Obrazowanie w optycznej domenie częstotliwości próbek resekcji płuc ex vivo: uzyskanie korelacji obrazu z histopatologią w stosunku jeden do jednego

Badanie endobronchialne, OCT lub OFDI, wykonuje się przy użyciu cienkich elastycznych cewników, które są kompatybilne ze standardowymi portami dostępu bronchoskopowego. Bronchoskop jest wprowadzany w obrębie drzewa tchawkowo-bronchialnego do docelowych dróg oddechowych. Następnie cewnik OFDI zostaje wprowadzony do dróg oddechowych przez kanał roboczy bronchoskopu w celu wykonania obrazowania.

Wewnętrzny rdzeń optyczny cewnika OFDI jest obracany i jednocześnie wycofywany z zewnętrznej przezroczystej osłonki w celu wygenerowania trójwymiarowych danych OFDI. Laboratorium Sudora w Massachusetts General Hospital opracowało cewnik OFDI oparty na igle, który jest kompatybilny ze standardowymi igłami do biopsji transbronchialnej rutynowo stosowanymi do pobierania próbek z guzów obwodowych. Bronchoskop jest wprowadzany do dróg oddechowych aż do docelowego guza.

Po bezpiecznym cofnięciu cewnika OFDI do igły transbronchialnej, igłę wprowadza się do masy guza. Następnie igłę wycofuje się, pozostawiając cewnik OFDI w miejscu. Podobnie jak w przypadku endobronchialnego OFDI, wewnętrzny rdzeń optyczny cewnika do transbronchialnego OFDI jest obracany i jednocześnie cofany wewnątrz zewnętrznej przezroczystej osłony w celu wygenerowania trójwymiarowego obrazu OFDI.

Dane histopatologiczne uzyskane in vivo składają się z niewielkich fragmentów biopsji, które są trudne do powiązania z dużymi zestawami danych OFDI. W konsekwencji, w warunkach in vivo nie można łatwo opracować specyficznych cech obrazowania patologii płuc. Ogólnym celem niniejszego protokołu jest uzyskanie precyzyjnych, jednowartościowych korelacji między OFDI a histologią w tkance ex vivo, co jest niezbędne do dokładnej oceny cech widocznych w OFDI w odniesieniu do histologii jako złotego standardu.

Po opracowaniu i walidacji ex vivo specyficznych kryteriów obrazowania przy użyciu dopasowanej histologii jeden do jednego, kryteria te można zastosować w badaniach obrazowych in vivo. Główną zaletą tej techniki jest możliwość bezpośredniej korelacji obrazowania z histologią, co usprawnia interpretację cech obrazu. Aby przygotować system obrazowania w optycznej dziedzinie częstotliwości (OFDI) do eksperymentu, należy najpierw włączyć system obrazowania, a następnie ustawić i zapisać odpowiednie parametry obrazowania.

Podłącz cewnik do przegubu obrotowego i urządzenia do wycofywania. Ten cewnik wykonany na zamówienie ma średnicę 0,8 milimetra. Obracaj cewnikiem i sprawdź jakość obrazu, używając opuszki palca w rękawiczce, aby upewnić się, że obraz jest ostry, a stosunek sygnału do szumu jest odpowiedni.

Aby rozpocząć procedurę przygotowania tkanki, należy położyć na blacie jednorazową chłonną podkładkę i umieścić na niej preparat płuca. Ze względu na trudności z harmonogramem pozyskiwania tkanek od pacjentów, w tej demonstracji wideo zostanie wykorzystana tkanka świńska.

Zidentyfikuj oskrzele wchodzące do preparatu resekcyjnego w obrębie wnęki. Używając końcówki strzykawki, usuń widoczny śluz z wnętrza dróg oddechowych. Palpuj zewnętrzną powierzchnię preparatu, aby zlokalizować drogi oddechowe lub poszukiwaną zmianę.

Otwórz drogi oddechowe wzdłuż sondy, aż do momentu, gdy zmiana zainteresowania stanie się widoczna lub wyczuwalna pod śluzówką dróg oddechowych przy użyciu aplikatora z bawełnianym końcem. Ostrożnie usuń krew lub śluz ze śluzówki dróg oddechowych pokrywającej zmianę. Umieść cewnik OFDI nad śluzówką dróg oddechowych i wykonaj obrazowanie.

Służy to potwierdzeniu, że zmiana znajduje się pod śluzówką dróg oddechowych, oraz identyfikacji wysokiej jakości obszaru obrazowania (region of interest) do korelacji histologicznej. Po wybraniu obszaru zainteresowania w drogach oddechowych, należy zaznaczyć dwa punkty na tkance wzdłuż pożądanej linii obrazowania. W tym przykładzie punkty zostaną wyznaczone równolegle do osi podłużnej dróg oddechowych.

Uwidocznienie znaczników z tuszu zarówno w OFDI, jak i w badaniu histologicznym może być trudne, dlatego stosujemy zarówno nacięcia igłą, jak i tusz, aby oznaczenia były widoczne w obu technikach. Po wybraniu dwóch punktów, zanurz igłę z otwartym światłem i cienką końcówką w barwniku do znakowania tkanek, a następnie ostrożnie usuń nadmiar tuszu z zewnętrznej strony igły za pomocą gazy, pozostawiając tusz do znakowania tkanek jedynie wewnątrz światła igły. Nakłuj tkankę prostopadle do błony śluzowej dróg oddechowych w wybranym punkcie wzdłuż linii obrazowania. W ten sam sposób zaznacz drugi punkt na błonie śluzowej dróg oddechowych, upewniając się, że drugi punkt znajduje się nie dalej niż 1.5 centymetrów od pierwszego punktu.

Jeśli tusz rozleje się po powierzchni śluzówki z dala od miejsca nakłucia, należy użyć aplikatora z bawełnianą końcówką, aby ostrożnie usunąć nadmiar tuszu. W zależności od pożądanych rezultatów, dwa punkty można również wyznaczyć równolegle do obwodu dróg oddechowych, jak pokazano tutaj. Aby obrazować tkankę, należy umieścić cewnik OFDI nad każdym znakiem z tuszu i wykonać obrazowanie, aby upewnić się, że oznaczenia są widoczne w OFDI.

Znaki powinny przejawiać się jako ogniskowe przerwania w strukturze tkanki z nakładającymi się silnie rozpraszającymi cząsteczkami i gwałtownym tłumieniem sygnału poniżej, co odpowiada cząsteczkom tuszu w miejscu nakłucia. Na tym obrazie OFDI dróg oddechowych świni oba znaki tuszem są zaznaczone gwiazdką. Umieść cewnik równolegle do dwóch znaków tuszem na powierzchni śluzowej dróg oddechowych w taki sposób, aby optyka cewnika znajdowała się nad tkanką poza pierwszym znakiem tuszem.

Przejdź do wykonania skanu cofającego OFDI; przejrzyj obrazy z cofania OFDI, aby upewnić się, że oba znaczniki z tuszu są widoczne na obrazowaniu oraz aby sprawdzić obecność artefaktów ruchowych przed pobraniem tkanki. Nanieś zieloną kropkę z tuszu na tkankę błony śluzowej dróg oddechowych w odległości 0,3 centymetra od znacznika z tuszu, który pojawił się jako pierwszy podczas skanu cofającego. Służy to do zorientowania początku skanu obrazowania.

Następnie należy usunąć fragment tkanki obejmujący dwa czarne i jeden zielony znak z tuszu. Przytnąć tkankę tak, aby mieściła się w standardowej kasecie do obróbki histologicznej. Umieścić tkankę w kasecie do obróbki histologicznej i utrwalić w 10% formalinie przez co najmniej 48 godzin.

Następnie tkankę poddaje się obróbce zgodnie z opisem w tekście protokołu. Reprezentatywny wynik OFDI przedstawiają poniższe obrazy in vivo uzyskane z dróg oddechowych świni poddaną wentylacji mechanicznej. Panel A przedstawia przekrój poprzeczny OFDI proksymalnych dróg oddechowych, a panel B przekrój poprzeczny OFDI dystalnych dróg oddechowych.

Panel E przedstawia przekrój podłużny dróg oddechowych wykonany metodą OFDI, od części proksymalnej po lewej do dystalnej po prawej stronie; panel C stanowi powiększenie obszaru wyróżnionego na czerwono z panelu E. Panel D jest obrazem o większym powiększeniu obszaru wyróżnionego na zielono z panelu E. Średnica cewnika wynosi 0,8 mm, a znaczniki reprezentują przyrosty co 0,5 mm. Chociaż na obrazach OFDI można rozróżnić poszczególne warstwy ściany dróg oddechowych oraz przyczepy pęcherzykowe, trudna jest precyzyjna interpretacja anatomicznego odpowiednika sygnałów OFDI bez bezpośrednio zarejestrowanej histologii. E oznacza nabłonek, lp – warstwę właściwą, SM – błonę podśluzową, C – chrząstkę oraz a – przyczepy pęcherzykowe.

Stosując zaprezentowany tutaj protokół, uzyskano precyzyjną korelację między OFDI a histologią. Ten obraz OFDI dróg oddechowych świni wykazuje dokładną korelację z histologią przekrojów tkankowych barwionych H i E. Gwiazdki wskazują ślady czarnego tuszu widoczne na nabłonku oddechowym.

Warstwy dróg oddechowych można zwizualizować na barwieniach H&E oraz Tri-RME. Przedstawiono tutaj powiększony widok obrazu OFDI wraz z odpowiadającą mu histologią barwioną H&E i Tri-RME: E oznacza nabłonek oddechowy, el gęstą tkankę kolagenową i elastynową, SM mięśnie gładkie, C pierścienie chrzęstne, G tkankę gruczołu ślinowego oraz D przewód ślinowy wchodzący w nabłonek. Mięśnie gładkie pojawiają się jako przerywane, przeplatające się pasma i tym samym nie są identyfikowalne w OFDI.

Podobnie, dzięki zastosowaniu markerów tkankowych wykazano precyzyjną korelację między OFDI a histologią w ludzkich drogach oddechowych. Na tym obrazie OFDI proksymalnych dróg oddechowych człowieka widoczne są oba znaczniki z tuszu, oznaczone gwiazdkami. W barwieniu h i e występuje precyzyjna korelacja z histologią przekrojów tkankowych barwionych h i e oraz trichrome.

Czarne oznaczenia tuszem są widoczne na nabłonku oddechowym wskazanym gwiazdką w obrazach OFDI o większym powiększeniu oraz na odpowiadających im przekrojach histologicznych. W obrazach wstawkowych przedstawiono barwienie H&E oraz trichrome. E oznacza nabłonek oddechowy, lp – błonę właściwą, G – tkankę gruczołów ślinowych, C – pierścienie chrzęstne oraz pc – okołochrzęstkę w ludzkich drogach oddechowych.

Widoczne jest typowe warstwowanie. W luźnej tkance łącznej przeplatają się pasma czerwono barwionych mięśni gładkich, pokazane na panelach C i F, które nie tworzą ciągłego pasma i nie są zatem widoczne jako odrębna warstwa w OFDI. Te dwa obrazy przedstawiają wyniki OFDI dystalnych dróg oddechowych człowieka oraz precyzyjnie skorelowaną histologię h i d.

Czarny atrament widoczny na nabłonku oddechowym jest oznaczony gwiazdką, a przyczepy pęcherzykowe oznaczone literą a są widoczne jako intensywne sygnałowo, kratkowate ściany pęcherzyków z obszarami pęcherzyków pozbawionymi sygnału. Przestrzenie naczyniowe w błonie właściwej są również widoczne jako struktury pozbawione sygnału z lekkim cieniowaniem pod nimi, wskazanym przez strzałki. E oznacza nabłonek, a LP błonę właściwą.

Szybkie tempo akwizycji charakterystyczne dla OFDI umożliwia obrazowanie obszarów o dużej powierzchni. Dane można analizować zarówno w przekroju poprzecznym, jak i podłużnym, co dostarcza dodatkowych informacji o architekturze tkanki. Po opracowaniu cech obrazowania za pomocą tej techniki, mogą one służyć do interpretacji obszarów obrazowania, dla których nie dysponowano odpowiadającą im histologią.

Technika ta umożliwia interpretację cech obrazowania przy użyciu bezpośrednio zarejestrowanej histologii. Chociaż metoda ta została zaprezentowana z wykorzystaniem OFDI i tkanki płucnej, może ona zostać zastosowana do wielu technik obrazowania i rodzajów tkanek. Po ustaleniu cech obrazowania tkanek prawidłowych i chorobowo zmienionych za pomocą tej techniki, mogą one zostać wykorzystane do interpretacji obrazów in vivo, w przypadkach, gdy bezpośrednio skorelowana histologia może być niedostępna.