Name: Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w normalnym ludzkim mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Poznaj metodę izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów białka PrP z ludzkiego mózgu. Techniki ultrawirówki i chromatografii umożliwiają badanie agregatów białkowych w chorobach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

The Autorzy są wdzięczni Human Brain and Spinal Fluid Resource Center (Los Angeles, CA) za udostępnienie prawidłowych próbek mózgu. Badanie zostało sfinansowane przez National Institutes of Health (NIH) R01NS062787, CJD Foundation, Alliance BioSecure, a także University Center on Aging and Health przy wsparciu McGregor Foundation oraz President's Discretionary Fund (Case Western Reserve University).

1. Przygotowanie homogenatu mózgu oraz frakcji rozpuszczalnych w detergencie (S2) i nierozpuszczalnych (P2)
<ol>
	<li>Odważ 100 mg zamrożonej tkanki mózgu ludzkiego i dodaj 100 μl buforu do lizy (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% EDTA, pH 7,4).</li>
	<li>Homogenizuj próbkę na lodzie za pomocą tłuczka napędzanego silnikiem akumulatorowym, zamroź w suchem lodzie przez 5 min, a następnie homogenizuj ponownie, najpierw ręcznie, a potem za pomocą silnika, i dodaj 300 μl lub 800 μl buforu do lizy (co odpowiada odpowiednio 20% lub 10% całkowitego homogenatu mózgu).</li>
	<li>Wirowkuj 20% lub 10% całkowitego homogenatu mózgu w wirówce stołowej z prędkością 1 000 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C, aby zebrać supernatant (S1).</li>
	<li>Przeprowadź ultrawirowanie 10% frakcji S1 przy 35 000 rpm (100 000 x g) w rotorze SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) przez 1 h w temperaturze 4 °C. Przenieś supernatanty (S2) zawierające frakcję rozpuszczalną w detergentach do czystej probówki. Przesuspenduj osady zawierające frakcję nierozpuszczalną w detergentach (P2) w 100 μl lub 200 μl buforu do lizy, aby uzyskać preparat stężony 10- lub 5-krotnie.</li>
	<li>W celu trawienia PK inkubuj próbki z takimi samymi ilościami PK w stężeniu 50 μg/ml w temperaturze 37 °C przez 1 h dla obu frakcji, S2 i P2. Aby przerwać trawienie PK, dodaj fenylometylosulfonian fluorowy do stężenia końcowego 5 mM oraz równą objętość buforu do próbek SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 4% β-merkaptoetanol, 10% glicerol, 50 mM Tris, pH 6,8). Gotuj próbki przez 10 min, a następnie chłodź w temperaturze pokojowej przez 5 min. Próbki są gotowe do analizy Western blotting.</li>
</ol>
2. Sedymentacja prędkościowa w gradientach skokowych sacharozy
<ol>
	<li>Inkubować 450 μl 20% S1 z równą objętością 2% sarkosylu w H2O przez 30 min na lodzie.</li>
	<li>Do probówki Beckman o maksymalnej pojemności 5 ml dodać po 0,5 ml sacharozy o stężeniach 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10%.</li>
	<li>Nanieść 0,4 ml S1 na górę skokowego gradientu sacharozy 10-60%.</li>
	<li>Wirować przy 48 000 obr./min (200 000 x g, rotor SW55) przez 1 h w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zbierać frakcje o objętości 283 μl każda, zaczynając od góry probówki, aby uzyskać łącznie 12 frakcji.</li>
	<li>Przenieść 20 μl każdej frakcji do nowej probówki Eppendorf, dodać 20 μl buforu do próbek i gotować przez 10 min.</li>
	<li>Schładzać próbki przez 4 min w dygestorium, wirować przy 1 000 x g przez 1 min, a następnie wymieszać w wirówce typu vortex. Nanieść próbki na gotowy żel.</li>
</ol>
3. Chromatografia żelowa (wykluczania rozmiarów)
<ol>
	<li>Do wyznaczenia stanu oligomerycznego cząsteczek PrP należy użyć kulek Superdex 200 HR (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) w kolumnie o wymiarach 1 x 30 cm.</li>
	<li>Siedem markerów masy cząsteczkowej (Sigma, St. Louis, MI), w tym błękitny dekstran (2,000 kDa), tyreoglobulina (669 kDa), apoferrytyna (443 kDa), β-amylaza (200 kDa), dehydrogenaza alkoholowa (150 kDa), albuminy (66 kDa) oraz anhidraza węglanowa (29 kDa), jest nakładana niezależnie w stężeniach zalecanych przez firmę Sigma w objętościach próbek 200 μl.</li>
	<li>Objętość elucji błękitnego dekstranu służy do wyznaczenia objętości martwej (V0 = 8.45 ml), a całkowita objętość (Vt = 24 ml) jest podana w instrukcji produktu. Objętości elucji pików (Ve) oblicza się na podstawie chromatogramu i retencji frakcyjnej. Współczynnik podziału Kav (definiujący zachowanie próbki) oblicza się według równania: Kav = (Ve - V0)/(Vt - V0). Krzywą kalibracyjną wyznacza się, nanosząc Kav standardów białkowych względem log MW standardów8.</li>
	<li>Masę cząsteczkową (MW) różnych form PrP odzyskanych w poszczególnych frakcjach FPLC ocenia się zgodnie z krzywą kalibracyjną wygenerowaną za pomocą filtracji żelowej różnych standardów.</li>
