Name: Stosowanie pożywki ze sztucznej plwociny w celu zbadania skuteczności antybiotyku przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej istotnych dla płuc chorych na mukowiscydozę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Poznaj metodę oceny skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom Pseudomonas aeruginosa w sztucznej plwocinie. Technika ta symuluje warunki płuc chorych na mukowiscydozę i pozwala określić stężenie hamujące wzrost bakterii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność za wsparcie udzielone przez brytyjski National Institute for Health Research, Dr Hadwen Trust for Humane Research – wiodącą w Wielkiej Brytanii organizację charytatywną wspierającą badania medyczne, która finansuje wyłącznie techniki badawcze bez udziału zwierząt w celu zastąpienia eksperymentów na zwierzętach, oraz Wellcome Trust (grant 089215). Dziękujemy również firmie Novartis Pharmaceuticals UK Ltd (nieograniczony grant edukacyjny).

<ol><li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> J. Antimicrob. Chemother. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Worlitzsch, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+reduced+mucus+oxygen+concentration+in+airway+Pseudomonas+infections+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients.</a> J. Clin. Invest. 109, 317-325 (2002).</li>
<li>Smith, A. L., Fiel, S. B., Mayer-Hamblett, N., Ramsey, B., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+testing+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+and+clinical+response+to+parenteral+antibiotic+administration%3A+lack+of+association+in+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">Susceptibility testing of Pseudomonas aeruginosa isolates and clinical response to parenteral antibiotic administration: lack of association in cystic fibrosis.</a> Chest. 123, 1495-1502 (2003).</li>
<li>Sriramulu, D. D., Lunsdorf, H., Lam, J. S., Romling, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcolony+formation%3A+a+novel+biofilm+model+of+Pseudomonas+aeruginosa+for+the+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microcolony formation: a novel biofilm model of Pseudomonas aeruginosa for the cystic fibrosis lung.</a> J. Med. Microbiol. 54, 667-676 (2005).</li>
<li>Garbe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+JG024%2C+a+pseudomonas+aeruginosa+PB1-like+broad+host+range+phage+under+simulated+infection+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of JG024, a pseudomonas aeruginosa PB1-like broad host range phage under simulated infection conditions.</a> BMC Microbiol. 10, 301(2010).</li>
<li>Naughton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+AES-1+exhibits+increased+virulence+gene+expression+during+chronic+infection+of+cystic+fibrosis+lung%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa AES-1 exhibits increased virulence gene expression during chronic infection of cystic fibrosis lung.</a> PLoS One. 6, e24526(2011).</li>
<li>Moskowitz, S. M., Foster, J. M., Emerson, J. C., Gibson, R. L., Burns, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Pseudomonas+biofilm+susceptibilities+to+assign+simulated+antibiotic+regimens+for+cystic+fibrosis+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Antimicrob.+Chemother%22%5BJournal%5D)">Use of Pseudomonas biofilm susceptibilities to assign simulated antibiotic regimens for cystic fibrosis airway infection.</a> J. Antimicrob. Chemother. 56, 879-886 (2005).</li>
<li>Field, T. R., White, A., Elborn, J. S., Tunney, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+oxygen+limitation+on+the+in+vitro+antimicrobial+susceptibility+of+clinical+isolates+of+Pseudomonas+aeruginosa+grown+planktonically+and+as+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Clin.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Effect of oxygen limitation on the in vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa grown planktonically and as biofilms.</a> Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 24, 677-687 (2005).</li>
<li>Bjarnsholt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+the+respiratory+tract+of+cystic+fibrosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Pulmonol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilms in the respiratory tract of cystic fibrosis patients.</a> Pediatr. Pulmonol. 44, 547-558 (2009).</li>
