Name: Genetyczne badanie przesiewowe w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii wydostających się z komórek gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Poznaj metodę fenotypowego przesiewania do izolacji mutantów Toxoplasma gondii z defektami wydostawania się z komórek gospodarza przy 40°C. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla biologii pasożyta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N oraz grantu badawczego National Institutes of Health AI081220. BIC jest wspierany przez grant badawczy Knights Templar Eye Foundation.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisany protokół zapewnia wydajną metodę izolacji mutantów Toxoplasma z defektem egressu. Z sukcesem wyizolowano mutanty na różnych etapach ścieżki egressu, z których niektóre wykazują podwójny fenotyp inwazji13. Potencjalne efekty wpływu na inwazję można określić za pomocą tzw. testu czerwono-zielonego (red-green assay), który rozróżnia pasożyty, które dokonały inwazji, od tych, które jej nie dokonały, poprzez różnicowe barwienie przeciwciałami23,24. W przypadku testów inwazji i egressu wy...

<table><tbody><tr><td>ENU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3385</td><td>roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>EMS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0880</td><td>roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4911</td><td> </td></tr><tr><td>PDTC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8765</td><td>roztwór stokowy 100 mM w PBS</td></tr><tr><td>Diff Quick</td><td>EMD Chemicals</td><td>65044-93</td><td> </td></tr><tr><td>Uchwyt do filtrów</td><td>Cole-Parmer</td><td>540100</td><td> </td></tr><tr><td>filtr poliwęglanowy 3 &amp;mu;m</td><td>Whatman Schleicher Schuell</td><td>110612</td><td> </td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td> </td></tr><tr><td>Inkubatory CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Różni producenci</td><td></td><td>Kuweta nawilżona, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, w temp. 35, 37 i 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Różni producenci</td><td></td><td>Preferowany odwrócony, szerokopolowy z obiektywem olejowym 63x lub 100x</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">HBSSc (zgodnie z Black &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;):&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;98,0 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (Hyclone, numer katalogowy SH30588)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 &amp;mu;l 1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 100 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 &amp;mu;l 1M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 100 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (stężenie końcowe 20 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;84 mg NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 10 mM) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Powszechny, obligatoryjny wewnątrzkomórkowy pierwotniak pasożytniczy Toxoplasma gondii wywołuje choroby oportunistyczne u pacjentów z niedoborami odporności oraz wady wrodzone w przypadku zakażenia prenatalnego. Lityczny cykl replikacyjny charakteryzuje się trzema etapami: 1. aktywną inwazją do jądrowej komórki gospodarza; 2. replikacją wewnątrz komórki gospodarza; 3. aktywnym opuszczeniem (egresem) komórki gospodarza. Mechanizm egresu jest coraz częściej postrzegany jako unikalny, ściśle regulowany proces, który wciąż pozostaje słabo poznany na poziomie molekularnym. Szlaki sygnalizacyjne leżące u podstaw egresu zostały scharakteryzowane przy użyciu czynników farmakologicznych oddziałujących na różne aspekty tych szlaków1-5. W ten sposób zidentyfikowano kilka niezależnych wyzwalaczy egresu, które wszystkie zbiegają się w uwalnianiu wewnątrzkomórkowego Ca2+, sygnału, który jest również krytyczny dla inwazji do komórki gospodarza6-8. Ta wiedza posłużyła do zastosowania podejścia opartego na genach kandydackich, co doprowadziło do identyfikacji przypominającej roślinne kinazy białkowe zależne od wapnia (CDPK) biorących udział w egresie9. Ponadto, dzięki zastosowaniu podejść genetycznych (chemicznych), dokonano w ostatnim czasie kilku przełomów w rozumieniu procesu egresu10-12. Aby połączyć bogactwo informacji farmakologicznych ze zwiększoną dostępnością genetyczną Toxoplasma, opracowaliśmy niedawno screening umożliwiający wzbogacenie populacji mutantów pasożyta z defektem egresu z komórki gospodarza13. Chociaż mutageneza chemiczna z użyciem N-etyl-N-nitrozomocznika (ENU) lub etylo-metanosulfonianu (EMS) była stosowana od dziesięcioleci w badaniach nad biologią Toxoplasma11,14,15, dopiero niedawno mapowanie genetyczne mutacji leżących u podstaw fenotypów stało się rutynowe16-18. Co więcej, poprzez generowanie mutantów temperaturozależnych, możliwe jest przeanalizowanie procesów niezbędnych i bezpośrednia identyfikacja leżących u ich podstaw genów. Mutanty te zachowują się jak typ dziki w temperaturze dopuszczalnej (35 °C), ale nie namnażają się w temperaturze restrykcyjnej (40 °C) w wyniku rozważanej mutacji. Tutaj prezentujemy nową metodę screeningu fenotypowego służącą do izolacji mutantów z temperaturozależnym fenotypem egresu13. Wyzwaniem w screeningach egresu jest oddzielenie pasożytów, które opuściły komórkę, od tych, które pozostały wewnątrz, co jest utrudnione przez szybką reinwazję oraz ogólną lepkość pasożytów w kontakcie z komórkami gospodarza. Wcześniej opracowany screening egresu opierał się na uciążliwej serii etapów biotynylacji w celu oddzielenia pasożytów wewnątrzkomórkowych od zewnątrzkomórkowych11. Metoda ta nie generowała również mutantów warunkowych, co skutkowało słabymi fenotypami. Metoda opisana w niniejszej pracy pokonuje problem silnego przywierania pasożytów podczas egresu poprzez zastosowanie konkurenta glikanowego, siarczanu dekstranu (DS), który zapobiega przywieraniu pasożytów do komórki gospodarza19. Ponadto, pasożyty zewnątrzkomórkowe są specyficznie eliminowane przez ditiokarbaminian pirrolidyny (PDTC), który nie uszkadza pasożytów wewnątrzkomórkowych20. Zatem, dzięki nowemu screeningowi fenotypowemu do specyficznej izolacji mutantów pasożyta z defektami indukowanego egresu, potencjał genetyki może zostać teraz w pełni wykorzystany do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw opuszczania komórki gospodarza.