	<li>W każdym przebiegu do kolumny należy wstrzyknąć 200 μl S1 w buforze lizującym zawierającym 1% sarkosylu.</li>
	<li>Chromatografię przeprowadza się w systemie FPLC (GE Healthcare) przy szybkości przepływu 0,25 ml/min, a frakcje o objętości 0,25 ml każda zbiera się za pomocą kolektora frakcji (Amersham Biosciences, RediFrac).</li>
	<li>Każdą frakcję o objętości 0,125 ml inkubuje się z 0,5 ml schłodzonego wcześniej metanolu w temperaturze -20 °C przez 2 h.</li>
	<li>Próbki wiruje się w mikrocentry fudze laboratoryjnej przy 13,000 x g przez 30 min w temperaturze 4 °C. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad resuspenduje w 20 μl buforu do próbek SDS, jak wspomniano powyżej, gotuje przez 10 min, chłodzi do temperatury pokojowej i nakłada na gotowy żel.</li>
</ol>
4. Wychwytywanie PrP przez g5p
<ol>
	<li>Cząsteczkę g5p (100 μg) (uprzejmie udostępnioną przez drów Geoffa Kneale'a i Johna McGeehana z University of Portsmouth, UK) konjuguje się z 7 x 108 magnetycznymi kulkami aktywowanymi tosylanem, inkubując 100 μg g5p oraz 350 μl kulek g5p w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS) w temperaturze 37 °C przez 20 h. Kulki g5p przyciąga się do ścianek probówek Eppendorf za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego, a następnie usuwa cały roztwór. Kulki przemywa się trzykrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).</li>
	<li>Kulek skoniugowanych z g5p inkubuje się w 1 ml 0,2 M Tris-HCl, pH 7,4 zawierającego 0,1% BSA w temperaturze 37 °C przez 5 h w celu zablokowania niespecyficznego wiązania, a następnie przemywa się kulki trzykrotnie 1 ml PBS zawierającego 0,1% BSA, zgodnie z opisaną wcześniej procedurą. Roztwór usuwa się i dodaje 1 ml PBS do kulek. Przygotowane kulki g5p są stabilne przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Wychwytywanie PrP przez g5p przeprowadza się poprzez inkubację 100 μl frakcji S1 lub P2 z 60 μl kulek skoniugowanych z g5p (10 μg białka/6 X 107 kulek) w 1 ml buforu wiążącego (3% Tween-20, 3% NP-40 w PBS, pH 7,5).</li>
	<li>Po inkubacji przy stałej rotacji przez 3 h w temperaturze pokojowej, kulki g5p zawierające PrP są przyciągane do ścianek probówek Eppendorf za pomocą zewnętrznego pola magnetycznego, co umożliwia łatwe usunięcie wszystkich niewiązących się cząsteczek z roztworu.</li>
	<li>Po trzykrotnym przemyciu w buforze piorącym (2% Tween-20 i 2% NP-40 w PBS, pH 7,5), kulki g5p są zbierane i podgrzewane do 95 °C przez 5 min w buforze do próbek SDS (3% SDS, 2 mM EDTA, 10% glicerolu, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).</li>
	<li>Po schłodzeniu próbek przez 5 min w temperaturze pokojowej, próbki wiruje się przy 1 000 x g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Nadlodze są gotowe do analizy Western blotting.</li>
</ol>
5. Western blotting
<ol>
	<li>Próbki zagotowane w buforze do próbek SDS nanosi się na 15% gotowe żele Tris-HCl Criterion (Bio-Rad) przy napięciu 150 V przez około 80 min.</li>
	<li>Białka z żeli przenosi się na membranę PVDF przez 2 h przy 70V.</li>
	<li>Po zablokowaniu membran w 5% roztworze mleka w soli buforowanej Trisem zawierającej 0,01% Tween-20 (TBS-T), membrany inkubuje się przez 2 h w temperaturze pokojowej z pierwotnym przeciwciałem monoklonalnym lub poliklonalnym 3F4 (1:40 000), 1E4 (1:1 000), anty-N8 (1:6 000) lub anty-C8 (1:6 000) w celu detekcji cząsteczki PrP.</li>
	<li>Po inkubacji z przeciwciałem wtórnym: owczym anty-mysim IgG sprzężonym z HRP w rozcieńczeniu 1:3000 lub oslim anty-kroliczym IgG w rozcieńczeniu 1:3 000, prążki PrP wizualizuje się na filmie Kodak przy użyciu zestawu ECL Plus, zgodnie z protokołem producenta.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
W porównaniu z próbkami sporadycznego CJD, w frakcji P2 w normalnych mózgach wykryto niewielką ilość iPrPC, choć większość PrPC odzyskano we frakcji S2 (Rysunek 1). Jak wskazano wcześniej8, iPrP stanowi około 5-25% całkowitego PrP, w tym form pełnowymiarowych i skróconych z N-końca.
Analizy z wykorzystaniem sedymentacji w gradientach skokowych sacharozy wykazały, że choć większość PrPC z mózgów osób bez CJD odzyskano w górnych frakcjach 1-3, niewielkie ilości PrP wykryto również w dolnych frakcjach 9-11, które zazwyczaj zawierają duże agregaty8 (Rysunek 2).
Za pomocą filtracji żelowej w mózgu z chorobą Creutzfelda-Jakoba wyizolowano różne gatunki PrPSc, obejmujące monomery, małe oligomery oraz większe agregaty (Rysunek 3A). Jednakże w frakcjach nierozpuszczalnych prawidłowych mózgów wykryto również niewielką ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej przekraczającej 2 000 kDa (Rysunek 3C). Co więcej, dimery i tetramery PrPC wykryto nie tylko we frakcjach nierozpuszczalnych, ale również we frakcjach rozpuszczalnych (Rysunek 3B i 3C).