<li>Hill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+susceptibilities+of+Pseudomonas+aeruginosa+isolates+derived+from+patients+with+cystic+fibrosis+under+aerobic%2C+anaerobic%2C+and+biofilm+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotic susceptibilities of Pseudomonas aeruginosa isolates derived from patients with cystic fibrosis under aerobic, anaerobic, and biofilm conditions.</a> J. Clin. Microbiol. 43, 5085-5090 (2005).</li>
<li>Fung, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+a+mucin-containing+synthetic+growth+medium+mimicking+cystic+fibrosis+lung+sputum%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Gene expression of Pseudomonas aeruginosa in a mucin-containing synthetic growth medium mimicking cystic fibrosis lung sputum.</a> J. Med. Microbiol. 59, 1089-1100 (2010).</li>
<li>Andrews, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BSAC+standardized+disc+susceptibility+testing+method+%28version+8%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+antimicrobial+chemotherapy%22%5BJournal%5D)">BSAC standardized disc susceptibility testing method (version 8).</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 64, 454-489 (2009).</li>
<li>Rybtke, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implication+of+Pseudomonas+aeruginosa+biofilms+in+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Inflamm+Allergy+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">The implication of Pseudomonas aeruginosa biofilms in infections.</a> Inflamm Allergy Drug Targets. 10, 141-157 (2011).</li>
<li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation+in+the+cystic+fibrosis+airway%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa biofilm formation in the cystic fibrosis airway.</a> Pulm. Pharmacol. Ther. 21, 595-599 (2008).</li>
<li>Ahmed, S. A., Gogal, R. M., Walsh, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rapid+and+simple+non-radioactive+assay+to+monitor+and+determine+the+proliferation+of+lymphocytes%3A+an+alternative+to+%5B3H%5Dthymidine+incorporation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A new rapid and simple non-radioactive assay to monitor and determine the proliferation of lymphocytes: an alternative to [3H]thymidine incorporation assay.</a> J. Immunol. Methods. 170, 211-224 (1994).</li>
<li>Fothergill, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+antibiotic+treatment+on+bacteriophage+production+by+a+cystic+fibrosis+epidemic+strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Effect of antibiotic treatment on bacteriophage production by a cystic fibrosis epidemic strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 55, 426-428 (2011).</li>
<li>Singh, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quorum-sensing+signals+indicate+that+cystic+fibrosis+lungs+are+infected+with+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quorum-sensing signals indicate that cystic fibrosis lungs are infected with bacterial biofilms.</a> Nature. 407, 762-764 (2000).</li>
<li>Mowat, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+Aeruginosa+Population+Diversity+and+Turnover+in+Cystic+Fibrosis+Chronic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care.+Med%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas Aeruginosa Population Diversity and Turnover in Cystic Fibrosis Chronic Infections.</a> Am. J. Respir. Crit. Care. Med. , (2011).</li>
<li>Fothergill, J. L., Mowat, E., Ledson, M. J., Walshaw, M. J., Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+phenotypes+and+genotypes+within+populations+of+Pseudomonas+aeruginosa+in+the+cystic+fibrosis+lung+during+pulmonary+exacerbations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in phenotypes and genotypes within populations of Pseudomonas aeruginosa in the cystic fibrosis lung during pulmonary exacerbations.</a> J. Med. Microbiol. 59, 472-481 (2010).</li>
<li>Fouhy, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusible+signal+factor-dependent+cell-cell+signaling+and+virulence+in+the+nosocomial+pathogen+Stenotrophomonas+maltophilia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Diffusible signal factor-dependent cell-cell signaling and virulence in the nosocomial pathogen Stenotrophomonas maltophilia.</a> J. Bacteriol. 189, 4964-4968 (2007).</li>
<li>Winstanley, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+introduced+genomic+prophage+islands+are+critical+determinants+of+in+vivo+competitiveness+in+the+Liverpool+Epidemic+Strain+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Newly introduced genomic prophage islands are critical determinants of in vivo competitiveness in the Liverpool Epidemic Strain of Pseudomonas aeruginosa.</a> Genome Res. 19, 12-23 (2009).</li>
<li>Carter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+subtype+of+a+Pseudomonas+aeruginosa+cystic+fibrosis+epidemic+strain+exhibits+enhanced+virulence+in+a+murine+model+of+acute+respiratory+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">A subtype of a Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis epidemic strain exhibits enhanced virulence in a murine model of acute respiratory infection.</a> J. Infect. Dis. 202, 935-942 (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym badaniu wykorzystaliśmy nowatorski model in vitro oparty na ASM w celu odtworzenia warunków tworzenia biofilmu przez P. aeruginosa w płucach chorych na CF4. Model ten został pomyślnie zmodyfikowany do małoscale'owych badań wysokoprzepustowych w celu testowania środków przeciwdrobnoustrojowych.
	Kluczowe etapy tego testu to:
	<ol>
		<li>Spójne przygotowanie pożywki ASM i utrzymanie sterylności. Poświęciliśmy wiele godzin na optymalizację sposobu dodawania każdego składnika, aby za każdym razem uzyskiwać powtarzalne wyniki. Filtracja ASM jest powolna, ale jest preferowana nad autoklawowaniem, które może uszkodzić komponent mucyny. Nie zalecamy dodawania antybiotyków, jak sugerują inni 11, ponieważ może to wywierać znaczną presję selekcyjną, prowadzić do mutacji, indukować lizę profagów 16 i znacząco zmieniać ekspresję wielu genów bakteryjnych.</li>
	 <li>Test należy zoptymalizować w zależności od objętości użytej pożywki ASM. Dla mniejszych objętości zwiększa się prędkość wytrząsania, co skutkuje krótszym cyklem życia biofilmu.</li>
	</ol>
	Oczywistym zastosowaniem małoscale'owego modelu biofilmu w ASM jest bardziej realistyczne określanie wrażliwości biofilmu na środki przeciwdrobnoustrojowe (BSMIC90). W płucach pacjentów z mukowiscydozą (CF) występują nisze beztlenowe i mikroaerofilne, a istnieją dowody na to, że dostęp do tlenu jest ograniczony w głębi dojrzałych biofilmów2, 17. Wykazaliśmy tutaj, że 10/14 klinicznych izolatów P. aeruginosa z plwociny pacjentów z CF wykazuje znaczny (4- do ≥ 128-krotny) spadek wrażliwości na tobramycynę w warunkach mikroaerofilnych w ASM. Wyniki niniejszego badania sugerują, że antybiotyki, takie jak tobramycyna, mogą być mniej skuteczne w zwalczaniu infekcji P. aeruginosa w płucach z CF, niż wynikałoby to z konwencjonalnych metod badania wrażliwości. Wyniki te odzwierciedlają wcześniejsze badania nad wrażliwością biofilmów na środki przeciwdrobnoustrojowe 10. Zatem testy w małoscale'owym ASM stanowią prostą platformę wysokoprzepustową do generowania istotnych danych o wrażliwości na antybiotyki, co pozwala na lepsze podejmowanie decyzji terapeutycznych. Metoda ta jest ograniczona w ten sam sposób, co konwencjonalne testy wrażliwości na antybiotyki, ponieważ do przesiewu wybierane są pojedyncze kolonie, które mogą nie być reprezentatywne dla całej populacji. Wierzymy jednak, że podejście (i) wykorzystujące wzrost biofilmu nieprzytwierdzonego do powierzchni oraz (ii) możliwe do zastosowania w warunkach mikroaerofilnych, stanowi wyraźną alternatywę i potencjalną poprawę istniejących metod. Konkludujemy, że test ten jest odpowiednim modelem do badania populacji biofilmów P. aeruginosa. Dalsze badania w warunkach klinicznych pozwoliłyby ustalić, czy wrażliwość na antybiotyki oparta na P. aeruginosa hodowanych w biofilmie mogłaby prowadzić do innych wyborów antybiotykoterapii z potencjalnie lepszymi efektami mikrobiologicznymi i klinicznymi. Podobne badania z wykorzystaniem klasycznych modeli biofilmów wykazały, że wartości BSMIC prowadzą do innych zaleceń dotyczących leczenia antybiotykowego5,17.
	Oprócz testowania skuteczności środków przeciwinfekcyjnych, system ASM stanowi tanią, prostą i powtarzalną alternatywę dla modeli zwierzęcych w badaniach takich jak te mające na celu zrozumienie dywersyfikacji populacji P. aeruginosa. Zaobserwowaliśmy rozległą heterogeniczność w naturalnych populacjach P. aeruginosa wyizolowanych z plwociny pacjentów z mukowiscydozą 18, 19. Podobną dywersyfikację fenotypową i genotypową można zaobserwować podczas wzrostu w ASM4 (oraz w naszych niepublikowanych danych), co czyni go atrakcyjnym modelem in vitro warunków panujących w płucach w mukowiscydozie. Stosunkowa prostota modelu ASM ułatwia projektowanie długoterminowych eksperymentów adaptacyjnych mających na celu, na przykład, monitorowanie wpływu antybiotyków lub innych stresorów na dywergencję populacji P. aeruginosa. Ponadto w ASM można hodować inne patogeny bakteryjne. Na przykład Fouhy et al. 2007 wykorzystali ASM do badania tworzenia biofilmu przez S. maltophillia20.

<table><tbody><tr><td>DNA z nasienia ryb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74782</td><td></td></tr><tr><td>Mucyna z żołądka świni, typ II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2378</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Acros Organics</td><td>102830250</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Asparagina monohydrat</td><td>Acros Organics</td><td>175271000</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Kwas asparaginowy</td><td>Acros Organics</td><td>105041000</td><td></td></tr><tr><td>L-Cysteina</td><td>Sigma-Adrich</td><td>168149</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Kwas glutaminowy</td><td>Acros Organics</td><td>156211000</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Acros Organics</td><td>220911000</td><td></td></tr><tr><td>L-Histydyna</td><td>Sigma-Adrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Izoleucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L(+)-Lizyny monowodorek</td><td>Acros Organics</td><td>125222500</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenyloalanina</td><td>Acros Organics</td><td>130310250</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Seryna</td><td>Acros Organics</td><td>132660250</td><td></td></tr><tr><td>L-Treonina</td><td>Acros Organics</td><td>138930250</td><td></td></tr><tr><td>L(-)-Tryptofan</td><td>Acros Organics</td><td>140590250</td><td></td></tr><tr><td>L-Tyrozyna</td><td>Acros Organics</td><td>140641000</td><td></td></tr><tr><td>L-Walina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas didetylenotriaminopentaoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>32318</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3160/60</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>VWR</td><td>BDH0258</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>VWR</td><td>BDH0262</td><td></td></tr><tr><td>Emulsja z żółtka jaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17148</td><td></td></tr><tr><td>Pompa próżniowa membranowa ME 2</td><td>Vacuubrand</td><td>696126</td><td></td></tr><tr><td>Filtry Steritop (rozmiar porów: 0,22 &amp;mu;m, rozmiar szyjki: 45 mm)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT10RE</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2897</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytki 96-dołkowe</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>82.1581</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 24-dołkowe do hodowli komórkowych</td><td>Iwaki, Asahi Techno Glass Corp.</td><td>3820-024</td><td></td></tr><tr><td>Pakiety do generowania gazów CampyGen</td><td>Oxford Labware</td><td>CN0025</td><td></td></tr><tr><td>Komora mikroaerofilna</td><td>Oxford Labware</td><td>HP0011</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan tobramycyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1783</td><td></td></tr><tr><td>Celulaza z &lt;em&gt;Aspergillus niger&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22178</td><td></td></tr><tr><td>Rezazurena</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>199303</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>VWR</td><td>BDH0288</td><td></td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek Fluostar omega</td><td>BMG-Labtech</td><td>SPECTROstar Omega</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Rośnie zaniepokojenie kwestią relewantności testów wrażliwości przeciwdrobnoustrojowej in vitro w przypadku izolatów P. aeruginosa pochodzących od pacjentów z mukowiscydozą (CF). Istniejące metody opierają się na pojedynczych lub kilku izolatach hodowanych tlenowo i planktonicznie. Do określenia, czy bakterie są wrażliwe, czy oporne na dany antybiotyk, stosuje się wcześniej ustalone wartości graniczne1. Jednakże podczas chronicznych infekcji płuc w przebiegu mukowiscydozy populacje P. aeruginosa występują w biofilmach i istnieją dowody na to, że środowisko to jest w przeważającej mierze mikroaerofilne2. Wyraźna różnica w warunkach bytowania bakterii w płucach i tych panujących podczas testów diagnostycznych poddała w wątpliwość wiarygodność, a nawet zasadność stosowania tych testów3.
 Sztuczna pożywka plwocin (Artificial sputum medium, ASM) jest pożywką hodowlaną zawierającą składniki plwocin pacjentów z mukowiscydozą, w tym aminokwasy, mucynę i wolne DNA. Wzrost P. aeruginosa w ASM naśladuje wzrost podczas infekcji w przebiegu mukowiscydozy, z tworzeniem samoporządujących się struktur biofilmu oraz dywergencją populacji4,5,6. Celem niniejszego badania było opracowanie testu na płytkach mikrotitracyjnych do badania wrażliwości P. aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe w oparciu o wzrost w ASM, który można zastosować zarówno w warunkach mikroaerofilnych, jak i tlenowych.
 Opracowano test ASM w formacie płytki mikrotitracyjnej. Biofilmom P. aeruginosa pozwolono rozwijać się przez 3 dni przed inkubacją z czynnikami przeciwdrobnoustrojowymi w różnych stężeniach przez 24 godziny. Po rozbiciu biofilmu żywotność komórek zmierzono poprzez barwienie rezazuryną. Test ten wykorzystano do oznaczenia minimalnego stężenia hamującego dla komórek osiadłych (SMIC) tobramycyny dla 15 różnych izolatów P. aeruginosa w warunkach tlenowych i mikroaerofilnych, a następnie wartości SMIC porównano z wartościami uzyskanymi w standardowej hodowli w bulionie. Choć zaobserwowano pewne dowody na zwiększenie wartości MIC dla izolatów hodowanych w ASM w porównaniu z ich odpowiednikami planktonicznymi, największe różnice stwierdzono u bakterii badanych w warunkach mikroaerofilnych, które wykazały znacznie większą oporność na tobramycynę w systemie ASM – wzrost aż &gt;128-krotny – w porównaniu do testów przeprowadzonych w warunkach tlenowych.
 Brak związku pomiędzy obecnymi metodami badania wrażliwości a wynikiem klinicznym podał w wątpliwość poprawność aktualnych metod3. Wcześniej do badania biofilmów P. aeruginosa wykorzystywano kilka modeli in vitro7, 8. Metody te opierają się jednak na biofilmach przylegających do powierzchni, podczas gdy biofilmy ASM przypominają te obserwowane w płucach osób z mukowiscydozą (CF)9. Ponadto wykazano, że obniżone stężenie tlenu w śluzie zmienia zachowanie P. aeruginosa2 i wpływa na wrażliwość na antybiotyki10. Dlatego zastosowanie ASM w warunkach mikroaerofilnych może zapewnić bardziej realistyczne środowisko do badania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe.

Obecna diagnostyka testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe opiera się na wzroście planktonicznym izolatów w bogatych w składniki odżywcze warunkach tlenowych. W niniejszej pracy wykorzystujemy alternatywne sztuczne podłoże plwociny, aby zbadać wrażliwość biofilmów Pseudomonas aeruginosa na środki przeciwdrobnoustrojowe zarówno w warunkach tlenowych, jak i mikroaerofilnych, które są bardziej reprezentatywne dla płuc w mukowiscydozie.

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Narasta niepokój dotyczący trafności testów wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe in vitro w odniesieniu do izolatów P. aeruginosa pochodzących z torbieli...

Celem niniejszego eksperymentu jest ocena skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom Pseudomonas Aerogen w warunkach reprezentatywnych dla przewlekłych infekcji w płucach przy mukowiscydozie, z wykorzystaniem zdefiniowanego sztucznego medium plwocnego. Biofilmy bakteryjne są hodowane w 24-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.Następnie biofilmy poddaje się działaniu antybiotyków. W kolejnym kroku kultury traktowane antybiotykiem rozbija się przy użyciu celulazy i inkubuje z barwnikiem metabolicznym srin, który jest redukowany z koloru niebieskiego do różowego przez żywe komórki. Poprzez pomiar absorbancji w dołkach można wyznaczyć minimalne stężenie hamujące dla komórek w biofilmie (B-S-M-I-C), aby określić wrażliwość na antybiotyki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wyznaczanie minimalnych stężeń hamujących w oparciu o hodowlę planktonową, jest fakt, że bakterie są hodowane w specjalistycznym medium zawierającym wszystkie składniki plwociny, co sprzyja tworzeniu biofilmu. Biofilmy te wykazują znacznie większą oporność na antybiotyki. Aby przygotować medium, należy najpierw przygotować dwie butelki, z czego w pierwszej powinno znajdować się 250 mililitrów sterylnej wody.Stopniowo mieszając, dodaj 4 g DNA nasienia ryb do 250 ml sterylnej wody. Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, aż DNA się rozpuści, a następnie przelej go do drugiej butelki. Stopniowo dodaj 5 g mucyny typu 2 z żołądka świni i wymieszaj.Po przygotowaniu roztworów DNA i mucyny, rozpuścić aminokwasy w 100 mililitrach sterylnej wody, z wyjątkiem L-tyrozyny i L-cysteiny, które należy rozpuścić odpowiednio w 25 mililitrach wody lub 25 mililitrach 0,5 molarnego wodorotlenku potasu. Następnie rozpuścić 5,9 miligrama DTPA, pięć gramów chlorku sodu i 2,2 grama chlorku potasu w 100 mililitrach wody. Połączyć wszystkie roztwory w butelce o pojemności jednego litra, dodać pięć mililitrów emulsji żółtka jaja, a następnie uzupełnić objętość mieszaniny wodą do 850 mililitrów.Używając jeden molarnego TRIS, należy dostosować pH do 6.9 i uzupełnić końcową objętość do jednego litra wodą. Aby wysterylizować medium, należy je przefiltrować, używając dwumembranowej pompy próżniowej marki Vacuum ME oraz jednostki filtrującej Millipore Stericup z 45 milimetrową szyjką i rozmiarem porów 0.2 mikrona. Proces filtracji może być przeprowadzany przez dwa dni. Medium A SM można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego miesiąca.Rozpocznij od rozcieńczenia nocnych kultur Pseudomonas arosa w podłożu LB, aby uzyskać OD na poziomie 0.05. Następnie rozcieńcz bakterie w stosunku 1:100 na płytce z podłożem SM, rozdzielając po 1,8 ml rozcieńczonej kultury bakteryjnej do 21 studzienek 24-studzienkowej płytki do hodowli tkanek. Do trzech pozostałych studzienek wlej taką samą objętość podłoża SM, które posłużą jako ślepe kontrole negatywne. Zabezpiecz płytkę 24-studzienkową z biofilmem i, aby umożliwić formowanie się biofilmów, umieść ją w warunkach mikroaerofilnych, które można uzyskać za pomocą zestawów do generowania gazów CampiGen w dużych słoikach beztlenowych.Inkubuj kulturę na wytrząsarce przy 75 RPM przez trzy dni w temperaturze 37 °C. Po trzech dniach biofilmy pojawią się w formie żelatynowej masy zawierającej komórki bakteryjne, której nie można rozbić poprzez pipetowanie. Po uformowaniu się biofilmów dodaj do każdej studzienki 200 µL antybiotyku o stężeniach rozcieńczeniowych. Należy przygotować co najmniej cztery powtórzenia dla każdego testowanego stężenia leku oraz pozostawić cztery studzienki z biofilmami niepoddane działaniu leku, aby mogły służyć jako kontrole negatywne.Następnie inkubuj płytki przez kolejne 24 godziny po inkubacji z antybiotykami. Aby rozbić biofilmy, dodaj 100 µL na każdą studzienkę celulazy rozcieńczonej do stężenia 100 mg/mL w buforze cytrynianowym i inkubuj płytki na wytrząsarce przy 150 RPM w warunkach aerobowych w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu tej inkubacji można zastosować ręczne pipetowanie w celu dalszej dezagregacji biofilmów, jeśli w medium widoczne są skupiska komórek.Następnie do każdej studzienki dodaje się 100 µL rezyn w celu określenia żywotności komórek uwolnionych z biofilmu i inkubuje komórki przez jedną do dwóch godzin. W temperaturze 37 °C tylko żywe komórki są w stanie zmetabolizować niebieski barwnik zarin do jego różowej formy fluorescencyjnej. Po inkubacji próbki przenosi się do płytki 96-dołkowej i mierzy fluorescencję w studzienkach, stosując długość fali wzbudzenia 540 nm oraz długość fali emisji 590 nm.Aby określić żywotność bakterii oraz ich wrażliwość na leki, najpierw należy odjąć fluorescencję tła kontroli ujemnej od wyników pozostałych dołków. Następnie obliczamy procent inhibicji, dzieląc średnią fluorescencję dla każdego stężenia przez średnią fluorescencję kontroli nieleczonych i mnożąc wynik przez 100. B-S-M-Y-C definiuje się jako stężenie antybiotyku powodujące 90% inhibicję aktywności metabolicznej; jak pokazano na tych mikrografiach elektronowych, komórki hodowane w biofilmach różnią się znacznie od bakterii hodowanych w kulturach planktonicznych.W szczególności duże ilości macierzy zewnątrzkomórkowej zaznaczone na żółto otaczają komórki w biofilmie zaznaczone na zielono, czego nie obserwuje się w koloniach planktonicznych. Ponadto bakterie w biofilmach w tym doświadczeniu są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki. Minimalne stężenie hamujące tobramycyny dla kultury planktonicznej Pseudomonas aerogen zaznaczonej na niebiesko określono na około 4 µg/mL.W przeciwieństwie do tego, jak pokazano na czerwono, 100% bakterii w biofilmach przeżyło w stężeniu antybiotyku do 512 µg/mL. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować bakterie w zdefiniowanym sztucznym medium plwociny. Powinni Państwo również być w stanie przeprowadzić test wrażliwości na antybiotyki w celu określenia minimalnego stężenia hamującego niezbędnego do zahamowania wzrostu bakterii w środowisku bardziej realistycznie oddającym warunki w płucach przy mukowiscydozie.

use-artificial-sputum-medium-to-test-antibiotic-efficacy-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Zastosowanie sztucznego podłoża plwociny do testowania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom z mukowiscydozą

Źródło: Vieira, J., et al. Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy.  J. Vis. Exp. (2021).Ten film przedstawia przygotowanie sztucznej pożywki z plwociny, która naśladuje lepkość, skład składników odżywczych i pH plwociny płucnej mukowiscydozy. Otrzymana w ten sposób pożywka stanowi fizjologicznie istotną platformę do badań ex vivo.

Przygotowanie sztucznej pożywki z plwociny w celu naśladowania mukowiscydozy i plwociny płucnej ex vivo

Source: Jackson, L., et al. Visualization of Pseudomonas aeruginosa within the Sputum of Cystic Fibrosis Patients. J. Vis. Exp. (2020)This video demonstrates the in situ visualization of Pseudomonas aeruginosa within chemically cleared cystic fibrosis sputum using fluorescent labeling and confocal microscopy to reveal bacterial localization and biofilm structure.

Visualization of Pseudomonas aeruginosa in Sputum Samples from Cystic Fibrosis Patients

Drogi oddechowe pacjentów z mukowiscydozą (CF) są idealnym środowiskiem dla rozwoju patogenów mikrobiologicznych. W manuskrypcie opisano nowatorską metodę badania mikrobiomu płuc mukowiscydozy w środowisku, które naśladuje miejsce, w którym powodują one chorobę i w jaki sposób zmiany warunków chemicznych mogą wpływać na dynamikę drobnoustrojów.

Model WinCF - niedrogi i łatwy w obsłudze mikrokosmos oskrzelika zatkanego śluzem do badania mikrobiologii infekcji płuc

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Ten protokół dostarcza metod wizualizacji komórek bakteryjnych i polisacharydów syntezy locus (Psl) w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą.

Wizualizacja Pseudomonas aeruginosa w plwocinie pacjentów z mukowiscydozą

Ten przepływ pracy może być wykorzystany do przeprowadzenia testów wrażliwości na antybiotyki przy użyciu ustalonego modelu ex vivo biofilmu bakteryjnego w płucach osób z mukowiscydozą. Zastosowanie tego modelu może zwiększyć ważność kliniczną testów MBEC (minimalne stężenie eradykacji biofilmu).

Badanie skuteczności antybiotyków w modelu ex vivo biofilmów Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus w płucach mukowiscydozy

Syntetyczne podłoże do mukowiscydozy (SCFM2) może być używane w połączeniu zarówno z konfokalną laserową mikroskopią skaningową, jak i aktywowanym fluorescencją sortowaniem komórek, aby obserwować agregaty bakteryjne w wysokiej rozdzielczości. W tym artykule szczegółowo opisano metody oceny zagregowanych populacji podczas leczenia przeciwdrobnoustrojowego jako platformę dla przyszłych badań.

Narzędzia do oceny w czasie rzeczywistym modelu zakażenia Pseudomonas aeruginosa

Celem tego protokołu jest opracowanie modelowego systemu dla wpływu hiperoksji na społeczności mikrobiologiczne dróg oddechowych mukowiscydozy.  Sztuczna pożywka z plwociny naśladuje skład plwociny, a warunki hodowli hiperoksycznej modelują wpływ dodatkowego tlenu na społeczności drobnoustrojów płucnych.

Zaprojektowanie i opracowanie modelu do badania wpływu dodatkowego tlenu na mikrobiom dróg oddechowych mukowiscydozy

Ten protokół opisuje czterogatunkowy model wielogatunkowego biofilmu polimikrobiologicznego dla płuc związanego z mukowiscydozą (CF), który może być wykorzystany do zbadania wpływu interakcji międzygatunkowych bakterii.

Hodowla biofilmu wielodrobnoustrojowego istotnego dla mukowiscydozy w celu zbadania fenotypów społeczności

Ta metodologia pozwala na stworzenie modelu wielomikrobiologicznego biofilmu w mukowiscydozie do testowania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe w laboratoriach badawczych i klinicznych. Model ten zapewnia dokładne i wiarygodne wyniki w szerokim zakresie danych wyjściowych.

Opracowanie wielomikrobiologicznego modelu biofilmu kolonijnego do badania środków przeciwdrobnoustrojowych w mukowiscydozie

To badanie nakreśla ramy dla rozwoju modelu zagregowanego biofilmu wielomikrobiologicznego i optymalizacji protokołu ekstrakcji RNA w celu oceny ekspresji genu Pseudomonas aeruginosa odzwierciedlającej środowisko płuc mukowiscydozy. Zastosowania obejmują ocenę działania przeciwdrobnoustrojowego i badanie alternatyw dla antybiotyków w warunkach istotnych dla mukowiscydozy.

Model zagregowanego biofilmu mukowiscydozy do badania ekspresji genów istotnych dla infekcji

Poznaj metodę oceny skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom Pseudomonas aeruginosa w sztucznej plwocinie. Technika ta symuluje warunki płuc chorych na mukowiscydozę i pozwala określić stężenie hamujące wzrost bakterii.

Stosowanie pożywki ze sztucznej plwociny w celu zbadania skuteczności antybiotyku przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej istotnych dla płuc chorych na mukowiscydozę (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Przeglądaj więcej filmów