Izolacja rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych oligomerów PrP w prawidłowym ludzkim mózgu

Celem niniejszej procedury jest wyizolowanie rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego białka prionowego lub PRP z wszystkich więzadeł w normalnym ludzkim mózgu. Osiąga się to najpierw poprzez homogenizację tkanki mózgowej człowieka i wyizolowanie frakcji. Następnie przeprowadza się sedymentację prędkościową w gradientach schodkowych sacharozy.

Następnie przeprowadza się chromatografię wykluczania treści. Na koniec PRP jest wychwytywane za pomocą białka G5P. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące izolację rozpuszczalnego i nierozpuszczalnego PRP lub agregatów z normalnego ludzkiego mózgu poprzez ultrawirowanie w stopniowych gradientach sacharozy, chromatografię wykluczania treści oraz wychwyt PRP za pomocą G5P. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad chorobami prionowymi, w tym nad chorobą Creutzfeldta-Jakoba, encefalopatią gąbczastą u bydła (BSE) oraz klinicznymi chorobami wyniszczającymi. Ponadto mogą one dostarczyć wiedzy na temat izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych agregatów białkowych nie tylko w przypadku chorób prionowych, ale także w innych schorzeniach, takich jak choroba Alzheimera i choroba Parkinsona.

Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tymi metodami napotykają trudności, ponieważ wszystkie kroki eksperymentalne są istotne i wymagają szczególnej staranności. Demonstracja wideo jest w tym przypadku kluczowa, gdyż SEC Fi ma znaczną głębokość, a wychwyt PRP z G five P to etapy trudne do opisania, które mogą nie przynieść prawidłowych rezultatów bez precyzyjnego wykonania. Aby przygotować homogenat mózgu, należy rozpocząć od dodania 100 µL buforu lizującego do 100 mg zamrożonej tkanki mózgowej; następnie, używając zmotoryzowanego tłuczka, homogenizować tkankę na lodzie, zamrozić ją na suchym lodzie przez pięć minut i ponownie homogenizować.

Przygotować 20% lub 10% całkowity homogenat mózgu, dodając odpowiednio 300 lub 800 µL buforu lizującego. Używając wirówki stołowej, wirować homogenat z prędkością 1000 G przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać SNA w wirówce z rotorem S SW 55, wirować frakcję S1 z prędkością 35 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze 4 °C.

Przenieś nadsącz do czystej probówki. Resuspenduj osad nierozpuszczalny w detergencie w buforze do lizy, aby przygotować próbki do analizy western blot. Inkubuj frakcje S2 i P2 z proteinazą K w stężeniu 50 µg/mL przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.

Przerwij trawienie poprzez dodanie 5 mM PMSF oraz buforu do próbek SDS. Gotuj próbki przez 10 minut, a następnie pozostaw je w temperaturze pokojowej na pięć minut. Aby przeprowadzić sedymentację prędkościową, zacznij od inkubowania 450 µL frakcji S1 20% z równą objętością 2% wodnego roztworu Sarco X na lodzie przez 30 minut w probówkach wirówkowych o pojemności 5 ml. Dodaj po 0,5 ml sacharozy w stężeniach 60%, 30%, 25%, 20%, 15% i 10%. Nanieś 0,4 ml inkubowanego S1 na górę gradientu sacharozy 10-60%.

Wiruj gradienty stopniowe w rotorze SW 55 przy 48 000 RPM przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsius od góry probówki. Zbierz 12 równych frakcji o objętości 283 µL każda. Pobierz 20 µL z każdej frakcji i dodaj równą objętość buforu do próbek SDS.

Aby przygotować próbki do żelu SDS-PAGE. Gotować próbki przez 10 minut, a następnie chłodzić przez cztery minuty. Odwirować próbki przy 1000 G przez jedną minutę.

Następnie wymieszaj je w wibratorze laboratoryjnym przed nałożeniem na gotowy żel do wykluczania żelowego. Chromatografia jest stosowana do wyznaczenia stanu oligomerycznego cząsteczek PRP. Rozpocznij od nałożenia próbek o objętości 200 µL siedmiu poszczególnych markerów masy cząsteczkowej na kolumnę o wymiarach 1 x 30 wypełnioną granulkami SUEx 200 HR.

Objętość elucji niebieskiego dekstranu należy przyjąć jako objętość martwą. Na podstawie chromatogramu i retencji frakcji oblicz objętości elucji piku VE. Oblicz współczynnik podziału KAV, korzystając z równania KAV równa się V minus V zero podzielone przez VT minus V zero.

Aby wygenerować krzywą kalibracyjną, należy nanieść KAV standardów białkowych w funkcji logarytmu masy cząsteczkowej standardów. Następnie należy nałożyć 200 µL próbki S one na kolumnę przy szybkości przepływu 0,25 mL/min.

Przemyj kolumnę buforem lizującym 1%cile i za pomocą kolektora frakcji wyeluuj frakcje o objętości 0,25 ml. Inkubuj 125 µl z każdej frakcji z 500 µl schłodzonego wcześniej metanolu w temperaturze -20 °C przez dwie godziny. Wirowaj próbki przy 13 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.

Reese, rozpuść osad w 20 µL buforu do próbek SDS i gotuj przez 10 minut. Schłodź do temperatury pokojowej i rozdziel na 15% żelach poliakrylamidowych. Wykorzystaj krzywą wzorcową, aby wyznaczyć masy cząsteczkowe różnych odzyskanych gatunków PRP w celu sprzężenia cząsteczki G5P z kuleczkami magnetycznymi.

Inkubować 100 µg G5P z 350 µL aktywowanych kulek magnetycznych TOCI w 1 ml PBS w temperaturze 37 °C przez 20 godzin. Za pomocą zewnętrznego magnesu przyciągnąć kulki G5P do ścianki probówek Eppendorf i usunąć roztwór. Przemyć kulki trzy razy 1 ml PBS z 0,1% BSA w celu zablokowania niespecyficznego wiązania.

Inkubować kulek sprzęganych z G5P w 1 ml 0,2 M Tris-HCl pH 7,4 zawierającego 0,1% BSA przez pięć godzin w temperaturze 37 °C. Następnie trzykrotnie przemyć kulki. Usunąć ostatni roztwór płuczący i dodać 1 ml PBS w celu wyizolowania PRP. Inkubować 100 µL S1 lub P2 z 60 µL kulek sprzęganych z G5B w 1 ml buforu wiążącego w warunkach ciągłego obracania przez trzy godziny w temperaturze pokojowej.

Umieść probówkę na magnesie. Odlej roztwór i przemyj kuleczki trzy razy buforem do mycia. Odlej ostatnią porcję buforu i dodaj bufor do próbek SDS.

Podgrzewaj kuleczki w temperaturze 95 °C przez pięć minut. Naniesienie próbek na gotowe żele 15% i prowadź elektroforezę przy napięciu 150 V przez około 80 minut. Po zablokowaniu membran w 5% mleka w TBST, przenieś białka na membranę PVDF przy napięciu 70 V przez dwie godziny.

Inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze pokojowej z przeciwciałami PRP. 3F4 i 1E4 anty-N lub anty-C. Po inkubacji z przeciwciałami wtórnymi sprzężonymi z HRP, inkubuj błonę z roztworem chemiluminescencyjnym zgodnie z instrukcjami producenta i naświetl film, jak pokazano tutaj, w porównaniu do sporadycznych próbek vCJD, sCJD lub CJD. W frakcji P2 z normalnych mózgów wykryto niewielką ilość nierozpuszczalnego komórkowego PRP.

Jednak większość odzyskano w frakcji S dwa. Nierozpuszczalne PRP stanowi około 5–25% całkowitego PRP, w tym gatunki pełnowymiarowe i ucięte z końca. Analizy z wykorzystaniem sedymentacji w gradientie skokowym sacharozy wykazały, że choć większość PRPC z mózgów osób bez CJD odzyskano w górnych frakcjach jeden trzy, niewielkie ilości PRP wykryto również w dolnych frakcjach dziewięć 11, które zazwyczaj zawierają duże agregaty. Różnorodne patogenne gatunki PRP lub PRP SC, od monomerów.

Mniejsze ligandy i większe agregaty wyizolowano metodą filtracji żelowej z mózgu z chorobą Croutzona (CRUT valve yakup disease). Co zaskakujące, niewielką ilość większych agregatów o masie cząsteczkowej przekraczającej 2000 kilodaltonów wykryto również w frakcjach nierozpuszczalnych prawidłowych mózgów. Ponadto dimery i tetramery PRPC wykryto nie tylko we frakcjach nierozpuszczalnych, ale również we frakcjach nierozpuszczalnych.

Po traktowaniu PK i PNGazami. PRP wychwycone przez G pięć P wykazano przy użyciu przeciwciała one E cztery przeciwko PRP 97 1 0 5 3. Wykryto odporne na PK fragmenty rdzenia, nazwane PRP asterisk 20, PRP asterisk 19 oraz PRP asterisk siedem, które migrowały odpowiednio przy 20 kilodaltonach, 19 kilodaltonach i siedmiu kilodaltonach.

Jednak nie wykryto PRP, gdy przeciwciało one E four poddano inkubacji z syntetycznym peptydem o sekwencji identycznej z epitopem one E four, co wskazuje, że prążki wykryte za pomocą one E four są fragmentami PRP. Przeciwciało anti C wykryło dwa różne fragmenty PRP migrujące przy około 18 kilodaltonach oraz około 12 do 13 kilodaltonach. Oprócz PRP metoda ETE 20 Once.

Przy prawidłowym wykonaniu technikę tę można przeprowadzić w ciągu czterech dni. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć sposób izolacji rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych polimerów PRP w dolnych obszarach ludzkiego mózgu po ich wytworzeniu. Technika ta utorowała drogę do badań nad losem PRP w celu zgłębienia informacji o konformacji PIP w mózgu.