Name: Ekspresja i oczyszczanie transbłonowego białka regulatora przewodnictwa mukowiscydozy w Saccharomyces cerevisiae (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Poznaj metodę ekspresji białka CFTR w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem znacznika GFP do monitorowania poziomów ekspresji. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości białka dla badań nad mukowiscydozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy fundacji Cystic Fibrosis Foundation (CFF) za sfinansowanie tych prac w ramach konsorcjum CFTR 3D Structure Consortium (numer grantu FORD08XX0). Wyrażamy uznanie dla ogromnego wkładu wszystkich naszych współpracowników z Konsorcjum w tę pracę, w szczególności w zakresie projektowania genów CFTR. Dziękujemy również za nieoceniony wkład dr Jamesa Birtleya (NCSR Demokritos, Grecja), dr Marka Younga (University of Cardiff, Wielka Brytania) oraz dr Davida Drew (Imperial College, Londyn, Wielka Brytania) na wczesnych etapach prac. Szczególne podziękowania kierujemy do dr Iny Urbatsch (Texas Tech University, Lubbock) za krytyczną lekturę manuskryptu.

<ol><li>Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+three-dimensional+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">CFTR three-dimensional structure.</a> Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR%29.+J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).</li>
<li>Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain+location+within+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+investigated+by+electron+microscopy+and+gold+labelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).</li>
<li>Kiser, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae.</a> Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).</li>
<li>Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).</li>
<li>Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+heat-shock+proteins+select+deltaF508-CFTR+for+endoplasmic+reticulum-associated+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation.</a> Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).</li>
<li>Fu, L., Sztul, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-associated+complexes+%28ERACs%29+containing+aggregated+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+are+degraded+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy.</a> Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).</li>
<li>Sun, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derlin-1+promotes+the+efficient+degradation+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+and+CFTR+folding+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants.</a> J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).</li>
<li>Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CFTR+expression+and+ER-associated+degradation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">CFTR expression and ER-associated degradation in yeast.</a> Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).</li>
<li>Drew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).</li>
<li>Knight, A. W., Billinton, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seeing+the+wood+through+the+trees%3A+A+review+of+techniques+for+distinguishing+green+fluorescent+protein+from+endogenous+autofluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence.</a> Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).</li>
<li>Robinson, K. M., Lemire, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+nucleotide+sequence+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+gene+for+the+succinate+dehydrogenase+flavoprotein+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit.</a> J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).</li>
<li>Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+degradation+depends+on%5BTitle%5D)+AND+%22the+lectins+Htm1p%2FEDEM+and+the+Cdc48+protein+complex+in%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on.</a> the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-conventional+trafficking+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+through+the+early+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway.</a> J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).</li>
<li>Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+and+structural+changes+associated+with+phosphorylation+and+nucleotide+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding.</a> Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).</li>
<li>Wellhauser, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).</li>
