Name: Biopsja dziurkacza skóry Hodowla eksplantatów w celu uzyskania pierwotnych ludzkich fibroblastów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: Poznaj metodę hodowli eksplantatów fibroblastów z biopsji skóry w celu uzyskania pierwotnych ludzkich komórek. Protokół ten umożliwia bankowanie 15-20 milionów komórek przy niskim numerze pasma w ciągu 4-8 tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Opracowanie niniejszego protokołu zostało sfinansowane przez California Institute for Regenerative Medicine (CIRM, TR1-01246) oraz Parkinson Alliance.

Wyciętą biopsję skóry, pobraną zgodnie ze standardową procedurą3 (np. przy użyciu 4mm okrągłego instrumentu Visipunch), należy przechowywać w lodzie w pełnej pożywce DMEM z 20% FBS. Po dostarczeniu próbki do laboratorium należy niezwłocznie przystąpić do obróbki biopsji.
1. Przygotowanie biopsji skóry wyciętej wykrawaczem
KROKI 1.1- 1.3 NALEŻY WYKONAĆ W KOMORZE ZAPEWNIANIA BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO
<ol>
 <li>Przygotowanie wstępne: Do każdej studni płytki 6-dołkowej dodać 1 ml 0,1% żelatyny. Pozostawić płytkę na 30–60 min. Odessać roztwór żelatyny i do każdej studni dodać 800 μl pełnej pożywki DMEM/20% FBS. Upewnić się, że cała powierzchnia studni jest pokryta pożywką.</li>
 <li>Odwrócić pokrywkę sterylnej 10 cm naczynia do hodowli tkanek, na środek pokrywki nanieść 1,5 ml pożywki DMEM/20% FBS i rozprowadzić kroplę pożywki za pomocą końcówki pipety serologicznej.</li>
 <li>Za pomocą sterylnej pęsety umieścić wycinek biopsji skóry w pożywce na pokrywce naczynia.</li>
</ol>
2. Disekcja wycinka skóry pobranego biopsją
KROKI 9 2.1-2.2 NALEŻY WYKONAĆ W POZIOMEJ KOMORZE Z PRZEPŁYWEM LAMINARNYM
<ol>
 <li>Umieść dno szalki 10 cm na odwróconej pokrywie, a następnie przenieś biopsjat skóry pod mikroskop stereoskopowy w komorze z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Podziel okrągły biopsjat skóry o średnicy 4 mm na 12-15 równych kawałków o ostrych krawędziach, dzieląc go na równe połowy; użyj jednego skalpela do przytrzymania biopsjatu, a drugiego do cięcia ruchem toczącym w jednym kierunku. Kawałki o poszarpanych krawędziach przyczyniają się do słabej adhezji i ograniczonego wzrostu komórek.</li>
</ol>
3. Przeniesienie wypreparowanych fragmentów biopsji skóry do płytek hodowlanych
KROKI 3.1-3.6 NALEŻY WYKONAĆ W KOMORZE BEZPIECZEŃSTWA BIOLOGICZNEGO
<ol>
 <li>Umieścić dno 10 cm szalki do hodowli tkankowej na odwróconej pokrywie, a następnie przenieść szalkę z powrotem do komory z laminarnym przepływem powietrza.</li>
 <li>Za pomocą pęsety z ostrym końcem umieścić 2-3 fragmenty biopsji w każdym dołku przygotowanej płytki 6-dołkowej zawierającej 800 μl medium, unikając dołków suchych. Aby fragmenty przywarły do dna dołka, należy zastosować delikatne opukiwanie lub przesuwanie. Do usunięcia fragmentów biopsji z pęsety można użyć skalpela.</li>
 <li>Umieścić płytkę 6-dołkową w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Przez pierwszy tydzień codziennie monitorować obecność cienkiej warstwy medium na dnie dołków; co 2 dni dodawać ~200 μl w celu uzupełnienia odparowanego medium.</li>
 <li>Po tygodniu zwiększyć objętość medium do 2 ml kompletnego DMEM/20%FBS i wymieniać medium co 2-3 dni.</li>
 <li>Gdy fibroblasty w każdym dołku osiągną konfluencję i zaczną docierać do krawędzi dołka, przeprowadzić trypsynizację i przelać zawartość płytki 6-dołkowej do 2x kolb T75 (pasaż 1). Można również przenieść fragmenty tkanki; nie przywrą one do dna i zostaną wypłukane podczas następnej wymiany medium.</li>
 <li>Po osiągnięciu konfluencji przez fibroblasty, przenieść je do 3x kolb T175 (pasaż 2) lub zamrozić w kompletnym medium DMEM z dodatkiem 10% DMSO w stężeniu 1x106 cells/ml na fiolkę.</li>
