Name: Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu myszy wyrażającego YFP (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Poznaj mikroskopię wielofotonową oczyszczonego mózgu myszy wyrażającego YFP. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości z głębokości kilku milimetrów, zachowując fluorescencję białka.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Jacobowi Solisowi za pomoc w montażu wideo.
Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu NSF CAREER Award DBI-0953902 przyznanego MJ Levene.

1. Perfuzja zwierząt5 i oczyszczanie całego mózgu myszy
<ol>
	<li>Całkowity czas trwania procedury może się różnić w zależności od czasu trwania poszczególnych etapów odwodnienia, jednak cały proces można przeprowadzić w ciągu dwóch dni.</li>
	<li>Zważyć myszy YFP, a następnie wprowadzić w stan głębokiej anestezji poprzez podanie dootrzewnowe ketaminy/ksylazyny (100 mg/kg:10 mg/kg).</li>
	<li>Przed przystąpieniem do zabiegu potwierdzić osiągnięcie chirurgicznej płaszczyzny głębokiej anestezji. Sprawdzać stan zwierzęcia co 5 min, obserwując reakcję na mocne ściśnięcie palca u nogi lub ogona. Jeśli zwierzę reaguje, należy podać dawkę uzupełniającą (1/3 dawki pierwotnej) ketaminy/ksylazyny.</li>
	<li>Po wprowadzeniu w stan głębokiej anestezji unieruchomić mysz, przymocowując każdą kończynę do podłoża chirurgicznego za pomocą taśmy laboratoryjnej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji na plecach (leżenie grzbietowe), z odsłoniętą klatką piersiową do zabiegu. Podłoże chirurgiczne jest zazwyczaj wykonane z metalowej lub plastikowej siatki i umieszczone w zlewie lub w kuwecie z rantem, aby krew i odpady z utrwalacza mogły być łatwo zbierane.</li>
	<li>W celu rozpoczęcia wykonać nacięcie poniżej wyrostka mieczykowatego. Za pomocą nożyczek i pęsety przeciąć wzdłuż podstawy klatki piersiowej, odsuwając skórę w miarę postępu cięcia. Wykonać dwa cięcia wzdłuż obu stron mostka myszy (przez żebra), aby stworzyć płat tkanki, który zostanie odsunięty od jamy klatki piersiowej za pomocą kleszczyków hemostatycznych, pozostawiając serce odsłonięte.</li>
	<li>Wprowadzić igłę 23 g do lewej komory serca i wykonać małe nacięcie w ścianie mięśniowej prawego przedsionka, aby umożliwić odpływ krwi. Film z tej procedury znajduje się w artykule JoVE 2497.5</li>
	<li>Natychmiast po nacięciu prawego przedsionka rozpocząć perfuzję chłodnym (4 °C) fosforanowym roztworem buforowanym, PBS (pH 7.2), aż do momentu, gdy z prawego przedsionka serca przestanie wypływać krew (30 - 40 ml przy przepływie około 5 ml/min).</li>
	<li>Po całkowitym odprowadzeniu krwi (płyn wypływający z prawego przedsionka jest przejrzysty), zmienić medium perfuzyjne na schłodzony 4% roztwór PFA. Perfuzję prowadzić do momentu, gdy ciało myszy stanie się wyraźnie sztywne i zimne w dotyku (ok. 30 - 40 ml przy przepływie około 5 ml/min). (Stężony 16% roztwór PFA należy rozcieńczyć zgodnie z instrukcjami producenta i dodać NaOH, aż do osiągnięcia pH 7.2. Należy używać rękawiczek oraz fartucha laboratoryjnego, a odczynniki chemiczne przygotowywać i mieszać w dygestorium).</li>
	<li>Po perfuzji zdjąć mysz z podłoża chirurgicznego i przeprowadzić dekapitację w celu rozpoczęcia wycięcia mózgu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety i nożyczek irydowych usunąć czaszkę w małych sekcjach, zaczynając od tyłu czaszki i przesuwając się do przodu. Nożyczkami wykonywać małe cięcia co 2 - 4 mm w poprzek czaszki, jednocześnie ostrożnie odsuwając kość od mózgu pęsetą w małych fragmentach. Powtarzać czynność do momentu odsłonięcia całej górnej powierzchni mózgu.</li>
	<li>Wyjąć mózg z czaszki za pomocą płaskiej szpatułki o szerokości 5 mm i umieścić go w szklanej fiolce. Zanurzyć w 4% PFA na 6 hr w temperaturze 4 °C w celu dofixacji.</li>
	<li>Po dofixacji przemyć mózg dwukrotnie w PBS w temperaturze pokojowej, wylewając PFA z fiolki i zastępując go PBS. Delikatnie zamieszać mózg w roztworze PBS przed wylaniem go i ponownym zastąpieniem nową porcją PBS do drugiego przemycia.</li>
