Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wizualizacja i kwantyfikacja odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek, które różnicują się w biofilmach organizmu modelowego bacillus subtles. Osiąga się to poprzez uprzednie wprowadzenie reporterów transkrypcyjnych do chromosomu B subtles. Reportery te będą ekspresowane wyłącznie w badanej subpopulacji komórek.

Kolejnym krokiem jest stymulacja rozwoju biofilmu poprzez hodowlę B subtles w medium indukującym tworzenie biofilmu, Ms GG gg. Po uformowaniu biofilmu komórki z biofilmu są dyspergowane i utrwalane przy użyciu paraformaldehydu. Ostatnim etapem procedury jest detekcja sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez pojedyncze komórki społeczności mikrobowej przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej.

Ostatecznie wyniki pokazują, w jaki sposób komórki specjalizują się w produkcji i wydzielaniu. Macierz zewnątrzkomórkowa, która tworzy biofilm, jest wytwarzana przez inną subpopulację niż komórki wydzielające surfaktant — cząsteczkę sygnałową odpowiedzialną za różnicowanie subpopulacji producentów macierzy. Główną zaletą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak ilościowe określanie ekspresji transkrypcyjnej przy użyciu testów żywotności lub analizy mikromacierzy, jest to, że pozwala ona na monitorowanie ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki oraz wizualizację szczególnie niewielkich populacji komórek wyspecjalizowanych w ekspresji konkretnego genu.

Ekspresja tych genów nie zostanie wykryta podczas analizy całej populacji. Do znakowania podtypów B stosuje się plazmidy integracyjne, a przykład przedstawiono tutaj. PTAA to promotor genów odpowiedzialnych za produkcję tass.

Białko macierzy zostaje sklonowane do wektora przy użyciu miejsc restrykcyjnych EcoRI oraz HindIII. Ekspresja genu reporterowego CFP znajduje się obecnie pod kontrolą promotora tapA. Aby rozpocząć procedurę znakowania B. subtilis, zlinearyzuj plazmid integracyjny poprzez trawienie enzymatyczne. Zalecanym enzymem restrykcyjnym jest XhoI. Gdy plazmid integracyjny będzie gotowy, indukuj naturalną kompetencję w szczepie B. subtilis 168, hodując komórki w medium indukującym kompetencję przez pięć godzin w temperaturze 37 °C.

Dodaj zlinearyzowany plazmid do hodowli kompetentnych komórek B subtilis i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 °C. Po dwóch godzinach wysiej komórki na agar z spectinomycyną i inkubuj przez noc w temperaturze 37 °C. Chromosom B subtilis posiada dwa loci neutralne, Amy E i LAC A, które mogą być wykorzystane do integracji fuzji reporterowych bez wpływu na rozwój biofilmu. Zlinearyzowany plazmid PKM 0 0 8 integruje się z genomem B subtilis poprzez podwójną rekombinację.

Kolejnym krokiem jest przeniesienie reportera z oznakowanego szczepu do szczepu zdolnego do tworzenia biofilmów, z wykorzystaniem protokołu transdukcji fagowej SPP one. Na potrzeby tego filmu pokazano jedynie najważniejsze kroki protokołu. Hoduj szczep donorowy 1 68, zawierający fuzję reporterową, w pożywce TY w temperaturze 37°C, aż kultura osiągnie wczesną fazę stacjonarną, dodając 200 µL komórek do 100 µL rozcieńczonego zapasu fagów w probówce szklanej.

Następnie pozostawmy próbkę w temperaturze 37 °C na 15 minut. Dalej, pipetuj gorący agar miękki TY do probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą vortexa. Delikatnie rozprowadź zawiesinę na świeżej płytce z agarem TY i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 8 do 16 godzin, aby umożliwić powstanie halo fagowych.

Aby zebrać halo faga, dodaj trzy mililitry medium TY na płytkę i za pomocą pipety szklanej rozbij górną warstwę agaru. Przenieś zawiesinę agarową do probówki typu falcon o pojemności 15 mililitrów. Delikatnie wymieszaj na wortexie, aby rozbić agar, a następnie odwiruj przy 1000 G przez 15 minut.

Przenieś supernatant do nowej probówki. Przepuść supernatant przez filtr strzykawkowy o rozmiarze porów 22 µm. Użyj tego supernatantu do zakażenia hodowli szczepu biorcy hodowanego w medium TY.

