Analiza pojedynczych komórek biofilmów Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tej procedury jest wizualizacja i ilościowe określenie odrębnych subpopulacji wyspecjalizowanych komórek, które różnicują się w biofilmach organizmu modelowego, Bacillus subtles. Osiąga się to poprzez najpierw wstawienie reporterów transkrypcyjnych do chromosomu subtelnych B. Te reportery będą ulegać ekspresji wyłącznie w subpopulacji badanych komórek.

Kolejnym krokiem jest promowanie rozwoju biofilmu poprzez hodowlę subtelnych B w pożywce indukującej biofilm, Ms GG gg. Po utworzeniu biofilmu komórki z biofilmu są rozpraszane i utrwalane za pomocą paraformaldehydu. Ostatnim etapem procedury jest wykrycie sygnału fluorescencyjnego emitowanego przez pojedyncze komórki społeczności drobnoustrojów za pomocą fluorescencji, mikroskopii i cytometrii przepływowej.

Ostatecznie wyniki pokazują, w jaki sposób komórki specjalizują się w produkcji i wydzielaniu. Macierz zewnątrzkomórkowa tworząca biofilm to inna subpopulacja niż komórki wydzielające surfaktant, cząsteczkę sygnałową odpowiedzialną za różnicowanie subpopulacji producentów macierzy. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak kwantyfikacja ekspresji transkrypcji przy użyciu testów Vita Ities do analizy mikrorentgenowskiej, jest to, że pozwala nam monitorować ekspresję genów na poziomie pojedynczej komórki i wizualizować szczególnie małe populacje komórek, które są wyspecjalizowane w ekspresji określonego genu.

Te ekspresje genów nie zostaną wykryte podczas analizy całej populacji. Plazmidy integracyjne są używane do oznaczania subtelności B, a przykład pokazano tutaj. PTAA, promotor genów odpowiedzialnych za produkcję tass.

Białko macierzy jest klonowane do wektora przy użyciu miejsc restrykcyjnych ECO, R jeden i hindi trzy. Ekspresja genu reporterowego CFP jest teraz pod kontrolą ptap A, aby rozpocząć procedurę znakowania B, subtelne linearyzują integracyjny plazmid przez trawienie enzymatyczne. Zalecanym enzymem restrykcyjnym jest XH oh jeden, gdy plazmid integracyjny jest gotowy, indukuj naturalną kompetencję w najsubtelniejszym szczepie B 1 68 poprzez hodowlę komórek w pożywce indukującej kompetencje przez pięć godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Dodaj zlinearyzowany plazmid do hodowli kompetentnych najsubtelniejszych komórek B i inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza po dwóch godzinach, pokryj komórki na agarze z mycyną spect i inkubuj przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Chromosom subtelny B ma dwa neutralne loci, Amy, E, E i LAC A, które można wykorzystać do integracji fuzji reporterowych bez wpływu na rozwój biofilmu. Zlinearyzowany plazmid PKM 0 0 8 integruje się z genomem subtelnych B poprzez podwójną rekombinację.

Następnym krokiem jest przeniesienie reportera z oznakowanego szczepu do szczepu, który jest w stanie tworzyć biofilmy przy użyciu protokołu transdukcji jednego faga SPP. Na potrzeby tego filmu pokazane są tylko ważne kroki w protokole. Hoduj szczep dawcy 1 68, ukrywając fuzję reporterową w pożywce TY w temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż kultura osiągnie wczesną fazę stacjonarną przy 200 mikrolitrach komórek do 100 mikrolitrów rozcieńczonego faga w szklanej probówce.

I stańmy w 37 stopniach Celsjusza przez 15 minut. Następnie odpipetuj gorący miękki agar TY do probówki i dokładnie wymieszaj, wirując. Delikatnie rozprowadzić na świeżej płytce TY i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez osiem do 16 godzin, aby umożliwić powstanie halo fagów.

Aby zebrać aureole fagów, dodaj trzy mililitry pożywki TY do płytki i użyj szklanej pipety, aby rozbić górny agar. Przenieś zawiesinę agaru do 15-mililitrowej probówki Falcon. Delikatnie wirować, aby rozbić agar, a następnie odwirować przy 1000 G przez 15 minut.

Przenieść supernatant do nowej probówki. Przepuścić supernatant przez filtr strzykawkowy o średnicy 22 mikronów. Użyj tego supernatantu do zainfekowania kultury szczepu biorcy wyhodowanego na pożywce TY.

Dodaj 30 mikrolitrów supernatantu do 10 mililitrów kultury rozcieńczonej jeden do 10 i inkubuj przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie odwirować z prędkością 5 000 obr./min przez siedem minut, zawiesić osad w 200 mikrolitrach pożywki TY i rozprowadzić na płytce zawierającej mycynę SPECT plus 10 milimolowców. Cytrynian sodu.

Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 do 36 godzin. Wybierz kolonię i hoduj ją przez noc w płynnym LB w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Na koniec umieść trzy mikrolitry nocnej kultury na stałym podłożu indukującym biofilm.

Pozwól komórkom rosnąć przez 72 godziny w temperaturze 30 stopni Celsjusza. Po trzech dniach wzrostu biofilmy utworzone na powierzchni agaru Ms.GG rozwiną złożoną architekturę morfologiczną na powierzchni agaru. Aby rozpocząć tę procedurę, użyj wykałaczki lub pęsety, aby usunąć biofilm z powierzchni agaru MSGG.

Konsystencja biofilmu powinna umożliwiać jego oderwanie od powierzchni agaru. W jednym kawałku umieść biofilm w trzech mililitrach buforu PBS, rozprowadź biofilm łagodnie. Wykonaj 12 impulsów z wyjściem trzech i amplitudą 0,7 sekundy, aby utrwalić próbki przed analizą pojedynczej komórki.

Resus zawiesić 300 mikrolitrów zawiesiny komórkowej w jednym mililitrze, 4% roztworze aldehydu paraformowego i inkubować w temperaturze pokojowej przez dokładnie siedem minut. Po siedmiominutowym utrwaleniu przemyć komórki w buforze PBS trzy razy. Na koniec ponownie zawieś komórki w 300 mikrolitrach buforu PBS przed mikroskopią fluorescencyjną.

Przygotuj szkiełko mikroskopowe, pipetując 200 mikrolitrów 0,8% agros na szkiełko i ostrożnie przykrywając je innym szkiełkiem. Po dwóch minutach delikatnie zdejmij górne szkiełko, aby uzyskać warstwę agros przymocowaną do szkiełka w dolnym miejscu. Dwa mikrolitry utrwalonych komórek na powierzchni warstwy agros i przykryć ją szkłem nakrywkowym mikroskopu.

Umieścić próbkę na stoliku mikroskopu fluorescencyjnego. Ustaw okres wzbudzenia zgodnie z kontrolą ujemną, która nie wykazuje fluorescencji w warunkach wybranych do eksperymentu. Ekspozycja powinna wynosić od 50 do 200 milisekund.

Uzyskaj obraz fluorescencyjny, a także obraz jasnego pola dla każdego pola view. Aby przygotować komórki do analizy za pomocą cytometrii przepływowej, należy rozproszyć próbkę utrwalonych komórek za pomocą łagodnej sonikacji. Wykonaj dwie serie po 12 impulsów z wyjściem pięciu i amplitudą 0,7 sekundy, aby rozproszyć grudki na pojedyncze komórki bez powodowania lizy komórek.

Potwierdź skuteczność dyspersji komórek za pomocą mikroskopii świetlnej. Następnie rozcieńczyć próbkę do 100 w buforze PBS. Do tej analizy fluorescencji YFP zostanie użyty cytometr dwuprzepływowy z faksem BD

Wzbudzenie laserowe o długości 488 nanometrów w połączeniu z filtrem 5 30 30 służy do fluorescencji CFP. Stosuje się wzbudzenie laserowe o długości 405 nanometrów w połączeniu z filtrem 4 0 8 40, skalibruj cytometr przepływowy za pomocą dwóch kontroli ujemnych. Próbka buforu PBS bez komórek w zawiesinie powinna służyć jako kontrola ujemna wielkości cząstki wykrytej przez cytometr przepływowy.

Próbka bez reportera fluorescencyjnego powinna służyć jako ujemna kontrola wrażliwości fluorescencyjnej przepływu. Cytometr po kalibracji umieścić próbkę oznakowaną fluorescencyjnym reporterem w cytometrze przepływowym dla każdej próbki, przeanalizować co najmniej 50 000 zdarzeń z natężeniem przepływu między 303 000 zdarzeń na sekundę. Kiedy B Subtles rośnie na płytce pożywki indukującej biofilm, tworzenie się biofilmu MSGG obserwuje się po trzech dniach inkubacji w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Biofilm pokazuje złożoną architekturę morfologiczną, która wskazuje na odrębne subpopulacje komórek uczestniczących w badaniu. Na przykład produkcja macierzy zewnątrzkomórkowej i biofilmów powoduje powstawanie zmarszczek na powierzchni kolonii. Rysunek ten przedstawia przykład wizualizacji różnicowania komórek w pojedynczym znakowanym szczepie przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej.

Szczep ten zawiera fluorescencyjny reporter Ptap, CFP, który ulega ekspresji w subpopulacji komórek wytwarzających matrycę zabarwionych na niebiesko. Ta subpopulacja wytwarza i wydziela macierz zewnątrzkomórkową, która tworzy biofilm. Następny obraz jest wynikiem wizualizacji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej podwójnie znakowanego szczepu, który zawiera reporter Ptap, A CFP i dodatkowy reporter P Surfaktyna YFP.

Ten drugi reporter umożliwia monitorowanie subpopulacji komórek odpowiedzialnych za wydzielanie cząsteczki sygnałowej surfaktyny, która uruchamia kaskadę sygnalizacyjną dla różnicowania producentów macierzy. W tym przypadku producenci matryc są fałszywie zabarwieni na niebiesko, podczas gdy producenci środków powierzchniowo czynnych są fałszywie zabarwieni na żółto, wyniki cytometrii przepływowej 2D przy użyciu pojedynczego znakowanego szczepu zawierającego reporterowy ptap. YFB jest prezentowany tutaj.

Nieleczony szczep kontrolny bez żadnych genów białka fluorescencyjnego wykazał pojedynczą populację z komórkami o niskiej względnej fluorescencji zawierającymi ptap. YFP w warunkach nieindukujących biofilm nie różnicował subpopulacji producentów matrycy, a cała populacja wykazywała również niską fluorescencję względną. W przeciwieństwie do tego, w warunkach indukujących biofilm, subpopulacja komórek o wysokiej fluorescencji względnej została wykryta jako ramię na prawo od niskiej fluorescencji względnej.

Wyniki pików uzyskane za pomocą cytometrii przepływowej 3D przedstawiono tutaj. Sygnały fluorescencyjne monitorowanych kanałów są prezentowane na osi X dla YFP i osi Y dla CFP, lewy górny panel pokazuje szczep bez genów białka fluorescencyjnego jako kontrolę dla fluorescencji tła. W prawym górnym panelu wykorzystano pojedynczy znakowany szczep do wykrycia subpopulacji producentów surfaktyny w kanale fluorescencyjnym YFP obramowanym na żółto.

W lewym dolnym panelu do wykrycia subpopulacji producentów matryc użyto innego, pojedynczego oznakowanego szczepu. W kanale fluorescencyjnym CFP obramowanym na niebiesko monitorowane są subpopulacje producentów matryc i producentów środków powierzchniowo czynnych przy użyciu podwójnie znakowanego szczepu, a wyniki są prezentowane. W tym prawym dolnym panelu.

Wykryto dwie subpopulacje komórek wykazujące wysoki poziom reporterów fluorescencyjnych. Każda populacja jest ujęta w ramki, co pokazuje, że nie ma nakładania się ekspresji reporterów między dwiema subpopulacjami wyspecjalizowanych komórek. Ten ostatni rysunek przedstawia kwantyfikację subpopulacji producentów matryc i kanibali za pomocą cytometrii przepływowej 3D.

W prawym górnym panelu użyto pojedynczego oznaczonego szczepu do wykrycia subpopulacji kanibali. W kanale fluorescencyjnym YFP obramowanym na żółto, ta subpopulacja kanibali została opisana w celu zróżnicowania się skoordynowanie z subpopulacją producentów matrycy. W lewym dolnym panelu subpopulacja producentów matryc jest wykrywana w innym pojedynczym znakowanym szczepie w kanale fluorescencyjnym CFP.

Obramowane na niebiesko wyniki z podwójnie oznakowanego szczepu w prawym dolnym panelu pokazały pojedynczą subpopulację komórek fluorescencyjnych wyrażających zarówno YFP, jak i CFP obramowane na zielono. Jednoczesna ekspresja dwóch reporterów wskazuje, że oba szlaki różnicowania komórek są aktywowane koordynacyjnie w tej samej subpopulacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wizualizować i określać ilościowo różne subpopulacje komórek, które tworzą biofilm drobnoustrojów, za pomocą analizy komórkowej populacji komórek, takiej jak mikroskopia fluorescencyjna lub cytometria przepływowa.