązania białek w całym genomie jest ważne dla zrozumienia regulacji genów. W tym miejscu opisujemy metodę mapowania genomu, która traktuje DNA immunoprecypitowane chromatyną za pomocą trawienia egzonukleazą (ChIP-exo), a następnie sekwencjonowania o wysokiej przepustowości. Metoda ta wykrywa interakcje białko-DNA z rozdzielczością mapowania par zasad bliską i wysokim stosunkiem sygnału do szumu w neuronach ssaków.

Mapowanie w wysokiej rozdzielczości interakcji białko-DNA w neuronach pochodzących z mysich komórek macierzystych przy użyciu immunoprecypitacji chromatyny i egzonukleazy (ChIP-Exo)

Przedstawiamy tutaj szybki i prosty protokół ATAC-seq do zaimplementowania w całym robaku Caenorhabditis elegans na etapie L4, używając tylko 30 µL pelletu z dżdżownic.

Analiza dostępności chromatiny w całym Caenorhabditis elegans larw L4

Przedstawiamy tutaj protokół umożliwiający wychwycenie interakcji chromatyny DNA z RNA w celu mapowania trójwymiarowej organizacji genomu powiązanej z RNA.

Metoda interakcji chromatyny DNA z DNA związanej z RNA

Poznaj metodę ChIA-PET do analizy interakcji chromatyny i badania regulacji transkrypcji. Technika łączy immunoprecypitację chromatyny z sekwencjonowaniem nowej generacji, umożliwiając mapowanie interakcji na skalę genomową.

Analiza interakcji chromatyny z sekwencjonowaniem znaczników na sparowanych końcach (ChIA-PET) w celu mapowania interakcji chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji (Wideo) | JoVE Journal

Analiza oddziaływań chromatyny z sekwencjonowaniem parowanych końców (ChIA-PET) w celu mapowania oddziaływań chromatyny i zrozumienia regulacji transkrypcji

Przeglądaj więcej filmów