Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie pierwotnych kultur komórek mikrogleju z mózgów noworodków szczura. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie mózgu i usunięcie opon mózgowych. Drugim krokiem jest homogenizacja mózgu oraz wysianie mieszanej kultury glejowej do kolb T 75.

Następnie kolby inkubuje się od 10 do 14 dni, aż monowarstwa astrocytów osiągnie pełną konfluencję. Ostatnim krokiem jest wstrząśnięcie kolb w celu uwolnienia mikrogleju rosnącego na powierzchni monowarstwy astrocytów, co pozwala na uzyskanie oczyszczonej hodowli mikrogleju. Ostatecznie mikroglej pierwotny o wysokiej czystości może być wykorzystany w dalszych in vitro badaniach hodowli pojedynczych komórek oraz w testach kokultury.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda gradientu Perico, jest to, że nominalna dysrupcja mechaniczna minimalizuje dysfunkcję lub aktywację mikrogleju, a mikroglia do eksperymentów może być generowana przez wiele tygodni po wstępnym przygotowaniu. Będę demonstrować tę procedurę wraz z Tammy Tero, doktorantką w laboratorium dr. Cliftona Dauguarda. Wysokiej czystości hodowle mikrogleju uzyskane podczas tego protokołu mogą być wykorzystywane w eksperymentach in vitro do badania funkcji mikrogleju w normalnych warunkach fizjologicznych, a także w stanach patologicznych.

Odpowiedź mikrogleju na uszkodzenia tkanek, jak również na bodźce zapalne, ma bezpośredni związek z urazami neurologicznymi oraz stanami chorobowymi o charakterze neurodegeneracyjnym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak doświadczenia w szybkim usuwaniu opon mózgowych z tkanki mózgowej, co jest niezbędne do zminimalizowania kontaminacji fibroblastami w pierwotnych kulturach mikrogleju. Ponadto należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić monowarstwy astrocytów podczas potrząsania kolbami i manipulowania kulturami mikrogleju.

W ramach przygotowania do procedury, schłodzono podłoże L 15 do 4 °C, przygotowano szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierające podłoże L 15 i umieszczono je w lodu. Podłoże hodowlane ogrzano do 37 °C i upewniono się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane. Po odcięciu głowy szczurzego młodziaka w wieku od P1 do P5 za pomocą ostrych nożyczek, głowę zanurzono w 70% etanolu.

Po pobraniu głów pięciu szczurząt, należy przenieść je do roztworu soli fizjologicznej. Z każdej głowy należy wyjąć cały mózg, wykonując ostrożnie nacięcia po obu stronach czaszki nad uszami, a następnie wyciągnąć mózg i umieścić go w jednej z szalek Petriego zawierających medium L 15 w lodzie. Po przeniesieniu pierwszych pięciu mózgów do medium L 15 w lodzie, kolejne pięć szczurząt można przetworzyć w ten sam sposób, aż do momentu pobrania wszystkich mózgów.

Usuń opony mózgowe, delikatnie chwytając pęsetą krawędź błony oponowej i ostrożnie oddzielając ją od leżącej poniżej kory. Niezbędne jest dokładne usunięcie opon mózgowych i wykonanie tego procesu tak szybko, jak to możliwe. Po usunięciu opon przenieś każdy z mózgów do nowej szalki Petriego z pożywką L 15 umieszczonej na lodzie.

Używając pipety o pojemności 10 ml, odessać tkankę mózgową wraz z pożywką z płytki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwiruj próbkę przy 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu odessać nadsącz.

Następnie, używając sterylnej pipety o pojemności 10 ml, należy resuspender osad w czterech do pięciu mililitrów świeżej pożywki L 15, pipetując pożywkę i tkankę w górę i w dół 10 razy. Następnie należy umieścić sitko komórkowe o rozmiarze oczek 100 µm na świeżej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.

Używając sterylnej pipety o pojemności pięciu mililitrów, należy kilkukrotnie pobrać i wypuścić zawiesinę tkankową, a następnie, przy dociskaniu końcówki pipety do sita komórkowego, przenieść materiał przez sito do probówki stożkowej. Przepłukać sito od czterech do pięciu mililitrów świeżej, schłodzonej pożywki L 15. Następnie odwirować próbkę przy 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Dla każdego przetworzonego mózgu młodego szczura przygotuj sterylną kolbę T 75, wlewając do każdej z nich 12 mililitrów medium hodowlanego z prefabrykatem. Następnie, po odessaniu supernatantu z osadu komórkowego, dodaj od pięciu do sześciu mililitrów medium hodowlanego do pelletu komórkowego i pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 10 mililitrów. Następnie przenieś równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej kolby T 75.

Inkubuj kolby w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech tygodni, pozwalając komórkom pozostawać w spokoju przez pierwsze pięć dni po początkowym wysiewaniu. Po pięciu dniach wymień medium warunkujące w każdej kolbie na 12 mililitrów świeżego medium, aby osiągnąć konfluencję. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, nie dotykając dna kolby, do którego przytwierdzone są komórki.

