Name: Szybkie oznaczanie termicznego progu nocyceptywnego u szczurów z cukrzycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Naucz się oznaczać termiczny próg nocyceptywny u szczurów z cukrzycą przy użyciu inkrementalnej płyty grzewczej. Ta metoda umożliwia dokładne pomiary z minimalnym stresem zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez American Diabetes Association (ADA), grant JF1-10-14 (MDiF). Chcielibyśmy podziękować personelowi Laboratory of Animal Resources na WSU. Autorzy wyrażają wdzięczność za pomoc w analizie statystycznej danych dr. Neilowi Patonowi.

TNT u myszy i szczurów są określane przy użyciu inkrementalnego miernika analgesji na płytce grzejnej [iHPAM, IITC Inc. Life Science (Woodland Hills, CA)]. Urządzenie składa się z kilku komponentów: aluminiowej płyty (10 x 20 cm) z systemem grzewczym pod spodem i pleksiglasową komorą obserwacyjną nad nią; jednostki sterującej ciepłem, oprogramowania do akwizycji danych (IITC Part # Soft Series 8), komputera PC oraz przełącznika nożnego do zdalnego uruchamiania, zatrzymywania lub resetowania jednostki. System grzewczy umożliwia również ręczne uruchamianie, zatrzymywanie i resetowanie procesu grzania za pomocą klawiatury znajdującej się z przodu urządzenia. iHPAM można ustawić na różne szybkości nagrzewania oraz temperatury czuwania/odcięcia.
1. Konfiguracja sprzętu
<ol>
	<li>Przed badaniem zwierząt należy dokonać wizualnej inspekcji urządzenia, aby potwierdzić wybrane szybkości nagrzewania (np. 6 °C/min), początkową temperaturę stanu gotowości oraz końcową temperaturę odcięcia (np. odpowiednio 28 °C i 55 °C).</li>
	<li>Należy zweryfikować wszystkie połączenia. Aby zachować elektroniczną kopię wyników, urządzenie musi być podłączone do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem Software Series 8. Alternatywnie, kopie papierowe wyników można wydrukować za pomocą portu szeregowego urządzenia.</li>
	<li>Należy przetestować sprzęt. Naciśnij raz przełącznik nożny, aby upewnić się, że oprogramowanie Software Series 8 rejestruje dane: początkową temperaturę stanu gotowości, końcową temperaturę odcięcia oraz czas w sekundach potrzebny do osiągnięcia temperatury odcięcia.</li>
	<li>W ramach dodatkowego testu kontrolnego badacze biorący udział w eksperymentach mogą potrzebować przetestować urządzenie na sobie. Cofnięcie ręki z metalowej płyty w momencie odczucia bólu (46-48 °C) nie może spowodować uszkodzenia skóry ani wywołać późniejszego dyskomfortu.</li>
	<li>Po skonfigurowaniu urządzenia i zarejestrowaniu wyników z kroków 1.3 i 1.4 można je porównać. Jest to pomocne w wykrywaniu potencjalnych problemów, które mogłyby unieważnić wyniki pomiarów. Przykładami są rozbieżności między ustawionymi temperaturami stanu gotowości/odcięcia a rzeczywistym odczytem urządzenia i/lub różnice między temperaturami wyświetlanymi przez urządzenie a rzeczywistą temperaturą płyty wymaganą do cofnięcia ręki.</li>
</ol>
2. Badanie zwierząt zdrowych
Można wykorzystać młode lub dorosłe szczury Wistar [wiek postnatalny (p) 21-25 dni] lub myszy (p21-25) dowolnego tła genetycznego lub płci. Myszy użyte w naszych eksperymentach należą do szczepu C57BL/6J.
<ol>
	<li>W noc poprzedzającą planowane eksperymenty należy poddać zwierzęta aklimatyzacji, umieszczając ich klatki na blacie, na którym znajduje się iHPAM. Na dwie godziny przed przeprowadzeniem testów należy włączyć urządzenie iHPAM, aby zwierzęta oswoiły się z szumem tła generowanym przez aparat. Na tym etapie można skonfigurować i przetestować iHPAM w celu weryfikacji jego prawidłowego działania (patrz Krok 1). Zapewnienie pożywienia i wody ad libitum przez cały czas trwania testu, z wyjątkiem momentów, gdy zwierzę znajduje się w komorze obserwacyjnej (patrz Krok 2.1). 
	Uwaga: Ważne jest, aby nie zakładać, że warunki laboratoryjne w eksperymentach behawioralnych są kontrolowane domyślnie. Szczególną uwagę należy zwrócić na czynniki genetyczne i środowiskowe, które mogą wpływać na wyniki badań behawioralnych (recenzowane w 7).</li>
	<li>Ostrożnie umieść zdrową mysz/szczura w pleksiglasowej komorze obserwacyjnej na płycie grzewczej urządzenia. Pozwól zwierzęciu zaaklimatyzować się do ogrzanej powierzchni (ustawionej na 28 °C), aż zwierzę zacznie wykazywać zachowania świadczące o poczuciu komfortu. 