Po traktowaniu PK i PNGazą, PrP wychwycone przez g5p wykryto za pomocą przeciwciała 1E4 przeciwko PrP97-105 8. Wykryto trzy odporne na PK fragmenty rdzeniowe nazwane PrP*20, PrP*19 i PrP*7, które migrowały odpowiednio na poziomie ~20 kDa, ~19 kDa i ~7 kDa (Rysunek 4, panel lewy). Jednak nie wykryto żadnego PrP, gdy przeciwciało 1E4 inkubowano wstępnie z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem 1E4 (Rysunek 4, panel środkowy), co wskazuje, że prążki wykryte przez 1E4 są fragmentami PrP. Ponadto przeciwciało anty-C ujawniło dwa różne fragmenty PrP migrujące na poziomie ~18 kDa (PrP*18) i ~12-13 kDa (PrP-CTF12/13), oprócz PrP*20 (Rysunek 4, panel prawy).
<img alt="Schemat Western blot, analiza białek, traktowanie PNGazą F, CTL vs CJD, ścieżki S2 P2, wiązanie przeciwciał." src="/files/ftp_upload/3788/3788fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Detekcja iPrPC i iPrPSc. Po traktowaniu PNGazą F w ilości 1/10 całkowitej objętości reakcji w temperaturze 37 °C przez 1 h w celu usunięcia glikanów z białka, pełnowymiarowe lub ucięte z końca N-końcowego formy PrP w frakcjach rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych (S2 i P2) izolowanych przez ultrawirowanie w próbkach mózgu z grupy kontrolnej (CTL) oraz z przypadków sporadycznego CJD (sCJD) wykryto za pomocą przeciwciała 3F4 przeciwko PrP106-112 (lewy panel), przeciwciała anti-N przeciwko PrP23-40 (środkowy panel) oraz przeciwciała anti-C przeciwko PrP220-231 (prawy panel). W próbkach CTL niewielka ilość PrP jest wykrywana w P2, podczas gdy duża ilość występuje w S2. W przeciwieństwie do tego, w próbkach sCJD w P2 wykryto więcej PrP niż w S2.
<img alt="Wynik elektroforezy oczyszczania białka; żel pokazujący rozkład frakcji; masy cząsteczkowe." src="/files/ftp_upload/3788/3788fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Sedymentacja PrP w skokowych gradientach sacharozy. PrP w poszczególnych frakcjach od 1 do 11 z próbki mózgu S1 (bez CJD) wykryto metodą Western blotting z użyciem przeciwciała 3F4. Choć większość PrPC wykryto w górnych frakcjach 1-3, niewielkie ilości PrP zaobserwowano również w dolnych frakcjach 9-11. Ponadto wzór prążkowy PrP z góry i dołu różni się od siebie: PrP odzyskano w górnych frakcjach z dominującym górnym prążkiem, natomiast PrP odzyskano w dolnych frakcjach z dominującym dolnym prążkiem. Jako kontrola, po prawej stronie blotu, naniesiono PrPSc traktowane PK.
<img alt="Wyniki oczyszczania białek z frakcji FPLC, elektroforeza żelowa wykazująca prążki o różnych masach cząsteczkowych." src="/files/ftp_upload/3788/3788fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Detekcja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrPC. Rozpuszczalne i nierozpuszczalne PrPC z normalnych ludzkich mózgów zostały rozdzielone za pomocą ultrawirowania, a następnie poddane odpowiednio filtracji żelowej. Wielkości cząsteczkowe poszczególnych frakcji zmierzono poprzez przeprowadzenie analizy grupy markerów masy cząsteczkowej. (A) Formy PrPSc z próbek mózgu sCJD. Wykryto dwie populacje form PrP: frakcje filtracji żelowej 49-65 zawierają monomery i małe oligomery, natomiast frakcje 27-33 zawierają duże agregaty. Wykryto formy PrPC z frakcji rozpuszczalnej (S2) (B) i frakcji nierozpuszczalnej (P2) (C) z normalnych kontroli. PrP wykazano przy użyciu przeciwciała 3F4. Dimery (frakcja 55) i tetramery (frakcja 51) PrP wykryto nie tylko w P2, ale także w S2 próbek normalnego mózgu (B i C). Duże agregaty wykryto wyłącznie w P2 próbek normalnych (C).
<img alt="Analiza białek metodą Western blot; porównanie prążków PrP; traktowanie PK i PNGase F; wynik eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3788/3788fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Detekcja różnych fragmentów iPrP opornych na działanie PK w preparatach wzbogaconych o g5p z normalnych ludzkich mózgów. Próbki wzbogacone o g5p poddano działaniu PK i PNGase F przed przeprowadzeniem analizy Western blot z użyciem przeciwciał 1E4 (lewy panel), 1E4 preinkubowanych z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem 1E4 (środkowy panel) oraz przeciwciał anti-C (prawy panel). Przeciwciało 1E4 wykryło trzy oporne na PK fragmenty PrP nazwane PrP*20, PrP*19 oraz PrP*7 (lewy panel). Po zablokowaniu 1E4 peptydem nie wykryto żadnych PrPres (środkowy panel), co wskazuje, że prążki wykryte za pomocą 1E4 są fragmentami PrP. Przeciwciało anti-C ujawniło dwa dodatkowe oporne na PK fragmenty PrP nazwane PrP*18 oraz PrP-CTF12/13, oprócz PrP*20.

<ol><li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prions.+Proc%5BTitle%5D)+AND+%22Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Prions. Proc.</a> Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).</li>
<li>Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cellular+gene+encodes+scrapie+PrP+27-30+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein.</a> Cell. 40, 735-746 (1985).</li>
<li>Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+protein+that+purifies+with+the+scrapie+prion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of a protein that purifies with the scrapie prion.</a> Science. 218, 1309-1311 (1982).</li>
<li>Prusiner, S. B., McKinley, M. P., Bowman, K. A., Bolton, D. C., Bendheim, P. E., Groth, D. F., Glenner, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie+prions+aggregate+to+form+amyloid-like+birefringent+rods%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Scrapie prions aggregate to form amyloid-like birefringent rods.</a> Cell. 35, 349-358 (1983).</li>
<li>Hope, J., Morton, L. J., Farquhar, C. F., Multhaup, G., Beyreuther, K., Kimberlin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+polypeptide+of+scrapie-associated+fibrils+%28SAF%29+has+the+same+size%2C+charge+distribution+and+N-terminal+protein+sequence+as+predicted+for+the+normal+brain+protein+%28PrP%29%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">The major polypeptide of scrapie-associated fibrils (SAF) has the same size, charge distribution and N-terminal protein sequence as predicted for the normal brain protein (PrP).</a> EMBO J. 5, 2591-2597 (1986).</li>
<li>Prusiner, S. B., Groth, D. F., Bolton, D. C., Kent, S. B., Hood, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+structural+studies+of+a+major+scrapie+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Purification and structural studies of a major scrapie prion protein.</a> Cell. 38, 127-134 (1984).</li>
<li>Hall, D., Edskes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silent+prions+lying+in+wait%3A+a+two-hit+model+of+prion%2Famyloid+formation+and+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Silent prions lying in wait: a two-hit model of prion/amyloid formation and infection.</a> J. Mol. Biol. 336, 775-786 (2004).</li>
<li>Yuan, J., Xiao, X., McGeehan, J., Dong, Z., Cali, I., Fujioka, H., Kong, Q., Kneale, G., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insoluble+aggregates+and+protease-resistant+conformers+of+prion+protein+in+uninfected+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Insoluble aggregates and protease-resistant conformers of prion protein in uninfected human brains.</a> J. Biol. Chem. 281, 34848-34858 (2006).</li>
<li>Yuan, J., Dong, Z., Guo, J. P., McGeehan, J., Xiao, X., Wang, J., Cali, I., McGeer, P. L., Cashman, N. R., Bessen, R., Surewicz, W. K., Kneale, G., Petersen, R. B., Gambetti, P., Zou, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accessibility+of+a+critical+prion+protein+region+involved+in+strain+recognition+and+its+implications+for+the+early+detection+of+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Accessibility of a critical prion protein region involved in strain recognition and its implications for the early detection of prions.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65, 631-643 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Zheng, J., Gray, D. M., Gambetti, P., Chen, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+DNA+detects+scrapie+but+not+normal+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Antibody to DNA detects scrapie but not normal prion protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 1380-1385 (2004).</li>
<li>Gambetti, P., Dong, Z., Yuan, J., Xiao, X., Zheng, M., Alshekhlee, A., Castellani, R., Cohen, M., Barria, M. A., Gonzalez-Romero, D., Belay, E. D., Schonberger, L. B., Marder, K., Harris, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+disease+with+abnormal+prion+protein+sensitive+to+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A novel human disease with abnormal prion protein sensitive to protease.</a> Ann. Neurol. 63, 697-708 (2008).</li>
<li>Zou, W. Q., Puoti, G., Xiao, X., Yuan, J., Qing, L., Cali, I., Shimoji, M., Langeveld, J. P., Castellani, R., Notari, S., Crain, B., Schmidt, R. E., Geschwind, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variably+protease-sensitive+prionopathy%3A+A+new+sporadic+disease+of+the+prion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Variably protease-sensitive prionopathy: A new sporadic disease of the prion protein.</a> Ann. Neurol. 68, 162-172 (2010).</li>
<li>Zou, W. Q., Xiao, X., Yuan, J., Puoti, G., Fujioka, H., Wang, X., Richardson, S., Zhou, X., Zou, R., Li, S., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-beta42+interacts+mainly+with+insoluble+prion+protein+in+the+Alzheimer+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Amyloid-beta42 interacts mainly with insoluble prion protein in the Alzheimer brain.</a> J. Biol. Chem. 286, 15095-15105 (2011).</li>
<li>Zou, W. Q., Colucci, M., Gambetti, P., Chen, S. G. Characterization of prion proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZou%2C+WQ+%22Methods+in+Molecular+Biology-Neurogenetics%3A+Methods+and+Protocols%22">Methods in Molecular Biology-Neurogenetics: Methods and Protocols</a>. Potter, N. T. , Humana Press Inc. Totowa. 305-314 (2002).</li>
<li>Tzaban, S., Friedlander, G., Schonberger, O., Horonchik, L., Yedidia, Y., Shaked, G., Gabizon, R., Taraboulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protease-sensitive+scrapie+prion+protein+in+aggregates+of+heterogeneous+sizes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protease-sensitive scrapie prion protein in aggregates of heterogeneous sizes.</a> Biochemistry. 41, 12868-12875 (2002).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Opisana tutaj kombinacja podejść pozwala na wyizolowanie konsekwentnie nierozpuszczalnego białka PrPC agregaty i rozpuszczalne PrPC oligomery z normalnego ludzkiego mózgu. Ultracentryfugacja przy 100 000 x g przez jedną godzinę to klasyczna metoda, która była szeroko stosowana do oddzielania nierozpuszczalnego PrPSc z rozpuszczalnego PrPC 14Mimo że metoda ta jest wydajna, jedną z kwestii wymagających ostrożności jest unikanie kontaminacji podczas pobierania supernatantu (S2) po...

<table><tbody><tr><td>Fluorek fenylometylosulfonylowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td>72 mM w 2-propanolu</td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2308</td><td>2 mg/ml w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PNGaza F</td><td>New England Biolabs</td><td>MWGF200</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga LE-80K, rotor SW55</td><td>Beckman Coulter</td><td>Nr kat. 365668, 356860</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki Superdex 200 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1088-01</td><td></td></tr><tr><td>System AKTA FPLC</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1900-26</td><td></td></tr><tr><td>Markery masy cząsteczkowej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MWGF200</td><td>Różne</td></tr><tr><td>Magnetyczne kuleczki Dynabeads M-280</td><td>Invitrogen</td><td>143-01</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 3F4</td><td>Covance</td><td>SIG-39600</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało 1E4</td><td>Cell Sciences</td><td>M1840</td><td></td></tr><tr><td>Gotowe żele odlewane 15% Tris-HCl</td><td>Bio-Rad</td><td>345-0020</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów prp w prawidłowym ludzkim mózgu

Isolation of Soluble and Insoluble PrP Oligomers in the Normal Human Brain

Kluczowe zdarzenie w patogenezie chorób prionowych polega na konwersji kodowanego przez gospodarza komórkowego białka prionowego PrPC w jego patogenną izoformę PrPSc 1. PrPC jest rozpuszczalne w detergentach i wrażliwe na trawienie proteinazą K (PK), podczas gdy PrPSc tworzy nierozpuszczalne w detergentach agregaty i jest częściowo oporne na PK2-6. Wiadomo, że konwersja PrPC do PrPSc wiąże się z przejściem konformacyjnym struktur białka z helis α w harmonijki β. Jednak ścieżka in vivo pozostaje wciąż słabo poznana. Próba zidentyfikowania w nieinfected mózgu endogennego PrPSc, pośredniego PrP* lub „cichego prionu”, nie zakończyła się jeszcze sukcesem7.
Wykorzystując kombinację podejść biofizycznych i biochemicznych, zidentyfikowaliśmy nierozpuszczalne agregaty PrPC (oznaczone jako iPrPC) w niezinfekowanych mózgach ssaków oraz w hodowlanych komórkach neuronalnych8, 9. W niniejszym materiale opisujemy szczegółowe procedury tych metod, w tym ultrawirowanie w buforze z detergentem, sedymentację w gradientowym stopniu stężeń sacharozy, chromatografię wykluczania cząsteczkowego, wzbogacanie iPrP za pomocą białka genu 5 (g5p), które specyficznie wiąże się ze strukturalnie zmienionymi formami PrP10, oraz traktowanie PK. Połączenie tych podejść pozwala wyizolować z prawidłowego ludzkiego mózgu nie tylko nierozpuszczalne agregaty PrPSc i PrPC, ale również rozpuszczalne oligomery PrPC. Ponieważ protokoły opisane w niniejszym opracowaniu były stosowane do izolacji zarówno PrPSc z zakażonych mózgów, jak i iPrPC z niezinfekowanych mózgów, dają nam one możliwość porównania różnic w cechach fizykochemicznych, neurotoksyczności i zakaźności między tymi dwiema izoformami. Takie badanie znacząco poszerzy naszą wiedzę na temat zakaźnych patogenów białkowych. Fizjologia i patofizjologia iPrPC nie są obecnie jasne. Co istotne, w nowo zidentyfikowanej ludzkiej chorobie prionowej, określanej jako zmiennie wrażliwa na proteazy prionopatia, odkryliśmy nowy PrPSc, który wykazuje podobne zachowanie immunoreaktywne i fragmentację co iPrPC 11, 12. Ponadto niedawno wykazaliśmy, że iPrPC jest głównym gatunkiem oddziałującym z białkiem amyloid-β w chorobie Alzheimera13. W tym samym badaniu metody te zostały wykorzystane do izolacji agregatów i oligomerów Abeta w chorobie Alzheimera13, co sugeruje możliwość ich zastosowania w przypadku agregatów białek nieprionowych zaangażowanych w inne zaburzenia neurodegeneracyjne.

Nowy gatunek komórkowego białka prionowego (PrPC) został niedawno zidentyfikowany w niezakażonych ludzkich mózgach przy użyciu opisanych tutaj metod. Metody te mogą być wykorzystane do izolacji różnych gatunków PrP, a niektóre z nich są również przydatne w izolacji innych agregatów białek o błędnej strukturze z ludzkich mózgów.

Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Kluczowym zdarzeniem w patogenezie chorób prionowych jest konwersja kodowanego przez organizm gospodarza komórkowego białka prionowego PrPC w jego patogenną izoformę...

