Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu mysiego z ekspresją YFP

Mikroskopia wielofotonowa utrwalonych tkanek jest zazwyczaj ograniczona do niewielkich głębokości penetracji, wynoszących zaledwie kilkaset mikronów. Niedawno zaprezentowaliśmy pierwsze zastosowanie mikroskopii wielofotonowej na głębokości kilku milimetrów w utrwalonych organach myszy, wykorzystując utrudnianie optyczne (optical clearing) z użyciem roztworu benzoalkoholu i benzoilo benzoesanu. W naszej wstępnej demonstracji technika ta obrazowała wrodną fluorescencję tkankową.

Rośnie jednak zainteresowanie stosowaniem metod utrwalania optycznego (optical clearing) w przypadku tkanek wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak GFP. Przedstawiamy tutaj protokół wielofotonowej mikroskopii utrwalonej tkanki mózgowej z zastosowaniem tego samego roztworu alkoholu benzylowego, który zachowuje fluorescencję żółtego białka fluorescencyjnego wyrażanego przez promotor w mózgu myszy. Wysokorozdzielcze obrazowanie całych organów myszy za pomocą mikroskopii wielofotonowej jest możliwe dzięki optycznemu utrwaleniu organu przed obrazowaniem, w przeciwieństwie do obrazowania bez procesu utrwalania. Mikroskopia wielofotonowa.

Obrazowanie mózgu jest ograniczone do 300 mikronów poniżej powierzchni tkanki ze względu na efekty rozpraszania światła wywołane różnicami w współczynnikach załamania wody oraz białek tworzących tkankę mózgową. Aby przełamać to ograniczenie, organ zostaje odwodniony, a woda zastąpiona płynem o współczynniku załamania zbliżonym do białek budujących tkankę. Ten proces klarowania optycznego pomaga znacznie zredukować rozpraszanie światła, co pozwala na lepsze obrazowanie głębszych warstw pod powierzchnią tkanki.

Obrazy z pracy Batta i wsp. demonstrują, w jaki sposób technikę tę można zastosować do badania histologii różnych organów myszy z wykorzystaniem fluorescencji wewnętrznej oraz generowania drugiej harmonicznej. Pierwszy obraz przedstawia jądro myszy, wykonany 1,4 mm poniżej powierzchni tkanki. Wysoka rozdzielczość mikroskopii wielofotonowej pozwala na powiększenie obrazu i wyraźne zobaczenie pojedynczych komórek plemników formujących się w kanalikach nasiennych.

Jak widać po prawej stronie, przedstawiamy obraz płuca myszy, który został również wykonany 1,4 mm poniżej powierzchni tkanki. Obraz ten jest demonstracją dwukanałowego obrazowania wielofotonowego, w którym komponenty elastyny są znakowane na czerwono, a kolagen na zielono; po powiększeniu poszczególne włókna są łatwo rozróżnialne. Na koniec prezentujemy obrazy o wysokiej rozdzielczości wewnętrznych obszarów mózgu myszy, wykonane 850 µm poniżej powierzchni tkanki. Dzięki powiększeniu neokory oraz hipokampa mózgu można wyraźnie zobaczyć pojedyncze astrocyty i ciała komórek neuronów.

Jednakże w przypadku organów poddanych utrwalaniu optycznemu, które mogą zawierać białka fluorescencyjne, takie jak YFP, protokół utrwalania optycznego badra w ogóle nie zachowuje sygnału fluorescencji tych białek. Protokół przedstawiony w niniejszej pracy stanowi nowatorski sposób przeprowadzania utrwalania optycznego całego organu oraz obrazowania mózgu myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencji YFP i neuronów; stwierdzono, że odwodnienie mózgu przy użyciu serii roztworów etanolu o stopniowalnym stężeniu oraz utrwalanie za pomocą roztworu benzoalkoholu i benzozesorku w stosunku 1:2, znanego jako BAB, ogranicza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i pozwala zachować ich sygnał fluorescencyjny. Do obrazowania wielofotonowego myszy YFP są najpierw ważone, a następnie znieczulane poprzez dostrypanowe wstrzyknięcie ketaminy i ksylazyny.

