Mikroskopia wielofotonowa oczyszczonego mózgu myszy wyrażającego YFP

Mikroskopia wielofotonowa całych organów myszy jest możliwa poprzez optyczne oczyszczenie narządu przed obrazowaniem, ale nie wszystkie protokoły zachowują sygnał fluorescencyjny białek fluorescencyjnych. Stosując metodę oczyszczania optycznego z odwodnieniem na bazie etanolu i usuwaniem alkoholem benzylowym: benzoesan benzylu, pokazujemy wielofotonowe obrazy o wysokiej rozdzielczości całego mózgu myszy wyrażającego YFP.

Mikroskopia wielofotonowa utrwalonej tkanki jest zwykle ograniczona do płytkiej głębokości penetracji wynoszącej zaledwie kilkaset mikronów. Niedawno zademonstrowaliśmy pierwsze zastosowanie mikroskopii wielofotonowej na głębokości kilku milimetrów w nieruchomych narządach myszy przy użyciu optycznego oczyszczania roztworem alkoholu benzoalkoholowego i benzoesanu benzoilu. Nasza wstępna demonstracja, technika obrazowała wewnętrzną fluorescencję tkanek.

Rośnie jednak zainteresowanie stosowaniem metod oczyszczania optycznego z białkami fluorescencyjnymi wykazującymi ekspresję w tkankach, takich jak GFP. W tym miejscu przedstawiamy protokół mikroskopii wielofotonowej oczyszczonej tkanki mózgowej z tym samym roztworem alkoholu benzo, który zachowuje fluorescencję żółtego białka fluorescencyjnego wyrażonego przez udo. Jeden promotor w mózgu myszy Obrazowanie całych narządów myszy w wysokiej rozdzielczości przy użyciu mikroskopii wielofotonowej jest możliwe dzięki optycznemu oczyszczeniu narządu przed obrazowaniem bez oczyszczania. Wielofoton.

Obrazowanie mózgu jest ograniczone do 300 mikronów pod powierzchnią tkanki ze względu na efekty rozpraszania świateł spowodowane różnicami we współczynnikach załamania światła wody i białek tworzących tkankę mózgową. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, narząd jest odwadniany, a woda jest zastępowana płynem, który ma podobny współczynnik załamania światła jak białka tworzące tkankę. Ten proces oczyszczania optycznego pomaga znacznie zmniejszyć rozpraszanie światła, aby zapewnić lepsze obrazowanie dalej pod powierzchnią tkanki.

Obrazy wykonane przez Batta i wsp. pokazują, w jaki sposób można zastosować tę technikę do oglądania histologii różnych narządów myszy przy użyciu wewnętrznej fluorescencji i generowania drugiej harmonicznej. To pierwsze zdjęcie przedstawia jądro myszy, wykonane 1,4 milimetra pod powierzchnią tkanki. Właściwość mikroskopii wielofotonowej o wysokiej rozdzielczości pozwala nam na powiększenie i wyraźne przyjrzenie się pojedynczym plemnikom tworzącym się w kanalikach nasiennych.

Jak widać po prawej stronie, pokazujemy zdjęcie płuca myszy, które również zostało wykonane 1,4 milimetra pod powierzchnią tkanki. Ten obraz jest demonstracją dwukanałowego obrazowania wielofotonowego, w którym składniki elastyny są oznaczone na czerwono, podczas gdy kolagen jest oznaczony na zielono, powiększenie poszczególnych oli jest łatwe do odróżnienia. Na koniec pokazujemy obrazy w wysokiej rozdzielczości wewnętrznych obszarów mózgu myszy znajdujących się 850 mikronów pod powierzchnią tkanki Powiększając korę nową i hipokamp mózgu, można wyraźnie zobaczyć poszczególne astrocyty i ciała komórek neuronów.

Jednakże, gdy optycznie oczyszczone narządy, które mogą zawierać białka fluorescencyjne, takie jak YFP, protokół optycznego usuwania badra w ogóle nie zachowuje sygnału fluorescencyjnego tych fluorescencyjnych białek. Przedstawiony tutaj protokół jest nowatorskim sposobem wykonywania optycznego oczyszczania całego narządu i obrazowania skręcenia myszy przy jednoczesnym zachowaniu sygnału fluorescencyjnego YFP i neuronów odwadniających mózg za pomocą serii stopniowanej etanolu i oczyszczania roztworem benzoesanu alkoholu benzoesanego z jednego do dwóch, znanego również jako BAB, który zmniejsza uszkodzenia białek fluorescencyjnych i zachowuje ich sygnał fluorescencyjny. W przypadku obrazowania wielofotonowego myszy YFP są najpierw ważone, a następnie znieczulane dootrzewnowym wstrzyknięciem ketaminy ksylazyny.

Przed przystąpieniem do zabiegu należy potwierdzić chirurgiczną płytkę znieczulającą. Zwierzę powinno być sprawdzane co pięć minut, aby zobaczyć, czy reaguje na mocne szczypanie palca u nogi lub ogona. Jeśli zwierzę zareaguje, wymagana jest dodatkowa dawka S ketaminy ksylazyny.

Po znieczuleniu myszy pozostają, przyklejając każdą kończynę do łóżka chirurgicznego za pomocą taśmy laboratoryjnej, tak aby mysz znajdowała się w pozycji leżącej, odsłaniając klatkę piersiową do operacji Aby rozpocząć, wykonuje się nacięcie poniżej wyrostka mieczykowatego w celu wykonania nacięcia wzdłuż podstawy klatki piersiowej za pomocą nożyczek i pęsety, aby odciągnąć skórę podczas wykonywania cięcia, Następnie wykonuje się dwa nacięcia po obu stronach mostka myszy, aby utworzyć płat tkanki, który jest trzymany z dala od jamy klatki piersiowej za pomocą hemostatu, aby pozostawić odsłonięte serce. Następnie do lewej komory serca wprowadza się igłę o rozmiarze 23 i wykonuje się małe nacięcie w ścianie mięśniowej prawego przedsionka, aby umożliwić ucieczkę krwi. Natychmiast po przecięciu prawego przedsionka rozpoczyna się perfuzja soli fizjologicznej z buforem fosforanowym o czterech stopniach Celsjusza, aż do momentu, gdy krew przestanie spływać z prawego przedsionka.

Podczas perfuzji używana jest pompa episkurczowa i ustawiona na moc pompowania, która wyrzuca płyn w odległości od 1,5 do dwóch cali od końcówki igły. Po odprowadzeniu całej krwi podłoże perfuzyjne zamienia się na 4% roztwór aldehydu paraform w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż ciało myszy stanie się zauważalnie sztywne i sztywne. Po perfuzji mysz jest usuwana z łóżka chirurgicznego i dekapitacjonowana, aby rozpocząć wycinanie mózgu za pomocą kleszczy i nożyczek do tęczówki.

Czaszka jest usuwana w małych sekcjach, zaczynając od tyłu czaszki i przesuwając się do przodu. Małe nacięcia wykonuje się nożyczkami co dwa do czterech milimetrów w poprzek czaszki, podczas gdy kleszcze służą do ostrożnego odciągania kości od mózgu w małych odcinkach, odbywa się to do momentu, gdy cała górna powierzchnia mózgu zostanie odsłonięta. Mózg jest następnie wycinany z czaszki za pomocą szpatułki chirurgicznej i umieszczany w szklanej fiolce z 4% aldehydem paraformowym do utrwalenia na sześć godzin.

Podczas gdy w tej demonstracji skupiamy się przede wszystkim na obrazowaniu mózgu myszy wyrażającego YFP, będziemy również optycznie oczyszczać mysz, tylną nogę i sekcję jelita cienkiego, aby jak najlepiej pokazać możliwości oczyszczania tej procedury. Po utrwaleniu mózg i inne tkanki są dwukrotnie myte w PBS. Próbki tkanek są następnie odwadniane w temperaturze pokojowej przez serię inkubacji etanolu w stężeniach 50%, 70%, 90% i 100% etanolu.

Każda inkubacja trwa dwie godziny, a następnie sekundę. Przeprowadza się 12-godzinną inkubację 100% etanolu w celu skutecznego wydobycia wody z utrwalonej tkanki. Po odwodnieniu wylewa się ostatni 100% roztwór etanolu, a próbki tkanek zanurza się w roztworze etanolu jeden do jednego do BAB na dwie godziny przed zanurzeniem w 100% roztworze oczyszczającym BAB.