<li>Ramjeesingh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+monomer+is+the+minimum+functional+unit+required+for+channel+and+ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).</li>
<li>Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylglycerol%3A+a+novel+effective+detergent+for+solubilizing+and+purifying+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Niniejsza praca przedstawia metodę ekspresji mysiego białka CFTR w komórkach drożdży, co powinno ułatwić badania nad mukowiscydozą. Celem jest powiązanie tej pracy z udostępnieniem konstrukcji DNA mysiego CFTR, która będzie dostępna za pośrednictwem Cystic Fibrosis Foundation (<a href="http://www.cff.org/research/CFFT/">http://www.cff.org/research/CFFT/</a>). Inne ortologi powinny stać się dostępne w późniejszym terminie. Transformacja komórek drożdży wektorem zawierającym CFTR jest prosta, jednak ważne jest wyselekcjonowanie kolonii wykazujących wysoki poziom ekspresji CFTR. Zmienne poziomy ekspresji mogą wynikać z kilku czynników, ale liczba kopii plazmidu na komórkę prawdopodobnie odpowiada za znaczną część tych różnic. Opisane tutaj krytyczne etapy powinny umożliwić otrzymanie komórek drożdży eksponujących CFTR oraz błon mikrosomalnych zawierających CFTR. Po opanowaniu procesów transformacji, wzrostu, zbioru i lizy komórek drożdży, możliwa powinna być puryfikacja białka; na Rysunku 3 przedstawiliśmy przykład czystości, którą można osiągnąć w tym przypadku, jako przydatny punkt odniesienia. W niniejszym manuskrypcie nie zamierzamy przedstawiać szczegółowej metodologii puryfikacji białka. Istnieją jednak pewne krytyczne etapy puryfikacji końcowej specyficzne dla systemu ekspresyjnego S.cerevisae, takie jak liza komórek i puryfikacja mikrosomów, które zostały szczegółowo opisane w pracy. Należy jednak wspomnieć, że poza dwiema zastosowanymi przez nas metodami, można wykorzystać alternatywne metody rozbijania komórek drożdży, takie jak użycie prasy francuskiej (French pressure cell). Białko rekombinowane posiada C-terminalną domenę GFP z miejscem cięcia dla proteazy TEV, co pozwala na śledzenie białka po indukcji (Rys. 4). Drożdże posiadają endogenne białko 70kDa (prawdopodobnie dehydrogenazę bursztynianową12), które fluorescuje w tych samych warunkach11, co może stanowić przydatny wewnętrzny standard kalibracyjny dla względnych poziomów ekspresji CFTR w ekstraktach z całych komórek lub w mikrosomach (Rys. 3). Z danych przedstawionych na Rysunku 4 wynika jednoznacznie, że czas zbioru komórek po indukcji galaktozą jest kluczowy. Wydajność CFTR gwałtownie spada po około 16 hr indukcji, tak że po 24 hr indukcji w komórkach drożdży prawie nie wykrywa się CFTR.
Wydajność oczyszczonego białka wynosi około 1-2mg białka CFTR z 15 litrów kultury w fermentorze. Odzysk można oszacować na około 70% całkowitego białka CFTR-GFP do etapu mikrosomów oraz około 25% odzysku białka oczyszczonego. Charakterystyka CFTR ekspresowanego w S. cerevisiae jest w toku. Jak pokazano na Rys. 4, lokalizację białka w komórce można monitorować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Chociaż znaczna część fluorescencji znajduje się wokół peryferii komórki, zgodnie z oczekiwaniami10, część białka wykazuje lokalizację punktową, w obrębie lub tuż wewnątrz błony plazmatycznej, co może wynikać z recyklingu CFTR poprzez późną drogę aparatu Golgiego/endosomalną14 lub być wynikiem obecności w przedziale za etapem pączkowania pęcherzyków transportowych z ER4. Traktowanie PNGazą F, enzymem deglikozylującym białka, wykazało minimalną zmianę w migracji prążka białka CFTR w SDS-PAGE, co sugeruje, że jest ono nieglikozylowane lub wykazuje minimalną glikozylację15. Trwają eksperymenty nad stanem fosforylacji białka. W niektórych z dotychczas przetestowanych detergentów oczyszczone białko wykazuje aktywność ATPase (hamowaną przez specyficzny inhibitor CFTR16) z szybkością podobną do wcześniej opublikowanych danych2,15. Pomiar aktywności kanału CFTR będzie wymagał rekonstytucji oczyszczonego białka, co wiązałoby się z końcowym etapem oczyszczania w detergencie o stosunkowo wysokim krytycznym stężeniu micelarnym (cmc)17. Mikrosomy drożdżowe zawierające CFTR można solubilizować za pomocą kilku powszechnie stosowanych detergentów18, w tym detergentów takich jak dodecyl maltosyd2, które są ogólnie uważane za „łagodne”. Jednakże większość detergentów o wysokim cmc okazała się do tej pory nieefektywna w solubilizacji, co sugeruje, że wymianę na te detergenty należy rozważyć na późnym etapie każdego schematu oczyszczania.

