Name: Pierwotna izolacja mikrogleju z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgowej noworodka szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Poznaj metodę izolacji pierwotnego mikrogleju z mózgów noworodków szczura. Protokół obejmuje mechaniczną izolację, hodowlę mieszaną i wstrząsanie, zapewniając wysoką czystość komórek do badań in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowane z programu wewnętrznego Uniformed Services University.

1. Disekcja tkanki mózgu noworodka szczura
<ol>
	<li>Schłodzić warunkowane medium Leibovitz'a L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) do 4 °C. Podgrzać medium hodowlane (DMEM + 10% FBS + 1% penicylina/streptomycyna) do 37 °C. Przygotować 4 szalki Petriego o wymiarach 60x15 mm z 4-5 ml warunkowanego medium L-15 na lodzie. Wszystkie narzędzia chirurgiczne wysterylizować 100% etanolem.</li>
	<li>Opłukać noworodki szczurów w wieku P2 70% etanolem. (W niniejszym protokole można stosować noworodki szczurów w wieku od P1 do P5).</li>
	<li>Szybko odciąć głowę noworodka szczura za pomocą sterylnych, ostrych nożyczek i niezwłocznie zanurzyć ją w 70% etanolu. Powtórzyć czynność dla łącznie 5 noworodków szczurów, a następnie przenieść głowy do roztworu soli fizjologicznej.</li>
	<li>Wyjąć całe mózgi z głów i umieścić je w szalce Petriego z 4-5 ml roztworu L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) na lodzie.</li>
	<li>Powtórzyć procedury 1.2 - 1.4 dla pozostałych noworodków z miotu.</li>
	<li>Usunąć oponami mózgowymi i przenieść pożądaną tkankę mózgową (np. korę, móżdżek, cały mózg itp.) do nowej szalki Petriego z 4-5 ml roztworu L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep) na lodzie.</li>
</ol>
2. Przygotowanie mieszanej populacji komórek glejowych
<ol>
	<li>Przenieś tkankę za pomocą pipety 10 ml do sterylnej probówki stożkowej 50 ml, uważając, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej nożyczkami ani ostrzem.</li>
	<li>Wiruj probówkę stożkową przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odssij supernatant. Dodaj 4-5 ml świeżej pożywki L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep).</li>
	<li>Przenieś tkankę w górę i w dół pipetą 10 razy, używając sterylnej pipety 10 ml.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek (oczka 100 μm) na świeżej probówce stożkowej 50 ml. Przenieś tkankę w górę i w dół raz za pomocą sterylnej pipety 5 ml, a następnie, trzymając pipetę równolegle do sitka, przelej materiał przez sitko do probówki stożkowej.</li>
	<li>Przepłucz sitko do komórek 4-5 ml świeżej pożywki L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen/Strep).</li>
	<li>Wiruj probówkę stożkową z przesianymi komórkami przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
3. Wysiewanie i utrzymywanie mieszanych kultur komórek glejowych
<ol>
	<li>Dla każdego przetworzonego mózgu młodego szczura przygotuj jedną sterylną kolbę T-75, wlewając do każdej z nich 12 ml pożywki hodowlanej (DMEM + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny).</li>
	<li>Odsaj pożywkę znad osadu komórkowego i dodaj do pelletu komórkowego 5-6 ml pożywki hodowlanej. Przenieś zawiesinę w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 10 ml.</li>
	<li>Przenieś równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej kolby T-75.</li>
	<li>Inkubuj kolby w inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez łącznie od 1 do 3 tygodni.</li>
	<li>Kolby należy inkubować najpierw przez 5 dni, a w piątym dniu wymienić pożywkę w każdej kolbie na 12 ml świeżej pożywki i ponownie umieścić je w inkubatorze. Następnie, co 3 dni, wymieniaj pożywkę kondycjonowaną w każdej kolbie na 12 ml świeżej pożywki, aż do uzyskania konfluencji. Należy to robić bardzo ostrożnie, aby nie dotknąć dna kolb, do którego przytwierdzone są komórki.</li>
</ol>
4. Izolacja i wysiew pierwotnych mikroglejów
<ol>
	<li>Po całkowitym zrośnięciu mieszanych kultur glejowych, wyjmij kolby z inkubatora i owiń ich zakrętki parafilmem, aby zapobiec wymianie gazowej z powietrzem otoczenia.</li>
	<li>Wstrząsaj kolby z częstotliwością 100 rps (Lab Companion SI-600, Jeio Tech) przez 1 hr w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Zbierz pożywkę ze wszystkich kolb za pomocą pipety 10 ml, nie naruszając warstwy astrocytów na powierzchni kolby. Przenieś pożywkę do probówek stożkowych o pojemności 50 ml. Dolej świeżą pożywkę do kolb i wprowadź je z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>Wiruj probówki stożkowe przy 2,500 RCF przez 5 min w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odsuń nadmiar cieczy znad osadu we wszystkich probówkach stożkowych. Osady komórkowe stanowią wysokiej czystości komórki mikrogleju. Resuspenduj osady w 1 ml pożywki do wysiewu mikrogleju (DMEM + 10% FES + 1% Penicillin/Streptomycin).</li>
	<li>Oznacz gęstość komórek w resuspendowanej pożywce za pomocą hemocytometru.</li>
	<li>Dodaj odpowiednią objętość pożywki do wysiewu mikrogleju, aby uzyskać gęstość 2 x 10e5 cells per ml. Wysiej zgodnie z wymogami analizy eksperymentalnej.</li>
	<li>Pozostaw mikroglej do przytwierdzenia przez noc.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Opisany powyżej protokół pozwala na uzyskanie pierwotnych kultur mikrogleju o wysokiej czystości. Jak ustalono w badaniu immunohistochemicznym z użyciem markera specyficznego dla makrofagów/mikrogleju (Iba1), wysiane kultury mikrogleju są czyste w &gt; 90% (Rysunek 2). Ponadto barwienie markerami specyficznymi dla astrocytów, oligodendrocytów i neuronów wykazuje minimalne zanieczyszczenie (Rysunek 2). Po ustaleniu mieszanych kultur komórek glejowych mikroglej można wyizolować poprzez wstrząsanie do 4 razy pod rząd. Pierwsza izolacja mikrogleju dostarczy około 2,2 x 10ˆ6 komórek/ml lub około 9 milionów komórek z 10 kolb, a spodziewana wydajność zmniejsza się z każdym kolejnym wstrząsaniem. Mikroglej izolowany tą metodą był z powodzeniem wykorzystywany do badania zdolności fagocytarnych, funkcji takich jak produkcja tlenku azotu oraz toksyczności neuronalnej (Rysunek 3) 13-14.
<img alt="Schemat sekcji noworodka szczura w celu hodowli mikrogleju; dysocjacja tkanek, przygotowanie hodowli." src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Przegląd protokołu przygotowania mieszanych hodowli komórek glejowych i izolacji pierwotnego mikrogleju.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek mózgu: mikroglej, neurony, astrocyty, oligodendrocyty; wykres czystości." src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Izolacja mikrogleju o wysokiej czystości potwierdzona analizą immunohistochemiczną z użyciem markerów specyficznych dla mikrogleju (Iba-1, czerwony), astrocytów (GFAP, zielony), neuronów (NeuN, czerwony) i oligodendrocytów (CC1, czerwony). Przedstawiono również barwienie DNA komórek w hodowli za pomocą DAPI (niebieski).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna i wykresy słupkowe dla analizy fagocytozy, produkcji NO i uwalniania LDH." src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Mikroglej wyizolowany opisaną metodą został wykorzystany w szeregu testów, w tym, między innymi, w testach fagocytozy, testach funkcji oraz badaniach neurotoksyczności. W badaniach tych stwierdzono, że mikroglej (Iba-1 dodatni, zielony), po ekspozycji na pożywkę kontrolną (A) lub traktowaną LPS (B), zwiększa fagocytozę znakowanych fluorescencyjnie kulek lateksowych (czerwone), co można ilościowo określić (C). Ponadto traktowanie LPS (1ng/ml) może zwiększyć produkcję tlenku azotu w mikrogleju (D). Wreszcie, w hodowlach mikrogleju i neuronów, zarówno rozdzielonych wkładkami transwell, jak i w kokulturach bezpośrednich, wykazano, że mikroglej inkubowany z LPS może indukować śmierć komórek neuronalnych, co zmierzono za pomocą uwalniania dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (E, F).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