Przed przystąpieniem do operacji należy potwierdzić osiągnięcie odpowiedniego poziomu znieczulenia chirurgicznego. Co pięć minut należy sprawdzać, czy zwierzę reaguje na mocne uciśnięcie palca u nogi lub ogona. W przypadku wystąpienia reakcji konieczne jest podanie dawki uzupełniającej ketaminy i ksylazyny.

Po znieczuleniu myszy unieruchamia się, przytwierdzając każdą kończynę do podłoża chirurgicznego za pomocą taśmy laboratoryjnej, tak aby zwierzę znajdowało się w pozycji grzbietnej z odsłoniętą klatką piersiową. Na początku wykonuje się nacięcie poniżej wyrostka mieczowatego, a następnie, przy użyciu nożyczek i pęsety do odciągania skóry, wykonuje się cięcie wzdłuż podstawy klatki piersiowej. Następnie wykonuje się dwa cięcia po obu stronach mostka myszy, aby stworzyć płat tkanki, który jest odsuwany od jamy klatki piersiowej za pomocą kleszczyków hemostatycznych w celu odsłonięcia serca. W kolejnym kroku do lewej komory serca wprowadza się igłę o rozmiarze 23 G, a w ścianie mięśniowej prawego przedsionka wykonuje się niewielkie nacięcie, aby umożliwić odpływ krwi. Bezpośrednio po nacięciu prawego przedsionka rozpoczyna się perfuzję roztworem PBS w temperaturze 4 °C, aż do momentu, gdy z prawego przedsionka przestanie wypływać krew.

Podczas perfuzji stosuje się pompę perystaltyczną, ustawiając moc pompowania tak, aby ciecz była wyrzucana na odległość od 1,5 do 2 cali od końcówki igły. Po całkowitym odprowadzeniu krwi medium perfuzyjne zmienia się na 4% roztwór paraformaldehydu w temperaturze 4 °C, aż ciało myszy stanie się wyraźnie sztywne. Po perfuzji mysz zostaje zdjęta ze stołu operacyjnego i poddana dekapitacji, aby rozpocząć wycinanie mózgu przy użyciu pęsety i nożyczek irydowych.

Czaszkę usuwa się małymi fragmentami, zaczynając od tyłu i przesuwając się do przodu. Nożyczkami wykonuje się niewielkie nacięcia co dwa do czterech milimetrów w poprzek czaszki, podczas gdy pęsetą ostrożnie oddziela się kość od mózgu w małych sekcjach; czynność tę powtarza się do momentu odsłonięcia całej górnej powierzchni mózgu. Następnie mózg wycina się z czaszki za pomocą szpatułki chirurgicznej i umieszcza w szklanej fiolce z 4% paraformaldehydem w celu utrwalenia przez sześć godzin.

Choć w tej demonstracji skupiamy się przede wszystkim na obrazowaniu mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP, przeprowadzimy również optyczne klarowanie tylnej kończyny myszy oraz przekroju jelita cienkiego, aby najlepiej zaprezentować możliwości klarowania w ramach tej procedury. Po utrwalaniu wtórnym mózg oraz pozostałe tkanki płucze się dwukrotnie w PBS. Następnie próbki tkanek są odwadniane w temperaturze pokojowej poprzez serię inkubacji w etanolu o stężeniach 50%, 70%, 90% i 100% etanolu.

Każda inkubacja trwa dwie godziny, po czym przeprowadzana jest druga inkubacja w 100% etanolu przez 12 godzin w celu efektywnego usunięcia wody z utrwalonej tkanki. Po odwodnieniu ostatni roztwór 100% etanolu zostaje wylany, a próbki tkanki zanurza się w roztworze etanolu i BAB w stosunku jeden do jednego na dwie godziny, przed przeniesieniem ich do 100% roztworu przejaśniającego BAB.

Po umieszczeniu w BAB, mózg oraz inne próbki tkanek staną się zauważalnie przezroczyste w ciągu od czterech do pięciu godzin. Poniżej przedstawiamy nagranie poklatkowe z pierwszych sześciu godzin procesu przejrzyszczania optycznego. Przeskok oznacza moment, w którym roztwór etanolu i BAB w stosunku 1:1 został zastąpiony 100% roztworem BAB.