Celem niniejszej procedury jest wyizolowanie rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego białka prionowego (PRP) ze wszystkich więzadeł w normalnym ludzkim mózgu. Osiąga się to poprzez wstępną homogenizację tkanki mózgowej człowieka i wyizolowanie frakcji. Następnie przeprowadza się sedymentację prędkościową w gradientach schodkowych sacharozy.Następnie przeprowadza się chromatografię wykluczania sizerowego. Na koniec PRP jest wychwytywane przez białko G5P. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące izolację rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego PRP lub agregatów z normalnego ludzkiego mózgu poprzez ultrawirowanie w gradientach schodkowych sacharozy, chromatografię wykluczania sizerowego oraz wychwytywanie PRP za pomocą G5P. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami prionowymi, w tym nad chorobą Creutzfeldt-Jakob, encefalopatią gąbczastą krów (BSE) oraz klinicznymi chorobami wyniszczającymi. Ponadto mogą one dostarczyć wiedzy na temat izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych agregatów białkowych nie tylko w przypadku chorób prionowych, ale także w innych schorzeniach, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami napotykają trudności, ponieważ wszystkie etapy eksperymentalne są istotne i wymagają szczególnej uwagi. Demonstracja wideo jest w tym przypadku kluczowa, gdyż SEC Fi oraz PRP capture z G five P to kroki trudne do opisania, które mogą nie przynieść prawidłowych rezultatów bez bardziej precyzyjnego wykonania. Aby przygotować homogenat mózgu, należy zacząć od dodania 100 µL buforu lizującego do 100 mg zamrożonej tkanki mózgowej; tkankę należy homogenizować na lodzie za pomocą zmechanizowanego tłuczka, zamrozić na suchym lodzie przez pięć minut, a następnie ponownie homogenizować.Przygotuj 20% lub 10% całkowity homogenat mózgu, dodając odpowiednio 300 lub 800 µL buforu do lizy. Przecentróż homogenat w wirówce laboratoryjnej przy 1000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zbierz SNA w wirówce z rotorem SW 55, odwirowując frakcję S1 przy 35 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.Przenieś supernatant do czystej probówki. Resuspenduj pellet nierozpuszczalny w detergencie w buforze lizującym w celu przygotowania próbek do western blotu. Inkubuj frakcje S2 i P2 z proteinazą K w stężeniu 50 µg/mL przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Przerwij trawienie, dodając 5 mM PMSF oraz bufor do próbek z SDS. Gotuj próbki przez 10 minut, a następnie pozostaw je w temperaturze pokojowej na 5 minut. Aby przeprowadzić sedymentację prędkościową, zacznij od inkubowania 450 µL frakcji S1 20% z równą objętością wody z 2% Sarco X na lodzie przez 30 minut w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml. Dodaj po 0,5 ml sacharozy o stężeniach 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10%. Nanieś 0,4 ml inkubowanego S1 na górę gradientu sacharozy 10-60%.Wiruj gradienty skokowe w rotorze SW 55 przy 48 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza, pobierając próbki od góry probówki. Zbierz 12 równych frakcji po 283 µl każda. Użyj 20 µl z każdej frakcji oraz równą objętość buforu do próbek SDS.Przygotowanie próbek do żelu SDS-PAGE. Gotuj próbki przez 10 minut, a następnie chłodź je przez cztery minuty. Odwiruj próbki w wirówce z prędkością 1000 G przez jedną minutę.Następnie wymieszaj je w wortexie przed naniesieniem na gotowy żel do wykluczania molekularnego. Chromatografia jest stosowana w celu określenia stanu oligomerycznego cząsteczek PRP. Rozpocznij od naniesienia próbek o objętości 200 µL siedmiu poszczególnych markerów masy cząsteczkowej na kolumnę o wymiarach 1 x 30 wypełnioną kulkami SUEx 200 HR.Przyjmij objętość elucji niebieskiego dekstranu jako objętość martwą. Oblicz objętości elucji piku VE na podstawie chromatogramu i retencji frakcji. Oblicz współczynnik podziału KAV, korzystając z równania KAV równa się V minus V zero podzielone przez VT minus V zero.W celu wygenerowania krzywej kalibracyjnej należy wykreślić KAV standardów białkowych w funkcji logarytmu masy cząsteczkowej standardów. Następnie należy nanieść 200 µL próbki S one na kolumnę przy szybkości przepływu 0,25 mL/min.Przemyj kolumnę buforem do lizy 1%cile, a następnie za pomocą kolektora frakcji wyługuj frakcje o objętości 0,25 ml. Inkubuj 125 µL z każdej frakcji z 500 µL schłodzonego wcześniej metanolu w temperaturze -20 °C przez dwie godziny. Odwiruj próbki przy 13 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.Reese, rozpuść osad w 20 µL buforu do próbek SDS i gotuj przez 10 minut. Schłodź do temperatury pokojowej i rozdziel na 15% żelach poliakrylamidowych. Wykorzystaj krzywą wzorcową do ekstrapolacji mas cząsteczkowych różnych odzyskanych gatunków PRP w celu sprzęgnięcia cząsteczki G5P z kulkami magnetycznymi.Inkubuj 100 µg G5P z 350 µL aktywowanych magnetycznych kulek toci w 1 mL PBS w temperaturze 37 °C przez 20 godzin. Użyj zewnętrznego magnesu, aby przyciągnąć kulki G5P do ścianki probówek Eppendorf, a następnie usuń roztwór. Przemyj kulki trzy razy 1 mL PBS z 0,1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.Inkubować kulki sprzężone z G5P w 1 ml 0,2 M buforu Tris-HCl pH 7,4 zawierającego 0,1% BSA przez pięć godzin w temperaturze 37°C. Następnie przemyć kulki trzykrotnie. Usunąć ostatni płucznik i dodać 1 ml PBS w celu wyizolowania PRP. Inkubować 100 µl S1 lub P2 z 60 µl kulek sprzężonych z G5B w 1 ml buforu wiążącego przy stałej rotacji przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.Umieść probówkę na magnesie. Usuń roztwór i przemyj kuleczki trzykrotnie buforem do mycia. Usuń ostatnią porcję buforu i dodaj bufor do próbek SDS.Podgrzewaj kuleczki w temperaturze 95°C przez pięć minut. Naniesienie próbek na gotowe żele 15% i prowadź elektroforezę przy napięciu 150 V przez około 80 minut. Przenieś białka na membranę PVDF przy napięciu 70 V przez dwie godziny, po uprzednim zablokowaniu membran w 5% mleku w TBST.Inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałami przeciwko PRP. 3F4 i 1E4 anty-N lub anty-C. Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP inkubuj membranę z roztworem chemiluminescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta i naświetl film, jak pokazano tutaj, w porównaniu z próbkami sporadycznego vCJD, sCJD lub CJD. W frakcji P2 z normalnych mózgów wykryto niewielką ilość nierozpuszczalnego komórkowego PRP.Jednak większość odzyskano w frakcji S dwa. Nierozpuszczalne PRP stanowi około 5 do 25% całkowitego PRP, w tym gatunki pełnowymiarowe i ucięte z końców. Analizy z wykorzystaniem sedymentacji w gradientowym stopniu stężenia sacharozy wykazały, że o ile większość PRPC z mózgów bez CJD odzyskano w górnych frakcjach, jeden trzy, to niewielkie ilości PRP wykryto również w dolnych frakcjach dziewięć 11, które zazwyczaj zawierają duże agregaty. Różnorodne gatunki patogennego PRP lub PRP SC, od monomerów.Mniejsze ligandy oraz większe agregaty wyizolowano za pomocą filtracji żelowej z mózgu z chorobą yakup z zaworem CRUT. Co zaskakujące, niewielka ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej przekraczającej 2000 kilodaltonów została wykryta również w frakcjach nierozpuszczalnych prawidłowych mózgów. Co więcej, dimery i tetramery PRPC wykryto nie tylko w frakcjach nierozpuszczalnych, ale także w frakcjach nierozpuszczalnych.Po traktowaniu PK i PNGaza. PRP wychwycone przez G5P wykryto za pomocą przeciwciała 1E4 przeciwko PRP 97 1 0 5 3. Wykryto fragmenty rdzenia odporne na PK, nazwane PRP*20, PRP*19 i PRP*7, które migrowały odpowiednio na poziomie 20 kDa, 19 kDa i 7 kDa.Jednak nie wykryto PRP, gdy przeciwciało one E four inkubowano wcześniej z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem one E four, co wskazuje, że prążki wykryte przez one E four są fragmentami PRP. Przeciwciało anti C wykryło dwa różne fragmenty PRP migrujące w okolicy 18 kilodaltonów oraz około 12 do 13 kilodaltonów. Dodatkowo do metody PRP ETE 20 Once.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu czterech dni, jeśli jest ona wykonywana prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak izolować rozpuszczalne i nierozpuszczalne polimery PRP w dolnych obszarach ludzkiego mózgu po ich rozwoju. Technika ta utorowała drogę do badań nad losem przed eksploracją informacji o potwierdzeniu PIP w mózgu.

isolation-soluble-insoluble-prp-oligomers-normal-human

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w normalnym ludzkim mózgu

Ten film demonstruje protokół izolacji włókienek amyloidu z ekstraktu tkanki mózgowej myszy za pomocą wirowania gradientu gęstości i trawienia białek nieamyloidowych.

Izolacja włókien amyloidowych z ekstraktu z tkanki mózgowej

Ten film wyjaśnia proces izolowania i wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z zamrożonej pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Demonstruje kluczowe etapy, w tym homogenizację, obróbkę detergentami, sonikację i ultrawirowanie w celu oddzielenia i oczyszczenia nierozpuszczalnych agregatów. Ostatnim etapem jest solubilizacja agregatów w buforze mocznikowym w celu dalszej analizy.

Izolacja nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiej pośmiertnej tkanki mózgowej

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Tutaj prezentujemy protokół izolacji coraz bardziej nierozpuszczalnej/zagregowanej alfa-synukleiny (α-syn) z pośmiertnej ludzkiej tkanki mózgowej. Dzięki zastosowaniu o zwiększonej mocy detergentu i technikom ultrawirowania z dużą prędkością, można badać zmienne właściwości agregacji α-syn w tkankach chorych i niechorych.

Sekwencyjna ekstrakcja rozpuszczalnej i nierozpuszczalnej alfa-synukleiny z mózgów parkinsonowskich

Tutaj prezentujemy protokół frakcjonowania błony mózgowej, który stanowi solidną procedurę izolowania białek należących do różnych przedziałów synaptycznych.

Frakcjonowanie błony mózgowej: podejście ex vivo do oceny lokalizacji białek subsynaptycznych

Opisany jest skrócony protokół frakcjonowania do wzbogacania nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego.

Wzbogacanie nierozpuszczalnych w detergentach agregatów białkowych z ludzkiego mózgu pośmiertnego

Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności...

Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

Izolowane naczynia włosowate mózgu z ludzkiej tkanki mózgowej mogą być użyte jako model przedkliniczny do badania funkcji bariery w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych. Tutaj przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolowania naczyń włosowatych mózgu od świeżej ludzkiej tkanki mózgowej.

Izolacja naczyń włosowatych mózgu ze świeżej ludzkiej tkanki mózgowej

Tutaj opisana jest metoda izolacji mikronaczyń mózgowych szczurów i przygotowania próbek błonowych. Protokół ten ma wyraźną zaletę polegającą na wytwarzaniu wzbogaconych próbek mikronaczyń o akceptowalnej wydajności białka od poszczególnych zwierząt. Próbki można następnie wykorzystać do solidnych analiz białek w śródbłonku mikronaczyniowym mózgu.

Prosta i powtarzalna metoda przygotowania próbek błonowych ze świeżo wyizolowanych mikronaczyń mózgu szczura

Ta metoda biochemicznego oczyszczania z analizą proteomiczną opartą na spektrometrii mas ułatwia solidną charakterystykę rdzeni włókienkowych amyloidu, co może przyspieszyć identyfikację celów zapobiegania chorobie Alzheimera.

Biochemiczne oczyszczanie i charakterystyka proteomiczna rdzeni fibryli amyloidowych z mózgu

Poznaj metodę izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów białka PrP z ludzkiego mózgu. Techniki ultrawirówki i chromatografii umożliwiają badanie agregatów białkowych w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Przeglądaj więcej filmów