<table><tbody><tr><td>Szczep FGY217 &lt;em&gt;S.cerevisiae&lt;/em&gt;, z delecją &lt;em&gt;pep4&lt;/em&gt; &lt;sup&gt;10&lt;/sup&gt; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Podłoże azotowe dla drożdży bez aminokwasów</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>Kompletna mieszanina suplementów bez uracylu</td><td>Formedium</td><td>DCS0169</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5306</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoza</td><td>Fisher</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Fisher</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatyna A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4265</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Merck</td><td>108975</td><td></td></tr><tr><td>Chimostatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Fenylometanosulfonylofluorek (PMSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Epoksysuccinylo-leucyloamido-butan (E-64)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>Amin&amp;#8211;tylobenzenosulfonylofluorek (AEBSF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8456</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek benzamidyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434760</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylendiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Fisher</td><td>BP120500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher</td><td>P631</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1876</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher</td><td>065017</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-dodecyl-&amp;#946;-D-maltopiranozyd</td><td>Affymetrix</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114391</td><td></td></tr><tr><td>Barwione standardy białkowe PageRuler Plus</td><td>Fermentas</td><td>SM1811</td><td></td></tr><tr><td>Żele gradientowe NuSep tris-gly 4-20%</td><td>NuSep</td><td>NB10-420</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik Coomassie Instant Blue</td><td>Novexin</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki szklane, myte kwasem</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki Falcon 50 ml</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne fiolki z nakrętką 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.005</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kolby Erlenmeyera z wypustkami 250 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>355119</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne kolby Erlenmeyera z wypustkami 2 l</td><td>BD Biosciences</td><td>355131</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi 2 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72.695</td><td></td></tr><tr><td>Filtr strzykawkowy 0,2&amp;mu;M</td><td>Sartorius</td><td>FC121</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do ultracentryfugi</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirówki</td><td>Beckman Coulter</td><td>357000</td><td></td></tr><tr><td>Kubki do wirówki 1 l</td><td>Beckman Coulter</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsaniem orbitalnym i kontrolą temperatury</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop do rekonstrukcji RT Deltavision</td><td>Applied Vision</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka nakładkowa</td><td>HERMLE</td><td>Z300</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowirówka nakładkowa</td><td>Fisher</td><td>13-100-511</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło Vortex</td><td>Star Labs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Skaner Typhoon Trio</td><td>GE Healthcare</td><td>63-0055-87</td><td></td></tr><tr><td>System obrazowania LAS3000</td><td>Fuji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik fermentora 20 l i jednostka sterująca</td><td>Applikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator komórkowy Constant systems</td><td>Constant systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizator komórkowy Beadbeater</td><td>BioSpec</td><td>1107900</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadbeater-16</td><td>BioSpec</td><td>607</td><td></td></tr><tr><td>Rotor JA-17</td><td>Beckman Coulter</td><td>369691</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga Optima L-100</td><td>Beckman Coulter</td><td>392050</td><td></td></tr><tr><td>Rotor 50.2Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=337901">337901&lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w saccharomyces cerevisiae

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) jest kanałem chlorkowym, którego mutacje mogą prowadzić do rozwoju mukowiscydozy u ludzi. Istnieje zatem duże zainteresowanie tym białkiem, jednak próby zbadania jego struktury i aktywności były utrudnione ze względu na trudności w ekspresji i oczyszczaniu odpowiednich ilości białka1-3. Podobnie jak w przypadku wielu „trudnych” eukariotycznych białek błonowych, pożądana, lecz wymagająca, jest ekspresja w szybko rosnącym organizmie; w drożdżach S. cerevisiae dotychczas uzyskiwano niskie ilości białka i obserwowano jego szybką degradację 4-9. Opisano białka zaangażowane w procesing rekombinowanego CFTR w drożdżach6-9. W niniejszym raporcie opisujemy metodologię ekspresji CFTR w drożdżach oraz jego oczyszczania w znaczących ilościach. Protokół opisuje, w jaki sposób można przezwyciężyć wcześniejsze problemy z proteolizą oraz jak znacznie zwiększyć poziom ekspresji CFTR poprzez modyfikację warunków wzrostu komórek i kontrolę warunków indukcji, w szczególności czasu przed zbiorem komórek. Odczynniki związane z niniejszym protokołem (drożdże ekspresyjne mysiego CFTR lub plazmidy drożdżowe) będą dystrybuowane za pośrednictwem US Cystic Fibrosis Foundation, która sponsorowała te badania. Artykuł opisujący projekt i syntezę konstrukcji CFTR wykorzystanej w tym raporcie zostanie opublikowany oddzielnie (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., niepublikowane). W niniejszym artykule wyjaśnimy naszą metodę, zaczynając od transformacji komórek drożdży plazmidem drożdżowym zawierającym konstrukt CFTR (Rys. 1). Konstrukt posiada sekwencję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) połączoną z CFTR na jego C-końcu i opiera się na systemie opracowanym przez Drew et al. (2008)10. GFP pozwala na stosunkowo łatwe monitorowanie ekspresji i oczyszczania CFTR. Wizualizowany protokół JoVE kończy się na przygotowaniu mikrosomów z komórek drożdży, choć zamieszczamy kilka sugestii dotyczących oczyszczania białka z mikrosomów. Czytelnicy mogą wprowadzić własne modyfikacje do procedury oczyszczania mikrosomów, w zależności od końcowych eksperymentów planowanych z białkiem oraz dostępnego sprzętu laboratoryjnego. Białko CFTR wyekspresowane w drożdżach może zostać częściowo oczyszczone za pomocą chromatografii powinowactwa do jonów metali, wykorzystując wewnętrzny znacznik oczyszczania polihistydynowy. Następująca po niej chromatografia wykluczania cząsteczek pozwala uzyskać białko, które według analizy SDS-PAGE i barwienia żelu Coomassie wydaje się być czyste w &gt;90%.

Próby ekspresji regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) w Saccharomyces cerevisiae przynosiły dotychczas stosunkowo niskie ilości białka. Niniejszy protokół oraz powiązane z nim odczynniki dystrybuowane przez Cystic Fibrosis Foundation powinny umożliwić przygotowanie miligramowych ilości tego „trudnego” eukariotycznego białka błonowego.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR) jest kanałem chlorkowym, którego mutacja może prowadzić do rozwoju mukowiscydozy w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ekspresja białka CFTR w ilościach liczonych w miligramach w Charmy Visier. Jest to osiągane poprzez wstępny wybór kolonii TRANSFORMANT do prób wzrostu i ekspresji w 50 mililitrowych kulturach komórkowych. Następnie identyfikuje się linie komórkowe oraz kolonie wykazujące ekspresję CFTR.Następnie kolonie o najwyższej ekspresji CFTR są hodowane w 15-litrowym fermentorze. Na koniec przygotowuje się lizaty komórkowe oraz mikrosomy zawierające CFTR. Ostatecznie wyniki wykazują ekspresję i ekstrakcję CFTR połączonego z GFP za pomocą fluorescencji Ingel oraz mikroskopii fluorescencyjnej.Główną zaletą tej techniki w stosunku do istniejących metod ekspresji CFTR jest wykorzystanie prostego gospodarza eukariotycznego, który jest tani, szybko rośnie i jest łatwy w hodowli. Posiada on znacznik w postaci zielonego białka fluorescencyjnego, co umożliwia szybkie monitorowanie poziomów ekspresji. Ponadto w procedurze tej zminimalizowano liczbę etapów biologii molekularnej.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu mukowiscydozy, takie jak właściwości biofizyczne białka CFTR. Zastosowania tej techniki obejmują terapię mukowiscydozy, ponieważ może ona doprowadzić do opracowania nowych badań przesiewowych leków opartych na oczyszczonym białku. Dzięki lekom oddziałującym bezpośrednio na białko możliwe będzie stworzenie nowych kategorii preparatów terapeutycznych.Główna wada w mukowiskozie powinna być bardziej specyficzna i potencjalnie wywoływać mniej efektów plejotropowych. Ponadto oczyszczanie dużych ilości białka jest istotne dla uzyskania struktury CFTR o wysokiej rozdzielczości. Projektowanie leków w oparciu o strukturę białka powinno usprawnić działanie istniejących preparatów i potencjalnie doprowadzić do odkrycia nowych leków.Publikacja niniejszej pracy oraz towarzyszącego jej filmu jest powiązana z udostępnieniem DNA lub zmodyfikowanych komórek przez Cystic Fibrosis Foundation. W celu uzyskania tych materiałów prosimy o kontakt z Elizabeth Joof w Cystic Fibrosis Foundation. Konieczne będzie podpisanie umowy o przekazaniu materiałów (MTA).Niniejsza metoda pozwala zapoznać się z zastosowaniem znacznika GFP do ekspresji białek błonowych, wprowadzoną przez Davida Drewa i jego współpracowników z Imperial College London. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności podczas transformacji. Wydajność transformacji może być niska, a czas zbioru komórek jest krytyczny dla uzyskania odpowiedniego poziomu ekspresji.Pomysł na tę metodę pojawił się po raz pierwszy podczas wizyty Davida Drew i zespołu z naszego laboratorium. Prowadzili oni badania strukturalne białek błonowych, które wyekspresowali i oczyścili z drożdży przy użyciu tego systemu. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ transformacja komórek, ich wzrost po indukcji oraz izolacja mikrosomów są trudne, a publikacja jest powiązana z udostępnieniem odczynnika.Film ten pomoże również w standaryzacji protokołu, aby różne laboratoria mogły porównywać swoje wyniki. Procedurę tę zaprezentują Tracy Remington i Natasha Kant, obie studentki studiów doktoranckich w naszym laboratorium. Liam o Ryan, drugi współautor artykułu, przebywa obecnie w Nowej Zelandii i nie mógł wziąć udziału w demonstracji. Po transformacji szczepu s visi FGY 2 1 7 plazmidem drożdżowym kodującym gen C-F-T-R-G-F-P eight hiss, wybierz od 5 do 10 dobrze oddzielonych kolonii z płytki transformacyjnej.Przenieś każdą kolonię do oddzielnej sterylnej probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów zawierającej 9 ml pożywki yeast nitrogen base (YNB) oraz 1 ml glukozy. Hoduj kultury przez noc, przez 16 godzin, przy 250 RPM i 30 °C w inkubatorze z wytrząsaniem orbitalnym, aby przygotować zapasy glicerolowe dla każdej z przesianych