Po znalezieniu się w bab mózg i inne próbki tkanek staną się zauważalnie przezroczyste w ciągu czterech do pięciu godzin. Tutaj pokazujemy film poklatkowy z pierwszych sześciu godzin procesu oczyszczania optycznego. Skip oznacza czas, w którym roztwór jeden do jednego etanolu do BAB został zastąpiony roztworem 100% BAB.

Po upływie sześciu godzin wszystkie narządy wykazują oznaki przezroczystości, na przykład kość w tylnej nodze myszy jest teraz wyraźnie widoczna, co zapewnia najlepsze wyniki oczyszczania. Mózg należy pozostawić do oczyszczenia na sześć dni w temperaturze pokojowej, chroniąc go przed jasnym światłem. Gdy mózg zostanie oczyszczony i gotowy do obrazowania, jest on umieszczany na dnie szalki Petriego za pomocą akrylu Sano lub super kleju.

Po wyschnięciu kleju mózg wyłania się w BAB, a szalka Petriego jest umieszczana pod obiektywem do obrazowania. Do obrazowania używamy mikroskopu wielofotonowego, który zawiera laser szafirowo-tytanowy MI tie regulowany w zakresie od 710 do 990 nanometrów długości fali wzbudzenia. Długość fali wzbudzenia, której używamy do generowania sygnałów YFP, wynosi 886 nanometrów.

Odblaskowy sygnał fluorescencyjny jest następnie przechwytywany za pomocą obiektywu NIK icon five x, który pozwala na obrazowanie o dużym polu widzenia. Odbiciowy sygnał fluorescencyjny jest filtrowany za pomocą filtra pasmowego 5 35 50 i zbierany za pomocą folderu o wysokiej wydajności kwantowej. Mnożnik dwa z obrazów OMA Matsu jest przetwarzany za pomocą oprogramowania do skanowania obrazów w rozdzielczości 2048 na 2048 pikseli przy użyciu szybkości skanowania dwóch milisekund na linię w celu wygenerowania obrazów YFP o wysokiej rozdzielczości.

Po zakończeniu obrazowania mózg jest usuwany z szalki P dwa i przechowywany w BAB i osłonięty przed światłem do przyszłego obrazowania. Przedstawione tutaj reprezentatywne obrazy i filmy pokazują możliwości obrazowania wielofotonowego w wysokiej rozdzielczości, które są możliwe dzięki oczyszczaniu optycznemu. Obrazowanie całego mózgu pozwala na wyraźne widoczne neurony oznaczone YFP w różnych warstwach hipokampa i kory nowej na głębokości dwóch milimetrów pod powierzchnią tkanki.

Tutaj pokazujemy film przedstawiający 1,2-milimetrowy stos zdjęć zwichnięcia całej jamy ustnej, wykonany od 0,8 do dwóch milimetrów w głąb mózgu, aby ujawnić różne warstwy anatomiczne hipokampa. Poniżej znajduje się reprezentatywny obraz przekroju koronalnego o długości 1,94 milimetra wywołany do Bergmana, wykonany z głębokiego na dwa milimetry obrazu, na którym oznaczono różne warstwy hipokampa. Przybliżając korę nową, poszczególne aksony i ciała komórek neuronów warstwy piątej neuronów peralnych kory nowej są wyraźnie rozróżnialne do 1,02 milimetra pod powierzchnią tkanki.

Tutaj pokazujemy obraz neuronów warstwy piątej, pobrany od 700 do 1020 mikronów pod powierzchnią tkanki. Poniżej znajduje się reprezentatywny obraz z tego stosu pobrany z 774 mikronów do mózgu. Korzystając z tego samego stosu obrazów, wykonano rekonstrukcję 3D regionu neuronu za pomocą oprogramowania Image J.

Wysoka rozdzielczość mikroskopii wielobotowej pozwala nam również na prezentowanie obrazów całych pojedynczych neuronów. Tutaj pokazujemy rekonstrukcję neuronu warstwy piątej kory nowej, w której wyraźnie widoczne są procesy genetyczne D. Na tym kończymy naszą prezentację oczyszczania optycznego, całego skręcenia myszy wyrażającego YFP.

Wykonanie tej techniki jest stosunkowo proste i, jak pokazaliśmy, może być używane do oglądania i obrazowania wielu różnych regionów i struktur zwichnięcia myszy. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia.