Name: Test wypływu cholesterolu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: Poznaj metodę testu wypływu cholesterolu z komórek hodowlanych w celu oceny akceptorów osocza. Ta technika umożliwia badanie homeostazy lipidów i metabolizmu cholesterolu w biologii komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty z National Health and Medical Research Council of Australia (NHMRC) (526615 oraz 545906), a częściowo przez program OIS rządu stanu Wiktoria. DS jest stypendystą NHMRC.

1. Przygotowanie [3H]-cholesterolu
<ol>
	<li>W dygestorium odmierzyć wymaganą ilość [3H]cholesterolu do probówki mikrocentryfugowej o pojemności 1,5 ml (do typowego testu wymagane jest 0,5 μCi (19 kBq) na dołek).</li>
	<li>Jeśli [3H]-cholesterol jest zawieszony w toluenie, odparować go całkowicie strumieniem gazu N2, a następnie zawiesić ponownie w 100% etanolu do końcowego stężenia 1 μCi (37 kBq/μl). Wymieszać dokładnie za pomocą wortexa.</li>
</ol>
2. Wysiewanie komórek i znakowanie cholesterolu komórkowego
Niniejszy protokół został przetestowany z użyciem następujących typów komórek: ludzkich monocytów 4,5, ludzkich monocytów-makrofagów THP-1 6,7,8, mysich makrofagów RAW 264.7 5,9,10,11, komórek HeLa 12, ludzkich komórek śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC), komórek BHK-21 9, ludzkich i mysich fibroblastów 13,14, ludzkich komórek raka wątrobowego HepG2 15 oraz w formie zmodyfikowanej, z płytek krwi 16.
<ol>
	<li>Resuspenderaj komórki i przeprowadź ich zliczanie. Wysiej komórki na płytki 12-dołkowe w końcowej gęstości 0,2x106 komórek na dołek w 0,9 ml pożywki kompletnej. Komórki będą nadal rosnąć i osiągną gęstość 0,8x106 komórek na dołek do czasu przeprowadzenia eksperymentu z odpływem. W przypadku komórek, które się nie dzielą, takich jak zróżnicowane komórki THP-1, gęstość siewu powinna wynosić 0,8x106 komórek na dołek. W przypadku użycia płytek 6- lub 24-dołkowych, odpowiednio podwoj lub zmniejsz o połowę liczbę komórek na dołek. Liczba dołków powinna być wystarczająca do wykonania oznaczeń w czterech powtórzeniach dla każdego warunku eksperymentalnego.</li>
	<li>Jeśli wymagana jest różnicowanie komórek THP-1, dodaj do pożywki PMA (końcowe stężenie 0,1 μg/ml) na 48-72 h.</li>
	<li>Dodaj niewielką alikwot pożywki do probówki do mikrocentryfugi zawierającej [3H]cholesterol.</li>
	<li>Przepłucz ścianki probówki pożywką przed dodaniem [3H]cholesterolu do oddzielnego alikwotu pożywki kompletnej (100 μl/dołek).</li>
	<li>Dodaj pożywkę zawierającą [3H]cholesterol do dołków z komórkami (końcowa objętość na dołek wynosi 1 ml). Jeśli przed znakowaniem nie jest wymagana żadna obróbka komórek, można je wysiać bezpośrednio w pożywce zawierającej [3H]cholesterol.</li>
	<li>Inkubuj komórki przez 48 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>
3. Inkubacja równoważąca
<ol>
	<li>Po 48-godzinnej inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem. Upewnić się, że są zdrowe i osiągnęły konfluencję na poziomie około 80%.</li>
	<li>Usunąć medium zawierające [3H]cholesterol. Delikatnie przemyć komórki buforem PBS. Powtórzyć proces płukania 3 razy.</li>
	<li>Przygotować medium bezsurowicze. W razie potrzeby aktywować komórki, dodając do medium bezsurowiczego agonistę LXR (np. TO-901317 w stężeniu 1-4 μMol/L) lub cAMP (0,3 mMol/L; wyłącznie dla komórek pochodzenia mysiego).</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 500 μl medium bezsurowiczego.</li>
	<li>Inkubować przez 18 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2).</li>
</ol>
4. Inkubacja w celu odpływu cholesterolu
<ol>
	<li>Po 18-godzinnej inkubacji w medium bezzużytkowym (bez surowicy), sprawdzić komórki pod mikroskopem. Upewnić się, że są zdrowe i zrosłe (minimum 80% konfluencji).</li>
	<li>Przygotować roztwór akceptorów odpływu cholesterolu w medium bez surowicy. Przykłady akceptorów obejmują: 
	Apolipoproteinę A-I (apoA-I) (stężenie końcowe 10 μg/ml) 
	Lipoproteinę o wysokiej gęstości (HDL) (stężenie końcowe 20 μg/ml) 
	Cyklodekstrynę (stężenie końcowe 200 μg/ml) 
	Osocze (stężenie końcowe 1-2%)</li>
	<li>Delikatnie przemyć komórki PBS.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 250 μl medium bez surowicy z akceptorami.</li>
	<li>Pozostawić jeden zestaw studninek w celu określenia tła odpływu (odpływ do medium bez surowicy BEZ akceptora).</li>
	<li>Inkubować komórki przez 2 godziny w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2). Czas inkubacji odpływu może wynosić od 30 min do 8 h, jeśli jest to wymagane.</li>
</ol>
5. Przetwarzanie próbek
<ol>