	Uwaga: W tych warunkach normalne dorosłe szczury wykazują początkowe zachowania eksploracyjne, okazjonalnie podnosząc się w stronę pokrywy komory obserwacyjnej i wciągając powietrze nozdrzami. Po kilku minutach u szczurów mogą wystąpić sporadyczne epizody pielęgnacji ciała oraz zachowania rozluźnione. Czasami szczury leżą w rozluźnionej postawie ciała (wyciągnięcie brzuszne), okazjonalnie węsząc w otoczeniu. Normalne myszy są zazwyczaj bardziej aktywne niż szczury. Jednakże po kilku minutach w komorze obserwacyjnej myszy wykazują rozluźnione zachowania eksploracyjne. Wyjątkowo rzadko obserwuje się zachowania ucieczkowe (np., skakanie, próby ucieczki z komory obserwacyjnej) lub postawy obronne (np., pisk). Należy również zauważyć, że myszy mogą przekazywać informacje o bólu innym osobnikom8W związku z tym istotne może być przeprowadzenie testów na myszach umieszczonych w osobnych klatkach.</li>
	<li>Umieść lustra z tyłu komory obserwacyjnej, aby umożliwić obserwację pod każdym kątem. Statyw z cyfrową kamerą wideo może pomóc w określeniu dokładnego momentu wystąpienia zachowań nocyceptywnych (unikających bólu).</li>
	<li>Gdy zwierzę oswoi się z komorą obserwacyjną, należy podgrzać płytkę, naciskając przełącznik nożny. Gdy temperatura płytki wzrośnie w tempie 6 °C/minutę, zdrowe zwierzęta wykazują zachowania nocyfuzyjne obejmujące tylną łapę*, zazwyczaj w temperaturach w zakresie od 46 do 48 °C3,5,9,10Zatem zwierzę jest zazwyczaj usuwane z komory obserwacyjnej po około 3 minutach. 
	Uwaga: Obserwacja typowej reakcji nocyfencyjnej u szczura lub myszy t. j. lizanie tylnej łapy, przy jednoczesnym potrząsaniu i/lub unoszeniu jej, jest wystarczające do przerwania bodźca termicznego. Osiąga się to poprzez naciśnięcie przełącznika nożnego. W tym momencie oprogramowanie rejestruje temperaturę płytki, a płytka natychmiast schładza się do temperatury czuwania (28 °C) zostanie osiągnięta (~0,5 min). Ta temperatura t. j.Wartość ta, która wywołuje jakąkolwiek reakcję nocyfozyjną, jest uznawana za próg ciepła szkodliwego (TNT) u normalnego zwierzęcia (kontrolnego). 
	Czasami, szczególnie u myszy, zachowania nocifensywne w odpowiedzi na szkodliwą temperaturę mogą być najpierw obserwowane w jednej lub obu przednich łapach (np., lizanie w pozycji siedzącej), kilka sekund przed tylnymi łapami. Jednakże lizanie przednich łap jest normalnym elementem zachowań pielęgnacyjnych. W związku z tym ocenie podlegają wyłącznie reakcje tylnych łap. W niektórych przypadkach myszy mogą pielęgnować również tylne łapy. Niemniej jednak prawidłowa pielęgnacja nie trwa dłużej niż kilka sekund, nie obejmuje intensywnego lizania i zazwyczaj kończy się po oczyszczeniu pazurów.</li>
	<li>Ostrożnie wyjmij zwierzę z płyty i umieść je w odpowiedniej klatce. Pomiar progu cieplnego powtarza się następnie dla pozostałych zwierząt kontrolnych (normalnych). 
	Uwaga: Wartości TNT można wyznaczać u jednego zwierzęcia w odstępach 1–2 minut bez konieczności wyjmowania go z komory obserwacyjnej. Pomiary TNT u szczurów lub myszy można powtarzać wielokrotnie przez kilka dni. Jest to szczególnie przydatne do wyznaczenia średniej wartości TNT dla poszczególnych osobników, a także do analizy jej zmian wraz z wiekiem.</li>
	<li>TNT zwierząt kontrolnych wyrażono jako średnią z trzech lub więcej progów ± SEM.</li>
	<li>Przeprowadzono analizę statystyczną uzyskanych danych w celu porównania różnych grup badawczych myszy lub szczurów. Procedury parametryczne, w tym analiza wariancji, mogą zostać odpowiednio zastosowane w przypadku normalnego rozkładu danych oraz homoskedastyczności grup badawczych; po spełnieniu tych warunków można zastosować następujące podejścia: analizę wariancji, a następnie test Newmana-Keulsa w celu wykrycia różnic w pomiarach wielokrotnych. t. j. powtórne pomiary pojedynczych TNT z traktowaniem lub bez traktowania bądź w różnych punktach czasowych (np. dane wejściowe Rycina 3). t-test dla prób zależnych Studenta ttest można wykorzystać do porównania dwóch grup danych tj., nanorurki tytanowe (TNTs) przed kontra po leczeniu lekiem; nieparowane t-test można wykorzystać do określenia różnic w zmianach TNT w grupach leczonych lekami kontra zwierzęta traktowane nośnikiem (np., dane w Rycina 4).</li>
</ol>