Gdy zmieszane hodowle glejne osiągną całkowitą konfluencję, wyjmij kolby z inkubatora. Przykryj nakrętki kolb parafilmem, aby zapobiec wymianie gazowej z powietrzem otoczenia, a następnie umieść kolby w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 100 RPS i 37 °C na jedną godzinę. Po upływie godziny użyj pipety 10 ml, aby zebrać pożywkę z kolb, nie naruszając warstwy astrocytów, i przelej ją do stożkowych probówek 50 ml. Do kolb dodaj świeżą pożywkę i przenieś je z powrotem do inkubatora.

Po odwirowaniu probówek z prędkością 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odessaj supernatant i resuspender komórki w jednym mililitrze pożywki do wysiewu mikrogleju. Następnie policz komórki, korzystając z cytometru i standardowych procedur. Po ustaleniu liczby komórek dodaj odpowiednią objętość pożywki do wysiewu mikrogleju, aby uzyskać pożądaną koncentrację komórek.

Stężenie wynoszące 2×10⁵ komórek na ml na płytkę jest odpowiednie dla eksperymentu; należy ją zwrócić do inkubatora, aby umożliwić mikroglejowi przytwierdzenie się przez noc. Komórki zostały poddane immunobarwieniu przeciwciałem specyficznym dla IBA1, markerem mikrogleju, który barwi się na czerwono.

Występuje minimalna kontaminacja hodowli komórkami neuronalnymi, co obrazuje to zdjęcie mikroskopowe barwienia immunocytochemicznego z użyciem przeciwciała przeciwko markerowi neuronalnemu new NA, który barwi się na czerwono. Preparat został zabarwiony kontrastowo DPI w celu wybarwienia wszystkich jąder komórkowych na niebiesko. To zdjęcie przedstawia barwienie immunocytochemiczne z użyciem GFAP i markera astrocytów.

Astrocyty są widoczne w kolorze zielonym. Tutaj widzimy obraz hodowli mikrogleju poddanego immunobarwieniu przeciwciałem specyficznym dla CC1, markera oligodendrocytów. Oligodendrocyty są widoczne w kolorze czerwonym.

Ten histogram przedstawia wyniki ilościowego oznaczenia każdego typu komórek. Widać, że wysiane hodowle mikrogleju są czyste w ponad 90%. Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia hodowlę mikrogleju, która została poddana immunobarwieniu na IBA1.

Czerwone obszary to lateksowe kuleczki znakowane fluorescencyjnie. Przedstawiona tutaj hodowla mikrogleju została poddana działaniu lipopolisacharydu w stężeniu 1 ng/mL; widać, że komórki mikrogleju dokonały fagocytozy fluorescencyjnie znakowanych lateksowych kuleczek. Wyniki testu fagocytozy zostały tutaj przedstawione na histogramie.

Zwiększoną fagocytozę obserwuje się po traktowaniu LPS. Rysunek ten pokazuje, że produkcja tlenku azotu w kulturach mikrogleju również wzrasta po dodaniu LPS. Wreszcie, zarówno w bezpośrednich kulturach mikrogleju i neuronów, jak i w kulturach rozdzielonych wkładką transwell, stwierdzono zwiększoną śmiertelność komórek po inkubacji z LPS, co zmierzono za pomocą uwalniania dehydrogenazy mleczanowej. Po opanowaniu pierwszej części tej techniki, etapy aż do wysiewu do kolb T 75 można zrealizować w półtorej godziny, a całą procedurę można przeprowadzić w ciągu dwóch tygodni.

Kolejnym aspektem podczas optymalizacji tego protokołu jest określenie czasu trwania procesu. Mieszane hodowle glejalne powinny być utrzymywane przed izolacją pierwotnej mikroglei w celu ich wysiania po uzyskaniu kultur o wysokiej czystości. Zastosowanie tej procedury pozwala na ocenę funkcji mikroglei in vitro; za pomocą rutynowych testów laboratoryjnych można wyznaczyć i zmierzyć produkcję tlenku azotu, uwalnianie cytokin i chemokin, a także aktywność fazową.

Dzięki opracowaniu tej procedury badacze z dziedziny neuronauki zyskali możliwość badania aktywności mikrogleju w jednorodnym środowisku komórkowym oraz analizowania ich roli w różnych stanach neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania pierwotnych kultur komórek mikrogleju z mózgów noworodków szczurów. Proces ten obejmuje izolację mózgu i usunięcie opon mózgowych, a następnie homogenizację tkanki mózgowej i wysianie jej do kolb, które są inkubowane od 10 do 14 dni, aż do momentu uzyskania konfluencji monowarstwy astrocytów.

Ostatnim krokiem jest potrząśanie kolbami w celu uwolnienia mikrogleju rosnącego na powierzchni monowarstwy astrocytów, co pozwala na uzyskanie oczyszczonej kultury mikrogleju.