kolonii. Aseptycznie dodaj 0,8 ml kultur nocnych do 0,2 ml sterylnego glicerolu w oznakowanych fiolkach z nakrętką.Krótko wymieszać w wirówce typu vortex i przechowywać w temperaturze -80 °C. Pozostałe kultury nocne rozcieńczyć do końcowej objętości 50 mL w pożywce YMB z 250 µL pożywki z glukozą. Hodowle prowadzić w oznakowanych, 250-mililitrowych kolbach Erlenmeyera z przegrodami do wartości OD 600 wynoszącej 0,7 do 0,8, przy 250 RPM i 30 °C w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną. Indukować kultury, dodając do każdej kolby 5 mL pożywki z galaktozą. Obniżyć temperaturę inkubatora do 25 °C i hodować przez noc, przez 16 godzin.Przenieś hodowle do probówek Falcon o pojemności 50 ml. Zbierz komórki poprzez wirowanie w wirówce laboratoryjnej z prędkością 3 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Przygotuj probówki do mikrocentryfugi z nakrętką o pojemności 2 ml, zawierające około 300 µL szklanych koralików mytych kwasem, i umieść je w lodzie.Odlej nadsączniki i ponownie zawieś każdy osad w 800 µL lodowatego buforu do resuspensji komórek (CRB) z inhibitorami proteaz. Przenieś zawiesiny do probówek typu mikro i przechowuj je w lodzie. Przenieś komórki do urządzenia mini bead beater i inkubuj przez trzy minuty.Umieść probówki w mikrowirówce laboratoryjnej i wiruj z przyspieszeniem 3 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Przenieś nadnadłośia zawierające membrany do czystych probówek do mikrowirówki i umieść je na lodzie. Zbierz membrany nieoczyszczone, wirując w maksymalnej prędkości w temperaturze 4 °C w mikrowirówce laboratoryjnej przez 2 godziny.Odlej supernatant i ponownie zawieś każdy osad w 50 µL schłodzonego buforu CFTR w czystych probówkach typu microcentrifuge. Wymieszaj 15 µL każdej zawiesiny z 15 µL dwukrotnego barwnika do ładowania (loading dye) poprzez pipetowanie.Nie należy gotować próbek, ponieważ spowoduje to tworzenie nierozpuszczalnych w SDS agregatów białka CFTR oraz innych białek błonowych, a także denaturację znacznika GFP. Próbki, a także wstępnie barwiony standard białkowy, należy nanieść na żel gradientowy z glicyną o stężeniu od 4 do 20% i prowadzić elektroforezę przy napięciu 150 V przez 40 minut. Po przeprowadzeniu fluorescencji w żelu w celu zidentyfikowania komórek o najwyższej ekspresji oraz weryfikacji ekspresji poprzez barwienie Coomassie, należy wyizolować linię komórkową o najwyższej ekspresji z zapasu w glicerolu na nową płytkę YNBA i inkubować w temperaturze 30 °C przez dwa do trzech dni.Przechowywać płytkę do dwóch tygodni w temperaturze 4°C w celu przygotowania prekultur do fermentora. Za pomocą sterylnej pętli zebrać komórki z obszaru o wymiarach 1 cm x 1 cm z płytki A-Y-N-B-A, a następnie dodać je do 45 ml pożywki YMB i 5 ml pożywki z glukozą, aby uzyskać OD 600 na poziomie około 0,1. Hodować kultury w inkubatorze z wytrząsarką orbitalną przy 250 RPM i temperaturze 30°C, aż OD 600 osiągnie wartość 1.Podziel kulturę pomiędzy dwie dwulitrowe kolby Erlenmeyera z przegrodami, z których każda zawiera 450 ml pożywki YMB i 25 ml glukozy. Hoduj pożywkę przez noc w inkubatorze wytrząsowym przy 250 RPM i 30 °C, aż OD 600 osiągnie wartość 1,2. W celu przygotowania fermentora przygotuj 11,2 l pożywki YNB, a następnie dodaj dodatkowe 8,28 g YNB oraz 0,95 g suplementacji dropout, aby zrekompensować dodatek glicerolu podczas indukcji.Następnie w warunkach aseptycznych dodaj 11,2 litra YNB oraz 75 mililitrów pożywki glukozowej do sterylnego naczynia fermentora o pojemności 20 litrów i ustaw temperaturę pracy na 30 °C. Następnie w warunkach aseptycznych dodaj prekultury do fermentora. Ustaw prędkość mieszania na około 800 RPM i dostosuj przepływ sprężonego powietrza do około 15 dm³ na minutę.Gdy hodowla osiągnie OD 600 na poziomie 1,2, przeprowadź indukcję, dodając aseptycznie 1,5 litra pożywki z galaktozą oraz 1,2 litra glicerolu. Obniż temperaturę do 25 °C i pozostaw kulturę do wzrostu na 16 godzin, korzystając z pompy perystaltycznej. Przenieś kulturę do schłodzonych, jednolitrowych probówek wirówkowych umieszczonych w lodzie.Zabierz komórki poprzez wirowanie przez 30 minut przy 3 500 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Resuspenduj komórki w 150 mililitrach lodowatego buforu do resuspensji micro zone lub MRB z inhibitorami