Pierwotna izolacja mikrogleju z mieszanych kultur komórek glejowych tkanki mózgowej noworodka szczura

Izolowanie pierwotnego mikrogleju od heterogeniczności komórkowej mózgu jest niezbędne do zbadania ich roli zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Protokół ten opisuje technikę izolacji mechanicznej i mieszanej hodowli komórkowej, która zapewnia wysoką wydajność i wysoką czystość, żywotne pierwotne komórki mikrogleju do badań in vitro i dalszych zastosowań.

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie pierwotnych kultur komórek mikrogleju z mózgów nowonarodzonych szczurów. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie mózgu i usunięcie opon mózgowych. Drugim krokiem jest homogenizacja mózgu i umieszczenie płytki w mieszanej kulturze glejowej w kolbach T 75.

Następnie kolby inkubuje się przez 10 do 14 dni, aż monowarstwa astrocytów osiągnie zbieg. Ostatnim krokiem jest potrząśnięcie kolbami w celu uwolnienia mikrogleju, który rośnie na wierzchu monowarstwy astrocytów, w wyniku czego powstaje oczyszczona kultura mikrogleju. Ostatecznie, pierwotny mikroglej o wysokiej czystości może być stosowany w późniejszych badaniach hodowli pojedynczych komórek in vitro i kokulturach.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak metoda gradientu Perico, jest to, że nominalne zakłócenia mechaniczne minimalizują dysfunkcję lub aktywację mikrogleju, a mikroglej do eksperymentów może być generowany przez kilka tygodni po wstępnym przygotowaniu. Zademonstruję tę procedurę razem z Tammy Tero, doktorantką w laboratorium dr. Cliftona Dau. Kultury mikrogleju o wysokiej czystości uzyskane podczas tego protokołu mogą być wykorzystane w eksperymentach in vitro do badania funkcji mikrogleju w normalnych warunkach fizjologicznych, a także w stanach chorobowych patologicznych.

Mikroglej, reagowanie na uszkodzenia tkanek, a także bodźce zapalne ma bezpośrednie znaczenie dla urazów neurologicznych i chorób neurodegeneracyjnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ nie są zaznajomione z tym, jak usunąć opony mózgowe z tkanki mózgowej w odpowiednim czasie, aby zmniejszyć zanieczyszczenie fibroblastami w pierwotnych kulturach mikrogleju. Ponadto należy zachować ostrożność, aby nie uszkodzić monowarstwy astrocytów podczas wytrząsania kolb i obchodzenia się z kulturami mikrogleju.

Aby przygotować się do zabiegu, Chi Livi przygotowuje pożywkę L 15 do czterech stopni Celsjusza, przygotowuje do podłoże o wymiarach 60 na 15 milimetrów zawierające pożywkę L 15 i umieszcza na lodzie. Podgrzej pożywkę hodowlaną do 37 stopni Celsjusza i upewnij się, że wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane. Po odcięciu głowy szczeniakowi szczura od jednego do pięciu P ostrymi nożyczkami, wrzuć głowę do 70% etanolu.

Po zebraniu głów pięciu młodych szczurów przenieś je do roztworu soli fizjologicznej. Usuń cały mózg z każdej głowy, ostrożnie wykonując nacięcia po obu stronach czaszki nad uszami i wyciągając mózg do jednego z problemów Petriego zawierających pożywkę L 15 na lodzie. Gdy pierwsze pięć mózgów zostanie przeniesionych do L 15 na lodzie, następne pięć szczeniąt może zostać przetworzonych w ten sam sposób, gdy wszystkie mózgi zostaną zebrane.

Usuń opony, delikatnie chwytając krawędź arkusza opony mózgowej kleszczami i ostrożnie odrywając ją od leżącej poniżej kory. Konieczne jest dokładne usunięcie opon mózgowych i zrobienie tego tak szybko, jak to możliwe. Po usunięciu opon mózgowych przenieś każdy z mózgów na świeżą szalkę Petriego z pożywką L 15 na lodzie.

Użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby zassać tkankę mózgową i pożywkę z płytki do sterylnej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów. Następnie odwirować w temperaturze 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu aspiratu.

Supinat następnie używa sterylnej 10-mililitrowej pipety do Reese'a. Zawiesić osad w czterech do pięciu mililitrach świeżego podłoża L 15, pipetować pożywkę i tkankę 10 razy w górę iw dół. Następnie umieść sitko do komórek porowych o średnicy 100 mikronów na świeżej stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów.

Użyj sterylnej pipety o pojemności pięciu mililitrów, aby pipetować zawiesinę tkankową w górę iw dół, a następnie z pipetą przepłukaną do sitka komórkowego, dozuj materiał przez sitko do komórek do stożkowej probówki. Przepłucz sitko czterema do pięciu mililitrami świeżo schłodzonego podłoża L 15. Następnie odwiruj 2 500 RCF przez pięć minut w czterech stopniach Celsjusza.

Dla każdego przetworzonego mózgu młodego szczura przygotuj sterylną kolbę T 75, dodając 12 mililitrów przedwojennej pożywki hodowlanej do każdej kolby. Następnie, po zaessaniu natantu sup z granulowanych komórek, dodaj od pięciu do sześciu mililitrów pożywki hodowlanej do osadu komórkowego, pipetuj w górę iw dół 10 razy za pomocą 10-mililitrowej pipety. Następnie przenieść równą objętość zawiesiny komórek do każdej kolby T 75.

Kolby należy inkubować w inkubatorze z 5% dwutlenkiem węgla w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jeden do trzech tygodni, pozwalając komórkom pozostać w spokoju przez pierwsze pięć dni po wstępnym posiewie. Po pięciu dniach zastąp kondycjonowaną pożywkę w każdej kolbie 12 mililitrami świeżej pożywki, aby uzyskać konfluencję. Należy to zrobić bardzo ostrożnie, nie dotykając dna kolby, do której przyczepiają się komórki.

Gdy mieszane kultury glejowe całkowicie się zsuną, wyjmij kolbę z inkubatora. Przykryj nasadki kolb param, aby zapobiec wymianie gazowej z powietrzem otoczenia i umieść kolby w inkubatorze wstrząsającym ustawionym na 100 RPS i 37 stopni Celsjusza na godzinę po upływie godziny, użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby zebrać pożywkę z kolb bez naruszania warstwy astrocytów i dozować do 50-mililitrowych stożkowych probówek. Dodać świeże podłoża do kolb i wrócić do inkubatora.

Po odwirowaniu probówek w temperaturze 2 500 RCF przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, odessać supinat i ponownie zawiesić komórki w jednym mililitrze pożywki do mikrogleju. Następnie policz komórki za pomocą ludzkiego cytometru i standardowych procedur. Po określeniu liczby komórek dodać odpowiednią objętość pożywki do powlekania mikrogleju, aby uzyskać komórkę.

Stężenie dwa razy 10 do pięciu komórek na mililitrową płytkę jest odpowiednie dla eksperymentu i powrotu do inkubatora. Aby umożliwić przyczepienie się mikrogleju przez noc. Komórki zostały wybarwione immunologicznie przeciwciałem specyficznym dla IBA one, markerem mikrogleju, który wydaje się czerwony.

Zanieczyszczenie hodowli komórkami neuronalnymi jest minimalne, jak pokazano na tym obrazie mikroskopowym barwienia immunologicznego przy użyciu przeciwciała dla nowego markera neuronalnego NA, który wydaje się czerwony. Szkiełko zostało wybarwione licznikami DPI, aby zabarwić wszystkie jądra komórkowe na niebiesko. Ten obraz przedstawia barwienie immunologiczne za pomocą GFAP i markera astrocytów.

Astrocyty wydają się zielone. Tutaj widzimy obraz kultury mikrogleju wybarwionej immunologicznie przeciwciałem specyficznym dla CC one, markerem oligodendrocytów. Oligodendrocyty są czerwone.

Ten histogram przedstawia wyniki kwantyfikacji każdego typu komórki. Można zauważyć, że platerowane kultury mikrogleju są czyste w ponad 90%. Ten obraz z mikroskopu fluorescencyjnego pokazuje kulturę mikrogleju, która była barwnikiem immunologicznym dla IBA one.

Czerwone obszary to fluorescencyjnie oznaczone koraliki lateksowe. Pokazana tutaj hodowla mikrogleju została potraktowana jednym nanogramem na mililitr polisacharydu lipo i można zauważyć, że komórki mikrogleju mają fagocytozę, fluorescencyjnie znakowane kulki lateksowe. Tutaj wyniki testu fagocytozy są wyświetlane w postaci histogramu.

Zwiększoną fagocytozę obserwuje się po leczeniu LPS. Rysunek ten pokazuje, że produkcja tlenku azotu wzrasta również w kulturach mikrogleju po dodaniu LPS. Wreszcie, zarówno hodowle neuronów mikrogleju oddzielone bezpośrednią, jak i transwellową są podatne na zwiększoną śmierć komórek po inkubacji z LPS, mierzoną uwalnianiem dehydrogenazy mleczanowej Po opanowaniu pierwszej części tej techniki, aż do posiewu do T 75, kolby można wykonać w ciągu półtorej godziny, a całą procedurę można wykonać w ciągu dwóch tygodni.

Kolejną kwestią, którą należy wziąć pod uwagę podczas optymalizacji tego protokołu, jest określenie czasu trwania. Mieszane kultury glejowe należy utrzymać przed wyizolowaniem pierwotnego mikrogleju do posiewu, po ustanowieniu kultur o wysokiej czystości. Za pomocą tej procedury można ocenić funkcję mikrogleju metodą in vitro produkcji tlenku azotu, uwalniania cytokin i chemokin, a także aktywności fazowej za pomocą rutynowych testów laboratoryjnych.

Tak więc, wraz z opracowaniem tej procedury, naukowcy w dziedzinie neuronauki mają możliwość zbadania aktywności mikrogleju w jednorodnym środowisku komórkowym i zbadania ich roli w różnych warunkach neurologicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować pierwotne hodowle komórek mikrogleju z mózgów nowonarodzonych szczurów. Najpierw izolując mózg i usuwając opony mózgowe, a następnie homogenizując mózg i posiewając w kolbach, następnie kolby inkubuje się przez 10 do 14 dni, aż monowarstwa astrocytów osiągnie zbieg.

Ostatnim krokiem jest potrząsanie kolbami w celu uwolnienia mikrogleju, który rośnie na wierzchu monowarstwy astrocytów, w wyniku czego powstaje oczyszczona kultura mikrogleju.