Do 10 ml kultury rozcieńczonej w stosunku 1:10 dodać 30 µL supernatantu i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie wirować z prędkością 5 000 RPM przez siedem minut, resuspendować osad w 200 µL podłoża TY i wysiać na płytkę zawierającą SPECTmycin oraz 10 mM cytrynianu sodu.

Inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 do 36 godzin. Wybrać kolonię i hodować ją przez noc w płynnym medium LB w temperaturze 37 °C. Na koniec nanieść 3 µL kultury z hodowli nocnej na stałe podłoże indukujące tworzenie biofilmu.

Pozostaw komórki do wzrostu przez 72 godziny w temperaturze 30 °C. Po trzech dniach wzrostu biofilmy utworzone na powierzchni agaru Ms.GG wykształcą złożoną architekturę morfologiczną na powierzchni agaru. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj wykałaczki lub pęsety, aby usunąć biofilm z powierzchni agaru MSGG.

Konsystencja biofilmu powinna umożliwiać jego oddzielenie od powierzchni agaru. Biofilm należy przenieść w całości do trzech mililitrów buforu PBS, a następnie go rozproszyć poprzez delikatne sonikowanie. Aby przygotować próbki do analizy pojedynczych komórek, należy wykonać 12 impulsów o mocy trzech i amplitudzie 0,7 sekundy.

Resuspender 300 µL zawiesiny komórkowej w jednym mililitrze 4% roztworu paraformaldehydu i inkubować w temperaturze pokojowej przez dokładnie siedem minut. Po siedmiominutowej fiksacji przemyć komórki trzy razy w buforze PBS. Na koniec resuspender komórki w 300 µL buforu PBS przed przeprowadzeniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Przygotuj preparat do mikroskopu, naniosząc pipetą 200 µL 0,8% agros na szkiełko i ostrożnie przykrywając go drugim szkiełkiem. Po dwóch minutach delikatnie usuń górne szkiełko, aby uzyskać warstwę agros przytwierdzoną do dolnego szkiełka. Nanieś 2 µL utrwalonych komórek na powierzchnię warstwy agros i przykryj całość szkiełkiem nakrywkowym.

Umieść próbkę na stole mikroskopu fluorescencyjnego. Ustaw czas naświetlania w oparciu o kontrolę negatywną, która nie wykazuje fluorescencji w warunkach wybranych dla eksperymentu. Czas ekspozycji powinien wynosić od 50 do 200 milliseconds.

Należy uzyskać obraz fluorescencyjny oraz obraz w polu jasnym dla każdego pola widzenia. Aby przygotować komórki do analizy cytometrycznej, próbkę utrwalonych komórek należy rozproszyć za pomocą łagodnej sonikacji. Wykonuje się dwie serie po 12 impulsów o mocy 5 i amplitudzie 0,7 sekundy, aby rozbić skupiska na pojedyncze komórki bez wywoływania lizy komórek.

Potwierdzić wydajność dyspersji komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie rozcieńczyć próbkę w stosunku 1:100 w buforze PBS. Do analizy fluorescencji YFP zostanie wykorzystany cytometr przepływowy BD FACSCanto II.

Do wzbudzenia fluorescencji CFP wykorzystuje się laser o długości fali 488 nanometrów z filtrem 5 30 30. Do wzbudzenia laserem o długości fali 405 nanometrów z filtrem 4 0 8 40 należy użyć kalibracji cytometru przepływowego za pomocą dwóch kontroli negatywnych. Próbka buforu PBS bez komórek w zawiesinie powinna służyć jako kontrola negatywna dla wielkości cząstek wykrywanych przez cytometr przepływowy.

Próba bez reportera fluorescencyjnego powinna służyć jako kontrola negatywna dla czułości fluorescencyjnej cytometru przepływowego. Po kalibracji umieść w cytometrze przepływowym próbę znakowaną reporterem fluorescencyjnym; dla każdej próbki przeanalizuj co najmniej 50 000 zdarzeń przy szybkości przepływu od 303 000 zdarzeń na sekundę. Gdy B Subtles rośnie na płytce z pożywką indukującą biofilm MSGG, tworzenie biofilmu obserwuje się po trzech dniach inkubacji w temperaturze 30 °C.

Biofilm wykazuje złożoną architekturę morfologiczną, która wskazuje na obecność odrębnych uczestniczących subpopulacji komórek. Na przykład produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej i biofilmów prowadzi do powstania zmarszczek na powierzchni kolonii. Rysunek ten przedstawia przykład wizualizacji różnicowania komórek w pojedynczym znakowanym szczepie z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Szczep ten posiada fluorescencyjny reporter Ptap, A CFP, który jest ekspresowany w subpopulacji komórek wytwarzających macierz, zaznaczonych kolorem niebieskim. Subpopulacja ta produkuje i wydziela macierz zewnątrzkomórkową, która stanowi biofilm. Następny obraz jest wynikiem wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej szczepu podwójnie znakowanego, który posiada reporter Ptap, A CFP oraz dodatkowy reporter P Surfactin YFP.

Ten drugi reporter umożliwia monitorowanie subpopulacji komórek odpowiedzialnych za wydzielanie cząsteczki sygnałowej surfaktyny, która uruchamia kaskadę sygnałową prowadzącą do różnicowania producentów macierzy. Tutaj producenci macierzy są zaznaczeni kolorem niebieskim, natomiast producenci surfaktyny kolorem żółtym; są to wyniki 2D cytometrii przepływowej z wykorzystaniem pojedynczego znakowanego szczepu zawierającego reporter ptap. Przedstawiono tutaj YFB.

Nieratowana szczep kontrolny bez genów białek fluorescencyjnych wykazał pojedynczą populację z niską względną fluorescencją komórek zawierających ptap. YFP w warunkach nieindukujących tworzenia biofilmu nie pozwolił na odróżnienie subpopulacji producentów macierzy, a cała populacja wykazała również niską względną fluorescencję. W przeciwieństwie do tego, w warunkach indukujących tworzenie biofilmu, wykryto subpopulację komórek o wysokiej względnej fluorescencji, widoczną jako ramię po prawej stronie niskiej względnej fluorescencji.

Przedstawiono tutaj wyniki szczytowe uzyskane z trójwymiarowej cytometrii przepływowej. Sygnały fluorescencji monitorowanych kanałów zaprezentowano na osi X dla YFP oraz na osi Y dla CFP; górny lewy panel przedstawia szczep pozbawiony genów białek fluorescencyjnych jako kontrolę fluorescencji tła. W prawym górnym panelu zastosowano pojedynczo oznakowany szczep w celu wykrycia subpopulacji producentów surfaktyny w kanale fluorescencji YFP, zaznaczonej żółtą ramką.

Na dolnym lewym panelu wykorzystano inny pojedynczo znakowany szczep do wykrycia subpopulacji producentów macierzy. Na kanale fluorescencji CFP obramowanym na niebiesko monitorowano subpopulacje producentów macierzy oraz producentów surfaktantów przy użyciu szczepu podwójnie znakowanego, a wyniki przedstawiono na tym dolnym prawym panelu.

Wykryto dwie subpopulacje komórek wykazujących wysokie poziomy ekspresji reporterów fluorescencyjnych. Każda z populacji została obramowana, co pokazuje brak nakładania się ekspresji reporterów pomiędzy dwiema subpopulacjami wyspecjalizowanych komórek. Ta końcowa rycina przedstawia ilościowe oznaczenie subpopulacji producentów macierzy oraz kanibali za pomocą trójwymiarowej cytometrii przepływowej.

Na górnym prawym panelu użyto pojedynczego znakowanego szczepu do wykrycia subpopulacji kanibali. W kanale fluorescencji YFP obramowanym na żółto subpopulacja ta została opisana jako różnicująca się w sposób skoordynowany z subpopulacją producentów macierzy. Na dolnym lewym panelu subpopulacja producentów macierzy jest wykrywana w innym pojedynczo znakowanym szczepie w kanale fluorescencji CFP.

W obramowaniu niebieskim wyniki dla szczepu z podwójnym znakowaniem w prawym dolnym panelu wykazały pojedynczą subpopulację komórek fluorescencyjnych wykazujących ekspresję zarówno YFP, jak i CFP w obramowaniu zielonym. Jednoczesna ekspresja dwóch reporterów wskazuje, że obie ścieżki różnicowania komórek są koordynacyjnie aktywowane w tej samej subpopulacji. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wizualizować i kwantyfikować odrębne subpopulacje komórek tworzących biofilm mikrobiologiczny, wykorzystując analizę populacji komórek, taką jak mikroskopia fluorescencyjna lub cytometria przepływowa.