Hodowla ludzkich komórek progenitorowych neuronów w trójwymiarowym samoorganizującym się hydrożelu peptydowym

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przyspieszenie analizy różnicowania neuronalnego ludzkich komórek progenitorowych układu nerwowego hodowanych w środowisku trójwymiarowym. Osiąga się to poprzez uprzednią hodowlę komórek w czystej macierzy hydrożelu na bazie samoorganizujących się peptydów, a następnie uwalnianie komórek z tych trójwymiarowych rusztowań.

W trzecim kroku, w końcowym etapie, przeprowadza się immunocytochemiczne barwienie fitochemiczne komórek. Komórki są zliczane za pomocą analizy cytometrycznej. Ostatecznie, poprzez analizę cytometryczną odpowiednio markerów neuronalnych lub apoptotycznych, można określić stopień różnicowania neuronów lub stopień apoptozy.

Dzięki tej technice kwantyfikacja różnicowania neuronalnego przebiega znacznie szybciej, a dane Optane są gromadzone w szerszej bazie niż w przypadku technik mikrofotograficznych. Aby osadzić komórki w czystej macierzy, należy najpierw umieścić sterylną szkiełko nakrywkowe o średnicy 13 mm w każdej z dwóch studni czterostudzienkowej płytki hodowlanej. Następnie płytkę należy przechowywać w komorze z laminarnym przepływem powietrza do późniejszego użycia. W kolejnym kroku odseparuj ludzkie komórki progenitorowe neuronów (H NPCs), dodając 2,5 ml świeżo przygotowanej trypsyny.

Dodaj roztwór benzon do naczynia hodowlanego i inkubuj zawiesinę komórkową w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide. Po pięciu minutach zatrzymaj reakcję za pomocą roztworu inhibitora trypsyny benzon. Następnie po odwirCowaniu oderwanych komórek przy 3000 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut, resuspender otrzymany osad w 5 mL 10% roztworu sucrose, a następnie przemyj zawiesinę komórkową w tych samych warunkach wirowania.

Po odpięciu osadu Resus, zawiesić go w roztworze sacharozy do końcowego stężenia komórek wynoszącego 1×10⁶ komórek/ml. Następnie, tak szybko jak to możliwe, wymieszać 60 µl zawiesiny komórkowej z roztworem jeden; przenieść 120 µl tej zawiesiny do probówki stożkowej z roztworem dwa, wymieszać dokładnie, a następnie niezwłocznie nanieść warstwą 100 µl mieszaniny na każde szkiełko podstawowe w płytce czterodotykowej. Na koniec powoli dodać 200 µl pożywki hodowlanej do każdego dołka.

Po dwóch do trzech minutach dodaj do dołków kolejne 200 µL pożywki hodowlanej, aby zainicjować samoorganizację macierzy. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę w ogrzewanej strefie komory laminarnej. Unikając w miarę możliwości przesuwania płytki z hodowlą po uformowaniu się macierzy, użyj pipety 1000 µL, aby usunąć większość, ale nie całą pożywkę, aby zapobiec wysychaniu macierzy.

Następnie przemyj matryce 500 µl świeżej pożywki przez 10 minut. Na koniec usuń pożywkę użytą do płukania. Dodaj kolejne 500 µl pożywki i umieść płytkę hodowlaną w inkubatorze.

Jeśli to możliwe, należy przechowywać matryce w oddzielnym inkubatorze, aby uniknąć przypadkowego potrząsania strukturami w pierwszym dniu eksperymentu barwienia. Usuń pożywkę z matryc za pomocą pipety 1000 µL, a następnie wypłucz rusztowania w PBS jednokrotnie przez pięć minut.

Następnie usuń PBS i dodaj 400 µl paraldehydu do każdej studzienki, aby utrwalić macierze, i inkubuj je przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu rusztowań przemyj je 500 µl PBS przez pięć minut. Następnie inkubuj struktury w buforze blokującym przez sześć do dziewięciu godzin, wymieniając bufor co dwie do trzech godzin, z końcową inkubacją przez noc w świeżym buforze blokującym w temperaturze 4 °C. Następnego dnia usuń bufor blokujący.

Dodaj roztwór przeciwciał do dołków i ponownie inkubuj matryce w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. Następnie usuń roztwór przeciwciał pierwszorzędowych i płucz rusztowania w 500 µL PBS przez osiem godzin, wymieniając PBS co dwie godziny, a następnie przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza ze świeżym PBS. Po nocnym płukaniu usuń PBS i inkubuj rusztowania z roztworem przeciwciał wtórnych przez cztery godziny w temperaturze pokojowej w ciemności.

Następnie przemyj próbki buforem PBS od czterech do sześciu razy, po jednej godzinie każdego razu, a następnie inkubuj struktury w świeżym buforze PBS w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez noc. Teraz nanieś 50 µL MOE all dab co na szkiełka mikroskopowe, aby przygotować je do montowania macierzy. Następnie ostrożnie nałóż szkiełko cover slip na każde szkiełko.