Po sześciu godzinach wszystkie organy wykazują oznaki przejrzystości; na przykład kość w tylnej nodze myszy jest teraz wyraźnie widoczna, co świadczy o optymalnych efektach klarowania. Mózg należy pozostawić do klarowania na sześć dni w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed jasnym światłem. Po sklarowaniu mózgu, gdy jest on gotowy do obrazowania, należy go przymocować do dna szalki Petriego za pomocą akrylu Sano lub superglue.

Po wyschnięciu kleju mózg zostaje zanurzony w BAB, a szalka Petriego jest umieszczana pod obiektywem w celu wykonania obrazowania. Do obrazowania wykorzystujemy mikroskop wielofotonowy wyposażony w tytanowy laser szafirowy MI tie, z regulowaną długością fali wzbudzenia w zakresie od 710 do 990 nanometrów. Długość fali wzbudzenia używana do generowania sygnałów YFP wynosi 886 nanometrów.

Refleksyjny sygnał fluorescencyjny jest następnie rejestrowany przy użyciu obiektywu NIK icon 5x, który umożliwia obrazowanie w szerokim polu widzenia. Refleksyjny sygnał fluorescencyjny jest filtrowany za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 5 35 50 i zbierany przez detektor o wysokiej wydajności kwantowej. Obrazy z mnożnika fotonów OMA Matsu są przetwarzane za pomocą oprogramowania Scan Image w rozdzielczości 2048 na 2048 pikseli, przy szybkości skanowania 2 ms na linię, w celu wygenerowania wysokorozdzielczych obrazów YFP.

Po zakończeniu obrazowania mózg zostaje usunięty z naczynia P dwa, umieszczony w BAB i chroniony przed światłem w celu przyszłego obrazowania. Przedstawione tutaj reprezentatywne obrazy i filmy demonstrują wysoką rozdzielczość obrazowania wielofotonowego, która jest możliwa dzięki przejrzystości optycznej. Obrazowanie całego mózgu pozwala na wyraźne uwidocznienie neuronów znakowanych YFP w różnych warstwach hipokampa i neocortex na głębokości do dwóch milimetrów pod powierzchnią tkanki.

W niniejszym materiale prezentujemy wideo stosu obrazów o grubości 1,2 milimetra z całego preparatu, wykonanych w głębokości od 0,8 do 2 milimetrów w głąb mózgu, aby ukazać różne warstwy anatomiczne hipokampu. Poniższy obraz jest reprezentatywnym przekrojem koronowym o grubości 1,94 milimetra w płaszczyźnie Bergmana, pobranym ze stosu obrazów o głębokości 2 milimetrów, na którym oznakowano poszczególne warstwy hipokampu. Po powiększeniu neocortexu wyraźnie widoczne są poszczególne aksony oraz ciała komórkowe neuronów warstwy V neocortexu, aż do 1,02 milimetra poniżej powierzchni tkanki.

Poniżej przedstawiamy stos obrazów neuronów warstwy piątej, pobranych z głębokości od 700 do 1020 mikronów pod powierzchnią tkanki. Następnie zaprezentowano reprezentatywny obraz z tego stosu, wykonany na głębokości 774 mikronów w głąb mózgu. Wykorzystując ten sam stos obrazów, przy użyciu oprogramowania Image J wykonano rekonstrukcję 3D obszaru neuronów.

Wysoka rozdzielczość mikroskopii wielobotowej pozwala nam również na prezentację obrazów całych, pojedynczych neuronów. Tutaj przedstawiamy rekonstrukcję neuronu warstwy piątej neocortex, w której wyraźnie widoczne są procesy genetyczne D. To kończy naszą prezentację przejrzystości optycznej całego mózgu myszy wykazującego ekspresję YFP.

Wykonanie tej techniki jest stosunkowo proste i, jak pokazaliśmy, może być wykorzystane do obserwacji i obrazowania wielu różnych obszarów oraz struktur mózgu myszy. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia.