Name: Obrazowanie w dziedzinie częstotliwości optycznej próbek do resekcji płuc ex vivo: uzyskanie obrazu jeden do jednego z korelacją histopatologiczną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Naucz się obrazowania OFDI w tkance płucnej ex vivo z dokładną korelacją histopatologiczną. Ta metoda umożliwia precyzyjne dopasowanie obrazów do preparatów histologicznych w badaniach patologii płuc.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować panu Svenowi Holderowi oraz panu Stephenowi Conleyowi za nieocenioną pomoc w niniejszym badaniu. Praca ta była częściowo finansowana przez National Institute of Heath [grant nr R00CA134920] oraz American Lung Association [grant nr RG-194681-N]. Firma NinePoint Medical Inc. sfinansowała koszty publikacji związane z niniejszym manuskryptem.

1. System obrazowania
Szczegóły techniczne OFDI zostały opisane wcześniej4-6. Obwodowe OFDI przeprowadzono przy prędkościach obrazowania od 25 do 100 klatek na sekundę oraz od 512 do 2048 profilów głębokości osiowej na obraz przekroju okrągłego. Specjalistyczne cewniki skanujące helikalnie o rozmiarze 2,4 Fr (średnica 0,8 mm) użyte w tej badaniu zostały zaprojektowane do pracy poprzez port dostępu standardowych bronchoskopów. Cewniki składały się z wewnętrznego rdzenia optycznego służącego do ogniskowania światła na ścianie oskrzeli oraz jednorazowej osłony zewnętrznej. Korpus cewnika pozostawał nieruchomy podczas obrazowania, podczas gdy rdzeń wewnętrzny był obracany z częstotliwością od 25 do 100 Hz i przesuwany z prędkością cofania od 1,25 do 5 mm/sec. Rozdzielczość osiowa systemu wynosiła 6 µm w tkance i zapewniała głębokość obrazowania wynoszącą 7,3 mm4-6. W niniejszym badaniu wykonano OFDI w oparciu o cewnik, aby odtworzyć bronchoskopowe OFDI in vivo (Rycina 1). Protokół ten można jednak zastosować również do obrazowania za pomocą optycznego systemu laboratoryjnego (Rycina 3 i 4).
2. Konfiguracja systemu obrazowania
<ol>
 <li>Włącz system obrazowania</li>
 <li>Ustaw i zarejestruj parametry obrazowania (prędkość obrotową, prędkość wycofania, częstotliwość akwizycji obrazu itp.). W przypadku systemu obrazowania OFDI zastosowanego w niniejszym badaniu, obrazy uzyskiwano przy 10-50 fps.</li>
 <li>Podłącz cewnik do złącza obrotowego i urządzenia do wycofywania.</li>
 <li>Obracaj cewnik i sprawdź jakość obrazu. W razie potrzeby dostosuj wyrównanie i przesunięcie systemu.</li>
</ol>
3. Przygotowanie tkanek
<ol>
 <li>Umieść jednorazową chłonną podkładkę na blacie i połóż na niej preparat płuca.</li>
 <li>W przypadku obrazowania chirurgicznego preparatu ex vivo pobranego od pacjenta, należy skonsultować się z oddziałem patomorfologii, aby upewnić się, że wszystkie marginesy resekcji (marginesy oskrzelowe, naczyniowe i miąższowe) zostały ocenione, udokumentowane i/lub usunięte przez patologa.</li>
 <li>Zidentyfikuj drogi oddechowe oskrzeli wchodzące do preparatu resekcyjnego w obrębie wnęki. Usuń widoczny śluz z dróg oddechowych za pomocą końcówki strzykawki. W razie potrzeby do końcówki strzykawki dołącz dłuższy odcinek plastikowej rurki, aby odessać treści z głębszych partii dróg oddechowych.</li>
 <li>Zbadaj palpacyjnie zewnętrzną powierzchnię preparatu, aby zlokalizować interesującą zmianę.</li>
 <li>Używając cienkiej metalowej sondy, ostrożnie wprowadź ją w głąb drzewa oskrzelowego, aż do obszaru w pobliżu interesującej zmiany.</li>
 <li>Otwórz drogi oddechowe wzdłuż sondy, aż zmiana stanie się widoczna lub wyczuwalna pod błoną śluzową dróg oddechowych.</li>
 <li>Ostrożnie usuń krew lub śluz z błony śluzowej dróg oddechowych nad zmianą, używając aplikatora z bawełnianym końcem.</li>
 <li>Umieść cewnik OFDI nad błoną śluzową dróg oddechowych i wykonaj obraz, aby potwierdzić, że zmiana znajduje się pod błoną śluzową, oraz aby zidentyfikować wysokiej jakości obrazowany obszar zainteresowania do korelacji histologicznej.</li>
</ol>
4. Markowanie tkanki
<ol>
 <li>Wybierz obszar zainteresowania w drogach oddechowych na podstawie wcześniejszych wyników obrazowania z kroku 3.8.</li>
 <li>Wyznacz dwa punkty na tkance wzdłuż pożądanej linii obrazowania. Punkty mogą być równoległe do osi podłużnej (Rycina 2) lub obwodowej (Rycina 3) dróg oddechowych, w zależności od pożądanych wyników. Odstępy między punktami nie powinny przekraczać 1.5 cm, aby fragment tkanki mógł zmieścić się w jednym bloku histologicznym do obróbki. Jeśli wymagana jest długość tkanki &gt; 1.5 cm, należy podzielić długość tkanki na kilka zaznaczonych tuszem obszarów zainteresowania o długości 1.5 cm, aby utworzyć wiele dopasowanych par obrazowania i histologii.</li>
 <li>Zanurz igłę z otwartym otworem o cienkim czubku (np. 25G o długości 7/8") w barwniku do znakowania tkanek (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC).</li>
 <li>Ostrożnie usuń nadmiar tuszu z zewnętrznej części igły za pomocą gazy, pozostawiając tusz do znakowania tkanek wyłącznie wewnątrz otworu igły.</li>
 <li>Nakłuj tkankę prostopadle do błony śluzowej dróg oddechowych w wybranym punkcie wzdłuż linii obrazowania.</li>
 <li>Powtórz kroki od 3.3 do 3.5 dla drugiego punktu na błonie śluzowej dróg oddechowych.</li>
 <li>Jeśli tusz rozleje się po powierzchni śluzowej z dala od miejsca nakłucia, użyj aplikatora z watcianym końcem, aby ostrożnie usunąć nadmiar tuszu.</li>
 <li>Jeśli są obecne, usuń śluz lub krew z powierzchni błony śluzowej dróg oddechowych za pomocą aplikatora z watcianym końcem.</li>
 <li>Jeśli punkty z tuszu zostały rozmieszczone obwodowo w drogach oddechowych, warto rozpiąć obie strony dróg oddechowych za pomocą szpilek, aby spłaszczyć tkankę w polu obrazowania (Rycina 3a).</li>
</ol>
5. Obrazowanie tkanki
<ol>
 <li>Umieść cewnik OFDI nad każdym znakiem z tuszu i wykonaj obrazowanie, aby upewnić się, że znaki są widoczne w OFDI. Znaki powinny pojawiać się jako ogniskowe przerwy w strukturze tkanki z silnie rozpraszającymi cząstkami powyżej oraz szybkim tłumieniem sygnału poniżej, co odpowiada cząstkom tuszu w miejscu nakłucia (Rysunek 3b, Rysunek 4a, Rysunek 4g).</li>
 <li>Jeśli znaki z tuszu nie są widoczne w OFDI, powtórz kroki od 4.3 do 4.7 dla niewidocznych znaków. Jeśli znaki z tuszu są widoczne w OFDI, przejdź do kroku 5.3.</li>
 <li>Umieść cewnik równolegle do dwóch znaków z tuszu na powierzchni śluzówki dróg oddechowych w taki sposób, aby optyka cewnika znajdowała się nad tkanką za pierwszym znakiem z tuszu (Rysunek 2b). Przymocowanie proksymalnego końca cewnika lekkim przedmiotem oraz zabezpieczenie końca dystalnego może pomóc w zmniejszeniu artefaktów ruchowych.</li>
 <li>Przystąp do wykonania skanu typu pullback w OFDI.</li>
 <li>Przeanalizuj obrazy pullback OFDI, aby upewnić się, że oba znaki z tuszu są widoczne na obrazach oraz aby sprawdzić obecność artefaktów ruchowych (Rysunek 3 i Rysunek 4). Jeśli znaki nie są widoczne, powtórz kroki od 5.1 do 5.4.</li>
</ol>
6. Pobieranie i przetwarzanie tkanek
<ol>
 <li>Nanieś zieloną kropkę z atramentu (Triangle Biomedical Sciences, Durham, NC) na tkankę błony śluzowej dróg oddechowych, aby wyznaczyć początek skanowania obrazowego, w odległości 0,3 cm od znaku atramentowego, który pojawił się jako pierwszy podczas wycofywania obrazowania (Rycina 2c).</li>
 <li>Wytnij fragment tkanki obejmujący dwa czarne znaki atramentowe oraz zielony znak atramentowy. Przytnij tkankę tak, aby mieściła się w standardowej kasecie do przetwarzania histologicznego. Jeśli cięcie świeżej tkanki jest utrudnione, można ją utrwalić przed pobraniem fragmentu do badania histologicznego.</li>
 <li>Umieść tkankę w kasecie do przetwarzania histologicznego i utrwal w 10% formalinie przez co najmniej 48 hr.</li>
 <li>Przetwórz tkankę w procesorze tkankowym, dostępnym w każdym dziale histologii.</li>
 <li>Zalewaj tkankę w parafinie w taki sposób, aby cięcia były równoległe do dwóch czarnych znaków atramentowych na powierzchni dróg oddechowych.</li>
 <li>Użyj mikrotomu tkankowego do czołowania bloku parafinowego, aż do momentu, gdy pojawi się znak atramentowy lub aż cały przekrój tkanki stanie się widoczny, zależnie od tego, co wystąpi wcześniej.</li>
 <li>Po pojawieniu się obu czarnych znaków atramentowych, wykonaj jeden przekrój o grubości 5 μm i zamocuj go na szkiełku przedmiotowym.</li>
 <li>Kontynuuj wycinanie i mocowanie przekrojów o grubości 5 μm co 50 μm, aż czarne znaki atramentowe przestaną być widoczne lub do momentu zakończenia tkanki, zależnie od tego, co wystąpi wcześniej.</li>
 <li>Zastosuj standardowe protokoły barwienia hematoksyliną i eozyną (H&amp;E) w celu zabarwienia i przykrycia szkiełek szkiełkami cover-slip.</li>
</ol>
7. Przetwarzanie obrazu
Jeśli obrazy zostały pozyskane za pomocą skanera laboratoryjnego lub innej techniki skanowania, w której oba oznaczenia tuszem były widoczne na pojedynczym obrazie przekroju poprzecznego, obraz ten można bezpośrednio skorelować z odpowiadającą mu histologią. W przypadku pozyskania zbiorów danych wolumetrycznych za pomocą cewnika do skanowania spiralnego, obrazy będą wymagały ponownej interpolacji w taki sposób, aby pojedynczy obraz 2D przeciékł oba oznaczenia tuszem w celu korelacji z histologią. Można to osiągnąć za pomocą programu ImageJ lub innego oprogramowania do przetwarzania obrazów. W niektórych przypadkach tusz może nie być łatwo widoczny, w razie czego należy zbadać sąsiednie sekcje/preparaty.

<ol><li>Jemal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J.+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J. Clin. 57, 43-66 (2007).</li>
<li>Fujimoto, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biopsy+and+imaging+using+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Optical biopsy and imaging using optical coherence tomography.</a> Nat. Med. 1, 970-972 (1995).</li>
<li>Tearney, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+endoscopic+optical+biopsy+with+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo endoscopic optical biopsy with optical coherence tomography.</a> Science. 276, 2037-2039 (1997).</li>
<li>Yun, S., Tearney, G., de Boer, J., Iftimia, N., Bouma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+optical+frequency-domain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">High-speed optical frequency-domain imaging.</a> Opt. Express. 11, 2953-2963 (2003).</li>
<li>Yun, S., Tearney, G., de Boer, J., Bouma, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removing+the+depth-degeneracy+in+optical+frequency+domain+imaging+with+frequency+shifting%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Removing the depth-degeneracy in optical frequency domain imaging with frequency shifting.</a> Opt. Express. 12, 4822-4828 (2004).</li>
<li>Yun, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+volumetric+optical+microscopy+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Comprehensive volumetric optical microscopy in vivo.</a> Nat. Med. 12, 1429-1433 (2006).</li>
<li>Tearney, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+coronary+artery+microscopy+by+intracoronary+optical+frequency+domain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22JACC+Cardiovasc.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional coronary artery microscopy by intracoronary optical frequency domain imaging.</a> JACC Cardiovasc. Imaging. 1, 752-7561 (2008).</li>
<li>Suter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+biopsy+in+the+esophagus+through+comprehensive+optical+frequency+domain+imaging+and+laser+marking%3A+a+study+in+living+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">Image-guided biopsy in the esophagus through comprehensive optical frequency domain imaging and laser marking: a study in living swine.</a> Gastrointest. Endosc. 71, 346-353 (2010).</li>
<li>Suter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+microscopy+of+the+esophagus+in+human+patients+with+optical+frequency+domain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">Comprehensive microscopy of the esophagus in human patients with optical frequency domain imaging.</a> Gastrointest. Endosc. 68, 745-753 (2008).</li>
<li>Desjardins, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angle-resolved+optical+coherence+tomography+with+sequential+angular+selectivity+for+speckle+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+express%22%5BJournal%5D)">Angle-resolved optical coherence tomography with sequential angular selectivity for speckle reduction.</a> Optics express. 15, 6200-6209 (2007).</li>
<li>Lam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+optical+coherence+tomography+imaging+of+preinvasive+bronchial+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">In vivo optical coherence tomography imaging of preinvasive bronchial lesions.</a> Clin. Cancer Res. 14, 2006-2011 (2008).</li>
<li>Michel, R. G., Kinasewitz, G. T., Fung, K. M., Keddissi, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+as+an+adjunct+to+flexible+bronchoscopy+in+the+diagnosis+of+lung+cancer%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography as an adjunct to flexible bronchoscopy in the diagnosis of lung cancer: a pilot study.</a> Chest. 138, 984-988 (2010).</li>
<li>Williamson, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+optical+coherence+tomography+to+improve+diagnostic+and+therapeutic+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Using optical coherence tomography to improve diagnostic and therapeutic bronchoscopy.</a> Chest. 136, 272-276 (2009).</li>
<li>Coxson, H. O., Lam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+the+airway+wall+using+computed+tomography+and+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of the airway wall using computed tomography and optical coherence tomography.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 6, 439-443 (2009).</li>
<li>Coxson, H. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+wall+thickness+assessed+using+computed+tomography+and+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Airway wall thickness assessed using computed tomography and optical coherence tomography.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 177, 1201-1206 (2008).</li>
<li>Hanna, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+and+3-dimensional+optical+coherence+tomographic+imaging+of+the+airway%2C+lung%2C+and+pleura%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thorac.+Cardiovasc.+Surg%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional and 3-dimensional optical coherence tomographic imaging of the airway, lung, and pleura.</a> J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 129, 615-622 (2005).</li>
<li>Quirk, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+imaging+of+lung+alveoli+with+an+optical+coherence+tomography+needle+probe%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">In situ imaging of lung alveoli with an optical coherence tomography needle probe.</a> J. Biomed. Opt. 16, 036009(2011).</li>
<li>Su, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+swept+source+optical+coherence+tomography+imaging+of+the+human+airway+using+a+microelectromechanical+system+endoscope+and+digital+signal+processor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Real-time swept source optical coherence tomography imaging of the human airway using a microelectromechanical system endoscope and digital signal processor.</a> J. Biomed. Opt. 13, 030506(2008).</li>
<li>Suter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+Comprehensive+Microscopy+Of+The+Pulmonary+Airways%3A+A+Pilot+Clinical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Real-time Comprehensive Microscopy Of The Pulmonary Airways: A Pilot Clinical Study.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 181, A5159(2010).</li>
<li>Tsuboi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+in+the+diagnosis+of+bronchial+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+Cancer%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography in the diagnosis of bronchial lesions.</a> Lung Cancer. 49, 387-394 (2005).</li>
<li>Whiteman, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%3A+real-time+imaging+of+bronchial+airways+microstructure+and+detection+of+inflammatory%2Fneoplastic+morphologic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography: real-time imaging of bronchial airways microstructure and detection of inflammatory/neoplastic morphologic changes.</a> Clin. Cancer Res. 12, 813-818 (2006).</li>
<li>Xie, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+three-dimensional+imaging+of+normal+tissue+and+tumors+in+the+rabbit+pleural+cavity+using+endoscopic+swept+source+optical+coherence+tomography+with+thoracoscopic+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">In vivo three-dimensional imaging of normal tissue and tumors in the rabbit pleural cavity using endoscopic swept source optical coherence tomography with thoracoscopic guidance.</a> J. Biomed. Opt. 14, 064045(2009).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+optical+coherence+tomography+in+delineating+airways+microstructure%3A+comparison+of+OCT+images+to+histopathological+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of optical coherence tomography in delineating airways microstructure: comparison of OCT images to histopathological sections.</a> Phys. Med. Biol. 49, 1247-1255 (2004).</li>
<li>Hariri, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+optical+frequency+domain+imaging+of+pulmonary+pathology+with+precise+correlation+to+histopathology%5BTitle%5D)+AND+%22CHEST%22%5BJournal%5D)">Volumetric optical frequency domain imaging of pulmonary pathology with precise correlation to histopathology.</a> CHEST. , In Press (2012).</li>
<li>Suter, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+biopsy+in+the+esophagus+through+comprehensive+optical+frequency+domain+imaging+and+laser+marking%3A+a+study+in+living+swine%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Image-guided biopsy in the esophagus through comprehensive optical frequency domain imaging and laser marking: a study in living swine.</a> Gastrointestinal endoscopy. 71, 346-353 (2010).</li>
<li>Chen, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+in+vivo+blood+flow+velocity+using+optical+Doppler+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+letters%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of in vivo blood flow velocity using optical Doppler tomography.</a> Optics letters. 22, 1119-1121 (1997).</li>
<li>Osiac, E., Saftoiu, A., Gheonea, D. I., Mandrila, I., Angelescu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+and+Doppler+optical+coherence+tomography+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+gastroenterology+%3A+WJG%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography and Doppler optical coherence tomography in the gastrointestinal tract.</a> World journal of gastroenterology : WJG. 17, 15-20 (2011).</li>
<li>Yang, V. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+Doppler+optical+coherence+tomography+in+the+human+GI+tract%3A+initial+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Endoscopic Doppler optical coherence tomography in the human GI tract: initial experience.</a> Gastrointestinal endoscopy. 61, 879-890 (2005).</li>
<li>Braaf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase-stabilized+optical+frequency+domain+imaging+at+1-microm+for+the+measurement+of+blood+flow+in+the+human+choroid%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Phase-stabilized optical frequency domain imaging at 1-microm for the measurement of blood flow in the human choroid.</a> Opt. Express. 19, 20886-20903 (2011).</li>
<li>Oh, W. Y., Vakoc, B. J., Shishkov, M., Tearney, G. J., Bouma, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((400+kHz+repetition+rate+wavelength-swept+laser+and+application+to+high-speed+optical+frequency+domain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">400 kHz repetition rate wavelength-swept laser and application to high-speed optical frequency domain imaging.</a> Opt. Lett. 35, 2919-2921 (2010).</li>
<li>Gora, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra+high-speed+swept+source+OCT+imaging+of+the+anterior+segment+of+human+eye+at+200+kHz+with+adjustable+imaging+range%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Express%22%5BJournal%5D)">Ultra high-speed swept source OCT imaging of the anterior segment of human eye at 200 kHz with adjustable imaging range.</a> Opt. Express. 17, 14880-14894 (2009).</li>
</ol>

Produkcja i wolny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez NinePoint Medical Inc.

Ocena wczesnych nowotworów złośliwych płuc może być niezwykle trudna ze względu na brak objawów oraz niemożność wizualizacji wczesnych zmian nowotworowych radiologicznie lub bronchoskopowo. OFDI zapewnia rozdzielczość zbliżoną do histologicznej oraz trójwymiarowe widoki mikrostruktury tkanki na dużym obszarze w czasie rzeczywistym2-6. Wykazano, że endobronchialna OFDI jest bezpieczną techniką stosowaną u pacjentów, która pozwala na uzyskanie wolumetrycznych zbiorów danych o wysokiej rozdzielczości z długich odcinków dróg oddechowych w płucach11-13 (Animacja). Jednakże w warunkach in vivo jako odpowiedniki histopatologiczne pobiera się jedynie niewielkie biopsje, które nie zapewniają wystarczających korelacji z OFDI w celu opracowania kryteriów obrazowania patologii płuc. Aby dokładnie ocenić cechy OFDI widoczne w obrazowaniu płuc, niezbędne jest uzyskanie precyzyjnie dopasowanych korelacji obrazu z histologią. Przedstawiamy prostą i skuteczną metodę precyzyjnej, jednowartościowej korelacji między OFDI a histologią zastosowaną w obrazowaniu dróg oddechowych w preparatach z resekcji płuc ex vivo , która jest możliwa do zastosowania w niemal każdym typie tkanki ex vivo . Po ustaleniu kryteriów obrazowania ex vivo z dopasowaną jednowartościową histologią, kryteria te można następnie zastosować w obrazowaniu in vivo .
Barwnik tkankowy użyty do zaznaczenia obrazowanego obszaru zainteresowania jest wyraźnie widoczny zarówno w OFDI, jak i w badaniu histologicznym. Dzięki zastosowaniu prostych technik orientacji tkanki, oznaczenia tuszem można skorelować w obrazowaniu i histologii, co pozwala na porównania jeden do jednego cech OFDI i wyników histologicznych w celu określenia identyfikowalnych charakterystyk obrazowania patologii tkanki. Technika ta jest niedroga i praktyczna, co czyni ją użyteczną w wielu zastosowaniach obrazowania optycznego.
W warunkach in vivo do orientacji tkanki można wykorzystać metody takie jak znakowanie laserowe25. Jednak mały rozmiar biopsji oskrzeli nadal stanowi czynnik ograniczający wykorzystanie badań in vivo do opracowania specyficznych kryteriów obrazowania patologii płuc. Choć badania ex vivo stanowią odpowiednią alternatywę dla obrazowania in vivo, istnieją pewne ograniczenia. Preparaty płuc ex vivo są nienapowietrzone i często wykazują atelektazę wywołaną chirurgicznie, co zmienia wygląd prawidłowych struktur pęcherzykowych. Napowietrzanie chirurgicznie wyresekcyjnej tkanki płuca wraz ze znakowaniem tkanki w celu korelacji histologicznej jest trudne technicznie, ponieważ większość chirurgicznych preparatów płuc otrzymuje się po ocenie patomorfologicznej w zamrożonym przekroju, podczas której powierzchnia opłucnej zostaje przerwana, co utrudnia napowietrzenie preparatu. Atelektaza niepatologiczna nie jest artefaktem obserwowanym w warunkach in vivo, zatem ograniczenie to nie byłoby istotne dla obrazowania płuc in vivo. Dodatkowo brak krwi w naczyniach w preparatach ex vivo może utrudniać odróżnienie struktur naczyniowych od innych struktur z brakiem sygnału. W warunkach in vivo dodanie Doppler OCT/OFDI26-28 do strukturalnego OCT/OFDI pomogłoby w identyfikacji naczyń.
Artefakty ruchowe mogą być widoczne in vivo, podczas gdy nie występują one ex vivo. Mogłoby to być potencjalnie problematyczne w standardowych systemach OCT z wolniejszą szybkością akwizycji. Jednakże szybkie częstotliwości klatek systemów OFDI wynoszą obecnie &gt; 200 fps29-31. W związku z tym nie oczekuje się, aby artefakty ruchowe stanowiły istotny problem. Poprzednie badania obrazowania OCT i OFDI in vivo wykazały pomyślną wizualizację drobnych cech obrazowania14,15,18,19.
W niniejszym badaniu zaprezentowaliśmy wolumetryczną technikę OFDI z precyzyjną korelacją do diagnozy tkankowej w celu oceny patologii płuc. Opisana procedura ma na celu dostarczenie dokładnie dopasowanych preparatów histologicznych, które będą służyć jako złoty standard dla interpretacji obrazów OFDI.
Po opracowaniu i walidacji specyficznych kryteriów obrazowania patologii płuc ex vivo przy użyciu dopasowanej w stosunku jeden do jednego histologii, kryteria te mogą zostać zastosowane w kolejnych badaniach obrazowych in vivo z wykorzystaniem biopsji oskrzelowej jako złotego standardu oceny zaobserwowanych cech obrazowych. Technika ta jest przedstawiona jako zastosowanie w przypadku preparatów z resekcji płuc, lecz może być stosowana w niemal każdym typie tkanki, aby zapewnić precyzyjną korelację obrazowania z histologią, niezbędną do określenia szczegółowych cech obrazowych tkanek prawidłowych oraz patologicznych.

<table><tbody><tr><td>Barwnik do znakowania tkanek</td><td>Triangle Biomedical</td><td>TMD-BK, TMD-G</td><td></td></tr></tbody></table>

obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Rak płuca jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami1. Raki płaskonabłonkowe i drobnokomórkowe powstają zazwyczaj w obrębie dróg oddechowych, podczas gdy gruczolakoraki lokalizują się zazwyczaj bardziej obwodowo. Wczesne wykrywanie nowotworów płuca w procesie chorobowym może być trudne ze względu na szereg ograniczeń: rozdzielczość radiologiczną, ograniczenia bronchoskopowe w ocenie tkanki pod błoną śluzową dróg oddechowych i identyfikacji wczesnych zmian patologicznych, a także niewielki rozmiar próbki i/lub niepełny pobór materiału w biopsjach histologicznych. Metody obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takie jak obrazowanie w dziedzinie częstotliwości optycznej (OFDI), zapewniają nieniszczący, trójwymiarowy wgląd w mikrostrukturę tkanek na dużym obszarze, do głębokości bliskiej 2 mm w czasie rzeczywistym (Rycina 1)2-6. OFDI wykorzystywano w wielu zastosowaniach, w tym do oceny miażdżycy tętnic wieńcowych6,7 oraz metaplazji i dysplazji jelitowej przełyku6,8-10.
Wykazano, że bronchoskopowa OCT/OFDI jest bezpiecznym narzędziem do obrazowania in vivo w celu oceny dróg oddechowych w płucach11-23 (Animacja). Metodę OCT oceniano w drogach oddechowych16,23 i miąższu płucnym17,22 w modelach zwierzęcych oraz in vivo w drogach oddechowych człowieka14,15. Obrazowanie OCT prawidłowych dróg oddechowych pozwoliło na wizualizację warstwowości dróg oddechowych oraz przylepień pęcherzykowych, a ocena zmian dysplastycznych okazała się przydatna w rozróżnianiu stopni dysplazji błony śluzowej oskrzeli11,12,20,21. Obrazowanie OFDI błony śluzowej oskrzeli zostało zaprezentowane w krótkim odcinku oskrzela (0,8 cm)18. Ponadto opisano wolumetryczne obrazowanie OFDI obejmujące wiele generacji dróg oddechowych w płucach świń i ludzi in vivo19. Endobronchialna OCT/OFDI jest zazwyczaj wykonywana przy użyciu cienkich, elastycznych cewników, które są kompatybilne ze standardowymi portami dostępowymi w bronchoskopii. Opracowano również sondy igłowe OCT i OFDI, które mogą być wykorzystywane do obrazowania obszarów płuc znajdujących się poza ścianą dróg oddechowych lub powierzchnią opłucnej17.
Mimo że OCT/OFDI zostało wykorzystane i uznane za wykonalne w obrazowaniu płuc in vivo, nie przeprowadzono żadnych badań z precyzyjnie dopasowaną korelacją jeden do jednego między OFDI a histologią. W związku z tym nie opracowano jeszcze specyficznych kryteriów obrazowania dla różnych patologii płuc. Odpowiedniki histopatologiczne uzyskane in vivo składają się jedynie z małych fragmentów biopsji, które trudno skorelować z dużymi zbiorami danych OFDI. Ponadto nie zapewniają one kompleksowej histologii niezbędnej do rejestracji z wolumetrycznym OFDI. W rezultacie w warunkach in vivo nie można opracować specyficznych cech obrazowych patologii płuc. Precyzyjnie dopasowana korelacja jeden do jednego między OFDI a histologią jest kluczowa dla dokładnej oceny cech widocznych w OFDI w odniesieniu do histologii jako złotego standardu, aby wyprowadzić specyficzne kryteria interpretacji obrazów dla nowotworów płuc i innych patologii płucnych. Po opracowaniu i walidacji specyficznych kryteriów obrazowania ex vivo z dopasowaną histologią jeden do jednego, kryteria te można zastosować w badaniach obrazowych in vivo. W niniejszej pracy przedstawiamy metodę precyzyjnej korelacji jeden do jednego między wysokorozdzielczym obrazowaniem optycznym a histologią w preparatach z resekcji płuc ex vivo. W całym manuskrypcie opisujemy techniki stosowane do dopasowania obrazów OFDI do histologii. Metoda ta nie jest jednak specyficzna dla OFDI i może być wykorzystana do uzyskania obrazów zarejestrowanych histologicznie dla dowolnej techniki obrazowania optycznego. Przeprowadziliśmy OFDI skoncentrowane na drogach oddechowych przy użyciu specjalistycznego, niestandardowego cewnika bronchoskopowego 2,4 French (średnica 0,8 mm). Próbki tkanek oznaczono barwnikiem tkankowym, widocznym zarówno w OFDI, jak i w histologii. Zastosowano staranne procedury orientacji, aby precyzyjnie skorelować miejsca obrazowania i pobierania próbek histologicznych. Techniki opisane w tym manuskrypcie zostały wykorzystane do przeprowadzenia pierwszej demonstracji wolumetrycznego OFDI z precyzyjną korelacją z diagnozą opartą na tkance w celu oceny patologii płuc24. Ta prosta i skuteczna technika może zostać rozszerzona na inne typy tkanek, aby zapewnić precyzyjną korelację obrazowania z histologią, niezbędną do określenia drobnych cech obrazowych tkanek zdrowych i chorych.

Czarne oznaczenia markerem powinny znajdować się w odległości 1 - 1,5 cm od siebie, aby wskazać obszar zainteresowania podczas obrazowania. Zielone oznaczenie markerem powinno zostać umieszczone na początku skanu obrazowania, przed pierwszym czarnym oznaczeniem, w celu zorientowania preparatu (Rysunek 2 i Rysunek 3a). Oznaczenia tkanki markerem powinny być widoczne zarówno w obrazowaniu OFDI, jak i w badaniu histologicznym (Rysunek 3 i 4). W normalnych drogach oddechowych świni (Rysunek 3) i człowieka (Rysunek 4>) powinno być widoczne typowe warstwowanie dróg oddechowych. Nabłonek (E) jest widoczny jako cienka, umiarkowanie gęsta sygnałowo, homogeniczna warstwa od strony światła dróg oddechowych. Blaszka właściwa składa się z zorganizowanej tkanki o sygnale od intensywnego do niskiego, co odpowiada różnym komponentom blaszki właściwej (LP), takim jak intensywne sygnałowo tkanki łączne, w tym elastyna i kolagen (EL), oraz słabo sygnałowa tkanka gruczołowa typu ślinowego (G). Okazyjnie widoczne są słabo sygnałowe przewody (D), które przechodzą przez nabłonek oddechowy, aby połączyć się ze światłem oskrzela. Mięśnie gładkie pojawiają się jako nieciągłe, przeplatające się pęczki mięśni gładkich i w związku z tym nie są możliwe do zidentyfikowania w OFDI. Na barwieniach H&amp;E oraz trichrome można zwizualizować warstwowanie dróg oddechowych (Rysunek 3c, 3d, 3f, 3g, 4b, 4c, 4e i 4f), gdzie w barwieniu trichrome powierzchowne gęste tkanki elastyczne i kolagenowe pojawiają się w kolorze ciemnoniebieskim, a leżące pod nimi mięśnie gładkie barwią się na czerwono (SM). Pierścienie chrzęstne (C) pojawiają się jako słabo sygnałowe struktury w kształcie półksiężyca o dobrze zdefiniowanych granicach, które nakładają się na siebie w drogach oddechowych świni i nie nakładają się w drogach oddechowych człowieka. Okrzestna otaczająca pierścienie chrzęstne pojawia się jako cienka warstwa intensywnie sygnałowej tkanki obejmująca słabo sygnałowe pierścienie chrzęstne. W obwodowych drogach oddechowych człowieka (Rysunek 4g i 4h) przyczepy pęcherzykowe (A) są widoczne jako cienkie, intensywnie sygnałowe, przypominające sieć ściany pęcherzyków z pozbawionymi sygnału przestrzeniami pęcherzykowymi. Przestrzenie naczyniowe w obrębie blaszki właściwej są widoczne jako pozbawione sygnału struktury liniowe lub okrągłe z lekkim artefaktem cieniowania pod nimi (strzałki).
<img alt="Optyczna tomografia koherentna, struktura rzęsek, metoda: analiza obrazowania, schemat." src="/files/ftp_upload/3855/3855fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. OFDI dróg oddechowych świni. In vivo obrazy uzyskane z dróg oddechowych świni podczas wentylacji mechanicznej. (a) Przekrój poprzeczny OFDI proksymalnych dróg oddechowych. (b) Przekrój poprzeczny OFDI dystalnych dróg oddechowych. (c) Przekrój podłużny OFDI proksymalnych dróg oddechowych, obraz o większym powiększeniu obszaru zaznaczonego na czerwono w panelu e. (d) Przekrój podłużny OFDI dystalnych dróg oddechowych, obraz o większym powiększeniu obszaru zaznaczonego na zielono w panelu e. (e) Przekrój podłużny OFDI dróg oddechowych od proksymalnych do dystalnych (od lewej do prawej). Średnica cewnika wynosi 0.8 mm, a znaczniki reprezentują przyrosty 0.5 mm. Chociaż w obrazach OFDI można rozpoznać różne warstwy ściany dróg oddechowych i przyczepy pęcherzykowe, trudno jest precyzyjnie zinterpretować anatomiczny odpowiednik sygnałów OFDI bez bezpośrednio zarejestrowanej histologii. e: nabłonek, lp: warstwa właściwa, sm: błona podśluzowa, c: chrząstka, a: przyczepy pęcherzykowe.
<img alt="Proces ligacji w rozwarstwień aorty; metoda chirurgiczna; sekwencja pokazująca kroki wprowadzania i połączenia." src="/files/ftp_upload/3855/3855fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Markowanie tkanek dróg oddechowych świni. (a) Otwarta droga oddechowa z dwoma czarnymi zaznaczeniami z tuszu na powierzchni luminalnej, umieszczonymi równolegle do osi podłużnej dróg oddechowych, w odległości 1,5 cm od siebie. (b) Cewnik OFDI umieszczony nad dwoma czarnymi zaznaczeniami z tuszu, aby oba znaki znalazły się w zakresie cofania (pullback) OFDI. (c) Droga oddechowa z dodatkowym zielonym zaznaczeniem z tuszu w celu zorientowania początku skanowania obrazowego na próbce.
<img alt="Optyczna tomografia koherencyjna i histologia przekrojów tkanek oka; obejmuje analizę G, E, D, EL, SM, C." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. OFDI i histologia dróg oddechowych świni wykazująca precyzyjną korelację z zastosowaniem markerów tkankowych. (a) Rozcięte drogi oddechowe z dwoma czarnymi zaznaczeniami tuszem na powierzchni światła, umieszczonymi równolegle do obwodu dróg oddechowych. Do dalszego rozwarcia dróg oddechowych użyto szpilek (strzałki). (b) OFDI dróg oddechowych świni z widocznymi oboma zaznaczeniami tuszem (gwiazdki) wraz z (c) precyzyjnie skorelowaną histologią barwioną H&amp;E (gwiazdki: widoczne czarne zaznaczenia tuszem na nabłonku oddechowym) oraz (d) skorelowanym barwieniem trichromowym. Pasek skali: 2 mm. (e) Obraz OFDI w większym powiększeniu wraz z (f) odpowiadającą histologią barwioną H&amp;E oraz (g) skorelowanym barwieniem trichromowym. E: nabłonek oddechowy, EL: gęste tkanki kolagenowe i elastyczne, SM: mięśnie gładkie, C: pierścienie chrzęstne (artefakt histologiczny spowodował sztuczne rozdzielenie pierścieni chrzęstnych), G: tkanka gruczołu ślinowego, D: przewód ślinowy wchodzący do nabłonka. Pasek skali: 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3855/3855fig3large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
<img alt="Schemat histologiczny warstw tkanki dziąsłowej; etykiety wskazujące nabłonek, tkankę łączną, analizę." fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/3855/3855fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. OFDI i histologia ludzkich dróg oddechowych wykazująca precyzyjną korelację z wykorzystaniem znakowania tkanek. (a) OFDI proksymalnych dróg oddechowych człowieka z widocznymi znacznikami tuszem (gwiazdki). (b) Precyzyjnie skorelowana histologia barwiona H&amp;E z widocznymi czarnymi znacznikami tuszem na nabłonku oddechowym (gwiazdki) oraz (c) skorelowane barwienie trichromowe. Pasek skali: 2 mm. (d) Widok obrazu OFDI przy większym powiększeniu oraz (e) odpowiadająca mu histologia barwiona H&amp;E i (f) trichromem. Pasek skali: 250 μm. E: nabłonek oddechowy, LP: błona własna, G: tkanka gruczołów ślinowych, C: pierścienie chrzęstne, PC: okostnowa. W ludzkich drogach oddechowych widoczne jest typowe warstwowanie. W luźnej tkance łącznej znajdują się rozproszone pęczki barwiących się na czerwono mięśni gładkich (SM, panele c i f), które nie tworzą ciągłego pasma i w związku z tym nie są widoczne jako odrębna warstwa w OFDI. (g) OFDI dystalnych dróg oddechowych człowieka i (h) precyzyjnie skorelowana histologia H&amp;E z widocznymi czarnymi znacznikami tuszem na nabłonku oddechowym (gwiazdki). Pasek skali: 2 mm. Przyczepy pęcherzykowe (A) są widoczne jako intensywne sygnałowo, kratkowane ściany pęcherzyków z pozbawionymi sygnału przestrzeniami pęcherzykowymi. Przestrzenie naczyniowe w obrębie błony własnej są również widoczne jako struktury pozbawione sygnału z towarzyszącym lekkim zacienieniem (strzałki).

Opisano metodę obrazowania preparatów z resekcji płuc ex vivo za pomocą obrazowania w dziedzinie częstotliwości optycznych (OFDI) oraz uzyskiwania precyzyjnej korelacji z histologią, co jest niezbędne do opracowania specyficznych kryteriów interpretacji OFDI w patologii płuc. Metoda ta może być zastosowana w przypadku innych typów tkanek i technik obrazowania w celu uzyskania precyzyjnej korelacji obrazowania z histologią dla dokładnej interpretacji i oceny obrazów. Kryteria obrazowania ustanowione za pomocą tej techniki mogłyby następnie znaleźć zastosowanie w ocenie obrazów w przyszłych badaniach in vivo.

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Rak płuca jest główną przyczyną zgonów związanych z nowotworami1. Raki płaskonabłonkowe i raki drobnokomórkowe zazwyczaj powstają w związku z drogami przewodzącymi...

Badanie endobronchialne, OCT lub OFDI, wykonuje się przy użyciu cienkich elastycznych cewników, które są kompatybilne ze standardowymi portami dostępu bronchoskopowego. Bronchoskop jest wprowadzany w obrębie drzewa tchawkowo-bronchialnego do docelowych dróg oddechowych. Następnie cewnik OFDI zostaje wprowadzony do dróg oddechowych przez kanał roboczy bronchoskopu w celu wykonania obrazowania.Wewnętrzny rdzeń optyczny cewnika OFDI jest obracany i jednocześnie wycofywany z zewnętrznej przezroczystej osłonki w celu wygenerowania trójwymiarowych danych OFDI. Laboratorium Sudora w Massachusetts General Hospital opracowało cewnik OFDI oparty na igle, który jest kompatybilny ze standardowymi igłami do biopsji transbronchialnej rutynowo stosowanymi do pobierania próbek z guzów obwodowych. Bronchoskop jest wprowadzany do dróg oddechowych aż do docelowego guza.Po bezpiecznym cofnięciu cewnika OFDI do igły transbronchialnej, igłę wprowadza się do masy guza. Następnie igłę wycofuje się, pozostawiając cewnik OFDI w miejscu. Podobnie jak w przypadku endobronchialnego OFDI, wewnętrzny rdzeń optyczny cewnika do transbronchialnego OFDI jest obracany i jednocześnie cofany wewnątrz zewnętrznej przezroczystej osłony w celu wygenerowania trójwymiarowego obrazu OFDI.Dane histopatologiczne uzyskane in vivo składają się z niewielkich fragmentów biopsji, które są trudne do powiązania z dużymi zestawami danych OFDI. W konsekwencji, w warunkach in vivo nie można łatwo opracować specyficznych cech obrazowania patologii płuc. Ogólnym celem niniejszego protokołu jest uzyskanie precyzyjnych, jednowartościowych korelacji między OFDI a histologią w tkance ex vivo, co jest niezbędne do dokładnej oceny cech widocznych w OFDI w odniesieniu do histologii jako złotego standardu.Po opracowaniu i walidacji ex vivo specyficznych kryteriów obrazowania przy użyciu dopasowanej histologii jeden do jednego, kryteria te można zastosować w badaniach obrazowych in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej korelacji obrazowania z histologią, co usprawnia interpretację cech obrazu. Aby przygotować system obrazowania w optycznej dziedzinie częstotliwości (OFDI) do eksperymentu, należy najpierw włączyć system obrazowania, a następnie ustawić i zapisać odpowiednie parametry obrazowania.Podłącz cewnik do przegubu obrotowego i urządzenia do wycofywania. Ten cewnik wykonany na zamówienie ma średnicę 0,8 milimetra. Obracaj cewnikiem i sprawdź jakość obrazu, używając opuszki palca w rękawiczce, aby upewnić się, że obraz jest ostry, a stosunek sygnału do szumu jest odpowiedni.Aby rozpocząć procedurę przygotowania tkanki, należy położyć na blacie jednorazową chłonną podkładkę i umieścić na niej preparat płuca. Ze względu na trudności z harmonogramem pozyskiwania tkanek od pacjentów, w tej demonstracji wideo zostanie wykorzystana tkanka świńska.Zidentyfikuj oskrzele wchodzące do preparatu resekcyjnego w obrębie wnęki. Używając końcówki strzykawki, usuń widoczny śluz z wnętrza dróg oddechowych. Palpuj zewnętrzną powierzchnię preparatu, aby zlokalizować drogi oddechowe lub poszukiwaną zmianę.Otwórz drogi oddechowe wzdłuż sondy, aż do momentu, gdy zmiana zainteresowania stanie się widoczna lub wyczuwalna pod śluzówką dróg oddechowych przy użyciu aplikatora z bawełnianym końcem. Ostrożnie usuń krew lub śluz ze śluzówki dróg oddechowych pokrywającej zmianę. Umieść cewnik OFDI nad śluzówką dróg oddechowych i wykonaj obrazowanie.Służy to potwierdzeniu, że zmiana znajduje się pod śluzówką dróg oddechowych, oraz identyfikacji wysokiej jakości obszaru obrazowania (region of interest) do korelacji histologicznej. Po wybraniu obszaru zainteresowania w drogach oddechowych, należy zaznaczyć dwa punkty na tkance wzdłuż pożądanej linii obrazowania. W tym przykładzie punkty zostaną wyznaczone równolegle do osi podłużnej dróg oddechowych.Uwidocznienie znaczników z tuszu zarówno w OFDI, jak i w badaniu histologicznym może być trudne, dlatego stosujemy zarówno nacięcia igłą, jak i tusz, aby oznaczenia były widoczne w obu technikach. Po wybraniu dwóch punktów, zanurz igłę z otwartym światłem i cienką końcówką w barwniku do znakowania tkanek, a następnie ostrożnie usuń nadmiar tuszu z zewnętrznej strony igły za pomocą gazy, pozostawiając tusz do znakowania tkanek jedynie wewnątrz światła igły. Nakłuj tkankę prostopadle do błony śluzowej dróg oddechowych w wybranym punkcie wzdłuż linii obrazowania. W ten sam sposób zaznacz drugi punkt na błonie śluzowej dróg oddechowych, upewniając się, że drugi punkt znajduje się nie dalej niż 1.5 centymetrów od pierwszego punktu.Jeśli tusz rozleje się po powierzchni śluzówki z dala od miejsca nakłucia, należy użyć aplikatora z bawełnianą końcówką, aby ostrożnie usunąć nadmiar tuszu. W zależności od pożądanych rezultatów, dwa punkty można również wyznaczyć równolegle do obwodu dróg oddechowych, jak pokazano tutaj. Aby obrazować tkankę, należy umieścić cewnik OFDI nad każdym znakiem z tuszu i wykonać obrazowanie, aby upewnić się, że oznaczenia są widoczne w OFDI.Znaki powinny przejawiać się jako ogniskowe przerwania w strukturze tkanki z nakładającymi się silnie rozpraszającymi cząsteczkami i gwałtownym tłumieniem sygnału poniżej, co odpowiada cząsteczkom tuszu w miejscu nakłucia. Na tym obrazie OFDI dróg oddechowych świni oba znaki tuszem są zaznaczone gwiazdką. Umieść cewnik równolegle do dwóch znaków tuszem na powierzchni śluzowej dróg oddechowych w taki sposób, aby optyka cewnika znajdowała się nad tkanką poza pierwszym znakiem tuszem.Przejdź do wykonania skanu cofającego OFDI; przejrzyj obrazy z cofania OFDI, aby upewnić się, że oba znaczniki z tuszu są widoczne na obrazowaniu oraz aby sprawdzić obecność artefaktów ruchowych przed pobraniem tkanki. Nanieś zieloną kropkę z tuszu na tkankę błony śluzowej dróg oddechowych w odległości 0,3 centymetra od znacznika z tuszu, który pojawił się jako pierwszy podczas skanu cofającego. Służy to do zorientowania początku skanu obrazowania.Następnie należy usunąć fragment tkanki obejmujący dwa czarne i jeden zielony znak z tuszu. Przytnąć tkankę tak, aby mieściła się w standardowej kasecie do obróbki histologicznej. Umieścić tkankę w kasecie do obróbki histologicznej i utrwalić w 10% formalinie przez co najmniej 48 godzin.Następnie tkankę poddaje się obróbce zgodnie z opisem w tekście protokołu. Reprezentatywny wynik OFDI przedstawiają poniższe obrazy in vivo uzyskane z dróg oddechowych świni poddaną wentylacji mechanicznej. Panel A przedstawia przekrój poprzeczny OFDI proksymalnych dróg oddechowych, a panel B przekrój poprzeczny OFDI dystalnych dróg oddechowych.Panel E przedstawia przekrój podłużny dróg oddechowych wykonany metodą OFDI, od części proksymalnej po lewej do dystalnej po prawej stronie; panel C stanowi powiększenie obszaru wyróżnionego na czerwono z panelu E. Panel D jest obrazem o większym powiększeniu obszaru wyróżnionego na zielono z panelu E. Średnica cewnika wynosi 0,8 mm, a znaczniki reprezentują przyrosty co 0,5 mm. Chociaż na obrazach OFDI można rozróżnić poszczególne warstwy ściany dróg oddechowych oraz przyczepy pęcherzykowe, trudna jest precyzyjna interpretacja anatomicznego odpowiednika sygnałów OFDI bez bezpośrednio zarejestrowanej histologii. E oznacza nabłonek, lp – warstwę właściwą, SM – błonę podśluzową, C – chrząstkę oraz a – przyczepy pęcherzykowe.Stosując zaprezentowany tutaj protokół, uzyskano precyzyjną korelację między OFDI a histologią. Ten obraz OFDI dróg oddechowych świni wykazuje dokładną korelację z histologią przekrojów tkankowych barwionych H i E. Gwiazdki wskazują ślady czarnego tuszu widoczne na nabłonku oddechowym.Warstwy dróg oddechowych można zwizualizować na barwieniach H&amp;E oraz Tri-RME. Przedstawiono tutaj powiększony widok obrazu OFDI wraz z odpowiadającą mu histologią barwioną H&amp;E i Tri-RME: E oznacza nabłonek oddechowy, el gęstą tkankę kolagenową i elastynową, SM mięśnie gładkie, C pierścienie chrzęstne, G tkankę gruczołu ślinowego oraz D przewód ślinowy wchodzący w nabłonek. Mięśnie gładkie pojawiają się jako przerywane, przeplatające się pasma i tym samym nie są identyfikowalne w OFDI.Podobnie, dzięki zastosowaniu markerów tkankowych wykazano precyzyjną korelację między OFDI a histologią w ludzkich drogach oddechowych. Na tym obrazie OFDI proksymalnych dróg oddechowych człowieka widoczne są oba znaczniki z tuszu, oznaczone gwiazdkami. W barwieniu h i e występuje precyzyjna korelacja z histologią przekrojów tkankowych barwionych h i e oraz trichrome.Czarne oznaczenia tuszem są widoczne na nabłonku oddechowym wskazanym gwiazdką w obrazach OFDI o większym powiększeniu oraz na odpowiadających im przekrojach histologicznych. W obrazach wstawkowych przedstawiono barwienie H&amp;E oraz trichrome. E oznacza nabłonek oddechowy, lp – błonę właściwą, G – tkankę gruczołów ślinowych, C – pierścienie chrzęstne oraz pc – okołochrzęstkę w ludzkich drogach oddechowych.Widoczne jest typowe warstwowanie. W luźnej tkance łącznej przeplatają się pasma czerwono barwionych mięśni gładkich, pokazane na panelach C i F, które nie tworzą ciągłego pasma i nie są zatem widoczne jako odrębna warstwa w OFDI. Te dwa obrazy przedstawiają wyniki OFDI dystalnych dróg oddechowych człowieka oraz precyzyjnie skorelowaną histologię h i d.Czarny atrament widoczny na nabłonku oddechowym jest oznaczony gwiazdką, a przyczepy pęcherzykowe oznaczone literą a są widoczne jako intensywne sygnałowo, kratkowate ściany pęcherzyków z obszarami pęcherzyków pozbawionymi sygnału. Przestrzenie naczyniowe w błonie właściwej są również widoczne jako struktury pozbawione sygnału z lekkim cieniowaniem pod nimi, wskazanym przez strzałki. E oznacza nabłonek, a LP błonę właściwą.Szybkie tempo akwizycji charakterystyczne dla OFDI umożliwia obrazowanie obszarów o dużej powierzchni. Dane można analizować zarówno w przekroju poprzecznym, jak i podłużnym, co dostarcza dodatkowych informacji o architekturze tkanki. Po opracowaniu cech obrazowania za pomocą tej techniki, mogą one służyć do interpretacji obszarów obrazowania, dla których nie dysponowano odpowiadającą im histologią.Technika ta umożliwia interpretację cech obrazowania przy użyciu bezpośrednio zarejestrowanej histologii. Chociaż metoda ta została zaprezentowana z wykorzystaniem OFDI i tkanki płucnej, może ona zostać zastosowana do wielu technik obrazowania i rodzajów tkanek. Po ustaleniu cech obrazowania tkanek prawidłowych i chorobowo zmienionych za pomocą tej techniki, mogą one zostać wykorzystane do interpretacji obrazów in vivo, w przypadkach, gdy bezpośrednio skorelowana histologia może być niedostępna.

optical-frequency-domain-imaging-ex-vivo-pulmonary-resection

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Obrazowanie optyczne domen częstotliwości ex vivo próbek resekcji płuc: Uzyskanie skorelowania obrazu jeden do jednego z histopatologią

Złożone masy tkankowe, od organów po guzy, składają się z różnych elementów komórkowych. Wyjaśniliśmy udział fenotypów komórkowych w tkance przy użyciu wieloznakowanych fluorescencyjnych myszy transgenicznych w połączeniu z wieloparametrowym barwieniem immunofluorescencyjnym, a następnie rozmieszaniem widmowym w celu rozszyfrowania pochodzenia komórek, a także cech komórek na podstawie ekspresji białka.

Ilościowa analiza wielospektralna po przeszczepie tkanki fluorescencyjnej w celu wizualizacji pochodzenia, typów i interakcji komórek

Analiza ex vivo zmian w tętnicach z modeli zwierzęcych chorób sercowo-naczyniowych klasycznie opiera się na technikach histologicznych i immunohistochemicznych. Zapewniają one 2-wymiarowe pomiary w 3-wymiarowych zmianach. W artykule opisano generowanie zmian tętniczych do analizy ilościowej w 3 wymiarach z wykorzystaniem optycznej tomografii projekcyjnej.

Generowanie i 3-wymiarowa ocena ilościowa zmian w tętnicach u myszy za pomocą optycznej tomografii projekcyjnej

Opisujemy stosunkowo prostą metodę obrazowania na żywo ex vivo interakcji komórka nowotworowa - zrąb w obrębie przerzutów do płuc, wykorzystując fluorescencyjne reportery u myszy. Wykorzystując mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, technika ta umożliwia wizualizację żywych komórek przez co najmniej 4 godziny i może być dostosowana do badania innych stanów zapalnych płuc.

Ex vivo Obrazowanie na żywo przerzutów do płuc i ich mikrośrodowiska

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

Opisujemy użycie pełnej koherentnej mikroskopii optycznej jako metody wysokiej jakości oceny zrębu dawcy rogówki. Protokół ten może być stosowany do identyfikacji cech wskazujących na zdrowie lub chorobę i ma na celu poprawę badań przesiewowych i selekcji tkanek dawcy, a tym samym wyników keratoplastyki.

Pełnopolowa optyczna mikroskopia koherentna do histologicznej analizy cech zrębu w przeszczepach rogówki

Tutaj opisujemy prostą i przystępną strategię wizualizacji, kwantyfikacji i mapowania komórek odpornościowych w utrwalonych w formalinie odcinkach tkanki nowotworowej zatopionej w parafinie. Metodologia ta łączy istniejące techniki obrazowania i analizy cyfrowej w celu rozszerzenia możliwości multipleksowania i analizy wieloparametrowej testów obrazowania.

Wizualizacja, kwantyfikacja i mapowanie populacji komórek odpornościowych w mikrośrodowisku guza

Przedstawiamy protokół użycia światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii (CLM) do nieinwazyjnego badania czasoprzestrzennego rozkładu liposomów w oku po wstrzyknięciu podspojówkowym.

Przestrzenno-czasowe obrazowanie in vivo ocznych systemów dostarczania leków za pomocą światłowodowej konfokalnej laserowej mikroendoskopii

Obecny protokół przedstawia kroki do wyrównania in vivo obrazów światłowodowej optycznej koherentnej tomografii koherentnej (vis-OCTF) in vivo z obrazami konfokalnymi ex vivo tej samej siatkówki myszy w celu weryfikacji obserwowanej morfologii pęczka aksonów komórek zwojowych siatkówki na obrazach in vivo.

Wyrównanie światłowodów światłowodowej koherentnej tomografii koherentnej w świetle widzialnym z obrazami konfokalnymi tej samej siatkówki myszy

Przedstawiamy szczegółowy protokół dla korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej Epon po osadzeniu przy użyciu białka fluorescencyjnego o nazwie mScarlet. Ta metoda może jednocześnie utrzymać fluorescencję i ultrastrukturę. Ta technika jest podatna na szeroką gamę zastosowań biologicznych.

Epon Post Osadzanie korelacyjnej mikroskopii świetlnej i elektronowej

Tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej jest utrudnione ze względu na jego płytką głębokość penetracji w tkanki. W tym miejscu opisujemy mysi model komory z oknem grzbietowym, który umożliwia jednoczesną rejestrację mikroskopii przyżyciowej i klinicznie stosowanych metod obrazowania (np. CT, MRI) w celu bezpośredniej korelacji przestrzennej, potencjalnie usprawniając kliniczne tłumaczenie wyników mikroskopii przyżyciowej.

Mysi model guza w komorze grzbietowego fałdu skórnego do połączonej mikroskopii przyżyciowej i obrazowania metodą rezonansu magnetycznego w translacyjnych badaniach nad rakiem

Prezentujemy metodę modelu patogenezy grzybów, która zachowuje naturalne położenie zarodników grzybów w drogach oddechowych płuc do analizy za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Skuteczna metoda obrazowania płuc myszy, która zachowuje dynamikę przestrzenną zarodników grzybów w drogach oddechowych

Naucz się obrazowania OFDI w tkance płucnej ex vivo z dokładną korelacją histopatologiczną. Ta metoda umożliwia precyzyjne dopasowanie obrazów do preparatów histologicznych w badaniach patologii płuc.

Obrazowanie w dziedzinie częstotliwości optycznej próbek do resekcji płuc ex vivo: uzyskanie obrazu jeden do jednego z korelacją histopatologiczną (Wideo) | JoVE Journal

Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Przeglądaj więcej filmów