<li>Raivich, G., Bohatschek, M., Kloss, C. U., Werner, A., Jones, L. L., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroglial+activation+repertoire+in+the+injured+brain%3A+graded+response%2C+molecular+mechanisms+and+cues+to+physiological+function%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Brain+Res.+Rev%22%5BJournal%5D)">Neuroglial activation repertoire in the injured brain: graded response, molecular mechanisms and cues to physiological function.</a> Brain Res. Brain Res. Rev. 30, 77-105 (1999).</li>
<li>Loane, D. J., Byrnes, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+microglia+in+neurotrauma%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Role of microglia in neurotrauma.</a> Neurotherapeutics. 7, 245-265 (2010).</li>
<li>Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+underlying+inflammation+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration.</a> Cell. 140, 918-934 (2010).</li>
<li>Pocock, J. M., Liddle, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+signalling+cascades+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Microglial signalling cascades in neurodegenerative disease.</a> Prog. Brain Res. 132, 555-565 (2001).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Soc.+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem. Soc. Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Barger, S. W., Basile, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+microglia+by+secreted+amyloid+percursor+protein+evokes+release+of+glutamate+by+cystine+exchange+and+attenuates+synpatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of microglia by secreted amyloid percursor protein evokes release of glutamate by cystine exchange and attenuates synpatic function.</a> J. Neurochem. 76, 846-854 (2001).</li>
<li>Ni, M., Aschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+rat+primary+microglia%3A+isolation%2C+culturing%2C+and+selected+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications.</a> Curr. Protoc. Toxicol. Chapter 12, Unit 12.17(2010).</li>
<li>Hassan, N. F., Rifat, S., Campbell, D. E., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+characterization+of+newborn+mouse+brain-derived+microglia+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric characterization of newborn mouse brain-derived microglia maintained in vitro.</a> J. Leukoc. Biol. 50, 86-92 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Prakash, K., Chehimi, J., McCawley, L. J., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+newborn+rabbit+brain-derived+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of newborn rabbit brain-derived microglia.</a> Clin. Immunol. Immunopathol. 59, 426-435 (1991).</li>
<li>Hassan, N. F., Campbell, D. E., Rifat, S., Douglas, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+fetal+brain-derived+microglia+in+in+vitro+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human fetal brain-derived microglia in in vitro culture.</a> Neuroscience. 41, 149-158 (1991).</li>
<li>Frank, M. G., Wieseler-Frank, J. L., Watkins, L. R., Maier, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+highly+enriched+and+quiescent+microglia+from+adult+rat+hippocampus%3A+immunophenotypic+and+functional+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of highly enriched and quiescent microglia from adult rat hippocampus: immunophenotypic and functional characteristics.</a> J. Neurosci. Methods. 151, 121-130 (2006).</li>
<li>Byrnes, K. R., Stoica, B., Loane, D. J., Riccio, A., Davis, M. I., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabotropic+glutamate+receptor+5+activation+inhibits+microglial+associated+inflammation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Metabotropic glutamate receptor 5 activation inhibits microglial associated inflammation and neurotoxicity.</a> Glia. 57, 550-560 (2009).</li>
<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Brak deklarowanych konfliktów interesów.