	<li>Po 2 godzinach inkubacji sprawdzić komórki pod mikroskopem.</li>
	<li>Zebrać medium do probówek do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wirować z prędkością 14 000 rpm przez 1-10 min w temperaturze pokojowej, aby usunąć resztki komórkowe.</li>
	<li>Przenieść 100 μl medium do 7 ml fiolki scyntylacyjnej. Dodać 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i wymieszać na wirówce typu vortex. Pozostałe próbki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieścić płytki w zamrażarce na 30 min. Do każdej studzienki dodać 500 μl dH2O. Sprawdzić komórki pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie oddzieliły się od dna studzienek. Jeśli nadal przylegają, pozostawić płytki z dH2O w temperaturze 4 °C przez noc lub zeskrobać zawartość studzienek.</li>
	<li>Po oddzieleniu wszystkich komórek pipetować zawiesinę w górę i w dół, aby rozbić skupiska komórkowe. Przenieść 100 μl do 7 ml fiolek scyntylacyjnych. Dodać 5 ml Insta-gel Plus (PerkinElmer) i wymieszać na wirówce typu vortex. Pozostałe płytki przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieścić fiolki scyntylacyjne w liczniku scyntylacyjnym. Skonfigurować licznik do pomiaru [3H] w jednostkach dpm.</li>
</ol>
6. Analiza wyników
<ol>
	<li>Szybkość odpływu cholesterolu jest zazwyczaj wyrażana jako proporcja cholesterolu przeniesionego z komórek do akceptora. Stosuje się następujący wzór:</li>
</ol>
<img alt="Wzór na odpływ cholesterolu, równanie służące do obliczania odpływu z uwzględnieniem czynnika rozcieńczenia w analizie badawczej." src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 1">
<ol start="2">
	<li>Specyficzny odpływ oblicza się jako różnica między odpływem w obecności a odpływem w nieobecności akceptora (próba ślepa).</li>
</ol>
<img alt="Wzór na wypływ cholesterolu: % Końcowy Wypływ = % Wypływu Cholesterolu - % Wypływu Tła; tekst równania." src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 2">
7. Harmonogram
<img alt="Schemat harmonogramu eksperymentu odpływu cholesterolu; liczenie komórek, przygotowanie [³H]-cholesterolu, analiza próbek." src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
8. Reprezentatywne wyniki
Przykład wyniku eksperymentu z efLuksem cholesterolu przedstawiono na Rys. 1. W tym doświadczeniu ludzkie monocyty THP-1 zróżnicowano do makrofagów i przetestowano ef luks cholesterolu do różnych akceptorów. Ef luks cholesterolu do medium bez akceptorów („blank”) wyniósł 0,79%; wartość ta została uznana za nieswoisty ef luks i odjęta od pozostałych wyników. Ef luks cholesterolu do ludzkiej apoA-I (stężenie końcowe 30 μg/ml) wyniósł 4,75%. W eksperymencie uwzględniono referencyjną próbkę osocza w celu monitorowania zmienności międzyeksperymentalnej. Próbka referencyjna może służyć do normalizacji danych z wielu eksperymentów, jednak uznaliśmy za zasadne powtórzenie analizy w przypadku wysokiej zmienności. Przebadano osocze pacjenta (stężenie końcowe 2%) przed i po zastosowaniu leczenia farmakologicznego. Stwierdzono, że u tego pacjenta lek miał negatywny wpływ na zdolność osocza do wspomagania ef luksu cholesterolu.
Kolejny przykład wyniku eksperymentu dotyczącego odpływu przedstawiono na Rys. 2. W tym doświadczeniu makrofagi RAW 264.7 były aktywowane lub nieaktywowane poprzez inkubację przez noc z agonistą LXR TO-901317 (stężenie końcowe 1 μmol/L), a następnie badano odpływ cholesterolu do tej samej próbki ludzkiej osocza (2%). Wyciągnięto wniosek, że aktywacja ekspresji komórkowej transporterów ABC za pomocą agonisty LXR zwiększa zdolność komórek do uwalniania cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.
<img alt="Wykres słupkowy odpływu cholesterolu; porównanie apoA-I, osocza; efekty leczenia; analiza danych pacjentów." src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Odpływ cholesterolu z komórek THP-1 do różnych akceptorów. Przedstawiono procentowy odpływ cholesterolu (tj. proporcję znakowanego cholesterolu przeniesionego z komórek do określonego akceptora) po odjęciu wartości tła. Średnia ± SD z czterech pomiarów, *p&lt;0.05.
<img alt="Wykres słupkowy; porównanie odpływu cholesterolu w komórkach aktywowanych i nieaktywowanych; metabolizm komórkowy." src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Odpływ cholesterolu z komórek RAW 264.7 aktywowanych lub nieaktywowanych agonistą LXR do ludzkiej osocza. Procent odpływu cholesterolu (tj. proporcja znakowanego cholesterolu przetransportowanego z komórek do określonego akceptora) przedstawiono po odjęciu wartości tła. Średnia ± SD z czterech powtórzeń, *p&lt;0.001.

<ol><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li>
<li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol+feedback%3A+from+Schoenheimer%27s+bottle+to+Scap%27s+MELADL%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation%3A+basic+concepts+and+physiological+implications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li>
<li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li>
<li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li>
<li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li>
<li>Shaw, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infusion+of+reconstituted+high-density+lipoprotein+leads+to+acute+changes+in+human+atherosclerotic+plaque%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque.</a> Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).</li>
<li>Kekulawala, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+freezing+on+high-density+lipoprotein+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality.</a> Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).</li>
<li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2FFunction+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides%3A+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li>
<li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li>
<li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li>
<li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+%28caveolae%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li>
<li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li>
<li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li>
<li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie istnieją żadne konflikty interesów związane z niniejszym badaniem.

Opisana metoda pomiaru odpływu cholesterolu została opracowana w celu zmierzenia przemieszczania się cholesterolu z komórek do pozakomórkowego akceptora cholesterolu. Istnieje kilka kluczowych kwestii istotnych dla zrozumienia tej metodologii.
Etykietowanie i równoważenie
W opisanej metodologii do surowicy dodawany jest znakowany cholesterol. Choć nie zostało to szczegółowo zbadane, przyjmuje się, że cholesterol wbudowuje się w lipoproteiny surowicze, które są następni...

test odpływu cholesterolu

Cholesterol Efflux Assay

Zawartość cholesterolu w komórkach musi być utrzymywana w bardzo wąskich granicach; zbyt wysoka lub zbyt niska ilość cholesterolu w komórce prowadzi do zaburzeń błon komórkowych, apoptozy i nekrozy 1. Komórki mogą pozyskiwać cholesterol z syntezy wewnątrzkomórkowej oraz z lipoprotein osocza, przy czym oba źródła są wystarczające do pełnego zaspokojenia zapotrzebowania komórek na cholesterol. Procesy syntezy i poboru cholesterolu są ściśle regulowane, a niedobory cholesterolu występują rzadko 2. Nadmiar cholesterolu jest częstszym problemem 3. Z wyjątkiem hepatocytów i w pewnym stopniu komórek kory nadnerczy, komórki nie są w stanie degradować cholesterolu. Komórki mają dwie możliwości zmniejszenia zawartości cholesterolu: przekształcenie cholesterolu w estry cholesterolu, co jest opcją o ograniczonej wydajności, ponieważ nadmiar estrów cholesterolu w komórkach jest również toksyczny, oraz odpływ cholesterolu, który jest opcją o potencjalnie nieograniczonej wydajności. Odpływ cholesterolu jest specyficznym procesem regulowanym przez szereg transporterów wewnątrzkomórkowych, takich jak białka transporterowe ABCA1 (ATP binding cassette transporter protein A1) i ABCG1 (ABCG1) oraz receptor scavenger typu B1. Naturalnymi akceptorami cholesterolu w osoczu są lipoprotein wysokiej gęstości (HDL) oraz apolipoproteina A-I. 
Test odpływu cholesterolu został zaprojektowany w celu ilościowego oznaczenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych. Mierzy on zdolność komórek do utrzymania odpływu cholesterolu i/lub zdolność akceptorów osoczowych do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Analiza składa się z następujących etapów. Krok 1: znakowanie cholesterolu komórkowego poprzez dodanie znakowanego cholesterolu do medium zawierającego surowicę i inkubację z komórkami przez 24-48 h. Krok ten można połączyć z ładowaniem komórek cholesterolem. Krok 2: inkubacja komórek w medium bezsurowiczym w celu wyrównania poziomu znakowanego cholesterolu we wszystkich wewnątrzkomórkowych pulach cholesterolu. Etap ten można połączyć z aktywacją komórkowych transporterów cholesterolu. Krok 3: inkubacja komórek z akceptorem zewnątrzkomórkowym i ilościowe oznaczenie przemieszczania się znakowanego cholesterolu z komórek do akceptora. Jeśli do znakowania nowo syntetyzowanego cholesterolu użyto prekursorów cholesterolu, może być wymagany czwarty krok – oczyszczanie cholesterolu.
Test dostarcza następujących informacji: (i) w jaki sposób konkretna interwencja (mutacja, wyciszenie genu, nadekspresja lub zastosowanie leku) wpływa na zdolność komórek do usuwania cholesterolu na zewnątrz oraz (ii) w jaki sposób zdolność akceptorów osocza do przyjmowania cholesterolu jest modyfikowana przez chorobę lub leczenie. Metoda ta jest często stosowana w badaniach nad układem sercowo-naczyniowym, zaburzeniami metabolicznymi i neurodegeneracyjnymi, a także chorobami zakaźnymi i reprodukcyjnymi.

Test oznaczania cholesterolu został opracowany w celu ilościowego określenia szybkości odpływu cholesterolu z hodowli komórkowych oraz zdolności akceptorów plazmy do przyjmowania cholesterolu uwalnianego z komórek. Procedura obejmuje znakowanie komórek cholesterolem, wyrównanie poziomu cholesterolu w pulach wewnątrzkomórkowych oraz uwalnianie cholesterolu do akceptora zewnątrzkomórkowego.

Test odpływu cholesterolu

Zawartość cholesterolu w komórkach musi być utrzymywana w bardzo wąskich granicach; zbyt wysokie lub zbyt niskie stężenie cholesterolu w komórce prowadzi do zaburzenia...

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Test efektu cholesterolu

Proteoliposomy są używane do badania oczyszczonych kanałów i transporterów odtworzonych w dobrze zdefiniowanym środowisku biochemicznym. Zilustrowano eksperymentalną procedurę pomiaru wypływu, w którym pośredniczą te białka. Opisano etapy przygotowania proteoliposomów, wykonywania zapisów i analizy danych w celu ilościowego określenia właściwości funkcjonalnych odtworzonego białka.

Test wypływu na podstawie proteoliposomów w celu określenia właściwości pojedynczych cząsteczek kanałów i transporterów Cl

Opisujemy tutaj fluorometryczny, bezkomórkowy test biochemiczny do oznaczania peroksydacji lipidów HDL. Ten szybki i powtarzalny test może być wykorzystany do określenia funkcji HDL w badaniach na dużą skalę i może przyczynić się do zrozumienia funkcji HDL w chorobach ludzkich.

Bezkomórkowy biochemiczny fluorometryczny test enzymatyczny do wysokoprzepustowego pomiaru peroksydacji lipidów w lipoproteinach o dużej gęstości

Ten protokół zapewnia skuteczne podejście do pomiaru wychwytu cholesterolu LDL z rzeczywistymi wskaźnikami napływu przy użyciu systemu obrazowania żywych komórek w różnych typach komórek. Technika ta stanowi platformę do badania przesiewowego aktywności farmakologicznej związków wpływających na napływ LDL przy jednoczesnym monitorowaniu morfologii komórek, a tym samym potencjalnej cytotoksyczności.

Test wychwytu cholesterolu LDL przy użyciu analizy obrazowania żywych komórek z monitorowaniem stanu zdrowia komórek

Pomiar zdolności in vitro cholesterolu do surowicy lub osocza w modelach komórek makrofagów jest obiecującym narzędziem jako biomarker miażdżycy. W niniejszym badaniu optymalizujemy i standaryzujemy metodę fluorescencyjnego wypływu cholesterolu NBD oraz opracowujemy analizę wysokoprzepustową przy użyciu płytek 96-dołkowych.

Wysokoprzepustowy test wypływu cholesterolu znakowany nitrobenzoksadiazolem

Ten artykuł ma na celu przedstawienie protokołu, jak zbudować mikroskop spektroskopii korelacji fluorescencji (svFCS) do pomiaru dyfuzji molekularnej na błonie komórkowej żywych komórek.

Spektroskopia korelacji fluorescencji zmienności plamki do analizy dyfuzji molekularnej na błonie plazmatycznej żywych komórek

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Tutaj opisujemy protokoły pomiaru ilości fluorescencyjnego fosfolipidu specjalnie usuwanego z cząstek dawcy lipidów za pomocą lipoproteiny o wysokiej gęstości (HDL) obecnej w całym ludzkim osoczu lub surowicy. Wykazaliśmy, że ten wskaźnik funkcjonalności HDL przewiduje występ chorób sercowo-naczyniowych.

Testy wypływu lipoproteiny o wysokiej gęstości

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Opisujemy małoinwazyjną i bezbolesną metodę pomiaru siły mięśni kończyn tylnych u psów oraz reakcji mięśni na powtarzające się skurcze ekscentryczne.

Test funkcji mięśni psów in vivo

Rogówka jest wyjątkowa ze względu na brak tkanek naczyniowych. Niemniej jednak, silne czynniki angiogenne mogą indukować intensywny wzrost i przeżywalność naczyń krwionośnych w rogówce. W związku z tym rogówka może stanowić cenne narzędzie w badaniach nad angiogenezą. Niniejszy protokół demonstruje, jak wykonać model kieszonkowy w rogówce myszy oraz jak ocenić indukowaną przez czynniki angiogenne angiogenezę z wykorzystaniem tego modelu.

Myszowy model testu kieszonki rogówkowej do badań angiogenezy

Poznaj metodę testu wypływu cholesterolu z komórek hodowlanych w celu oceny akceptorów osocza. Ta technika umożliwia badanie homeostazy lipidów i metabolizmu cholesterolu w biologii komórkowej.

Test odpływu cholesterolu

Przeglądaj więcej filmów