3. Badanie zwierząt z cukrzycą
Szczur z cukrzycą indukowaną streptozotocyną (STZ) jest najczęściej stosowanym modelem zwierzęcym do badania mechanizmów PDN oraz oceny leków i terapii przeciwbólowych11,12. Szczury, u których wywołano cukrzycę poprzez jednorazową dawkę STZ (60 mg/kg) podanąt doprzewłonowo, mogą być badane pod kątem hiperalgezji termicznej w 3rd tygodniu po wystąpieniu cukrzycy11. Należy zauważyć, że nie u wszystkich szczurów z cukrzycą rozwija się PDN. Jednak zwierzęta, u których występuje hiperalgezja (~50%), można łatwo zidentyfikować. W rzeczywistości ich TNT są niższe niż w normie*.
*Aby wyznaczyć TNT u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ, stosuje się początkową temperaturę płytki wynoszącą 15 °C zamiast 28 °C. Powodem tej zmiany jest oczekiwanie, że większość zwierząt z cukrzycą z PDN będzie wykazywać hiperalgezję2,11. W związku z tym będą one miały niższe niż normalnie progi bólowe na ciepło (np. &lt;45 °C).
<ol>
	<li>Szczura z cukrzycą umieszcza się w komorze obserwacyjnej na górze aparatury testowej. Zwierzę zostawia się do aklimatyzacji do powierzchni płyty, aż wykaże komfortowe zachowanie. 
	Uwaga: Zazwyczaj szczur z cukrzycą nie wykazuje w pełni normalnego zachowania. Szczury z cukrzycą są zazwyczaj hypoaktywne, letargiczne; często wykazują ograniczoną ruchomość i powolną pielęgnację futra. Rzadko obserwuje się próby stania przy pokrywie komory obserwacyjnej. Po kilku minutach szczury z cukrzycą mogą spokojnie przebywać w narożniku komory, swobodnie wąchając otoczenie.</li>
	<li>Gdy zwierzę z cukrzycą poczuje się komfortowo w komorze obserwacyjnej, płytę nagrzewa się zgodnie z krokiem 2.3; szczur z cukrzycą może wykazać zachowanie nocyfensywne angażujące tylną lub przednią łapę. Zazwyczaj dzieje się to w nie drażniących temperaturach płyty (np. &lt;45 °C) lub po nie więcej niż 5 minutach w komorze przy wzroście temperatury o 6 °C/min. 
	Uwaga: Reakcja nocyfensywna młodego dorosłego szczura z cukrzycą nie różni się od reakcji szczura zdrowego. Jednakże najniższa temperatura wywołująca takie zachowanie jest znacząco obniżona.</li>
	<li>Patrz krok 2.4</li>
	<li>Średnią z więcej niż trzech progów wyznaczonych w dniu eksperymentu, wyrażoną jako °C ± SEM, uznaje się za próg cieplny nocyceptywny zwierzęcia z cukrzycą. 
	Uwaga: Podobny schemat, jak ten wyjaśniony dla szczurów zdrowych lub z cukrzycą, można zastosować w celu określenia termicznego efektu anty-nocyfensywnego leków przeciwbólowych na progi cieplne.</li>
</ol>
4. Badanie przeciwbólowcze
Właściwości przeciwbólowe leków (np. analgetyków), a także określenie parametrów farmakologicznych, takich jak minimalna dawka skuteczna, mogą zostać łatwo uzyskane przy zastosowaniu kroków wyjaśnionych powyżej. Przewiduje się, że odpowiednie dawki analgetyku podane szczurom/myszom znacząco zwiększą ich TNTs. Jest to szczególnie wyraźne u zwierząt z hiperalgezją termiczną3. Jednakże, aby uniknąć błędów w interpretacji wyników, badacze zaangażowani w obserwację behawioralną grupy zwierząt nie mogą wiedzieć ani być świadomi, czy zwierzęta zostały poddane leczeniu, czy nie. Ponadto leki do wstrzyknięcia przez obserwatora mogą być przygotowane przez innego badacza i oznaczone jako A, B, C itd. Dawkowanie jest podane w wydruku, zawierającym poszczególne dawki dla zidentyfikowanego zwierzęcia.
W zależności od testowanego leku, zwierzętom zdrowym lub cukrzycowym można podać różne dawki potencjalnego środka przeciwbólowego na 5-15 min przed testami behawioralnymi. Należy uwzględnić odpowiednie grupy kontrolne (t.j. zwierzęta w tym samym wieku, którym wstrzyknięto sam nośnik i/lub szczury z cukrzycą bez PDN) i poddać je badaniom w identycznych warunkach (np. ta sama temperatura początkowa płyty). Można również badać przewlekłe działanie leków.
5. Reprezentatywne wyniki
Najniższą temperaturę płyty wywołującą reakcje nocyceptywne w dowolnej tylnej łapie młodych dorosłych, normalnych, nieleczonych szczurów lub myszy określono zgodnie z krokami od 2-1 do 2-6. Jak pokazano na Ryc. 1, TNT normalnych młodych dorosłych szczurów i myszy wynosiły odpowiednio 47.2 ± 0.2 °C oraz 47.5 ± 0.5 °C.
Nie zaobserwowaliśmy ani istotnych dobowych wahań TNT u poszczególnych osobników (Rysunek 2A), ani istotnych różnic w TNT pomiędzy osobnikami w tym samym wieku (Rysunek 2B). Nie odnotowano różnic w TNT wynikających z płci (nie pokazano).
TNT u młodych dorosłych szczurów z cukrzycą indukowaną STZ określano w sposób analogiczny jak u szczurów zdrowych (kroki 3.1 do 3.3). Jednakże temperaturę płytki startowej ustawiono na 15 °C zamiast 28 °C. Zachowania nocyceptywne szczurów z cukrzycą indukowaną STZ oceniano co najmniej trzykrotnie u każdego osobnika w odstępach dobowych, zaczynając od jedenastu dni po wstrzyknięciu STZ. Jak pokazano na Rysunku 3, znaczący spadek (p&lt;0.01) TNT u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ staje się widoczny dwa tygodnie po wstrzyknięciu STZ. Średnia wartość TNT u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ wynosiła 45,6 ± 0,1 °C (n=16, wartości zbiorcze z dni 14-23).
Szczury cukrzycowe wykazujące znacznie niższy TNT niż szczury zdrowe uznano za zwierzęta z PDN. Szczury te wykorzystano do zbadania ostrych właściwości przeciwbólowych analgetyku (związek A). Wartości TNT określono u szczurów zdrowych i cukrzycowych, którym na pięć minut przed testem podano pojedynczą dawkę związku lub sam nośnik. Jak pokazano na Rysunku 4, pojedyncza dawka dostarczona dootrzewnowo znacząco zwiększyła TNT u szczurów cukrzycowych w porównaniu do szczurów traktowanych samym nośnikiem (odpowiednio 45,6 °C vs 47,6 °C). Efekt przeciwbólowy związku A zaobserwowano również u szczurów zdrowych; choć był on istotny statystycznie (p&lt;0,01), był mniej wyraźny (odpowiednio 47,4 °C vs 48,0 °C).
<img alt="Próg nocycepcji termicznej; wykres słupkowy; szczury vs myszy; porównanie temperatury; wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3785/3785fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wyznaczanie TNT u zdrowych młodych dorosłych szczurów lub myszy: TNT u młodych dorosłych szczurów (p21-24) lub myszy (p20-21) badano w iHPAM zgodnie z opisanymi powyżej krokami. Przebadano łącznie 12 szczurów i 25 myszy. Pomiary przeprowadzano przez kilka dni, a wyniki zsumowano. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SEM. Minimalna i maksymalna wartość TNT odnotowana u tych szczurów wynosiła odpowiednio 46.2 °C i 48.6 °C. W przypadku myszy maksymalna i minimalna wartość TNT wynosiły odpowiednio 48.8 °C i 44.9 °C.
<img alt="Temperatura neutralna termoregulacyjna (TNT) w zależności od wieku u szczurów i myszy, wykres z punktami danych." src="/files/ftp_upload/3785/3785fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Zależność TNT od wieku u szczurów i myszy: A) Przedstawiono wartości TNT czterech prawidłowych szczurów (n=4) w wieku 21 dni, wyznaczone co najmniej trzy razy dziennie przez 5 dni. B) Wartości TNT myszy z jednego miotu wyznaczone jednorazowo w wskazanych wieku. Liczby nad każdym punktem pomiarowym oznaczają liczbę wykorzystanych myszy z miotu.
<img alt="Wykres słupkowy poziomów TNT (°C) w dniach po iniekcji STZ; prawidłowy TNT: 47,2±0,2°C, n=12." src="/files/ftp_upload/3785/3785fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Szczury cukrzycowe stają się hiperalgetyczne 3 tygodnie po wystąpieniu cukrzycy: Wartości TNT u sześciu (n=6) młodych dorosłych szczurów z cukrzycą indukowaną STZ w tym samym wieku były oznaczane codziennie, począwszy od 11. dnia po indukcji cukrzycy. Przedstawiono średnie dobowe wartości TNT (średnia ± SEM). Wartości TNT u szczurów cukrzycowych oznaczone między 11. a 13. dniem po iniekcji STZ mieściły się w zakresie normy (czerwona linia). Dwa tygodnie po iniekcji STZ wartości TNT znacząco spadły do 45,1 ± 0,4 °C, (p&lt;0,05).
<img alt="Wykres słupkowy progu termicznej nocycepcji z porównaniem grup kontrolnej i cukrzycowej z zastosowaniem związków." src="/files/ftp_upload/3785/3785fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Ostre efekty przeciwbólowe związku B u szczurów z cukrzycą indukowaną STZ. Młode dorosłe szczury prawidłowe (grupa niebieska n=12) oraz dopasowane wiekowo hiperalgetyczne szczury z cukrzycą indukowaną STZ (grupa zielona n=6) zostały przebadane w iHPAM po wewnątrzbrzusznym wstrzyknięciu nośnika (ciemne słupki) lub związku A (jasne słupki). Przedstawiono średnią wartość TNT ± SEM dla każdego rodzaju terapii (kontrola nośnikiem lub leczenie związkiem A). Gwiazdki oznaczają różnice statystyczne (p&lt;0.05).