Choć protokół ten jest rutynowo wykorzystywany do pozyskiwania czystych i zdrowych mikroglejów na potrzeby eksperymentów badawczych, staranne uwzględnienie aspektów technicznych podczas krytycznych etapów procedury pozwoli zminimalizować zmienność w wyizolowanych komórkach mikrogleju. Po pierwsze, podczas preparowania tkanki mózgowej z noworodków szczura, konieczna jest sprawna i szybka praca, aby zminimalizować uszkodzenia tkanki wynikające z niedotlenienia i niedokrwienia. Niezwykle ważne jest jednak również całkowite ...

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego 60 mm x 15 mm</td><td>Fisher brand</td><td>0875713A</td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki do dyssekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #7b – końcówki standardowe, zakrzywione, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11270-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5 – końcówki standardowe, proste, 11 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td></td></tr><tr><td>Stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 5 ml</td><td>Grenier Bio One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Pipety serologiczne 10 ml</td><td>Grenier Bio One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne nylonowe sitko do komórek 100 &amp;mu;m</td><td>Falcon</td><td>35-2360</td><td></td></tr><tr><td>Flaski do hodowli tkankowej 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Corning</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże DMEM (Dulbecco's minimal essential medium)</td><td>Gibco (Invitrogen)</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże L-15 Leibovitza</td><td>Gibco (Invitrogen)</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Gibco(Invitrogen)</td><td>16000-036</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica końska</td><td>Fisher</td><td>SH3007402</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco (Invitrogen)</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>The Warner Graham Company</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór soli fosforanowo-buforowanej (PBS), 10X, pH 7.4 </td><td>Quality Biological, inc.</td><td>119-069-131</td><td>1X w sterylnej wodzie destylowanej</td></tr><tr><td>Worki na odpady biologiczne</td><td>VWR</td><td>14220-028</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki do hodowli komórek z powierzchnią cellBIND</td><td>Corning</td><td>3335</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Mikrogleja stanowi około 12% całkowitej populacji komórkowej w mózgu ssaków. Podczas gdy neurony i astrocyty są uważane za główne typy komórek układu nerwowego, mikroglej odgrywa istotną rolę w prawidłowej fizjologii mózgu, monitorując tkankę pod kątem obecności debris i patogenów oraz utrzymując homeostazę w miąższu poprzez aktywność fagocytarną 1,2. Mikroglej ulega aktywacji w wielu stanach urazowych i chorobowych, w tym w chorobach neurodegeneracyjnych, urazach czaszkowo-mózgowych oraz infekcjach układu nerwowego 3. W warunkach aktywacji komórki mikrogleju zwiększają swoją aktywność fagocytarną, przechodzą zmiany morfologiczne i proliferacyjne oraz aktywnie wydzielają reaktywne formy tlenu i azotu, prozapalne chemokiny i cytokiny, często uruchamiając pętlę parakrynną lub autokrynną 4-6. Ponieważ odpowiedzi te przyczyniają się do patogenezy schorzeń neurologicznych, uzasadnione są badania skoncentrowane na mikrogleju.