proteaz i jednym milimolarnym DTT. Od tego momentu wszystkie czynności wykonuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Użyj urządzenia do rozbijania komórek, aby poddać komórki lizie.Następnie przenieść lizaty do probótek Falcon o pojemności 50 ml i odwirować szczątki komórkowe przez wirowanie przy 3 500 ×g w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Aby usunąć mitochondria, przenieść nadsącz do schłodzonych probótek do wirowania i wirować przy 14 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Następnie, w celu wyizolowania mikrosomów, przenieść nadsącz do schłodzonych probótek do ultrawirowania i wirować przy 200 000 ×g w temperaturze 4 °C przez 90 minut.Ostrożnie odlej i usuń nadsącz, a następnie do każdej probówki dodaj dwa mililitry lodowatego buforu CFTR z inhibitorami proteaz i jeden milimol DTT. Używając pędzelka, delikatnie zresuspenduj osady. Następnie dopełnij każdą probówkę buforem CFTL i wymieszaj w wstrząsarce wirowej. Centryfuguj zawiesinę przy 100 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 60 minut.Odrzucić osad i za pomocą pędzla powtórzyć proces resuspensji w 2 ml lodowatego buforu CFTR z inhibitorami proteaz i 1 mM DTT. Odwirować resuspensowane mikrosomy, następnie uzupełnić objętość końcową do 50 ml buforem CFTR i dokładnie wymieszać. Odstawić 1 ml alikwotu do elektroforezy SDS-PAGE, a mikrosomy przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji CFTR z mikrosomów.Należy odnieść się do protokołu pisemnego. Transformacja drożdży plazmidem zawierającym CFTR nie jest w 100% wydajna. Reprezentatywny screening w małej skali ekspresji CFTR w wybranych koloniach z eksperymentu transformacyjnego wykaże, że około jedna na cztery kolonie wykazuje ekspresję przedstawionego białka.Poniżej przedstawiono wyniki przesiewu pięciu kolonii pobranych z płytki. Jedna kolonia wykazuje silny poziom ekspresji białka fuzyjnego C-F-T-R-G-F-P. Poziomy fluorescencji C-F-T-R-G-F-P będą znacznie zróżnicowane w zależności od eksperymentu, przy czym kolonia czwarta wykazuje co najmniej 10-krotnie większą fluorescencję niż wewnętrzny prążek fluorescencyjny przy około 70 kilodaltonach.Nawet przy wysokim poziomie ekspresji C-F-T-R-G-F-P, jak pokazano po lewej stronie, mało prawdopodobne jest, aby prążek C-F-T-R-G-F-P był widoczny w ekstrakcie komórkowym po barwieniu kumasi, co widać po prawej stronie. Rysunek ten pokazuje obecność C-F-T-R-G-F-P w mikrosomach. Wyniki tego eksperymentu są istotne nie tylko dla oceny wydajności indukcji ekspresji, ale także dla sprawdzenia, czy mikrosony zostały przygotowane starannie i czy zminimalizowano proteolizę.Jak pokazano tutaj. Wzrost komórek powyżej 16 godzin spowoduje spadek ekspresji CFTR. Jest to prawdopodobnie spowodowane obrotem białka, być może w wyniku nadekspresji mechanizmów kontroli jakości białek u drożdży.Zaleca się zatem monitorowanie poziomów ekspresji CFTR po indukcji, wykorzystując fluorescencję żelową oraz obrazowanie fluorescencyjne. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest monitorowanie wzrostu komórek za pomocą pomiarów OD 600. Przed zwiększeniem skali należy wszystko przetestować w małej skali i sprawdzić ekspresję białka w funkcji czasu po indukcji, ponieważ optymalny czas zbioru komórek może się różnić w zależności od laboratorium.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskiwać ilości białka CFTR rzędu miligramów w drożdżach Scro Visier. Po zastosowaniu tej procedury białko CFTR może zostać oczyszczone z mikrosomów drożdżowych w celu dalszej charakterystyki biochemicznej i biofizycznej. Technika ta, opracowana przez Davida Drew i jego współpracowników, utorowała drogę do lepszej ekspresji eukariotycznych białek błonowych.Mamy nadzieję, że praca ta wpłynie na badania nad mukowiscydozą, umożliwiając laboratoriom na całym świecie produkcję CFTR przy użyciu taniego i prostego systemu ekspresji. Niniejsza praca nie byłaby możliwa bez wsparcia Cystic Fibrosis Foundation oraz oczywiście naszych współpracowników z CFTR three dimensional Structure Consortium. Należy pamiętać, że praca z każdym organizmem rekombinowanym jest ściśle regulowana, a procedury obchodzenia się z nimi i ich utylizacji powinny zostać zatwierdzone przez odpowiedni organ regulacyjny przed rozpoczęciem jakichkolwiek prac.