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Powszechnie występujący, obligatoryjnie wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniak Toxoplasma gondii wywołuje chorobę oportunistyczną u pacjentów z niedoborem odporności oraz powoduje wady wrodzone...

Niniejszy film ilustruje nową metodę przesiewania fenotypowego w celu wyizolowania mutantów o fenotypie wyjścia z komórki wrażliwym na temperaturę. Mutagen oraz pasożyty nanosi się na hodowle ludzkich fibroblastów z napletka zainfekowanych Toxoplasma. Przez dwie godziny usuwa się pasożyty nieinwazyjne, a następnie kolbę przenosi się do temperatury 40 °C, aby wywołać rozwój fenotypu.Po 26 godzinach wakuole zawierają od ośmiu do 16 pasożytów. Następnie komórki stymuluje się związkami indukującymi wyjście. Pasożyty zmutowane z defektem procesu wyjścia pozostaną wewnątrzkomórkowo, podczas gdy pasożyty typu dzikiego wyjdą do pożywki. pasożyty typu dzikiego są usuwane poprzez przemywanie, a pozostałe komórki są ponownie inkubowane w temperaturze 35 °C w celu wzbogacenia populacji mutantów. Na koniec weryfikowany jest fenotyp mutantów, a pojedyncze klony pasożytów są izolowane z wzbogaconej populacji metodą rozcieńczeń ograniczających. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda bioinhalacyjna, jest znacznie większa wydajność specyficznego wzbogacania mutantów wyjścia.Koncepcja tej metody pojawiła się po raz pierwszy, gdy zidentyfikowaliśmy mutant zaburzony w procesie wyjścia (egress mutant) z panelu mutantów z wadami wzrostu. Wykorzystując ten mutant, zoptymalizowaliśmy procedurę przesiewową poprzez mieszanie go w różnych proporcjach z pasożytami typu dzikiego. Procedurę zaprezentuje Bradley Coleman, postdoc w moim laboratorium.W tej procedurze stosuje się silnie mutagenne związki i ciecze, a także zakaźnego pasożyta Toxoplasma gondii. Niezbędne jest stosowanie odpowiedniego sprzętu ochronnego, w tym fartucha laboratoryjnego, podwójnych rękawiczek oraz komory bezpieczeństwa biologicznego. Wszelkie powstałe odpady płynne należy zbierać oddzielnie w celu ich właściutroną utylizacji.Zacznij od inokulacji konfluencyjnych ludzkich fibroblastów przes킨ki najpółpnia lub komórek HFF jednym mililitrem świeżo lizowanych tachy Lloyds w medium ed one. Następnie umieść kolbę w inkubatorze z nawilżaną atmosferą w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ na 18 do 25 godzin. Następnego dnia wymień medium na 10 ml medium z 0,1% płodowej surowicy bydlęcej i inkubuj w temperaturze 37°C przez 10 minut.Po inkubacji do każdej kolby należy dodać 0, 12,5, 25, 50 lub 100 µL mutagenu ENU. Stężenia robocze będą wynosić odpowiednio 1,25, 2,55 i 10 mM. Do każdej kolby należy dodać do 100 µL DMSO.Inkubować przez cztery godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Płukać monowarstwę 10 ml zimnego PBS trzykrotnie przez 10 sekund. Dodać 5 ml PBS i użyć skrobaka do komórek w celu poluzowania monowarstwy.Następnie, używając nożyczek o dużej wytrzymałości, odetnij końcówkę kapturka igły w taki sposób, aby igła nie była odsłonięta. Dalej, przenieś komórki do strzykawki i przepuść je przez igłę o średnicy 26.5 gauge. Aby fizycznie usunąć pasożyta z fibroblastów, wielokrotne przepuszczanie przez igłę zwiększy wydajność uwalniania pasożytów z komórki gospodarza.Przymocuj filtr poliwęglanowy o rozmiarze oczek 3,0 µm do strzykawki. Pobierz zawiesinę komórek do strzykawki i przeciśnij ją przez filtr do probówki, a następnie nanieś pasożyty na komorę licznikową (hemocytometr) w celu ich policzenia. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest odróżnienie pasożytów od zanieczyszczeń.Aby zapewnić sukces, ważne jest, aby pozwolić pasożytom opaść przed przystąpieniem do liczenia. Po odczekaniu pięciu minut, aż pasożyty opadną, należy je policzyć. Po określeniu stężenia Toxoplasma, należy je rozcieńczyć do wartości 3 333 pasożytów na mililitr w ED one do objętości 10 mililitrów.Wymagane jest 33 333 pasożytów. Dodaj trzy mililitry do pierwszej studni płytki sześcio-studnijkowej z komórkami HFF, aby zaszczepić je 10 000 pasożytami. Następnie wykonaj dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne pasożytów w kolejnych trzech studniach, przenosząc 300 µL z jednej studni do następnej.Pozostaw płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na siedem dni. Po upływie tygodnia odessać pożywkę i utrwalić komórki, dodając do każdej studni 3 mL 100% etanolu na 15 minut. Po usunięciu etanolu zabarwić komórki, dodając do każdej studni 3 mL roztworu fioletu krystalicznego na 15 minut.Na koniec każdą studzienkę należy przemyć trzema mililitrami PBS przez jedną minutę. Po wyschnięciu płytki należy policzyć plaki i wybrać stężenie mutagenu niezbędne do uzyskania 30% przeżywalności naświetlonych pasożytów. Historycznie stosowano dawkę powodującą 70% śmiertelności, która indukuje mniej niż 100 mutacji punktowych na genom.Kolejnym krokiem procedury jest wzbogacenie populacji w mutanty z zaburzeniem procesu wyjścia (egress). Po namnożeniu populacji, dodaj 120 000 świeżo lizowanych pasożytów do konfluencyjnych komórek HFF w 10 ml. Inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 35°C.Pozwoli to na synchronizację populacji poprzez ograniczenie czasu inwazji. Po inkubacji odessać medium i płukać komórki przez 10 sekund 10 mililitrami zimnego PBS, a następnie dodać 10 mililitrów medium ED one uzupełnionego o 25 miligramów na mililitr siarczanu dekstranu.Dzięki temu białka wiążące glikany na powierzchni pasożytów zostaną nasycone, co uniemożliwi im ponowne przyczepienie się i zainfekowanie komórki gospodarza. Inkubuj kolbę przez 26 godzin w wilgotnej inkubatorze w temperaturze 40 °C przy 5% CO2. W tym czasie prawidłowo sfałdowane białka zostaną zastąpione przez białka termolabilne o nieprawidłowej strukturze.Następnego dnia rozcieńczyć wybrany induktor wypływu do stężenia roboczego w probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml HBSS suplementowanego dekstranem siarczanowym w stężeniu 25 mg/ml. Umieścić próbkę w kąpieli wodnej w celu wstępnego ogrzania roztworu przez 30 minut.Odssać medium z kolb zainfekowanych pasożytem i dodać uprzednio ogrzany roztwór induktora wyjścia. Inkubować w temperaturze 37 °C zgodnie ze wskazówkami w załączonym dokumencie. Następnie odessać medium i płukać przez 10 sekund.Do 10 mililitrów zimnego PBS dodać 10 mililitrów ED one uzupełnionego o 25 miligramów na mililitr siarczanu dekstranu oraz 50 mikromola karbamianu pirydyny DIO, a następnie inkubować przez pięć godzin w temperaturze 35 °C. Po inkubacji odessać medium i raz przepłukać PBS przez 10 sekund.Następnie dodaj 10 mililitrów pożywki EED, a następnie przenieś kolbę z powrotem do inkubatora w temperaturze 35°C. Wstrząsaj codziennie, aby rozproszyć opuszczające naczynie pasożyty.Kontynuuj inkubację do momentu, aż pasożyty zniszczą monowarstwę. Około siedmiu dni po przesiewie wzbogaconym populację propaguje się przez jeden pasaż. Następnie fenotypy potwierdza się za pomocą testu egressu.Zaszczep 20 000 pasożytów do każdej studzienki płytki 24-dołkowej zawierającej konfluencyjne komórki HFF hodowane na szkiełkach cover slip, a następnie inkubuj przez osiem godzin w inkubatorze w temperaturze 35 °C, aby umożliwić inwazję wszystkich pasożytów znajdujących się w medium w temperaturze dopuszczalnej. Następnie przenieś płytkę do inkubatora w temperaturze 40 °C na 24 godziny w celu indukowania fenotypu i wzrostu oles zawierających od 8 do 24 pasożytów, po uprzednim przemyciu każdej studzienki 1 mL PBS przez 10 sekund. W temperaturze pokojowej dodaj 1 mL podgrzanego i rozcieńczonego w H-B-S-S-C induktora wyjścia, a następnie inkubuj przez czas opisany w towarzyszącym protokole pisemnym.Odsajczyć medium i utrwalić, dodając jeden mililitr 100%metanolu do każdej studzienki, a następnie inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć jednym mililitrem PBS w temperaturze pokojowej. Po przemyciu i przygotowaniu preparatów na szkiełkach, użyć mikroskopu z obiektywem 40-60x, aby obliczyć odsetek egressu S w stosunku do wakuol wewnątrzkomórkowych. Po walidacji fenotypu wzbogaconej populacji mutantów egress, populację poliklonalną klonuje się w celu uzyskania pojedynczych klonów pasożytów.Po wyznaczeniu stężenia pasożytów, rozcieńczono je do poziomu 500 pasożytów na mililitr w medium ED one w 384-dołkowej płytce zawierającej konfluencyjną monowarstwę komórek HFF. Medium wymieniono na 40 µL medium ED one na dołek, używając pipety wielokanałowej. Cztery populacje poliklonalne przedstawiono kolorami: czerwonym, niebieskim, żółtym i zielonym.Na tej ilustracji pokazano sposób klonowania na płytce przy użyciu pipety. Do studzienek C3–C12 należy nanieść po 40 µL rozcieńczonego mutanta jeden, do studzienek C13–C22 mutanta dwa, do studzienek H3–H12 mutanta trzy oraz do studzienek H13–H22 mutanta cztery. Całkowita objętość w każdej studzience powinna teraz wynosić 80 µL.Następnie, używając pipety wielokanałowej, kilkakrotnie (pięć razy) pobierz i odlej roztwór, a następnie przenieś 40 µl do rzędu znajdującego się poniżej rzędu początkowego. Kontynuuj te dwukrotne rozcieńczenia seryjne aż do mutantów jednego i drugiego w rzędzie H lub mutantów trzeciego i czwartego w rzędzie N. Odrzuć nadmiarowe 40 µl z ostatniego rzędu.Inkubować w inkubatorze w temperaturze 35 °C przez siedem do 10 dni, nie poruszając płytki. W kolejnym tygodniu sprawdzić studzienki pod mikroskopem odwróconym z obiektywem 10 do 20 x pod kątem obecności pojedynczych placków, widocznych jako otwory w monowarstwie. Wybrać cztery studzienki na każdy mutant z pojedynczym plackiem i przenieść pasożyty do kolby T 12,5 do hodowli tkankowej, w której znajduje się konfluencyjna warstwa komórek HFF i 5 ml medium.W medium ED one hoduj pasożyty w inkubatorze w temperaturze 35 °C. Codziennie wstrząsaj kolbami, aby rozproszyć pasożyty pozakomórkowe. Zazwyczaj trwa to siedem dni.Testy plackowe przeprowadzono w płytce sześciodołkowej, stosując różne stężenia mutagenu EMS oraz różną liczbę pasożytów na dołek. Jak pokazano w tym filmie, białe plamki w widocznych dołkach to placki pasożytów powstałe w monowarstwie HFF na płytkach traktowanych EMS. Wyniki tych testów plackowych posłużyły do wygenerowania krzywych przeżywalności pasożytów poddanych działaniu zwiększających się dawek EMS oraz ENU.Dawkę wywołującą 70% śmiertelności wybrano następnie do eksperymentów z mutagenezą. W innym eksperymencie odsetek fenotypu mutantów z zaburzeniem egressu w populacji po wzbogaceniu oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano tutaj. Gdy stosunek początkowy mutantów z zaburzeniem egressu do pasożytów typu dzikiego wynosił 1 do 10 000, dzięki wzbogaceniu osiągnięto 80% czystości.Jednakże, gdy stosunek wyjściowy wynosił jeden na 100 000 pasożytów, izolowana populacja stanowiła jedynie od 1 do 2%. Dane te sugerują, że moc wzbogacania procesu przesiewowego wynosi 1000-krotność. W trzecim eksperymencie wyjście z komórek indukowano jonoforem wapniowym A23187. Na tych obrazach strzałki wskazują cztery różne VAE zawierające od czterech do ośmiu pasożytów wykazujących ekspresję YFP w grupach kontrolnych.Jednakże strzałki wskazują cztery grupy rozproszonych pasożytów, co odzwierciedla cztery niezależne zdarzenia wyjścia (VAs). Zatem stosunek fenotypów mutantów do typu dzikiego można łatwo określić, licząc je zgodnie z tą procedurą. W celu zidentyfikowania mutacji sprawczej, a tym samym interesującego genu, można zastosować dodatkowe metody, takie jak komplementacja kosmiczna lub sekwencjonowanie całego genomu.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić miareczkowanie interesującego mutagena, poddać populację pasożytów Toxoplasma działaniu mutagena oraz wyizolować pojedyncze mutanty wyjścia (egress mutants) wrażliwe na temperaturę z tej zmutowanej populacji. Pamiętaj, że praca z pasożytami Toxoplasma opornymi na parametyminę może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak okulary ochronne.

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przesiewowe badanie genetyczne w celu izolowania Toxoplasma gondii mutantów komórek gospodarza

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi in vitro Toxoplasma gondii za pomocą testu wzrostu opartego na lucyferazie. Technikę tę stosuje się w celu potwierdzenia swoistości inhibicji poprzez genetyczną delecję odpowiedniego genu docelowego. Jako przykład oceniane jest hamowanie LHVS wobec proteazy TgCPL.

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Ta praca opisuje protokół dla wielokopijnego badania genetycznego supresorowego u Schizosaccharomyces pombe. To badanie przesiewowe wykorzystuje bibliotekę plazmidów obejmującą cały genom do identyfikacji klonów supresorowych fenotypu utraty funkcji związanego ze zmutowanym szczepem zapytania. Za pomocą tego badania przesiewowego zidentyfikowano nowe supresory genetyczne mutanta zerowego ell1.

Genetyczne badanie przesiewowe do identyfikacji wielokopijnych supresorów u Schizosaccharomyces pombe

Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.

Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Poznaj metodę fenotypowego przesiewania do izolacji mutantów Toxoplasma gondii z defektami wydostawania się z komórek gospodarza przy 40°C. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla biologii pasożyta.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Przeglądaj więcej filmów