Stosowanie pożywki ze sztucznej plwociny w celu zbadania skuteczności antybiotyku przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej istotnych dla płuc chorych na mukowiscydozę

Celem tego eksperymentu jest ocena skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom Pseudomonas Aerogen, w warunkach reprezentatywnych dla przewlekłych zakażeń płuc mukowiscydozy przy użyciu określonego sztucznego podłoża plwociny. Biofilmy bakteryjne są hodowane w 24. Cóż, płytki do mikromiareczkowania.

Biofilmy są następnie poddawane działaniu antybiotyków. Następnie kultury poddane działaniu antybiotyków są rozbijane za pomocą celulazy i inkubowane z barwnikiem metabolicznym srin, który jest redukowany z niebieskiego do różowego przez żywe komórki. Mierząc absorbancję studzienek, można określić minimalne stężenie hamujące B-S-M-I-C biofilmu w komórkach Cecile w celu ilościowego określenia wrażliwości na antybiotyki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami, takimi jak oznaczanie minimalnych stężeń hamujących w oparciu o hodowlę planktonu, jest to, że bakterie hodują się w specjalistycznym pożywce zawierającej wszystkie składniki plwociny, sprzyjając w ten sposób tworzeniu biofilmu. Te biofilmy są znacznie bardziej odporne na antybiotyki. Aby przygotować pożywkę, najpierw przygotuj dwie butelki zawierające 250 mililitrów sterylnej wody w pierwszej butelce.

Stopniowo dodawaj mieszanie, a następnie dodaj cztery gramy nasienia ryby, DNA do 250 mililitrów sterylnej wody. Wymieszaj roztwór w temperaturze pokojowej i pozwól DNA rozpuścić się w drugiej butelce. Stopniowo dodawaj pięć gramów mucyny typu drugiego z żołądka świni i mieszaj.

Gdy roztwory DNA i mucyny są gotowe, rozpuść aminokwasy w 100 mililitrach sterylnej wody, z wyjątkiem L tyrozyny i L cysteiny, które należy rozpuścić odpowiednio w 25 mililitrach wody lub 25 mililitrach 0,5 molowego wodorotlenku potasu. Następnie wytwarza 5,9 miligrama DTPA, pięć gramów chlorku sodu i 2,2 grama chlorku potasu w 100 mililitrach wody. Połącz wszystkie różne roztwory w litrowej butelce, a następnie dodaj pięć mililitrów emulsji z żółtka jaja i uzupełnij mieszaninę do 850 mililitrów wodą.

Używając jednego trzonowca, dostosuj pH do 6,9 i doprowadź końcową objętość do jednego litra wodą, aby wysterylizować pożywkę, przefiltruj ją za pomocą dwumembranowej pompy próżniowej ME marki próżniowej i górnego filtra stereo Millipore z 45-milimetrową szyjką i rozmiarem porów 0,2 mikrona. Proces filtracji można przeprowadzić w ciągu dwóch dni. Pożywka A SM może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do jednego miesiąca.

Rozpocznij od rozcieńczenia przez noc kultur pseudomona arosa w pożywce LB, aby uzyskać OD 0,05. Następnie dalej rozcieńczyć bakterie w ilości od jednego do 100 w pożywce SM, 1,8 mililitra na studzienkę rozcieńczonej kultury bakteryjnej w 21 dołkach 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej podamy tę samą objętość pożywki SM w trzech pozostałych studzienkach, które posłużą jako ślepe kontrole ujemne. Zabezpiecz płytkę 24-dołkową biofilmem i aby umożliwić tworzenie się biofilmów, umieść ją w warunkach mikrobłędu, które można uzyskać za pomocą zestawów do wytwarzania gazu campi gen w dużych słoikach beztlenowych.

Inkubuj kulturę na wytrząsarce ustawionej na 75 obr./min przez trzy dni w temperaturze 37 stopni Celsjusza po trzech dniach, biofilmy pojawią się jako galaretowata masa zawierająca komórki bakteryjne i nie będą mogły zostać przerwane przez pipetowanie. Po utworzeniu biofilmów w ilości 200 mikrolitrów na studzienkę antybiotyku w seryjnie rozcieńczanych stężeniach. Należy upewnić się, że dla każdego stężenia leku do badania przypadają co najmniej cztery powtórzenia, a cztery studzienki zawierające biofilmy pozostawić niepoddane obróbce, tak aby można je było wykorzystać jako kontrole ujemne.

Następnie należy inkubować posiewki przez kolejne 24 godziny po inkubacji z antybiotykami. Użyć 100 mikrolitrów celulazy na studzienkę, aby rozcieńczyć do 100 miligramów na mililitr w buforze cytrynianowym w celu rozbicia biofilmów, inkubować płytki na wytrząsarce ustawionej na 150 obr./min w warunkach tlenowych w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę. Zgodnie z niniejszą instrukcją inkubacji, pipetowanie może być stosowane w celu dalszej dezagregacji biofilmów, jeśli w pożywce widoczne są grudki komórek.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów rezyny na studzienkę, aby określić ilościowo żywotność komórek uwolnionych z biofilmów i inkubować komórki przez jedną do dwóch godzin. W temperaturze 37 stopni Celsjusza tylko żywotne komórki są w stanie metabolizować niebieski barwnik zarin do jego różowej fluorescencji. Po inkubacji przenieś próbki na 96-dołkową płytkę i zmierz fluorescencję studzienek za pomocą pięciu 40-nanometrowych długości fal wzbudzenia i pięciu 90-nanometrowych długości fali emisyjnych.

Aby określić ilościowo żywotność bakterii i podatność na leki, najpierw odejmij fluorescencję tła ślepej próby kontrolnej od innych studzienek. Następnie oblicz procent zahamowania, dzieląc średnią fluorescencję dla każdego stężenia przez średnią fluorescencję nieleczonych kontrol i mnożąc przez 100. B-S-M-Y-C definiuje się jako stężenie antybiotyku powodujące 90% zahamowanie aktywności metabolicznej, jak pokazano na tych mikrografiach elektronowych, komórki, hodowane w biofilmach, różnią się znacznie od bakterii hodowanych w kulturach planktonowych.

W szczególności duże ilości macierzy zewnątrzkomórkowej pokazane na żółto otaczają komórki w biofilmie na zielono, ale nie w koloniach planktonowych. Ponadto bakterie w biofilmach są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki w tym eksperymencie. Minimalne stężenie hamujące tobramycyny w hodowli planktonu Pseudomonas aerogen w kolorze niebieskim określono na około cztery mikrogramy na mililitr.

W przeciwieństwie do tego, jak pokazano na czerwono, 100% bakterii w biofilmach przetrwało do 512 mikrogramów na mililitr antybiotyku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować bakterie w określonym sztucznym pożywce z plwociny. Powinieneś być również w stanie wykonać test wrażliwości na antybiotyki w celu określenia minimalnego stężenia hamującego wymaganego do zahamowania wzrostu bakterii w środowisku bardziej realistycznym w płucach mukowiscydozy.