</ol>
4. Charakterystyka fibroblastów za pomocą immunobarwienia
<ol>
 <li>Hodować fibroblasty w 8-dołkowych szkiełkach z komorami pokrytych żelatyną.</li>
 <li>Gdy komórki osiągną 80% konfluencji, odessać medium z każdej dołki.</li>
 <li>Utrwalić komórki w 4% Paraformaldehydzie przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.</li>
 <li>Permeabilizować komórki, dodając 150 μl 0,3% Triton X-100 (w PBS) na 5 min w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.</li>
 <li>Dodać 200 μl roztworu blokującego (PBS + 5% Normal Goat Serum (Vector, S-1000)) na 1 h w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przygotować rozcieńczenie 1:250 Anti-SERPHIN-1 (Anti-rabbit, mAB, Sigma, S5950-200 μl) w roztworze blokującym.</li>
 <li>Odessać roztwór blokujący i dodać 150 μl rozcieńczenia 1:250 AntiSERPINH-1. Inkubować przez 1-2 h w temperaturze pokojowej lub w 4 °C przez noc.</li>
 <li>Przemyć dołki 3 razy 1X PBS.</li>
 <li>Przygotować rozcieńczenie 1:200 koziego przeciwciała monoklonalnego przeciw króliczym (Alexa Fluor Goat anti-rabbit IgG(H+L), Invitrogen, A11008) w roztworze blokującym.</li>
 <li>Dodać 150 μl rozcieńczenia 1:200 koziego przeciwciała monoklonalnego przeciw króliczym do każdej dołki. Inkubować przez 1 h w ciemności w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Przemyć dołki raz 1xPBS.</li>
 <li>Odessać PBS i ostrożnie zdjąć komory, aby odsłonić samo szkiełko.</li>
 <li>Zamontować preparat, dodając 2-3 krople medium montażowego zawierającego DAPI (Vector, H-1200).</li>
 <li>Analizować preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRK2+mutant+iPSC-derived+DA+neurons+demonstrate+increased+susceptibility+to+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress.</a> Cell Stem Cell. 8, 267-280 (2011).</li>
<li>Mak, S. K., Tewari, D., Tetrud, J. W., Langston, J. W., Schule, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+skin+fibroblasts+from+a+Parkinson%27s+disease+patient+with+an+alpha-synuclein+triplication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parkinson%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in skin fibroblasts from a Parkinson's disease patient with an alpha-synuclein triplication.</a> Journal of Parkinson's Disease. 1, 175-183 (2011).</li>
<li>Punch Zuber, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((biopsy+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+Fam.+Physician%22%5BJournal%5D)">biopsy of the skin.</a> Am. Fam. Physician. 65, 1155-1164 (2002).</li>
<li>Takashima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+fibroblast+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Establishment of fibroblast cultures.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 2, Unit 2, 1(2001).</li>
<li>Kuroda, K., Tajima, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP47+is+a+useful+marker+for+skin+fibroblasts+in+formalin-fixed%2C+paraffin+embedded+tissue+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cutan.+Pathol%22%5BJournal%5D)">HSP47 is a useful marker for skin fibroblasts in formalin-fixed, paraffin embedded tissue specimens.</a> J. Cutan. Pathol. , 241-246 (2004).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Za pomocą niniejszego protokołu można uzyskać stosunkowo czyste hodowle fibroblastów skóry. Fibroblasty charakteryzują się typową morfologią w postaci wydłużonych, wrzecionowatych ciał komórkowych oraz okrągłych lub owalnych jąder komórkowych; po osiągnięciu konfluencji fibroblasty rosną w uporządkowany sposób, tworząc pęczki. Stosowane medium wspomaga wzrost fibroblastów, podczas gdy inne populacje komórek, np. keratynocyty, wymagają dodatkowych suplementów i czynników wzrostu lub wykazują mniejszą aktywność mi...

<table><tbody><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica</td><td>S6E</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petri do hodowli tkanek 10 cm</td><td>VWR</td><td>25382-166</td><td></td></tr><tr><td>płytka do hodowli tkankowej 6-dołkowa </td><td>VWR</td><td>73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe sterylne skalpele ze stali nierdzewnej (2), ostrze nr 15, Miltex</td><td>VWR</td><td>21909-660</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna pęseta z ostrymi końcówkami</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 2 ml</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>VWR</td><td>89130-896</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>VWR</td><td>89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Pipety Pasteura</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. Jako profesjonalny tłumacz treści naukowych i edukacyjnych JoVE, jestem gotowy przetłumaczyć materiały na język polski, zachowując najwyższe standardy akademickie, precyzję terminologiczną oraz naturalny styl protokołów badawczych.&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela A. Tabela specyficznych odczynników i sprzętu.&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td>1X DMEM: wysoka zawartość glukozy</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>20% płodowa surowica bydlęca</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1X L-glutamina</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>25030-164</td><td></td></tr><tr><td>1X MEM nieessentialne aminokwasy </td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>11140-076</td><td></td></tr><tr><td>1X penicylina/streptomycyna</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;krok_jove&quot;&gt;&lt;silny&gt;Tabela B. Odczynniki.&lt;/strong&gt; &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Skin Punch Biopsy Explant Culture for Derivation of Primary Human Fibroblasts

Tkanki i linie komórkowe pochodzące od osoby chorej są idealnym źródłem do badania fenotypów komórkowych związanych z chorobą. Fibroblasty pochodzące od pacjenta wykorzystane w niniejszym protokole zostały z sukcesem użyte do otrzymywania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu modelowania chorób1. Wczesne pasażowanie tych fibroblastów można również wykorzystać w funkcjonalnych testach komórkowych do badania specyficznych szlaków i mechanizmów chorobowych2 oraz w późniejszych podejściach do przesiewania leków. Przewagą przedstawionego protokołu nad procedurami enzymatycznymi jest 1) powtarzalność techniki przy małych ilościach tkanki pochodzącej od starszych pacjentów, np. pacjentów cierpiących na chorobę Parkinsona, 2) techniczna prostota podejścia w porównaniu z bardziej wymagającymi metodologiami wykorzystującymi traktowanie enzymatyczne oraz 3) kwestia czasu: protokół ten trwa 15-20 min i może być wykonany natychmiast po otrzymaniu biopsji. Traktowanie enzymatyczne może trwać do 4 hr i wiąże się z problemami nadmiernego trawienia, obniżeniem żywotności komórek oraz problemami z późniejszą adhezją komórek, jeśli proces nie jest przeprowadzony prawidłowo. Niniejszy protokół opisuje sekcję i przygotowanie 4-mm biopsji skóry ludzkiej w celu otrzymania hodowli fibroblastów i charakteryzuje się bardzo wysokim wskaźnikiem sukcesu, co jest istotne przy pracy z próbkami tkanek pochodzącymi od pacjentów. W tej hodowli keratynocyty migrują z tkanki biopsyjnej w ciągu pierwszego tygodnia po przygotowaniu. Fibroblasty pojawiają się 7-10 dni po pierwszym wzroście keratynocytów. Pożywka DMEM high glucose uzupełniona o 20% FBS sprzyja wzrostowi fibroblastów nad keratynocytami, w wyniku czego fibroblasty zdominują keratynocyty. Po 2 pasażach keratynocyty zostają rozcieńczone, co prowadzi do powstania stosunkowo homogenicznych hodowli fibroblastów wykazujących ekspresję markera fibroblastów SERPINH1 (HSP-47). Stosując to podejście, w ciągu 4-8 tygodni można uzyskać 15-20 milionów fibroblastów do bankowania komórek. Sekcja skóry trwa około 15-20 min, następnie komórki są monitorowane raz dziennie pod mikroskopem, a pożywka jest wymieniana co 2-3 dni po adhezji i wzroście komórek.

Keratynocyty wyrastają z fragmentów biopsji już 48 h po wycięciu. Pierwszy wzrost fibroblastów można zaobserwować około tygodnia po przetworzeniu. Po osiągnięciu przez dołki pełnej konfluencji, fibroblasty są pasażowane dwukrotnie, aby uzyskać trzy kolby 150 cm (T150), a następnie komórki są kriokonserwowane. Metodą tą uzyskujemy 15-20 milionów komórek. Fibroblasty są dodatnie w kierunku przeciwciał anty-SERPINH1 (znanego również jako HSP-47) (Rycina 1), który jest swoistą dla kolagenu molekularną chaper...

Protokół hodowli eksplantów fibroblastów z biopsji wycinanych ze skóry ludzkiej jest technicznie niezawodną i prostą metodą pozyskiwania komórek skóry w ciągu 4-8 tygodni w celu zamrożenia około 15-20 milionów komórek o niskim numerze pasażu.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Tkanki i linie komórkowe pochodzące od osoby z chorobą stanowią idealne źródła do badania fenotypów komórkowych związanych z daną jednostką chorobową. Fibroblasty pochodzące od pacjentów...

Witam. Zapraszamy do wideo-samouczka dotyczącego przetwarzania biopsji skóry. Rozpocznij od umieszczenia wymaganych materiałów w komorze do hodowli tkankowej. Wszystkie przedmioty wprowadzane do komory muszą zostać spryskane 70% etanolem i przetarte. Oznacz płytkę numerem PI, datą, inicjałami oraz rodzajem pożywki. Nalej 1 mL 0.1% żelatyny na każdą ściankę, a następnie zakręć płytką, aby upewnić się, że dno jest pokryte żelatyną.Pozostaw płytkę na godzinę przed użyciem. Pierwszym krokiem jest przeniesienie biopsji z probówki do naczynia do cięcia. Naczyniem do cięcia jest pokrywka płytki Petriego o średnicy 10 centymetrów, na której zostanie przeprowadzona dysekcja biopsji.Do środka naczynia do wycinania należy dodać 1,5 milliliter DMEM 20%FBS. Rozprowadzić medium od środka na zewnątrz. Tutaj widoczna jest biopsja skóry.Kolejnym krokiem jest przeniesienie biopsji z probówki do centrum naczynia do cięcia. Używając sterylnej pęsety, umieść fragment biopsji skóry w centrum. Należy zachować ostrożność podczas tej czynności; utrzymanie sterylności jest niezbędne.Przykryć naczynie do cięcia i przenieść je pod mikroskop sekcyjny w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Kolejnym krokie

skin-punch-biopsy-explant-culture-for-derivation-primary-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Kultura eksplantatu z biopsji wycinka skóry do uzyskania pierwotnych fibroblastów ludzkich

Fibroblasty pobrane od pacjentów z mutacjami w genach odpowiedzialnych za chorobę Parkinsona stanowią łatwo dostępny model ex vivo do badania fenotypów związanych z tą chorobą. Obrazowanie żywych komórek daje możliwość analizy parametrów morfologicznych i funkcjonalnych w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy przygotowanie ludzkich fibroblastów oraz późniejsze monitorowanie fenotypów mitochondrialnych.

Wykorzystanie pierwotnych ludzkich fibroblastów do monitorowania fenotypów mitochondrialnych w badaniach nad chorobą Parkinsona

Opisujemy metodę izolowania naiwnych multipotencjalnych komórek prekursorowych pochodzenia skórnego (SKP) z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów. Pokazujemy, że te SKP pochodzące z kultur fibroblastów mają podobne właściwości komórek macierzystych do tych pochodzących bezpośrednio z biopsji ludzkiej skóry. Komórki te wyrażają marker grzebienia nerwowego, nestynę, oprócz markerów multipotencjalnych, takich jak OCT4 i Nanog.

Izolacja naiwnych dorosłych komórek macierzystych z pierwotnych kultur ludzkich fibroblastów

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Solidne pochodzenie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS) zostało osiągnięte dzięki zastosowaniu nieintegrującego wirusa Sendai (SeV) wektorowego przeprogramowania fibroblastów skóry. Utrzymanie komórek hiPS i ekspansja klonalna przeprowadzono przy użyciu wolnych od ksenotypów i chemicznie zdefiniowanych warunków hodowli z rekombinowaną ludzką lamininą 521 (LN-521) i podłożem Essential E8 (E8).

Bezintegracyjne wyprowadzanie indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu matrycy Laminin 521

Przeprogramowanie komórek wymaga wprowadzenia kluczowych genów, które regulują i utrzymują pluripotencjalny stan komórki. Opisany protokół umożliwia tworzenie kolonii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) z ludzkich fibroblastów skóry bez metod wirusowych/integrujących, ale przy użyciu niemodyfikowanych RNA (NM-RNA) w połączeniu z czynnikami unikania odporności zmniejszającymi mechanizmy obrony komórkowej.

Izolacja dorosłych ludzkich fibroblastów skórnych ze skóry brzucha i wytwarzanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu metody nieintegrującej

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Ten artykuł opisuje metodę opartą na hodowli eksplantatów do izolacji i hodowli pierwotnych, specyficznych dla pacjenta ludzkich komórek mięśni gładkich aorty i fibroblastów skóry. Ponadto przedstawiono nowatorską metodę pomiaru skurczu komórek i późniejszej analizy, która może być wykorzystana do badania specyficznych dla pacjenta różnic w tych komórkach.

Izolacja pierwotnych komórek mięśni gładkich aorty specyficznych dla pacjenta i półilościowe pomiary skurczu w czasie rzeczywistym in vitro

Badanie gojenia się ran związanych z urazami mięśniowo-szkieletowymi często wymaga oceny interakcji in vitro między komórkami Schwanna (SC), keratynocytami i fibroblastami. Protokół ten opisuje izolację, hodowlę i charakterystykę tych pierwotnych komórek z ludzkiego napletka.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych komórek Schwanna, keratynocytów i fibroblastów z ludzkiego napletka

To badanie opisuje zoptymalizowany protokół tworzenia pierwotnych fibroblastów z tkanek keloidowych, które mogą skutecznie i stabilnie dostarczać czystych i żywotnych fibroblastów.

Izolacja, hodowla i charakterystyka pierwotnych fibroblastów skórnych z ludzkiej tkanki keloidowej

Ten manuskrypt opisuje dwuetapowy protokół generowania specyficznych dla pacjenta podocytów z fibroblastów skóry poprzez episomalne przeprogramowanie w indukowane przez człowieka pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) i późniejsze różnicowanie w podocyty.

Generowanie podocytów pochodzących od pacjenta z biopsji skóry

Poznaj metodę hodowli eksplantatów fibroblastów z biopsji skóry w celu uzyskania pierwotnych ludzkich komórek. Protokół ten umożliwia bankowanie 15-20 milionów komórek przy niskim numerze pasma w ciągu 4-8 tygodni.

Kultura eksplantacyjna z biopsji wycinkowej skóry do izolacji pierwotnych ludzkich fibroblastów

Przeglądaj więcej filmów