Name: Genetyczne badanie przesiewowe w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii wydostających się z komórek gospodarza (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Poznaj metodę fenotypowego przesiewania do izolacji mutantów Toxoplasma gondii z defektami wydostawania się z komórek gospodarza przy 40°C. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla biologii pasożyta.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była finansowana z grantu American Heart Association Scientist Development Grant 0635480N oraz grantu badawczego National Institutes of Health AI081220. BIC jest wspierany przez grant badawczy Knights Templar Eye Foundation.

<ol><li>Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+and+acetaldehyde+elevate+intracellular+%5BCa2%2B%5D+and+stimulate+microneme+discharge+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii.</a> Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).</li>
<li>Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+cytoplasmic+potassium+upon+host+cell+breakdown+triggers+egress+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The loss of cytoplasmic potassium upon host cell breakdown triggers egress of Toxoplasma gondii.</a> J. Biol. Chem. 276 (44), 41492-41501 (2001).</li>
<li>Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+activation+of+the+Toxoplasma+gondii+nucleoside+triphosphate+hydrolase+leads+to+depletion+of+host+cell+ATP+levels+and+rapid+exit+of+intracellular+parasites+from+infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells.</a> J. Biol. Chem. 273 (20), 12352-12359 (1998).</li>
<li>Stommel, E. W., Ely, K. H., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+dithiol-induced+Ca2%2B+flux+causes+egress+of+parasites+from+the+parasitophorous+vacuole%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: dithiol-induced Ca2+ flux causes egress of parasites from the parasitophorous vacuole.</a> Exp. Parasitol. 87 (2), 88-97 (1997).</li>
<li>Fruth, I. A., Arrizabalaga, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+induction+of+egress+by+the+potassium+ionophore+nigericin%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: induction of egress by the potassium ionophore nigericin.</a> Int. J. Parasitol. 37 (14), 1559-1567 (2007).</li>
<li>Endo, T., Sethi, K. K., Piekarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+calcium+ionophore+A23187-mediated+exit+of+trophozoites+from+infected+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: calcium ionophore A23187-mediated exit of trophozoites from infected murine macrophages.</a> Exp. Parasitol. 53 (2), 179-188 (1982).</li>
<li>Hoff, E. F., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+Toxoplasma+egress+the+first+step+in+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Is Toxoplasma egress the first step in invasion.</a> Trends Parasitol. 18 (6), 251-255 (2002).</li>
<li>Wetzel, D. M., Chen, L. A., Ruiz, F. A., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+protein+secretion+potentiates+motility+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated protein secretion potentiates motility in Toxoplasma gondii.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt 24), 5739-5748 (2004).</li>
<li>Lourido, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+protein+kinase+1+is+an+essential+regulator+of+exocytosis+in+Toxoplasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent protein kinase 1 is an essential regulator of exocytosis in Toxoplasma.</a> Nature. 465 (7296), 359-362 (2010).</li>
<li>Arrizabalaga, G., Ruiz, F., Moreno, S., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutant+of+Toxoplasma+gondii+reveals+involvement+of+a+sodium%2Fhydrogen+exchanger+in+calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutant of Toxoplasma gondii reveals involvement of a sodium/hydrogen exchanger in calcium regulation.</a> J. Cell. Biol. 165 (5), 653-662 (2004).</li>
<li>Black, M. W., Arrizabalaga, G., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionophore-resistant+mutants+of+Toxoplasma+gondii+reveal+host+cell+permeabilization+as+an+early+event+in+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ionophore-resistant mutants of Toxoplasma gondii reveal host cell permeabilization as an early event in egress.</a> Mol. Cell. Biol. 20 (24), 9399-9408 (2000).</li>
<li>Chandramohanadas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apicomplexan+Parasites+Co-Opt+Host+Calpains+to+Facilitate+Their+Escape+from+Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Apicomplexan Parasites Co-Opt Host Calpains to Facilitate Their Escape from Infected Cells.</a> Science. , (2009).</li>
<li>Eidell, K. P., Burke, T., Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+screen+to+dissect+Toxoplasma+gondii+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biochem.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Development of a screen to dissect Toxoplasma gondii egress.</a> Mol. Biochem. Parasitol. 171 (2), 97-103 (2010).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Pfefferkorn, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+isolation+and+preliminary+characterization+of+temperature-sensitive+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants.</a> Exp. Parasitol. 39 (3), 365-376 (1976).</li>
<li>Pfefferkorn, E. R., Schwartzman, J. D., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+use+of+mutants+to+study+the+host-parasite+relationship%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba.+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: use of mutants to study the host-parasite relationship.</a> Ciba. Found. Symp. 99, 74-91 (1983).</li>