<ol><li>Baron, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+neuropathic+pain%3A+From+mechanisms+to+symptoms%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+J.+Pain%22%5BJournal%5D)">Peripheral neuropathic pain: From mechanisms to symptoms.</a> Clin. J. Pain. 16, S12-S20 (2000).</li>
<li>Calcutt, N. A., Jorge, M. C., Yaksh, T. L., Chaplan, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tactile+allodynia+and+formalin+hyperalgesia+in+streptozotocin-diabetic+rats%3A+Effects+of+insulin%2C+aldose+reductase+inhibition+and+lidocaine%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Tactile allodynia and formalin hyperalgesia in streptozotocin-diabetic rats: Effects of insulin, aldose reductase inhibition and lidocaine.</a> Pain. 68, 293-299 (1996).</li>
<li>Bolcskei, K., Petho, G., Szolcsanyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noxious+heat+threshold+measured+with+slowly+increasing+temperatures%3A+Novel+rat+thermal+hyperalgesia+models%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Noxious heat threshold measured with slowly increasing temperatures: Novel rat thermal hyperalgesia models.</a> Methods Mol. Biol. 617, 57-66 (2010).</li>
<li>Ankier, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+hot+plate+tests+to+quantify+antinociceptive+and+narcotic+antagonist+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">New hot plate tests to quantify antinociceptive and narcotic antagonist activities.</a> Eur. J. Pharmacol. 27, 1-4 (1974).</li>
<li>Almasi, R., Petho, G., Bolcskei, K., Szolcsanyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+resiniferatoxin+on+the+noxious+heat+threshold+temperature+in+the+rat%3A+A+novel+heat+allodynia+model+sensitive+to+analgesics%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of resiniferatoxin on the noxious heat threshold temperature in the rat: A novel heat allodynia model sensitive to analgesics.</a> Br. J. Pharmacol. 139, 49-58 (2003).</li>
<li>Bolcskei, K., Horvath, D., Szolcsanyi, J., Petho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+injury-induced+drop+of+the+noxious+heat+threshold+measured+with+an+increasing-temperature+water+bath%3A+A+novel+rat+thermal+hyperalgesia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Heat injury-induced drop of the noxious heat threshold measured with an increasing-temperature water bath: A novel rat thermal hyperalgesia model.</a> Eur. J. Pharmacol. 564, 80-87 (2007).</li>
<li>Chesler, E. J., Wilson, S. G., Lariviere, W. R., Rodriguez-Zas, S. L., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+ranking+of+genetic+and+laboratory+environment+factors+influencing+a+behavioral+trait%2C+thermal+nociception%2C+via+computational+analysis+of+a+large+data+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Identification and ranking of genetic and laboratory environment factors influencing a behavioral trait, thermal nociception, via computational analysis of a large data archive.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 26, 907-923 (2002).</li>
<li>Langford, D. J., Crager, S. E., Shehzad, Z., Smith, S. B., Sotocinal, S. G., Levenstadt, J. S., Chanda, M. L., Levitin, D. J., Mogil, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Social+modulation+of+pain+as+evidence+for+empathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Social modulation of pain as evidence for empathy in mice.</a> Science. 312, 1967-1970 (2006).</li>
<li>Hunt, S. P., Koltzenburg, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunt%2C+SP+%22The+neurobiology+of+pain%22">The neurobiology of pain</a>. , Oxford University Press. New York. (2005).</li>
<li>Willis, W. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillis%2C+WD+%22The+pain+system+%3A+The+neural+basis+of+nociceptive+transmission+in+the+mammalian+nervous+system%22">The pain system : The neural basis of nociceptive transmission in the mammalian nervous system</a>. , Basel, New York, Karger. (1985).</li>
<li>Calcutt, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCalcutt%2C+N+%22Modeling+diabetic+sensory+neuropathy+in+rats.+In%3A+Methods+in+molecular+medicine.+Pain+research%3A+Methods+and+protocols%22">Modeling diabetic sensory neuropathy in rats. In: Methods in molecular medicine. Pain research: Methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2004).</li>
<li>Bars, D. L. e, Gozariu, M., Cadden, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Animal models of nociception.</a> Pharmacol. Rev. 53, 597-652 (2001).</li>
<li>Shaikh, A. S., Somani, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+and+biomarkers+of+neuropathy+in+diabetic+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Animal models and biomarkers of neuropathy in diabetic rodents.</a> Indian J. Pharmacol. 42, 129-134 (2010).</li>
<li>Hargreaves, K., Dubner, R., Brown, F., Flores, C., Joris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+and+sensitive+method+for+measuring+thermal+nociception+in+cutaneous+hyperalgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia.</a> Pain. 32, 77-88 (1988).</li>
<li>Hardy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+rapid+measurement+of+skin+temperature+during+exposure+to+intense+thermal+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Method for the rapid measurement of skin temperature during exposure to intense thermal radiation.</a> J. Appl. Physiol. 5, 559-566 (1953).</li>
<li>Sumino, R., Dubner, R., Starkman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+small+myelinated+%26quot%3Bwarm%26quot%3B+fibers+to+noxious+heat+stimuli+applied+to+the+monkey%27s+face%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of small myelinated &quot;warm&quot; fibers to noxious heat stimuli applied to the monkey's face.</a> Brain Res. 62, 260-263 (1973).</li>
<li>Hammond, D. L., Ruda, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+alterations+in+thermal+nociceptive+threshold+and+the+distribution+of+immunoreactive+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+p+after+neonatal+administration+of+capsaicin+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Lett%22%5BJournal%5D)">Developmental alterations in thermal nociceptive threshold and the distribution of immunoreactive calcitonin gene-related peptide and substance p after neonatal administration of capsaicin in the rat.</a> Neurosci. Lett. 97, 57-62 (1989).</li>
</ol>

Zdecydowaliśmy się nie ujawniać tożsamości środka przeciwbólowego użytego w tych eksperymentach. Część przedstawionych tutaj wyników została zaprezentowana podczas 71.st Sesji Naukowej Amerykańskiego Stowarzyszenia Cukrzycy (San Diego CA) oraz 47.th Dorocznego Spotkania Europejskiego Stowarzyszenia Badań nad Cukrzycą (Lizbona, Portugalia).

Podobnie jak w klasycznym teście z płytką grzewczą służącym do ilościowego określania hiperalgezji termicznej4,13, opisany tutaj pomiar nocycepcji umożliwia szybki i wiarygodny sposób oceny zachowań nocyceptywnych u szczurów i myszy. Jednak w przeciwieństwie do klasycznego testu, metoda przyrostowej temperatury płytki grzewczej jest nieinwazyjna i praktycznie pozbawiona stresu. Chociaż do przeprowadzenia testu niezbędne jest pewne ograniczenie swobody (i.e., zwierzę musi znajdować się w komorze obserw...

<table><tbody><tr><td>Inkrementacyjny analizator analgesji na płytce grzejnej</td><td>IITC Inc. Life Science</td><td>Katalog nr PE34</td><td></td></tr><tr><td>Soft Series 8</td><td>IITC Inc. Life Science</td><td>Katalog nr Series8</td><td></td></tr><tr><td>Streptozotocyna</td><td>Calbiochem</td><td>572201</td><td></td></tr></tbody></table>

szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Rapid Determination of the Thermal Nociceptive Threshold in Diabetic Rats

Bolesna neuropatia cukrzycowa (PDN) charakteryzuje się hiperalgezją, tj. zwiększoną wrażliwością na bodźce szkodliwe, oraz allodynią, tj. nadwrażliwością na bodźce normalnie niebolesne1. Hiperalgezja i allodynia były badane w wielu różnych modelach cukrzycy u gryzoni2. Jednakże, jak stwierdzili Bölcskei et al, określenie „bólu” w modelach zwierzęcych jest trudne ze względu na jego subiektywny charakter3. Co więcej, tradycyjne metody stosowane do określania odpowiedzi behawioralnych na szkodliwe bodźce termiczne zazwyczaj wykazują brak powtarzalności i czułości farmakologicznej3. Na przykład, stosując metodę gorącej płyty według Ankiera4, drgnięcie, cofnięcie i/lub lizanie tylnych i/lub przednich łap jest kwantyfikowane jako opóźnienia odruchowe przy stałych wysokich bodźcach termicznych (52-55 °C). Jednak zwierzęta z hiperalgezją na bodziec termiczny nie wykazują powtarzalnych różnic w opóźnieniach odruchowych przy zastosowaniu tych temperatur powyprogowych3,5. Podobnie jak w niedawno opisanej metodzie Bölcskei et al.6, procedury opisane tutaj pozwalają na szybkie, czułe i powtarzalne oznaczenie progów nocycepcji termicznej (TNTs) u myszy i szczurów. Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny przykładany głównie do skóry powierzchni podeszwowej myszy/szczura. Metoda ta jest szczególnie czuła w badaniu antynocycepcji podczas stanów hiperalgetycznych, takich jak PDN. Procedury opisane poniżej opierają się na tych, które zostały szczegółowo opublikowane przez Almási et al 5 oraz Bölcskei et al 3. Procedury opisane w niniejszym opracowaniu zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Laboratoryjnych (LACUC) Uniwersytetu Wright State.

W niniejszym opracowaniu opisujemy szybką, niezawodną i prostą procedurę określania najniższej temperatury, przy której szczury lub myszy wykazują zachowania nocyfencyjne, t. j. na próg termicznej nocycepcji (TNT). Metoda ta wykorzystuje powoli zwiększający się bodziec termiczny, co pozwala na precyzyjną i powtarzalną ocenę TNT przy minimalnym lub żadnym stresie dla zwierząt.

Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Bolesna neuropatia cukrzycowa (PDN) charakteryzuje się hiperalgezją, czyli zwiększoną wrażliwością na bodźce nocyceptywne, oraz allodynią, czyli nadwrażliwością...

Ogólnym celem tej procedury jest wyznaczenie termicznego progu nocyceptywnego u szczurów kontrolnych oraz szczurów z cukrzycą. W pierwszym kroku zwierzę umieszcza się na inkrementalnej płycie grzejnej z miernikiem analgezji. Następnie, podczas nagrzewania powierzchni, temperatura płyty grzejnej jest stopniowo zwiększana.Obserwuje się zwierzę pod kątem wystąpienia reakcji obronnych. W momencie zaobserwowania takiego zachowania przerywa się ogrzewanie i zapisuje aktualną temperaturę płytki. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany progu nocycepcji termicznej u zwierząt leczonych lekami przeciwbólowymi lub cierpiących na bolesną neuropatię cukrzycową.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak płytka grzejna, która zazwyczaj jest ustawiona na temperaturę przekraczającą próg, jest fakt, że nasze metody stopniowo zwiększają temperaturę płytki, co pozwala na dokładne określenie progu termicznej nocycepcji. Próg termicznej nocycepcji (TNT) jest wyznaczany przy użyciu inkrementalnego miernika analgezji na płytce grzejnej (IHpam). Komponenty tego systemu obejmują pleksiglastową komorę obserwacyjną, aluminiową płytkę z kontrolą temperatury, klawiaturę służącą do programowania oraz przełącznik nożny do zdalnego sterowania urządzeniem.Dane są gromadzone za pomocą specjalistycznego oprogramowania na pobliskim komputerze. Alternatywnie można wydrukować kopie papierowe, korzystając z portu szeregowego znajdującego się w urządzeniu. Za komorą z pleksiglasu należy umieścić lustro, aby zwiększyć widoczność zachowania zwierzęcia.Następnie ustaw pożądane szybkości nagrzewania oraz początkową temperaturę stanu gotowości i końcową temperaturę odcięcia. Naciśnij przełącznik nożny, aby uruchomić i zatrzymać system. Potwierdź, że początkowa temperatura stanu gotowości oraz końcowa temperatura odcięcia zostały zapisane, a także czas potrzebny na osiągnięcie temperatury końcowej.W razie potrzeby badacz może przetestować system na sobie, cofając rękę z metalowej płyty w momencie odczucia bólu. Percepcja nie może spowodować uszkodzenia skóry ani nie może wywołać późniejszego dyskomfortu.Rozpocznij aklimatyzację wieczorem dnia poprzedniego, ustawiając klatki na blacie, na którym będą przeprowadzane testy. Na dwie godziny przed testowaniem włącz urządzenie IH, aby zwierzęta oswoiły się z hałasem generowanym przez jednostkę.Na tym etapie system można skonfigurować i przetestować zgodnie z wcześniejszymi opisami. Po tym, jak zwierzęta zaadaptują się do środowiska, delikatnie umieść szczura w pleksiglasowej komorze na rozgrzanej powierzchni. Pozwól zwierzęciu badać komorę przez kilka minut.Rozpocznij testowanie. Gdy zwierzę będzie wydawać się spokojne i gotowe do rozpoczęcia próby, naciśnij przełącznik nożny, aby rozpocząć ogrzewanie płyty. Obserwuj zachowanie zwierzęcia podczas nagrzewania się płyty.Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie napotykają trudności, ponieważ identyfikacja agresywnego zachowania masowego nie zawsze jest jednoznaczna i wymaga praktyki. Żadne zachowania agresywne nie charakteryzują się lizaniem, potrząsaniem lub unoszeniem któregokolwiek z tylnych porów. Warto zauważyć, że pierwszym zaobserwowanym zachowaniem może być lizanie czterech porów, po którym następuje reakcja tylnych porów.W przypadku zaobserwowania najbardziej nasilonej reakcji obronnej, należy nacisnąć przełącznik nożny, aby zakończyć próbę i przenieść zwierzę z powrotem do klatki domowej. Temperatura wywołująca taką reakcję jest uznawana za termiczny próg nocyceptywny lub TNT zwierzęcia kontrolnego. Urządzenie zostaje oczyszczone, a test powtórzony dla kolejnego zwierzęcia.Poniżej przedstawiono progi termicznej nocycepcji u zdrowych młodych dorosłych szczurów i myszy. Dane wskazują, że TNT szczurów nie uległo zmianie podczas testów przeprowadzanych w ciągu czterech dni. Podobnie TNT myszy pozostawało spójne w różnych grupach wiekowych.W tym przykładzie wielokrotnie mierzono TN TS młodych dorosłych szczurów z cukrzycą indukowaną STZ. Stały spadek progów termicznej nocycepcji jest widoczny poczynając od dwóch tygodni po indukowaniu cukrzycy. Tutaj zastosowano IH pam w celu przetestowania ostrych właściwości antynocyceptywnych związku przeciwbólowego.Związek A wywołał łagodne działanie przeciwbólowe u zwierząt kontrolnych w porównaniu z grupą otrzymującą nośnik. Jednakże przeciwbólowanie było bardziej wyraźne u zwierząt z cukrzycą otrzymujących związek w porównaniu z kontrolą z nośnikiem. Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest ciągłe monitorowanie zachowania zwierzęcia, w szczególności reakcji występujących w pobliżu jego kończyny.

rapid-determination-thermal-nociceptive-threshold-diabetic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Szybka ocena progowej wartości cieplnej nocyceptywnej u szczurów z cukrzycą

Przedstawiono algorytmy oceniające progi bólu cieplnego i mechanicznego w eksperymentalnie wywołanym stanie zapalnym skóry u badanych ludzi. Dwa paradygmaty testowania bólu niezależnie badają przetwarzanie nocyceptywne przez dwie główne populacje obwodowych włókien nerwowych przekazujących ból, tj. nieumielinowane włókna C oraz małe umielinowane włókna A-delta.

Wyznaczanie progu bólu termicznego i mechanicznego w zapaleniu skóry u ludzi

Ze względu na prostotę zabiegu chirurgicznego oraz wyraźne efekty behawioralne, przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego jest jednym z najważniejszych modeli zwierzęcych bólu neuropatycznego. W ciągu 24 h po operacji rozwija się nadwrażliwość bólowa, którą można zmierzyć ilościowo za pomocą estezjometru von Freya (test mechaniczny) oraz urządzenia do pomiaru analgesii podeszwowej (test termiczny).

Przewlekłe uciskowe uszkodzenie nerwu kulszowego i badanie nadwrażliwości bólowej u szczurów

Opisujemy protokół do badania rozwoju hiperalgezji i tolerancji wywołanej opioidami u myszy. Opierając się na pomiarze termicznych i mechanicznych reakcji nocyceptywnych zwierząt nieleczonych morfiną i leczonych morfiną, pozwala na ilościowe określenie wzrostu wrażliwości na ból (hiperalgezja) i spadku analgezji (tolerancji) związanego z przewlekłym podawaniem opiatów.

Ocena hiperalgezji wywołanej morfiną i tolerancji przeciwbólowej u myszy przy użyciu termicznych i mechanicznych modalności nocyceptywnych

Ta praca przedstawia metodologię stosowania ultradźwięków o wysokiej intensywności do blokowania potencjałów czynnościowych cukrzycowych nerwów neuropatycznych.

Narzędzie ultradźwiękowe do blokowania przewodnictwa nerwowego w modelach szczurów z cukrzycą

Dostarczony jest tutaj protokół, który szczegółowo opisuje kroki prowadzące do stworzenia zwierzęcego modelu przewlekłego bólu po niedokrwieniu (CPIP). Jest to dobrze rozpoznawalny model naśladujący ludzki złożony zespół bólu regionalnego typu I. Dalej oceniane są nadwrażliwości mechaniczne i termiczne, a także zachowania nocyfensywne wywołane kapsaicyną obserwowane w modelu szczurzym CPIP.

Model przewlekłego bólu po niedokrwieniu złożonego zespołu bólu regionalnego typu I u szczurów

Zmodyfikowana operacja to uproszczona metoda dla modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego u myszy lub szczura, która wymaga tylko jednego podwiązania i jednego cięcia, aby uszkodzić zarówno wspólne nerwy strzałkowe, jak i łydkowe.

Zmodyfikowany model chirurgii oszczędzonego uszkodzenia nerwu bólu neuropatycznego u myszy

Aby opracować nowatorskie interwencje terapeutyczne w celu zapobiegania i leczenia bólu pleców, potrzebne są modele zwierzęce, które zbadają mechanizmy i skuteczność tych terapii z perspektywy translacyjnej. Niniejszy protokół opisuje test BMS, znormalizowaną metodę oceny wrażliwości mechanicznej pleców u szczura.

Ocena wrażliwości mechanicznej pleców u szczura do mechanistycznego badania przewlekłego bólu pleców

Ten protokół opisuje ocenę mechanicznej nadwrażliwości w modelu szczura neuropatycznego bólu ustno-twarzowego przy użyciu instrumentalnego urządzenia do oceny bólu ustno-twarzowego.

Ocena nadwrażliwości mechanicznej wywołanej uszkodzeniem nerwów u szczurów za pomocą operacyjnego testu bólu ustno-twarzowego

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego wywołuje długotrwały przewlekły ból neuropatyczny, charakteryzujący się przesadnymi reakcjami na bodźce termiczne i mechaniczne. Ten mysi model bólu neuropatycznego jest powszechnie stosowany do badania innowacyjnych terapii leczenia bólu. W tym artykule szczegółowo opisano procedurę chirurgiczną w celu poprawy standaryzacji i odtwarzalności.

Częściowe podwiązanie nerwu kulszowego: mysi model przewlekłego bólu neuropatycznego w celu zbadania antynocyceptywnego działania nowych terapii

Prezentujemy protokół wykorzystujący symulator manipulacji tuina do przeprowadzenia terapii tuina "Three-Manipulation and Three-Acupoint" dla szczurów z niewielkimi przewlekłymi urazami zwężeniowymi i oceny skutecznych punktów czasowych przeciwbólowych tuiny w ciągu 24 godzin, testując zmiany bólu poprzez analizę behawioralną i zmiany w ekspresji czynnika zapalnego za pomocą testu immunoenzymatycznego.

Charakterystyka zmian bólowych u szczurów z uszkodzeniem nerwów w ciągu 24 godzin po jednorazowej interwencji Tuina

Ostatnie osiągnięcia w badaniach nad bólem podkreślają potencjał fotoneuromodulacji z wykorzystaniem zielonych diod elektroluminescencyjnych (GLED) jako metody leczenia niefarmakologicznego. GLED moduluje szlaki bólowe, oferując skuteczną ulgę w bólu. Niniejszy artykuł ma na celu standaryzację i udoskonalenie protokołów ekspozycji na GLED, poprawę spójności między badaniami i postęp w klinicznym zastosowaniu tej terapii.

Optymalizacja technik fotoneuromodulacji w celu oceny roli diod elektroluminescencyjnych w leczeniu bólu

Naucz się oznaczać termiczny próg nocyceptywny u szczurów z cukrzycą przy użyciu inkrementalnej płyty grzewczej. Ta metoda umożliwia dokładne pomiary z minimalnym stresem zwierząt.

Szybkie oznaczanie progu termicznej nocycepcji u szczurów z cukrzycą

Przeglądaj więcej filmów