	<li>Odwodnić mózg w temperaturze pokojowej poprzez inkubację w stopniowanej serii roztworów etanolu (raz w 50%, 70%, 95% i dwukrotnie w 100%) przez 2 hr na każdą inkubację, a następnie przez 12 hr podczas drugiej inkubacji w 100% etanolu, aby usunąć wodę z utrwalonej tkanki. Dla każdej inkubacji wylać poprzedni roztwór etanolu z fiolki i zastąpić go kolejnym roztworem, aż mózg zostanie całkowicie zanurzony.</li>
	<li>Po drugiej inkubacji w 100% etanolu wylać roztwór i zastąpić go mieszaniną etanolu i roztworu przejaśniającego zawierającego alkohol benzylowy i benzoesan benzylu w równych częściach (stosunek objętościowy 1:2 vol:vol). Po 2 hr inkubacji odlać ten roztwór i zastąpić go 100% roztworem alkoholu benzylowego i benzoesanu benzylu (stosunek objętościowy 1:2 vol:vol). Współczynnik załamania światła roztworu przejaśniającego wynosi n = 1.54.</li>
	<li>Po umieszczeniu w BABB mózg stanie się wyraźnie przezroczysty w ciągu 4 - 5 hr. Aby uzyskać najlepsze rezultaty przejaśniania, pozostawić mózg w roztworze na 6 dni w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed silnym światłem.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
<ol>
	<li>Gdy mózg zostanie oczyszczony i będzie gotowy do obrazowania, należy przymocować go do dna szalki Petriego za pomocą cyjanoakrylanu. Przed przejściem do kolejnego etapu należy odczekać do wyschnięcia kleju.</li>
	<li>Po wyschnięciu mózg zanurza się w BABB, a szalkę Petriego umieszcza pod obiektywem mikroskopu w celu obrazowania.</li>
	<li>Używamy mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w tytanowy laser szafirowy Mai Tai z regulowaną długością fali wzbudzenia w zakresie od 710 nm do 990 nm. Długość fali wzbudzenia stosowana do generowania sygnałów YFP wynosi 886 nm. Moc lasera waha się od 30 - 100 mW w zależności od głębokości obrazowania.</li>
	<li>Sygnał fluorescencyjny odbity należy zarejestrować za pomocą obiektywu Nikon 5X (NA, 0,5), który umożliwia obrazowanie w szerokim polu widzenia (2 x 2 mm).</li>
	<li>Sygnał fluorescencyjny odbity należy przefiltrować za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 535/50 i zebrać go za pomocą PMT GaAsP (H7422PA-40, Hamamatsu, Bridgewater, New Jersey).</li>
	<li>Obrazy przetwarza się za pomocą oprogramowania ScanImage6 w rozdzielczości 2048 x 2048 pikseli, przy szybkości skanowania 2 ms na linię, aby uzyskać wysokorozdzielcze obrazy YFP.</li>
	<li>Po zakończeniu obrazowania mózg należy wyjąć z szalki Petriego pęsetą i przechowywać w BABB w warunkach osłoniętych od światła do późniejszego obrazowania. W przypadku próbek przyklejonych tkankę usuwa się, przesuwając ostrze żyletki między klejem a szalką Petriego pod kątem nie większym niż 30 stopni. Próbki przechowywane przez nas w BABB przez okres do 1 roku nie wykazywały widocznej degradacji.</li>
</ol>
3. Reprezentatywne wyniki
Przedstawione tutaj reprezentatywne obrazy i filmy demonstrują możliwości wysokorozdzielczego obrazowania wielofotonowego, które stało się możliwe dzięki optycznemu utrudnianiu (optical clearing). Obrazowanie całego mózgu pozwala na wyraźną wizualizację neuronów znakowanych YFP w różnych warstwach hipokampa i kory na głębokości do 2 mm poniżej powierzchni tkanki. Rycina 1 przedstawia reprezentatywny obraz przekroju czołowego odpowiadający cechom anatomicznym hipokampa w odległości 2,92 mm ku dołowi od bregmy7. Głębokość obrazowania w próbce wynosiła 1,94 mm. Część tej różnicy wynikała z usunięcia móżdżku z tylnego końca mózgu, a pozostała część ze skurczenia się tkanki w procesie odwodnienia. Inny obraz z serii pokazuje neurony piramidowe warstwy V/VI neocortex ekspresujące YFP 2 mm poniżej powierzchni tkanki (Rycina 2). Wszystkie obrazy zostały pozyskane przy użyciu obiektywu Nikon 5X, a powiększenie uzyskano dzięki funkcji cyfrowego zoomu podczas akwizycji obrazu w oprogramowaniu ScanImage.
Po powiększeniu obrazu neocortex, poszczególne aksony i ciała komórkowe neuronów piramidowych w warstwie V neocortex są wyraźnie rozróżnialne na głębokości do 1,02 mm pod powierzchnią tkanki (Rysunek 3). Wykorzystując stos obrazów z Rysunku 3, za pomocą oprogramowania ImageJ8 wykonano rekonstrukcję 3D obszaru neuronów (Rysunek 4).
Wysoka rozdzielczość MPM pozwala nam również na prezentację obrazów całych, pojedynczych neuronów. Przedstawiamy tutaj rekonstrukcję neuronu piramidalnego warstwy V neocortex, w której wyraźnie widoczne są pojedyncze wypustki dendrytyczne (Rysunek 5).
<img alt="Obraz mikroskopowy obszaru hipokampa z zaznaczonymi obszarami CA1, CA3 i DG wraz z opisanymi warstwami." src="/files/ftp_upload/3848/3848fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny obraz z zestawu obrazów o grubości 1,2 mm (0,8 - 2 mm poniżej powierzchni tkanki) całego mózgu myszy, przedstawiający neocortex oraz różne warstwy hipokampa. Cechy hipokampa są widoczne 1,1 mm poniżej powierzchni tkanki i zostały oznaczone zgodnie z następującym kodem: DG = zakręt zębaty, GrDG = warstwa ziarnista DG, Lmol = warstwa lacunosum moleculare, Mol = warstwa molekularna DG, Or = warstwa oriens, PoDG = warstwa polimorficzna DG, Py = warstwa komórek piramidowych, Rad = stratum radiatum.7 Rozmiar obrazu wynosi 1,8 x 1,8 mm, pasek skali = 200 μm. Przedni koniec mózgu przymocowano do szalki Petriego, tak aby koniec tylny był skierowany w górę w stronę obiektywu. Ułatwiło to obrazowanie w płaszczyźnie czołowej.
<img alt="Mikroskopia; analiza obrazu; wysoka rozdzielczość; struktura komórkowa; system mikroskopii fluorescencyjnej." src="/files/ftp_upload/3848/3848fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Reprezentatywna klatka z zestawu obrazów o grubości 1.2 mm (0.8 - 2 mm poniżej powierzchni tkanki) całego mózgu myszy, z zaznaczonym neokorteksem. Komórki piramidalne oraz wypustki wykazujące ekspresję YFP w warstwie V/VI kory są widoczne 2 mm poniżej powierzchni tkanki. Stopień znakowania jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami dotyczącymi rzadkiego znakowania w neokorteksie.9 Wstawka (po prawej) stanowi powiększenie obszaru zaznaczonego ramką po lewej. Rozmiar obrazu wynosi 1.8 x 1.8 mm, pasek skali = 200 μm (50 μm we wstawce).
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna neuronów; podkreślenie struktury komórkowej; eksperyment w obrazowaniu neuronowym." src="/files/ftp_upload/3848/3848fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywna klatka pobrana z głębokości 774 μm poniżej powierzchni tkanki z serii obrazów neuronów piramidowych warstwy V w neocortex mózgu. Seria obejmuje zakres od 700 μm do 1,020 μm poniżej powierzchni tkanki. W celu uchwycenia szczegółów, takich jak cienkie wypustki, zastosowano 8-krotny zoom cyfrowy. Rozmiar obrazu wynosi 225 x 225 μm, pasek skali = 20 μm.
<img alt="Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego komórek neuronalnych; użyty do analizy aktywności neuronalnej." src="/files/ftp_upload/3848/3848fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Reprezentatywny obraz rekonstrukcji 3D (225 x 225 x 320 μm) stosu obrazów przedstawionego na Rysunku 3. Rozmiar obrazu wynosi 225 x 225 μm, pasek skali = 28 μm.
<img alt="Schemat sieci neuronowej, obraz mikroskopowy, wizualizacja neuronu, śledzenie ścieżek aksonalnych." src="/files/ftp_upload/3848/3848fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Zrekonstruowany obraz o wysokiej rozdzielczości neuronu piramidalnego warstwy V neokory z zastosowaniem 10-krotnego powiększenia cyfrowego. Neuron ma długość 485 μm, pasek skali = 25 μm. Pole widzenia dla każdego kafelka obrazu wynosi 180 μm x 180 μm. Każdy kafel znajduje się na innej głębokości (poziomie z). Apikalne dendryty korowe zazwyczaj nie wykazują tak silnej ekspresji YFP jak soma. Aby uzyskać oba te elementy w tym samym polu widzenia, jak pokazano tutaj, obniżono moc, aby zminimalizować nasycenie somy; sprawia to, że cienkie wypustki wydają się ciemniejsze. Naszym celem było tutaj zademonstrowanie pola widzenia, a nie drobnych detali. Aby ujawnić szczegóły, należy zastosować powiększenie cyfrowe, skupić się na obszarze bez somy i zwiększyć moc lasera.

<ol><li>Parra, S. G., Chia, T. H., Zinter, J. P., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+microscopy+of+cleared+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Multiphoton microscopy of cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 15, 036017(2010).</li>
<li>Vesuna, S., Torres, R., Levene, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphoton+fluorescence%2C+second+harmonic+generation%2C+and+fluorescence+lifetime+imaging+of+whole+cleared+mouse+organs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Multiphoton fluorescence, second harmonic generation, and fluorescence lifetime imaging of whole cleared mouse organs.</a> J. Biomed. Opt. 16, 106009(2011).</li>
<li>Zucker, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+insect+and+mammalian+embryo+imaging+with+confocal+microscopy%3A+Morphology+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Whole insect and mammalian embryo imaging with confocal microscopy: Morphology and apoptosis.</a> Cytometry. A69, 1143-1152 (2006).</li>
<li>Sakhalkar, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+in+bulk+tissue+specimens+using+optical+emission+tomography%3A+Fluorescence+preservation+during+optical+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional imaging in bulk tissue specimens using optical emission tomography: Fluorescence preservation during optical clearing.</a> Phys. Med. Biol. 52, 2035-2054 (2007).</li>
<li>Dazai, J., Spring, S., Cahill, L. S., Henkelman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple-mouse+Neuroanatomical+Magnetic+Resonance+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging.</a> J. Vis. Exp. (48), e2497(2011).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Eng.+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.</a> Biomed. Eng. Online. 2, (2003).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , 2nd Ed, Elsevier Science. San Diego, CA, USA. (2001).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Feng, G., Mellor, R. H., Bernstein, M., Keller-Peck, C., Nguyen, Q. T., Wallace, M., Nerbonne, J. M., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Neuronal+Subsets+in+Transgenic+Mice+Expressing+Multiple+Spectral+Variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging Neuronal Subsets in Transgenic Mice Expressing Multiple Spectral Variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Hama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%3A+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neuro. 14, 1481-1488 (2011).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Institutional Animal Care &amp; Use Committee Uniwersytetu Yale.

Podczas gdy standardowe barwniki organiczne są kompatybilne z szeregiem rozpuszczalników organicznych i w związku z tym nie stanowią szczególnego problemu dla protokołów klarowania, białka fluorescencyjne są często mniej tolerancyjne na zmiany rozpuszczalnika.4 Celem niniejszej pracy było przełamanie poważnego ograniczenia poprzednich protokołów klarowania optycznego, w których fluorescencja białek XFP była tracona lub silnie degradowana. Przedstawione tutaj obrazy wykazują, że zachowano fluorescencję YFP. Opi...

<table><tbody><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>D8537</td><td>500 ml, pH 7.2</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>10 x 10 ml, 16% paraformaldehydu</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00515-00500</td><td>500 ml, 200 proof</td></tr><tr><td>Alkohol etylowy</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>111000190</td><td>1 gal., 190 proof</td></tr><tr><td>Alkohol benzylowy</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>402834</td><td>500 ml, 99+%</td></tr><tr><td>Benzozan benzylu</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td>B6630-IL</td><td>500 ml, &amp;#8805; 99%</td></tr><tr><td>Obiektyw 5X/0,5 NA</td><td>Nikon</td><td>AZ Plan Flour 5X</td><td>15 WD</td></tr></tbody></table>

mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją yfp

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Mikroskopia wielofotonowa autofluorescencji oraz generacji drugiej harmonicznej (SHG) całych narządów myszy jest możliwa dzięki optycznemu przejrzyszczaniu narządu przed obrazowaniem.1,2 Jednak w przypadku narządów zawierających białka fluorescencyjne, takie jak GFP i YFP, protokoły optycznego przejrzyszczania wykorzystujące odwodnienie metanolem i przejrzyszczanie za pomocą alkoholu benzylowego i benzożanu benzylu (BABB) bez ochrony przed światłem3 nie zachowują sygnału fluorescencyjnego. Przedstawiony tutaj protokół stanowi nową metodę optycznego przejrzyszczania całego mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencyjnego YFP ekspresowanego w neuronach. Stwierdzono, że zmiana protokołu optycznego przejrzyszczania w taki sposób, aby narząd był odwadniany przy użyciu serii roztworów etanolu o rosnącym stężeniu, zmniejsza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i pozwala zachować ich sygnał fluorescencyjny do obrazowania wielofotonowego.4 Stosując zoptymalizowaną metodę optycznego przejrzyszczania z odwodnieniem na bazie etanolu i przejrzyszczaniem za pomocą BABB z osłoną przed światłem, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe ekspresji żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) w neuronach mózgu myszy na głębokości ponad 2 mm poniżej powierzchni tkanki.

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu klarowaniu organu przed obrazowaniem, jednak nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę klarowania optycznego z dehydratacją opartą na etanolu oraz klarowaniem za pomocą mieszaniny alkoholu benzylowego i benzojanu benzylowego, prezentujemy wysokorozdzielcze obrazy wielofotonowe całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Mikroskopia wielofotonowa w zakresie fluorescencji wewnętrznej oraz generacji drugiej harmonicznej (SHG) całych organów myszy jest możliwa dzięki optycznemu wyjaśnianiu...

Mikroskopia wielofotonowa utrwalonych tkanek jest zazwyczaj ograniczona do niewielkich głębokości penetracji, wynoszących zaledwie kilkaset mikronów. Niedawno zaprezentowaliśmy pierwsze zastosowanie mikroskopii wielofotonowej na głębokości kilku milimetrów w utrwalonych organach myszy, wykorzystując utrudnianie optyczne (optical clearing) z użyciem roztworu benzoalkoholu i benzoilo benzoesanu. W naszej wstępnej demonstracji technika ta obrazowała wrodną fluorescencję tkankową.Rośnie jednak zainteresowanie stosowaniem metod utrwalania optycznego (optical clearing) w przypadku tkanek wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak GFP. Przedstawiamy tutaj protokół wielofotonowej mikroskopii utrwalonej tkanki mózgowej z zastosowaniem tego samego roztworu alkoholu benzylowego, który zachowuje fluorescencję żółtego białka fluorescencyjnego wyrażanego przez promotor w mózgu myszy. Wysokorozdzielcze obrazowanie całych organów myszy za pomocą mikroskopii wielofotonowej jest możliwe dzięki optycznemu utrwaleniu organu przed obrazowaniem, w przeciwieństwie do obrazowania bez procesu utrwalania. Mikroskopia wielofotonowa.Obrazowanie mózgu jest ograniczone do 300 mikronów poniżej powierzchni tkanki ze względu na efekty rozpraszania światła wywołane różnicami w współczynnikach załamania wody oraz białek tworzących tkankę mózgową. Aby przełamać to ograniczenie, organ zostaje odwodniony, a woda zastąpiona płynem o współczynniku załamania zbliżonym do białek budujących tkankę. Ten proces klarowania optycznego pomaga znacznie zredukować rozpraszanie światła, co pozwala na lepsze obrazowanie głębszych warstw pod powierzchnią tkanki.Obrazy z pracy Batta i wsp. demonstrują, w jaki sposób technikę tę można zastosować do badania histologii różnych organów myszy z wykorzystaniem fluorescencji wewnętrznej oraz generowania drugiej harmonicznej. Pierwszy obraz przedstawia jądro myszy, wykonany 1,4 mm poniżej powierzchni tkanki. Wysoka rozdzielczość mikroskopii wielofotonowej pozwala na powiększenie obrazu i wyraźne zobaczenie pojedynczych komórek plemników formujących się w kanalikach nasiennych.Jak widać po prawej stronie, przedstawiamy obraz płuca myszy, który został również wykonany 1,4 mm poniżej powierzchni tkanki. Obraz ten jest demonstracją dwukanałowego obrazowania wielofotonowego, w którym komponenty elastyny są znakowane na czerwono, a kolagen na zielono; po powiększeniu poszczególne włókna są łatwo rozróżnialne. Na koniec prezentujemy obrazy o wysokiej rozdzielczości wewnętrznych obszarów mózgu myszy, wykonane 850 µm poniżej powierzchni tkanki. Dzięki powiększeniu neokory oraz hipokampa mózgu można wyraźnie zobaczyć pojedyncze astrocyty i ciała komórek neuronów.Jednakże w przypadku organów poddanych utrwalaniu optycznemu, które mogą zawierać białka fluorescencyjne, takie jak YFP, protokół utrwalania optycznego badra w ogóle nie zachowuje sygnału fluorescencji tych białek. Protokół przedstawiony w niniejszej pracy stanowi nowatorski sposób przeprowadzania utrwalania optycznego całego organu oraz obrazowania mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencji YFP i neuronów; stwierdzono, że odwodnienie mózgu przy użyciu serii roztworów etanolu o stopniowalnym stężeniu oraz utrwalanie za pomocą roztworu benzoalkoholu i benzozesorku w stosunku 1:2, znanego jako BAB, ogranicza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i pozwala zachować ich sygnał fluorescencyjny. Do obrazowania wielofotonowego myszy YFP są najpierw ważone, a następnie znieczulane poprzez dostrypanowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny.Przed przystąpieniem do operacji należy potwierdzić osiągnięcie odpowiedniego poziomu znieczulenia chirurgicznego. Co pięć minut należy sprawdzać, czy zwierzę reaguje na mocne uciśnięcie palca u nogi lub ogona. W przypadku wystąpienia reakcji konieczne jest podanie dawki uzupełniającej ketaminy i ksylazyny.Po znieczuleniu myszy unieruchamia się, przytwierdzając każdą kończynę do podłoża chirurgicznego za pomocą taśmy laboratoryjnej, tak aby zwierzę znajdowało się w pozycji grzbietnej z odsłoniętą klatką piersiową. Na początku wykonuje się nacięcie poniżej wyrostka mieczowatego, a następnie, przy użyciu nożyczek i pęsety do odciągania skóry, wykonuje się cięcie wzdłuż podstawy klatki piersiowej. Następnie wykonuje się dwa cięcia po obu stronach mostka myszy, aby stworzyć płat tkanki, który jest odsuwany od jamy klatki piersiowej za pomocą kleszczyków hemostatycznych w celu odsłonięcia serca. W kolejnym kroku do lewej komory serca wprowadza się igłę o rozmiarze 23 G, a w ścianie mięśniowej prawego przedsionka wykonuje się niewielkie nacięcie, aby umożliwić odpływ krwi. Bezpośrednio po nacięciu prawego przedsionka rozpoczyna się perfuzję roztworem PBS w temperaturze 4 °C, aż do momentu, gdy z prawego przedsionka przestanie wypływać krew.Podczas perfuzji stosuje się pompę perystaltyczną, ustawiając moc pompowania tak, aby ciecz była wyrzucana na odległość od 1,5 do 2 cali od końcówki igły. Po całkowitym odprowadzeniu krwi medium perfuzyjne zmienia się na 4% roztwór paraformaldehydu w temperaturze 4 °C, aż ciało myszy stanie się wyraźnie sztywne. Po perfuzji mysz zostaje zdjęta ze stołu operacyjnego i poddana dekapitacji, aby rozpocząć wycinanie mózgu przy użyciu pęsety i nożyczek irydowych.Czaszkę usuwa się małymi fragmentami, zaczynając od tyłu i przesuwając się do przodu. Nożyczkami wykonuje się niewielkie nacięcia co dwa do czterech milimetrów w poprzek czaszki, podczas gdy pęsetą ostrożnie oddziela się kość od mózgu w małych sekcjach; czynność tę powtarza się do momentu odsłonięcia całej górnej powierzchni mózgu. Następnie mózg wycina się z czaszki za pomocą szpatułki chirurgicznej i umieszcza w szklanej fiolce z 4% paraformaldehydem w celu utrwalenia przez sześć godzin.Choć w tej demonstracji skupiamy się przede wszystkim na obrazowaniu mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP, przeprowadzimy również optyczne klarowanie tylnej kończyny myszy oraz przekroju jelita cienkiego, aby najlepiej zaprezentować możliwości klarowania w ramach tej procedury. Po utrwalaniu wtórnym mózg oraz pozostałe tkanki płucze się dwukrotnie w PBS. Następnie próbki tkanek są odwadniane w temperaturze pokojowej poprzez serię inkubacji w etanolu o stężeniach 50%, 70%, 90% i 100% etanolu.Każda inkubacja trwa dwie godziny, po czym przeprowadzana jest druga inkubacja w 100% etanolu przez 12 godzin w celu efektywnego usunięcia wody z utrwalonej tkanki. Po odwodnieniu ostatni roztwór 100% etanolu zostaje wylany, a próbki tkanki zanurza się w roztworze etanolu i BAB w stosunku jeden do jednego na dwie godziny, przed przeniesieniem ich do 100% roztworu przejaśniającego BAB.Po umieszczeniu w BAB, mózg oraz inne próbki tkanek staną się zauważalnie przezroczyste w ciągu od czterech do pięciu godzin. Poniżej przedstawiamy nagranie poklatkowe z pierwszych sześciu godzin procesu przejrzyszczania optycznego. Przeskok oznacza moment, w którym roztwór etanolu i BAB w stosunku 1:1 został zastąpiony 100% roztworem BAB.Po sześciu godzinach wszystkie organy wykazują oznaki przejrzystości; na przykład kość w tylnej nodze myszy jest teraz wyraźnie widoczna, co świadczy o optymalnych efektach klarowania. Mózg należy pozostawić do klarowania na sześć dni w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed jasnym światłem. Po sklarowaniu mózgu, gdy jest on gotowy do obrazowania, należy go przymocować do dna szalki Petriego za pomocą akrylu Sano lub superglue.Po wyschnięciu kleju mózg zostaje zanurzony w BAB, a szalka Petriego jest umieszczana pod obiektywem w celu wykonania obrazowania. Do obrazowania wykorzystujemy mikroskop wielofotonowy wyposażony w tytanowy laser szafirowy MI tie, z regulowaną długością fali wzbudzenia w zakresie od 710 do 990 nanometrów. Długość fali wzbudzenia używana do generowania sygnałów YFP wynosi 886 nanometrów.Refleksyjny sygnał fluorescencyjny jest następnie rejestrowany przy użyciu obiektywu NIK icon 5x, który umożliwia obrazowanie w szerokim polu widzenia. Refleksyjny sygnał fluorescencyjny jest filtrowany za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 5 35 50 i zbierany przez detektor o wysokiej wydajności kwantowej. Obrazy z mnożnika fotonów OMA Matsu są przetwarzane za pomocą oprogramowania Scan Image w rozdzielczości 2048 na 2048 pikseli, przy szybkości skanowania 2 ms na linię, w celu wygenerowania wysokorozdzielczych obrazów YFP.Po zakończeniu obrazowania mózg zostaje usunięty z naczynia P dwa, umieszczony w BAB i chroniony przed światłem w celu przyszłego obrazowania. Przedstawione tutaj reprezentatywne obrazy i filmy demonstrują wysoką rozdzielczość obrazowania wielofotonowego, która jest możliwa dzięki przejrzystości optycznej. Obrazowanie całego mózgu pozwala na wyraźne uwidocznienie neuronów znakowanych YFP w różnych warstwach hipokampa i neocortex na głębokości do dwóch milimetrów pod powierzchnią tkanki.W niniejszym materiale prezentujemy wideo stosu obrazów o grubości 1,2 milimetra z całego preparatu, wykonanych w głębokości od 0,8 do 2 milimetrów w głąb mózgu, aby ukazać różne warstwy anatomiczne hipokampu. Poniższy obraz jest reprezentatywnym przekrojem koronowym o grubości 1,94 milimetra w płaszczyźnie Bergmana, pobranym ze stosu obrazów o głębokości 2 milimetrów, na którym oznakowano poszczególne warstwy hipokampu. Po powiększeniu neocortexu wyraźnie widoczne są poszczególne aksony oraz ciała komórkowe neuronów warstwy V neocortexu, aż do 1,02 milimetra poniżej powierzchni tkanki.Poniżej przedstawiamy stos obrazów neuronów warstwy piątej, pobranych z głębokości od 700 do 1020 mikronów pod powierzchnią tkanki. Następnie zaprezentowano reprezentatywny obraz z tego stosu, wykonany na głębokości 774 mikronów w głąb mózgu. Wykorzystując ten sam stos obrazów, przy użyciu oprogramowania Image J wykonano rekonstrukcję 3D obszaru neuronów.Wysoka rozdzielczość mikroskopii wielobotowej pozwala nam również na prezentację obrazów całych, pojedynczych neuronów. Tutaj przedstawiamy rekonstrukcję neuronu warstwy piątej neocortex, w której wyraźnie widoczne są procesy genetyczne D. To kończy naszą prezentację przejrzystości optycznej całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.Wykonanie tej techniki jest stosunkowo proste i, jak pokazaliśmy, może być wykorzystane do obserwacji i obrazowania wielu różnych obszarów oraz struktur mózgu myszy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia.

multiphoton-microscopy-of-cleared-mouse-brain-expressing-yfp

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Mikroskopia wielofotonowa przejrzystego mózgu myszy ekspresującego YFP

Opracowaliśmy nową technikę kwantyfikacji zmian receptorów nikotynowych acetylocholiny w obrębie regionów podkomórkowych specyficznych podtypów neuronów OUN, aby lepiej zrozumieć mechanizmy uzależnienia od nikotyny, wykorzystując kombinację podejść, w tym znakowanie receptora białkiem fluorescencyjnym metodą knock-in oraz spektralną mikroskopię konfokalną.

Spektralne obrazowanie konfokalne nikotynowych receptorów znakowanych fluorescencyjnie u myszy typu knock-in z przewlekłą podażą nikotyny

Przedstawiamy metodę tworzenia okna obrazującego w czaszce myszy, które obejmuje obszar o wielkości kilku milimetrów i pozostaje stabilne przez wiele miesięcy bez wywoływania stanu zapalnego mózgu. Metoda ta jest odpowiednia do podłużnych badań przepływu krwi, dynamiki komórkowej oraz struktury komórkowej i naczyniowej z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.

Polerowane i wzmocnione okno z cienkiej czaszki do długoterminowego obrazowania mózgu myszy

Źródło: Etienne, F.  i wsp. Dwufotonowe obrazowanie przyciągania procesów mikroglejowych do ATP lub serotoniny w ostrych wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do badania przyciągania procesów mikroglejowych w kierunku wstrzykniętego związku w wycinkach mózgu. Zawiera przegląd przygotowywania wycinków mózgu myszy, wstrzykiwania związku testowego chemoatraktantu i obrazowania znakowanego fluorescencyjnie mikrogleju w celu wizualizacji ich...

Mikroskopia dwufotonowa do badania przyciągania procesów mikrogleju w kierunku związku w wycinku mózgu myszy

Źródło: Pekarek, B. T., et. al., Obrazowanie i kwantyfikacja nienaruszonych dendrytów neuronalnych za pomocą oczyszczania tkanek CLARITY. J. Vis. Exp. (2021)W tym filmie pokazujemy przygotowanie, obrazowanie i analizę oczyszczonego mózgu myszy w celu zbadania dendrytycznych altan dendrytycznych, morfologii kręgosłupa i rozmieszczenia neuronów przy użyciu mikroskopii konfokalnej i technik rekonstrukcji 3D.

Obrazowanie mikroskopem konfokalnym nienaruszonych altan dendrytycznych i morfologii kręgosłupa w oczyszczonym mózgu myszy

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Ostra uraz mózgu to poważny uraz, który do tej pory nie doczekał się odpowiedniego leczenia. Mikroskopia wielofotonowa pozwala na badanie podłużne procesu rozwoju ostrego urazu mózgu i sondowanie strategii terapeutycznych u gryzoni. W protokole przedstawiono dwa modele ostrego urazu mózgu badane za pomocą dwufotonowego obrazowania mózgu in vivo.

Ostry uraz mózgu u myszy, po którym następuje podłużne obrazowanie dwufotonowe

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Techniki optycznego oczyszczania rewolucjonizują sposób wizualizacji tkanek. W tym raporcie opisujemy modyfikacje oryginalnego protokołu CLARITY (Clear, Lipid-exchanged, Engineerized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel), który zapewnia bardziej spójne i tańsze wyniki.

Optyczne oczyszczanie ośrodkowego układu nerwowego myszy za pomocą pasywnego CLARITY

Ten protokół opisuje technikę przewlekłego wszczepiania okien czaszkowych, która może być używana do podłużnego obrazowania struktur nerwowo-glejowo-naczyniowych, interakcji i funkcji zarówno w zdrowych, jak i chorych warunkach. Służy jako alternatywa uzupełniająca dla metody obrazowania przezczaszkowego, która, choć często preferowana, ma pewne krytyczne ograniczenia.

Precyzyjne mapowanie mózgu w celu wykonywania powtarzalnych obrazowań in vivo dynamiki neuroimmunologicznej u myszy

Protokół dostarcza szczegółową metodę obrazowania neuronów w wycinku mózgu za pomocą metody oczyszczania tkanki, ScaleSF. Protokół obejmuje przygotowanie tkanki mózgowej, klarowanie tkanek, postępowanie z oczyszczonymi wycinkami oraz konfokalne obrazowanie struktur neuronalnych za pomocą laserowej mikroskopii skaningowej od poziomu mezoskopowego do mikroskopowego.

Metoda oczyszczania tkanek do obrazowania neuronów ze skal mezoskopowych do mikroskopowych

To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

Poznaj mikroskopię wielofotonową oczyszczonego mózgu myszy wyrażającego YFP. Ta metoda umożliwia uzyskanie obrazów wysokiej rozdzielczości z głębokości kilku milimetrów, zachowując fluorescencję białka.

Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Przeglądaj więcej filmów