<li>Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+complementation+in+apicomplexan+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Genetic complementation in apicomplexan parasites.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99 (9), 6304-6309 (2002).</li>
<li>White, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rescue+of+a+Toxoplasma+gondii+conditional+cell+cycle+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic rescue of a Toxoplasma gondii conditional cell cycle mutant.</a> Mol. Microbiol. 55 (4), 1060-1071 (2005).</li>
<li>Gubbels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+Genetic+Analysis+of+the+Apicomplexan+Cell+Division+Cycle+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Forward Genetic Analysis of the Apicomplexan Cell Division Cycle in Toxoplasma gondii.</a> PLoS Pathog. 4 (2), e36-e36 (2008).</li>
<li>Carruthers, V. B., Hakansson, S., Giddings, O. K., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+uses+sulfated+proteoglycans+for+substrate+and+host+cell+attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii uses sulfated proteoglycans for substrate and host cell attachment.</a> Infect. Immun. 68 (7), 4005-4011 (2000).</li>
<li>Camps, M., Boothroyd, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii%3A+selective+killing+of+extracellular+parasites+by+oxidation+using+pyrrolidine+dithiocarbamate%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii: selective killing of extracellular parasites by oxidation using pyrrolidine dithiocarbamate.</a> Exp. Parasitol. 98 (4), 206-214 (2001).</li>
<li>Roos, D. S., Donald, R. G., Morrissette, N. S., Moulton, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+tools+for+genetic+dissection+of+the+protozoan+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular tools for genetic dissection of the protozoan parasite Toxoplasma gondii.</a> Methods Cell Biol. 45, 27-63 (1994).</li>
<li>Gubbels, M. J., Li, C., Striepen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+growth+assay+for+Toxoplasma+gondii+using+yellow+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput growth assay for Toxoplasma gondii using yellow fluorescent protein.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 47 (1), 309-316 (2003).</li>
<li>Carey, K. L., Westwood, N. J., Mitchison, T. J., Ward, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+approach+to+studying+invasive+mechanisms+of+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A small-molecule approach to studying invasive mechanisms of Toxoplasma gondii.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (19), 7433-7438 (2004).</li>
<li>Kafsack, B. F., Carruthers, V. B., Pineda, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+modeling+of+Toxoplasma+gondii+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor.+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetic modeling of Toxoplasma gondii invasion.</a> J. Theor. Biol. 249 (4), 817-825 (2007).</li>
<li>Hanash, S. M., Boehnke, M., Chu, E. H., Neel, J. V., Kuick, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonrandom+distribution+of+structural+mutants+in+ethylnitrosourea-treated+cultured+human+lymphoblastoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Nonrandom distribution of structural mutants in ethylnitrosourea-treated cultured human lymphoblastoid cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 (1), 165-169 (1988).</li>
<li>Kafsack, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+membrane+disruption+by+a+perforin-like+protein+facilitates+parasite+exit+from+host+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rapid membrane disruption by a perforin-like protein facilitates parasite exit from host cells.</a> Science. 323 (5913), 530-533 (2009).</li>
<li>Lovett, J. L., Marchesini, N., Moreno, S. N., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxoplasma+gondii+microneme+secretion+involves+intracellular+Ca%282%2B%29+release+from+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+%28IP%283%29%29%2Fryanodine-sensitive+stores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toxoplasma gondii microneme secretion involves intracellular Ca(2+) release from inositol 1,4,5-triphosphate (IP(3))/ryanodine-sensitive stores.</a> J. Biol. Chem. 277 (29), 25870-25876 (2002).</li>
<li>Nagamune, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscisic+acid+controls+calcium-dependent+egress+and+development+in+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Abscisic acid controls calcium-dependent egress and development in Toxoplasma gondii.</a> Nature. 451 (7175), 207-210 (2008).</li>
<li>Tomita, T., Yamada, T., Weiss, L. M., Orlofsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Externally+triggered+egress+is+the+major+fate+of+Toxoplasma+gondii+during+acute+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Externally triggered egress is the major fate of Toxoplasma gondii during acute infection.</a> J. Immunol. 183 (10), 6667-6680 (2009).</li>
<li>Persson, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Death+receptor+ligation+or+exposure+to+perforin+trigger+rapid+egress+of+the+intracellular+parasite+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Death receptor ligation or exposure to perforin trigger rapid egress of the intracellular parasite Toxoplasma gondii.</a> J. Immunol. 179 (12), 8357-8365 (2007).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Opisany protokół zapewnia wydajną metodę izolacji mutantów Toxoplasma z defektem egressu. Z sukcesem wyizolowano mutanty na różnych etapach ścieżki egressu, z których niektóre wykazują podwójny fenotyp inwazji13. Potencjalne efekty wpływu na inwazję można określić za pomocą tzw. testu czerwono-zielonego (red-green assay), który rozróżnia pasożyty, które dokonały inwazji, od tych, które jej nie dokonały, poprzez różnicowe barwienie przeciwciałami23,24. W przypadku testów inwazji i egressu wy...

<table><tbody><tr><td>ENU</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3385</td><td>roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>EMS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0880</td><td>roztwór stokowy 1 M w DMSO, przechowywać w -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Siarczan dekstranu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4911</td><td> </td></tr><tr><td>PDTC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8765</td><td>roztwór stokowy 100 mM w PBS</td></tr><tr><td>Diff Quick</td><td>EMD Chemicals</td><td>65044-93</td><td> </td></tr><tr><td>Uchwyt do filtrów</td><td>Cole-Parmer</td><td>540100</td><td> </td></tr><tr><td>filtr poliwęglanowy 3 &amp;mu;m</td><td>Whatman Schleicher Schuell</td><td>110612</td><td> </td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td> </td></tr><tr><td>Inkubatory CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Różni producenci</td><td></td><td>Kuweta nawilżona, 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, w temp. 35, 37 i 40 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Różni producenci</td><td></td><td>Preferowany odwrócony, szerokopolowy z obiektywem olejowym 63x lub 100x</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_step">HBSSc (zgodnie z Black &lt;em&gt;et al&lt;/em&gt;.&lt;sup&gt;11&lt;/sup&gt;):&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;98,0 ml zrównoważonego roztworu soli Hanksa (Hyclone, numer katalogowy SH30588)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 &amp;mu;l 1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 100 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;100 &amp;mu;l 1M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 100 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (stężenie końcowe 20 mM)&lt;/li&gt; &lt;li&gt;84 mg NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (stężenie końcowe 10 mM) &lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

A Genetic Screen to Isolate Toxoplasma gondii Host-cell Egress Mutants

Powszechny, obligatoryjny wewnątrzkomórkowy pierwotniak pasożytniczy Toxoplasma gondii wywołuje choroby oportunistyczne u pacjentów z niedoborami odporności oraz wady wrodzone w przypadku zakażenia prenatalnego. Lityczny cykl replikacyjny charakteryzuje się trzema etapami: 1. aktywną inwazją do jądrowej komórki gospodarza; 2. replikacją wewnątrz komórki gospodarza; 3. aktywnym opuszczeniem (egresem) komórki gospodarza. Mechanizm egresu jest coraz częściej postrzegany jako unikalny, ściśle regulowany proces, który wciąż pozostaje słabo poznany na poziomie molekularnym. Szlaki sygnalizacyjne leżące u podstaw egresu zostały scharakteryzowane przy użyciu czynników farmakologicznych oddziałujących na różne aspekty tych szlaków1-5. W ten sposób zidentyfikowano kilka niezależnych wyzwalaczy egresu, które wszystkie zbiegają się w uwalnianiu wewnątrzkomórkowego Ca2+, sygnału, który jest również krytyczny dla inwazji do komórki gospodarza6-8. Ta wiedza posłużyła do zastosowania podejścia opartego na genach kandydackich, co doprowadziło do identyfikacji przypominającej roślinne kinazy białkowe zależne od wapnia (CDPK) biorących udział w egresie9. Ponadto, dzięki zastosowaniu podejść genetycznych (chemicznych), dokonano w ostatnim czasie kilku przełomów w rozumieniu procesu egresu10-12. Aby połączyć bogactwo informacji farmakologicznych ze zwiększoną dostępnością genetyczną Toxoplasma, opracowaliśmy niedawno screening umożliwiający wzbogacenie populacji mutantów pasożyta z defektem egresu z komórki gospodarza13. Chociaż mutageneza chemiczna z użyciem N-etyl-N-nitrozomocznika (ENU) lub etylo-metanosulfonianu (EMS) była stosowana od dziesięcioleci w badaniach nad biologią Toxoplasma11,14,15, dopiero niedawno mapowanie genetyczne mutacji leżących u podstaw fenotypów stało się rutynowe16-18. Co więcej, poprzez generowanie mutantów temperaturozależnych, możliwe jest przeanalizowanie procesów niezbędnych i bezpośrednia identyfikacja leżących u ich podstaw genów. Mutanty te zachowują się jak typ dziki w temperaturze dopuszczalnej (35 °C), ale nie namnażają się w temperaturze restrykcyjnej (40 °C) w wyniku rozważanej mutacji. Tutaj prezentujemy nową metodę screeningu fenotypowego służącą do izolacji mutantów z temperaturozależnym fenotypem egresu13. Wyzwaniem w screeningach egresu jest oddzielenie pasożytów, które opuściły komórkę, od tych, które pozostały wewnątrz, co jest utrudnione przez szybką reinwazję oraz ogólną lepkość pasożytów w kontakcie z komórkami gospodarza. Wcześniej opracowany screening egresu opierał się na uciążliwej serii etapów biotynylacji w celu oddzielenia pasożytów wewnątrzkomórkowych od zewnątrzkomórkowych11. Metoda ta nie generowała również mutantów warunkowych, co skutkowało słabymi fenotypami. Metoda opisana w niniejszej pracy pokonuje problem silnego przywierania pasożytów podczas egresu poprzez zastosowanie konkurenta glikanowego, siarczanu dekstranu (DS), który zapobiega przywieraniu pasożytów do komórki gospodarza19. Ponadto, pasożyty zewnątrzkomórkowe są specyficznie eliminowane przez ditiokarbaminian pirrolidyny (PDTC), który nie uszkadza pasożytów wewnątrzkomórkowych20. Zatem, dzięki nowemu screeningowi fenotypowemu do specyficznej izolacji mutantów pasożyta z defektami indukowanego egresu, potencjał genetyki może zostać teraz w pełni wykorzystany do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów leżących u podstaw opuszczania komórki gospodarza.

Genetyka forward jest potężną metodą pozwalającą na odkrycie mechanizmów molekularnych, za pomocą których Toxoplasma opuszcza komórkę gospodarza. Przedstawione protokoły obejmują chemiczną mutagenizację pasożytów, wzbogacanie populacji mutantów z defektami indukowanego opuszczania komórki oraz walidację fenotypu sklonowanych mutantów.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Powszechnie występujący, obligatoryjnie wewnątrzkomórkowy pasożyt pierwotniak Toxoplasma gondii wywołuje chorobę oportunistyczną u pacjentów z niedoborem odporności oraz powoduje wady wrodzone...

Niniejszy film ilustruje nową metodę przesiewania fenotypowego w celu wyizolowania mutantów o fenotypie wyjścia z komórki wrażliwym na temperaturę. Mutagen oraz pasożyty nanosi się na hodowle ludzkich fibroblastów z napletka zainfekowanych Toxoplasma. Przez dwie godziny usuwa się pasożyty nieinwazyjne, a następnie kolbę przenosi się do temperatury 40 °C, aby wywołać rozwój fenotypu.Po 26 godzinach wakuole zawierają od ośmiu do 16 pasożytów. Następnie komórki stymuluje się związkami indukującymi wyjście. Pasożyty zmutowane z defektem procesu wyjścia pozostaną wewnątrzkomórkowo, podczas gdy pasożyty typu dzikiego wyjdą do pożywki. pasożyty typu dzikiego są usuwane poprzez przemywanie, a pozostałe komórki są ponownie inkubowane w temperaturze 35 °C w celu wzbogacenia populacji mutantów. Na koniec weryfikowany jest fenotyp mutantów, a pojedyncze klony pasożytów są izolowane z wzbogaconej populacji metodą rozcieńczeń ograniczających. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda bioinhalacyjna, jest znacznie większa wydajność specyficznego wzbogacania mutantów wyjścia.Koncepcja tej metody pojawiła się po raz pierwszy, gdy zidentyfikowaliśmy mutant za

a-genetic-screen-to-isolate-toxoplasma-gondii-host-cell-egress-mutants

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Przesiewowe badanie genetyczne w celu izolowania Toxoplasma gondii mutantów komórek gospodarza

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Tutaj przedstawiamy metodę wykorzystania szczepów Δku80 typu I i II Toxoplasma gondii do efektywnego generowania docelowych delecji genów i zamienników genów do funkcjonalnej analizy genomowej.

Manipulacja genetyczna w szczepach Δku80 do funkcjonalnej analizy genomowej Toxoplasma gondii

Opisujemy metodologię przeprowadzania analizy genetycznej u Chlamydii w oparciu o mutagenezę chemiczną i sekwencjonowanie całego genomu. Ponadto opisano system wymiany DNA w zakażonych komórkach, który można wykorzystać do mapowania genetycznego. Metoda ta może mieć szerokie zastosowanie w systemach mikrobiologicznych pozbawionych systemów transformacji i narzędzi genetyki molekularnej.

Zaawansowane podejścia genetyczne w Chlamydia trachomatis

Genetyka do przodu to potężne podejście do identyfikacji genów w patogenach wewnątrzkomórkowych, ważnych dla odporności na autonomiczną odporność komórki. Obecne podejście wykorzystuje wrodzone komórki odpornościowe, w szczególności makrofagi, do identyfikacji nowych genów Toxoplasma gondii ważnych dla unikania odporności.

Zaawansowane badania genetyczne wykorzystujące makrofagi do identyfikacji genów Toxoplasma gondii ważnych dla odporności na niezależną od IFN-γ odporności komórek

Coxiella burnetii jest obligatoryjną wewnątrzkomórkową bakterią Gram-ujemną odpowiedzialną za chorobę odzwierzęcą Q gorączkę. W tym miejscu opisujemy metody generowania mutantów transpozonów fluorescencyjnych Coxiella, a także automatyczną identyfikację i analizę powstałych fenotypów internalizacji, replikacji i cytotoksyczności.

Wytwarzanie i wielofenotypowe badania przesiewowe o wysokiej zawartości mutantów transpozonów Coxiella burnetii

Przedstawiono szczegóły dotyczące sposobu wykorzystania mapowania QTL z mapą genetyczną opartą na całej sekwencji genomu do identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii i jak można to zweryfikować za pomocą systemu CRISPR/Cas9, który skutecznie edytuje cel genomowy, w tym przypadku gen oporności na leki.

Mapowanie QTL i edycja CRISPR/Cas9 w celu identyfikacji genu oporności na leki w Toxoplasma gondii

Prezentowany tutaj jest protokół do oceny skuteczności hamowania związków chemicznych przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi in vitro Toxoplasma gondii za pomocą testu wzrostu opartego na lucyferazie. Technikę tę stosuje się w celu potwierdzenia swoistości inhibicji poprzez genetyczną delecję odpowiedniego genu docelowego. Jako przykład oceniane jest hamowanie LHVS wobec proteazy TgCPL.

Oznaczanie skuteczności inhibitora chemicznego przeciwko wewnątrzkomórkowemu wzrostowi Toxoplasma Gondii przy użyciu testu wzrostu opartego na lucyferazie

Ten protokół wykorzystuje fluorescencyjne promotory-reportery, mikroskopię żywych komórek i ekstrakcję indywidualnych inkluzji w ukierunkowanym podejściu genetycznym do identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych Chlamydia trachomatis.

Genetyczne podejście oparte na żywych komórkach w celu identyfikacji i izolacji mutantów rozwojowych w Chlamydia trachomatis

Przedstawiamy tutaj protokół służący do szybkiego identyfikowania i genotypowania szczepów Toxoplasma gondii za pomocą przenośnego sekwencjonowania nanoporami wybranych markerów genetycznych, umożliwiając skalowalną, ukierunkowaną identyfikację szczepów w izolatów hodowanych w laboratorium z potencjalnym przyszłym zastosowaniem w ustawieniach nadzorczych.

Sekwencjonowanie wielomocysłowe do typowania szczepów Toxoplasma gondii

Niniejsze badanie opisuje opracowanie zmodyfikowanej metody z użyciem CsCl, która umożliwia łatwe oczyszczanie oocyst T. gondii z kału zarażonych kotów, tak aby nadawały się one do manipulacji w ramach biologii molekularnej i hodowli...

Uzyskiwanie wysoko oczyszczonych oocyst Toxoplasma gondii za pomocą nieciągłego gradientu chlorku cezu

Poznaj metodę fenotypowego przesiewania do izolacji mutantów Toxoplasma gondii z defektami wydostawania się z komórek gospodarza przy 40°C. Technika ta umożliwia identyfikację genów kluczowych dla biologii pasożyta.

Przesiew genetyczny w celu wyizolowania mutantów Toxoplasma gondii zaburzających wyjście z komórki gospodarza

Przeglądaj więcej filmów