Na koniec użyj mikroskopu fluorescencyjnego, aby uzyskać pojedyncze mikrografie i obrazy podobne do tych dla barwienia hNPCs na zielono w celu wykazania ekspresji neuronalnego markera beta three tubulin pokazanego tutaj. Po przemyciu rusztowań 500 µL HBSS przez jedną minutę, użyj pipety 1000 µL, aby przenieść rusztowania do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Następnie kilkakrotnie resuspender roztwór komórkowy pipetą 1000 µL, aby mechanicznie rozbić macierze, a następnie odwiruj roztwór z rusztowaniami przy 3000 ×g w temperaturze pokojowej przez pięć minut, usuń nadsącz pipetą, a następnie resuspender osad w 500 µL roztworu trypsyny i benzonukleazy, pipetując ciecz w górę i w dół kilka razy.

Następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C. Reakcję przerwać po pięciu minutach, dodając 1 mL inhibitora trypsyny. Po odwirowaniu zawiesiny komórkowej w tych samych warunkach wirowania, roztwór Benzonukleazy pipetować wielokrotnie w górę i w dół.

Usuń wszelkie resztki macierzy, płucząc komórki dwukrotnie dwiema mililitrami buforu HBSS. Na koniec usuń agregaty, przepuszczając zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 micron w wirówce w tych samych warunkach, a następnie zbierz komórki do medium hodowlanego. Rozpocznij od utrwalenia rozagregowanych komórek w 1% paraformaldehydzie przez 15 minut w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.

Następnie, po odwirowaniu komórek, zawiesić osad w buforze do płukania. Po odwirowaniu komórek przez 10 minut przy 350 ×g w temperaturze 4 °C, zawiesić otrzymany osad w 25 µL roztworu przeciwciał. Inkubować zawiesinę komórkową przez dwie godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce.

Następnie dodaj 300 µL buforu PON bezpośrednio do próbek, a następnie dwukrotnie przemyj zawiesiny komórkowe w tych samych warunkach wirowania. Po drugim przemyciu dodaj 25 µL przeciwciała wtórnego, a następnie inkubuj komórki przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. Po ponownym dwukrotnym przemyciu komórek buforem z saponiną, resuspenduj osad w 500 µL buforu do przemywania w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.

Na tym rysunku przedstawiono H NPCs zamknięte w czystej macierzy; komórki rosną w formie sfer, gęsto upakowanych struktur, w których średnica sfer może wynosić do kilkuset mikronów pomiędzy nimi. Można zaobserwować pęczki wypustek wytworzonych przez komórki, wskazane białymi strzałkami. Chociaż poszczególne komórki są niemal nierozpoznawalne, komórki zamknięte w czystej macierzy suplementowanej lamininą rosną w mniej gęstych strukturach i są rozmieszczone bardziej homogenicznie, co widać na tym rysunku; w obszarach o mniejszej gęstości można nawet rozpoznać pojedyncze komórki, wskazane czarnymi strzałkami. Tutaj H NPCs różnicowano przez cztery dni w czystej macierzy suplementowanej lamininą; barwienie na zielono wskazuje ekspresję markera neuronalnego.

Przedstawiono beta III tubuliny w celu oceny procentowego udziału komórek pozytywnych. Całkowitą liczbę komórek można określić poprzez zliczenie jąder komórkowych, zabarwionych tutaj na niebiesko za pomocą DAPI. Ta mikrofotografia stanowi pełną projekcję stosu obrazów Z (Z-stack), wykonanych przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego.

Komórki uwolnione z macierzy mogą zostać ponownie osadzone, na przykład na szkiełkach nakrywkowych, jak pokazano na tej rycinie, w celu przeprowadzenia dalszych badań funkcjonalnych. Ta mikrofotografia przedstawia komórki hodowane w 3D po poddaniu ich wspomnianej wcześniej procedurze uwalniania i hodowaniu przez trzy dni. Barwienie na beta-tubulinę III na czerwono wykazuje morfologię porównywalną do komórek znajdujących się w rusztowaniu 3D, przy zastosowaniu niebarwionych komórek jako kontroli negatywnej.

Brama (GA), przedstawiona tutaj jako czarna ramka, została ustawiona do późniejszej analizy komórek pozytywnych pod kątem beta three tubuliny; na tym wykresie punktowym komórki pozytywne znajdują się wewnątrz czarnej ramki w prawej części osi x, a w ramce przerywanej można zaobserwować populację pośrednią, która najprawdopodobniej reprezentuje szczątki komórkowe. Na tej końcowej rycini przedstawiono porównanie ręcznego liczenia komórek z enumeracją za pomocą cytometrii przepływowej. Analiza cytometryczna pozwala na wykrycie znacznie wyższego odsetka komórek pozytywnych, co wskazują puste czarne kwadraty, niż zazwyczaj udaje się wyliczyć metodą ręczną, co obrazują pełne czarne trójkąty.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania wskaźników jakościowych do hodowli krawędziowych MPC w rusztowaniu 3D oraz sposobu uwalniania komórek z rusztowania w celu przeprowadzenia analizy cytometrycznej.