	Ze względu na heterogeniczność komórkową mózgu, uzyskanie wystarczającej ilości materiału mikrogleju o wysokiej czystości podczas eksperymentów in vivo jest technicznie trudne. Obecne badania nad funkcjami neuroprotekcyjnymi i neurotoksycznymi mikrogleju wymagają rutynowej metody technicznej, która pozwalałaby na spójne generowanie czystego i zdrowego mikrogleju z wydajnością wystarczającą do prowadzenia badań. Przedstawiamy w tekście i wideo protokół izolacji czystego pierwotnego mikrogleju z mieszanych kultur glejowych do różnorodnych zastosowań analitycznych. W skrócie, technika ta wykorzystuje zdysocjowaną tkankę mózgową noworodków szczura do wytworzenia mieszanych kultur komórek glejowych. Po osiągnięciu przez mieszane kultury glejowe pełnej konfluencji, pierwotny mikroglej jest izolowany mechanicznie z kultury poprzez krótkotrwałe wytrząsanie. Następnie mikroglej o wysokiej czystości jest wysiewany do dalszych badań eksperymentalnych.
	Zasada i protokół tej metodologii zostały opisane w literaturze 7,8. Ponadto w literaturze dobrze opisano alternatywne metodologie izolacji pierwotnej mikroglei 9-12. Homogenizowaną tkankę mózgową można rozdzielić za pomocą wirowania w gradiencie gęstości w celu uzyskania pierwotnej mikroglei 12. Jednakże wirowanie to trwa umiarkowany czas (45 min) i może powodować uszkodzenia oraz aktywację komórkową, a także prowadzić do wzbogacenia populacji mikroglei i innych typów komórek. Inny protokół wykorzystywany do izolacji pierwotnej mikroglei u różnych organizmów opiera się na przedłużonym (16 hr) wstrząsaniu w hodowli 9-11. Po wstrząsaniu supernatant pożywki jest wirowany w celu wyizolowania mikroglei. Ta dłuższa, dwuetapowa metoda izolacji może również zaburzać funkcje i stan aktywacji mikroglei. W naszym laboratorium stosujemy głównie następujący protokół izolacji mikroglei z kilku powodów: (1) pierwotna mikrogleja wierniej odwzorowuje biologię in vivo niż unieśmiertelnione linie komórkowe mikroglei gryzoni, (2) minimalna destrukcja mechaniczna ogranicza potencjalne dysfunkcje lub aktywację komórkową oraz (3) można uzyskać wystarczającą wydajność bez konieczności pasażowania mieszanych kultur komórek glejowych.
	Należy zauważyć, że niniejszy protokół wykorzystuje tkankę mózgową noworodków szczurów do izolacji mikrogleju i że użycie starszych szczurów do izolacji mikrogleju może znacząco wpłynąć na wydajność, stan aktywacji oraz właściwości funkcjonalne wyizolowanych komórek. Istnieją dowody na to, że starzenie wiąże się z dysfunkcją mikrogleju, zwiększonym stanem neurozapalnym i patologiami neurodegeneracyjnymi, dlatego w poprzednich badaniach wykorzystywano mikroglej dorosłych osobników ex vivo, aby lepiej zrozumieć rolę mikrogleju w chorobach neurodegeneracyjnych, w których starzenie jest istotnym parametrem. Jednakże mikroglej ex vivo nie może być utrzymywany w kulturze przez dłuższy czas. Zatem, choć niniejszy protokół przedłuża żywotność pierwotnych kultur mikrogleju, należy pamiętać, że komórki te zachowują się inaczej niż mikroglej dorosłych osobników, a wyniki badań in vitro powinny być ostrożnie interpretowane przy przenoszeniu ich na warunki in vivo.

Izolowanie pierwotnych mikroglejów z heterogenicznej populacji komórek mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Niniejszy protokół opisuje technikę mechanicznej izolacji i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność oraz wysoką czystość żywych, pierwotnych komórek mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Mikroglej stanowi około 12% całkowitej populacji komórek w mózgu ssaków. Podczas gdy neurony i astrocyty są uważane za główne...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie pierwotnych kultur komórek mikrogleju z mózgów noworodków szczura. Jest to realizowane poprzez wstępne wyizolowanie mózgu i usunięcie opon mózgowych. Drugim krokiem jest homogenizacja mózgu oraz wysianie mieszanej kultury glejowej do kolb T 75.Następnie kolby inkubuje się od 10 do 14 dni, aż monowarstwa astrocytów osiągnie pełną konfluencję. Ostatnim krokiem jest wstrząśnięcie kolb w celu uwolnienia mikrogleju rosnącego na powierzchni monowarstwy astrocytów, co pozwala na uzyskanie oczyszczonej hodowli mikrogleju. Ostatecznie mikroglej pierwotny o wysokiej czystości może być wykorzystany w dalszych in vitro badaniach hodowli pojedynczych komórek oraz w testach kokultury.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda gradientu Perico, jest to, że nominalna dysrupcja mechaniczna minimalizuje dysfunkcję lub aktywację mikrogleju, a mikroglia do eksperymentów może być generowana przez wiele tygodni po wstępnym przygotowaniu. Będę demonstrować tę procedurę wraz z Tammy Tero, doktorantką w laboratorium dr. Cliftona Dauguarda. Wysokiej czystości hodowle mikrogleju uzyskane podczas tego protokołu mogą być wykorzystywane w eksperymentach in vitro do badania funkcji mikrogleju w normalnych warunkach fizjologicznych, a także w stanach patologicznych.Odpowiedź mikrogleju na uszkodzenia tkanek, jak również na bodźce zapalne, ma bezpośredni związek z urazami neurologicznymi oraz stanami chorobowymi o charakterze neurodegeneracyjnym. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności ze względu na brak doświadczenia w szybkim usuwaniu opon mózgowych z tkanki mózgowej, co jest niezbędne do zminimalizowania kontaminacji fibroblastami w pierwotnych kulturach mikrogleju. Ponadto należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić monowarstwy astrocytów podczas potrząsania kolbami i manipulowania kulturami mikrogleju.W ramach przygotowania do procedury, schłodzono podłoże L 15 do 4 °C, przygotowano szalki Petriego o wymiarach 60 x 15 mm zawierające podłoże L 15 i umieszczono je w lodu. Podłoże hodowlane ogrzano do 37 °C i upewniono się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane. Po odcięciu głowy szczurzego młodziaka w wieku od P1 do P5 za pomocą ostrych nożyczek, głowę zanurzono w 70% etanolu.Po pobraniu głów pięciu szczurząt, należy przenieść je do roztworu soli fizjologicznej. Z każdej głowy należy wyjąć cały mózg, wykonując ostrożnie nacięcia po obu stronach czaszki nad uszami, a następnie wyciągnąć mózg i umieścić go w jednej z szalek Petriego zawierających medium L 15 w lodzie. Po przeniesieniu pierwszych pięciu mózgów do medium L 15 w lodzie, kolejne pięć szczurząt można przetworzyć w ten sam sposób, aż do momentu pobrania wszystkich mózgów.Usuń opony mózgowe, delikatnie chwytając pęsetą krawędź błony oponowej i ostrożnie oddzielając ją od leżącej poniżej kory. Niezbędne jest dokładne usunięcie opon mózgowych i wykonanie tego procesu tak szybko, jak to możliwe. Po usunięciu opon przenieś każdy z mózgów do nowej szalki Petriego z pożywką L 15 umieszczonej na lodzie.Używając pipety o pojemności 10 ml, odessać tkankę mózgową wraz z pożywką z płytki do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie odwiruj próbkę przy 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po wirowaniu odessać nadsącz.Następnie, używając sterylnej pipety o pojemności 10 ml, należy resuspender osad w czterech do pięciu mililitrów świeżej pożywki L 15, pipetując pożywkę i tkankę w górę i w dół 10 razy. Następnie należy umieścić sitko komórkowe o rozmiarze oczek 100 µm na świeżej probówce stożkowej o pojemności 50 ml.Używając sterylnej pipety o pojemności pięciu mililitrów, należy kilkukrotnie pobrać i wypuścić zawiesinę tkankową, a następnie, przy dociskaniu końcówki pipety do sita komórkowego, przenieść materiał przez sito do probówki stożkowej. Przepłukać sito od czterech do pięciu mililitrów świeżej, schłodzonej pożywki L 15. Następnie odwirować próbkę przy 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Dla każdego przetworzonego mózgu młodego szczura przygotuj sterylną kolbę T 75, wlewając do każdej z nich 12 mililitrów medium hodowlanego z prefabrykatem. Następnie, po odessaniu supernatantu z osadu komórkowego, dodaj od pięciu do sześciu mililitrów medium hodowlanego do pelletu komórkowego i pipetuj w górę i w dół 10 razy za pomocą pipety 10 mililitrów. Następnie przenieś równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej kolby T 75.Inkubuj kolby w inkubatorze z 5% carbon dioxide w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech tygodni, pozwalając komórkom pozostawać w spokoju przez pierwsze pięć dni po początkowym wysiewaniu. Po pięciu dniach wymień medium warunkujące w każdej kolbie na 12 mililitrów świeżego medium, aby osiągnąć konfluencję. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, nie dotykając dna kolby, do którego przytwierdzone są komórki.Gdy zmieszane hodowle glejne osiągną całkowitą konfluencję, wyjmij kolby z inkubatora. Przykryj nakrętki kolb parafilmem, aby zapobiec wymianie gazowej z powietrzem otoczenia, a następnie umieść kolby w inkubatorze z wytrząsarką ustawionym na 100 RPS i 37 °C na jedną godzinę. Po upływie godziny użyj pipety 10 ml, aby zebrać pożywkę z kolb, nie naruszając warstwy astrocytów, i przelej ją do stożkowych probówek 50 ml. Do kolb dodaj świeżą pożywkę i przenieś je z powrotem do inkubatora.Po odwirowaniu probówek z prędkością 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odessaj supernatant i resuspender komórki w jednym mililitrze pożywki do wysiewu mikrogleju. Następnie policz komórki, korzystając z cytometru i standardowych procedur. Po ustaleniu liczby komórek dodaj odpowiednią objętość pożywki do wysiewu mikrogleju, aby uzyskać pożądaną koncentrację komórek.Stężenie wynoszące 2×10⁵ komórek na ml na płytkę jest odpowiednie dla eksperymentu; należy ją zwrócić do inkubatora, aby umożliwić mikroglejowi przytwierdzenie się przez noc. Komórki zostały poddane immunobarwieniu przeciwciałem specyficznym dla IBA1, markerem mikrogleju, który barwi się na czerwono.Występuje minimalna kontaminacja hodowli komórkami neuronalnymi, co obrazuje to zdjęcie mikroskopowe barwienia immunocytochemicznego z użyciem przeciwciała przeciwko markerowi neuronalnemu new NA, który barwi się na czerwono. Preparat został zabarwiony kontrastowo DPI w celu wybarwienia wszystkich jąder komórkowych na niebiesko. To zdjęcie przedstawia barwienie immunocytochemiczne z użyciem GFAP i markera astrocytów.Astrocyty są widoczne w kolorze zielonym. Tutaj widzimy obraz hodowli mikrogleju poddanego immunobarwieniu przeciwciałem specyficznym dla CC1, markera oligodendrocytów. Oligodendrocyty są widoczne w kolorze czerwonym.Ten histogram przedstawia wyniki ilościowego oznaczenia każdego typu komórek. Widać, że wysiane hodowle mikrogleju są czyste w ponad 90%. Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego przedstawia hodowlę mikrogleju, która została poddana immunobarwieniu na IBA1.Czerwone obszary to lateksowe kuleczki znakowane fluorescencyjnie. Przedstawiona tutaj hodowla mikrogleju została poddana działaniu lipopolisacharydu w stężeniu 1 ng/mL; widać, że komórki mikrogleju dokonały fagocytozy fluorescencyjnie znakowanych lateksowych kuleczek. Wyniki testu fagocytozy zostały tutaj przedstawione na histogramie.Zwiększoną fagocytozę obserwuje się po traktowaniu LPS. Rysunek ten pokazuje, że produkcja tlenku azotu w kulturach mikrogleju również wzrasta po dodaniu LPS. Wreszcie, zarówno w bezpośrednich kulturach mikrogleju i neuronów, jak i w kulturach rozdzielonych wkładką transwell, stwierdzono zwiększoną śmiertelność komórek po inkubacji z LPS, co zmierzono za pomocą uwalniania dehydrogenazy mleczanowej. Po opanowaniu pierwszej części tej techniki, etapy aż do wysiewu do kolb T 75 można zrealizować w półtorej godziny, a całą procedurę można przeprowadzić w ciągu dwóch tygodni.Kolejnym aspektem podczas optymalizacji tego protokołu jest określenie czasu trwania procesu. Mieszane hodowle glejalne powinny być utrzymywane przed izolacją pierwotnej mikroglei w celu ich wysiania po uzyskaniu kultur o wysokiej czystości. Zastosowanie tej procedury pozwala na ocenę funkcji mikroglei in vitro; za pomocą rutynowych testów laboratoryjnych można wyznaczyć i zmierzyć produkcję tlenku azotu, uwalnianie cytokin i chemokin, a także aktywność fazową.Dzięki opracowaniu tej procedury badacze z dziedziny neuronauki zyskali możliwość badania aktywności mikrogleju w jednorodnym środowisku komórkowym oraz analizowania ich roli w różnych stanach neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać wiedzę na temat przygotowania pierwotnych kultur komórek mikrogleju z mózgów noworodków szczurów. Proces ten obejmuje izolację mózgu i usunięcie opon mózgowych, a następnie homogenizację tkanki mózgowej i wysianie jej do kolb, które są inkubowane od 10 do 14 dni, aż do momentu uzyskania konfluencji monowarstwy astrocytów.Ostatnim krokiem jest potrząśanie kolbami w celu uwolnienia mikrogleju rosnącego na powierzchni monowarstwy astrocytów, co pozwala na uzyskanie oczyszczonej kultury mikrogleju.

primary-microglia-isolation-from-mixed-glial-cell-cultures-neonatal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja pierwotnych mikrogleju z mieszanych kultur komórek glialnych z tkanki mózgu noworodków szczurów

Ten film demonstruje metodę izolowania i hodowli mikrogleju z mózgów szczurów. Polega ona na oddzieleniu mikrogleju od innych komórek neuronalnych i nieneuronalnych za pomocą płytek pokrytych przeciwciałem monoklonalnym specyficznym dla mikrogleju.

Izolacja i hodowla mikrogleju z mózgów szczurów przy użyciu pożywek bez surowicy

Film demonstrował metodę izolowania i hodowli komórek z mózgu noworodka myszy. Polegało to na enzymatycznej i mechanicznej dysocjacji mózgu, a następnie hodowli w pożywkach wzrostowych pozbawionych neuronalnego czynnika wzrostu w celu uzyskania mieszanej populacji glejowej.

Uzyskiwanie mieszanej hodowli komórek glejowych z mózgu noworodka myszy

Przedstawiamy metody efektywnej i szybkiej izolacji/hodowli żywotnego mikrogleju z kory mózgowej noworodka i dorosłego rdzenia kręgowego.  Sekcja i posiew mikrogleju korowego może być przeprowadzona w ciągu 90 minut, a późniejsze zbieranie mikrogleju odbywa się ~ 10 dni po początkowym rozbiorze.

Hodowla mikrogleju z ośrodkowego układu nerwowego noworodków i dorosłych

Jednym z kluczy do udanego badania biologii mikrogleju jest zachowanie funkcji immunologicznej mikrogleju ex vivo podczas izolacji z tkanki OUN. Wyizolowanie mikrogleju za pomocą wytrząsania obrotowego daje wysoce czyste i immunofunkcjonalne hodowle komórek, oceniane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, immunocytochemii i ELISA po aktywacji mikrogleju za pomocą bodźców prozapalnych lipopolisacharydu (LPS) i Pam3CSK4 (Pam).

Izolacja mikrogleju korowego z zachowanym immunofenotypem i funkcjonalnością od mysich noworodków

Tutaj prezentujemy protokół izolacji mikrogleju od pourodzeniowych szczeniąt myszy (dzień 1) do eksperymentów in vitro. Ta improwizowana metoda izolacji zapewnia zarówno wysoką wydajność, jak i czystość, co stanowi znaczną przewagę nad alternatywnymi metodami, która pozwala na szeroki zakres eksperymentów w celu wyjaśnienia biologii mikrogleju.

Szybka i udoskonalona izolacja magnetyczna CD11b pierwotnego mikrogleju o zwiększonej czystości i wszechstronności

Wysiłki zmierzające do szczegółowego zrozumienia funkcji mikrogleju zostały utrudnione przez brak modeli hodowli mikrogleju, które podsumowują właściwości dojrzałego mikrogleju in vivo. Protokół ten opisuje podejście oparte na izolacji i hodowli, mające na celu utrzymanie solidnego przetrwania wysoce rozgałęzionego dojrzałego mikrogleju szczurów w warunkach o zdefiniowanej pożywce.

Izolacja i hodowla mikrogleju gryzoni w celu promowania dynamicznej, rozgałęzionej morfologii w pożywce wolnej od surowicy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji in vitro wielu populacji komórek glejowych z ośrodkowego układu nerwowego myszy. Metoda ta pozwala na segregację regionalnego mikrogleju, komórek prekursorowych oligodendrocytów i astrocytów w celu zbadania fenotypów każdego z nich w różnych systemach hodowli.

Rozwarstwienie i izolacja mysiego gleju z wielu regionów ośrodkowego układu nerwowego

Ten protokół jest wydajną, opłacalną i solidną metodą izolowania pierwotnego mikrogleju od żywej, dorosłej, ludzkiej tkanki mózgowej. Wyizolowany pierwotny mikroglej ludzki może służyć jako narzędzie do badania procesów komórkowych w homeostazie i chorobie.

Pozyskiwanie ludzkiego mikrogleju z tkanki mózgowej dorosłego człowieka

Pierwotne kultury mikrogleju są powszechnie używane do oceny nowych cząsteczek przeciwzapalnych. Niniejszy protokół opisuje powtarzalną i odpowiednią metodę magnetycznego izolowania mikrogleju od nowonarodzonych młodych.

Izolacja magnetyczna komórek mikrogleju od noworodków myszy do pierwotnych hodowli komórkowych

Ten protokół opisuje kokulturę mikrogleju i neuronów utworzoną z pierwotnych komórek nerwowych wyizolowanych z embrionalnych zarodków myszy w 15-16 dniach embrionalnych oraz pierwotnego mikrogleju generowanego z mózgów nowonarodzonych myszy w 1-2 dniach po urodzeniu.

Generowanie i kokultura mysich pierwotnych mikrogleju i neuronów korowych

Poznaj metodę izolacji pierwotnego mikrogleju z mózgów noworodków szczura. Protokół obejmuje mechaniczną izolację, hodowlę mieszaną i wstrząsanie, zapewniając wysoką czystość komórek do badań in vitro.

Izolacja pierwotnych mikroglejów z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgu noworodka szczura

Przeglądaj więcej filmów