expression-purification-cystic-fibrosis-transmembrane-conductance

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekspresja i Oczyszczanie Białka Regulatora Przewodnictwa Transbłonowego Mukowiscydozy w Saccharomyces cerevisiae

Wykazano, że regulator przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie (CFTR), będący nabłonkowym kanałem chlorkowym, oddziałuje z różnymi białkami i reguluje istotne procesy komórkowe; wśród nich dobrze udokumentowano oddziaływania pośredniczone przez motyw PDZ białka CFTR. Niniejszy protokół opisuje opracowane przez nas metody składania kompleksu sygnalizacyjnego makromolekularnego CFTR zależnego od domeny PDZ in vitro.

In vitro analiza makromolekularnych kompleksów sygnałowych CFTR zależnych od domen PDZ

Przygotowanie wysokiej jakości ekstraktów z komórek drożdży jest niezbędnym pierwszym krokiem w analizie pojedynczych białek lub całych proteomów.  Tutaj opisujemy szybki, wydajny i niezawodny protokół homogenizacji pączkujących komórek drożdży, który został zoptymalizowany w celu zachowania funkcji białek, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych.

Ekstrakcja i oczyszczanie białek pączkujących drożdży w celu badania funkcji, interakcji i modyfikacji potranslacyjnych

Heterologiczna ekspresja i oczyszczanie transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy (CFTR) są znaczącymi wyzwaniami i czynnikami ograniczającymi rozwój terapii lekowych mukowiscydozy. Protokół ten opisuje dwie metody izolacji miligramowych ilości CFTR odpowiednie do badań funkcjonalnych i strukturalnych.

Oczyszczanie białka transbłonowego regulatora przewodnictwa mukowiscydozy ulegającego ekspresji w Saccharomyces cerevisiae

Opisana tutaj jest szybka i skuteczna procedura funkcjonalnego odtwarzania oczyszczonego dzikiego i zmutowanego białka CFTR, które zachowuje aktywność tego kanału chlorkowego, który jest wadliwy w mukowiscydozie. Wypływ jodku z odtworzonych proteoliposomów, w którym pośredniczy CFTR, umożliwia badanie aktywności kanałów i wpływu małych cząsteczek.

Pomiary funkcjonalnej rekonstytucji i aktywności kanałowej oczyszczonego białka CFTR typu dzikiego i zmutowanego

Interakcje białek są sercem funkcji komórki. Do ich scharakteryzowania powszechnie stosuje się techniki kalorymetryczne i spektroskopowe. Tutaj opisujemy anizotropię fluorescencji jako narzędzie do badania interakcji między białkiem zmutowanym w zespole Shwachmana-Diamonda (SBDS) a GTPazą podobną do czynnika elongacji 1 (EFL1).

Anizotropia fluorescencyjna jako narzędzie do badania oddziaływań białko-białko

Ten protokół opisuje techniki używane do określania struktur kanałów jonowych za pomocą mikroskopii krioelektronowej, w tym system bakulowirusa używany do efektywnej ekspresji genów w komórkach ssaków przy minimalnym wysiłku i toksyczności, ekstrakcję białek, oczyszczanie i kontrolę jakości, przygotowanie siatki próbek i badanie przesiewowe, a także zbieranie i przetwarzanie danych.

Ekspresja i oczyszczanie ludzkiego wrażliwego na lipidy kanału kationowego TRPC3 do oznaczania strukturalnego za pomocą mikroskopii krioelektronowej pojedynczych cząstek

Tutaj prezentujemy protokół do ekspresji, solubilizacji i oczyszczania kilku eukariotycznych transporterów boranu o homologii do rodziny transporterów SLC4 za pomocą drożdży. Opisujemy również chemiczny test sieciowania w celu oceny oczyszczonych białek homomerycznych pod kątem składania multimerycznego. Protokoły te można dostosować do innych trudnych białek błonowych.

Ekspresja, solubilizacja i oczyszczanie eukariotycznych transporterów boranu

Ten artykuł opisuje protokół cytometrii przepływowej oparty na FRET, który pozwala określić ilościowo samoorganizację białek zarówno w komórkach S. cerevisiae, jak i HEK293T.

Wykrywanie i charakterystyka samoorganizacji białek in vivo za pomocą cytometrii przepływowej

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten artykuł przedstawia protokół izolacji błony plazmatycznej na małą skalę w celu scharakteryzowania białka Cdr1 Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), którego nadekspresja występuje w Saccharomyces cerevisiae. Podwójny znacznik c-końcowy mGFPHis z rozszczepialnym proteazą z łącznikiem 16 reszt między Cdr1 a znacznikiem został zaprojektowany w celu ułatwienia oczyszczania i przesiewania detergentem Cdr1.

Preparat błony plazmatycznej na małą skalę do analizy Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Badania strukturalne i biochemiczne ludzkich transporterów błonowych wymagają miligramowych ilości stabilnego, nienaruszonego i jednorodnego białka. W tym miejscu opisujemy skalowalne metody badań przesiewowych, ekspresji i oczyszczania ludzkich transporterów nośników substancji rozpuszczonych przy użyciu genów zoptymalizowanych pod kątem kodonów.

Wysokoprzepustowa ekspresja i oczyszczanie ludzkich nośników substancji rozpuszczonych do badań strukturalnych i biochemicznych

Poznaj metodę ekspresji białka CFTR w Saccharomyces cerevisiae z wykorzystaniem znacznika GFP do monitorowania poziomów ekspresji. Protokół umożliwia uzyskanie miligramowych ilości białka dla badań nad mukowiscydozą.

Ekspresja i oczyszczanie białka regulatora przewodnictwa przezbłonowego w mukowiscydozie w Saccharomyces cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów