Wykorzystanie sztucznej pożywki plwocin do badania skuteczności antybiotyków przeciwko Pseudomonas aeruginosa w warunkach bardziej odpowiadających płucom w mukowiscydozie

Celem niniejszego eksperymentu jest ocena skuteczności antybiotyków przeciwko biofilmom Pseudomonas Aerogen w warunkach reprezentatywnych dla przewlekłych infekcji w płucach przy mukowiscydozie, z wykorzystaniem zdefiniowanego sztucznego medium plwocnego. Biofilmy bakteryjne są hodowane w 24-dołkowych płytkach mikrotitracyjnych.

Następnie biofilmy poddaje się działaniu antybiotyków. W kolejnym kroku kultury traktowane antybiotykiem rozbija się przy użyciu celulazy i inkubuje z barwnikiem metabolicznym srin, który jest redukowany z koloru niebieskiego do różowego przez żywe komórki. Poprzez pomiar absorbancji w dołkach można wyznaczyć minimalne stężenie hamujące dla komórek w biofilmie (B-S-M-I-C), aby określić wrażliwość na antybiotyki w warunkach zbliżonych do fizjologicznych.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak wyznaczanie minimalnych stężeń hamujących w oparciu o hodowlę planktonową, jest fakt, że bakterie są hodowane w specjalistycznym medium zawierającym wszystkie składniki plwociny, co sprzyja tworzeniu biofilmu. Biofilmy te wykazują znacznie większą oporność na antybiotyki. Aby przygotować medium, należy najpierw przygotować dwie butelki, z czego w pierwszej powinno znajdować się 250 mililitrów sterylnej wody.

Stopniowo mieszając, dodaj 4 g DNA nasienia ryb do 250 ml sterylnej wody. Mieszaj roztwór w temperaturze pokojowej, aż DNA się rozpuści, a następnie przelej go do drugiej butelki. Stopniowo dodaj 5 g mucyny typu 2 z żołądka świni i wymieszaj.

Po przygotowaniu roztworów DNA i mucyny, rozpuścić aminokwasy w 100 mililitrach sterylnej wody, z wyjątkiem L-tyrozyny i L-cysteiny, które należy rozpuścić odpowiednio w 25 mililitrach wody lub 25 mililitrach 0,5 molarnego wodorotlenku potasu. Następnie rozpuścić 5,9 miligrama DTPA, pięć gramów chlorku sodu i 2,2 grama chlorku potasu w 100 mililitrach wody. Połączyć wszystkie roztwory w butelce o pojemności jednego litra, dodać pięć mililitrów emulsji żółtka jaja, a następnie uzupełnić objętość mieszaniny wodą do 850 mililitrów.

Używając jeden molarnego TRIS, należy dostosować pH do 6.9 i uzupełnić końcową objętość do jednego litra wodą. Aby wysterylizować medium, należy je przefiltrować, używając dwumembranowej pompy próżniowej marki Vacuum ME oraz jednostki filtrującej Millipore Stericup z 45 milimetrową szyjką i rozmiarem porów 0.2 mikrona. Proces filtracji może być przeprowadzany przez dwa dni. Medium A SM można przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do jednego miesiąca.

Rozpocznij od rozcieńczenia nocnych kultur Pseudomonas arosa w podłożu LB, aby uzyskać OD na poziomie 0.05. Następnie rozcieńcz bakterie w stosunku 1:100 na płytce z podłożem SM, rozdzielając po 1,8 ml rozcieńczonej kultury bakteryjnej do 21 studzienek 24-studzienkowej płytki do hodowli tkanek. Do trzech pozostałych studzienek wlej taką samą objętość podłoża SM, które posłużą jako ślepe kontrole negatywne. Zabezpiecz płytkę 24-studzienkową z biofilmem i, aby umożliwić formowanie się biofilmów, umieść ją w warunkach mikroaerofilnych, które można uzyskać za pomocą zestawów do generowania gazów CampiGen w dużych słoikach beztlenowych.

Inkubuj kulturę na wytrząsarce przy 75 RPM przez trzy dni w temperaturze 37 °C. Po trzech dniach biofilmy pojawią się w formie żelatynowej masy zawierającej komórki bakteryjne, której nie można rozbić poprzez pipetowanie. Po uformowaniu się biofilmów dodaj do każdej studzienki 200 µL antybiotyku o stężeniach rozcieńczeniowych. Należy przygotować co najmniej cztery powtórzenia dla każdego testowanego stężenia leku oraz pozostawić cztery studzienki z biofilmami niepoddane działaniu leku, aby mogły służyć jako kontrole negatywne.

Następnie inkubuj płytki przez kolejne 24 godziny po inkubacji z antybiotykami. Aby rozbić biofilmy, dodaj 100 µL na każdą studzienkę celulazy rozcieńczonej do stężenia 100 mg/mL w buforze cytrynianowym i inkubuj płytki na wytrząsarce przy 150 RPM w warunkach aerobowych w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Po zakończeniu tej inkubacji można zastosować ręczne pipetowanie w celu dalszej dezagregacji biofilmów, jeśli w medium widoczne są skupiska komórek.

Następnie do każdej studzienki dodaje się 100 µL rezyn w celu określenia żywotności komórek uwolnionych z biofilmu i inkubuje komórki przez jedną do dwóch godzin. W temperaturze 37 °C tylko żywe komórki są w stanie zmetabolizować niebieski barwnik zarin do jego różowej formy fluorescencyjnej. Po inkubacji próbki przenosi się do płytki 96-dołkowej i mierzy fluorescencję w studzienkach, stosując długość fali wzbudzenia 540 nm oraz długość fali emisji 590 nm.

Aby określić żywotność bakterii oraz ich wrażliwość na leki, najpierw należy odjąć fluorescencję tła kontroli ujemnej od wyników pozostałych dołków. Następnie obliczamy procent inhibicji, dzieląc średnią fluorescencję dla każdego stężenia przez średnią fluorescencję kontroli nieleczonych i mnożąc wynik przez 100. B-S-M-Y-C definiuje się jako stężenie antybiotyku powodujące 90% inhibicję aktywności metabolicznej; jak pokazano na tych mikrografiach elektronowych, komórki hodowane w biofilmach różnią się znacznie od bakterii hodowanych w kulturach planktonicznych.

W szczególności duże ilości macierzy zewnątrzkomórkowej zaznaczone na żółto otaczają komórki w biofilmie zaznaczone na zielono, czego nie obserwuje się w koloniach planktonicznych. Ponadto bakterie w biofilmach w tym doświadczeniu są zazwyczaj bardziej odporne na antybiotyki. Minimalne stężenie hamujące tobramycyny dla kultury planktonicznej Pseudomonas aerogen zaznaczonej na niebiesko określono na około 4 µg/mL.

W przeciwieństwie do tego, jak pokazano na czerwono, 100% bakterii w biofilmach przeżyło w stężeniu antybiotyku do 512 µg/mL. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak hodować bakterie w zdefiniowanym sztucznym medium plwociny. Powinni Państwo również być w stanie przeprowadzić test wrażliwości na antybiotyki w celu określenia minimalnego stężenia hamującego niezbędnego do zahamowania wzrostu bakterii w środowisku bardziej realistycznie oddającym warunki w płucach przy mukowiscydozie.