Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi indukowanych zapachami w neuronach receptorowych węchu myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie nabłonka węchowego i izolację neuronów receptorowych węchu myszy. Drugim krokiem jest umieszczenie wyizolowanych neuronów receptorowych węchu w komorze rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie odwróconym.

Mikromanipulatory utrzymują elektrodę rejestrującą oraz układ wymiany roztworów. Następnie zassaj zidentyfikowany neuron receptora węchowego do końcówki elektrody z pipety ssącej. Ostatnim krokiem jest umieszczenie pipety z zassaną w jej końcówce komórką przed układem wymiany roztworów w celu poddania neuronu działaniu substancji zapachowych.

Ostatecznie metoda rejestracji za pomocą pipety ssącej jest wykorzystywana do badania funkcji neuronów receptorowych węchu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technika clampy napięciowej całego komórki, jest możliwość prowadzenia długotrwałych rejestracji przy zastosowaniu szybkich i precyzyjnych zmian roztworów. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ istotny jest kształt pipety rejestrującej, a stabilne umieszczenie komórek w jej końcówce jest trudne do opanowania.

Procedurę rozpoczynamy od wyciągnięcia mikropipety z borokrzemianowej kapilary szklanej UNFI w wyciągaczu mikropipet, aby uzyskać długi stożek. Następnie przenosimy pipetę do wykonanego na zamówienie uchwytu do mikropipet zamontowanego na mikroskopie pionowym. Mikroskop jest wyposażony w celownik w okularze oraz ruchomy nóż diamentowy zamontowany na stole.

Następnie należy obserwować końcówkę pipety pod obiektywem 20 x. Jako prowadnicę należy wykorzystać redle. Delikatnie naciąć pipetę pod kątem 90 stopni za pomocą specjalnie wykonanego noża diamentowego na zewnętrznej średnicy pipety wynoszącej 10 micrometers.

Przesuń nóż diamentowy bliżej końcówki. Stopniowo wywieraj na niego nacisk. Końcówka pipety powinna przełamać się w sposób czysty w miejscu nacięcia.

Następnie, pod obiektywem 40x, wypoleruj końcówkę pipety za pomocą elektrycznie podgrzewanego włókna, aż do uzyskania średnicy wewnętrznej wynoszącej 5 µm. Po zakończeniu mikropipeta jest gotowa do rejestracji prądów z neuronów myszy. W kolejnym kroku uśmierć mysz i odetnij jej głowę.

Następnie zdejmij skórę pokrywającą czaszkę, a w dalszej kolejności przedziel głowę wzdłuż linii środkowej. Następnie przenieś obie połowy głowy pod stereo mikroskop sekcyjny. Usuń przegrodę nosową oraz małżowiny nosowe.

Umieść tkankę w płytce Petriego z roztworem Ringera dla ssaków zawierającym glukozę. Następnie oddziel nabłonek węchowy od leżącej pod nim chrząstki z dwóch małżowin nosowych. Przenieś tkankę do probówki typu Eppendorf zawierającej 250 µL roztworu Ringera.

Następnie pozostałą tkankę przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Probówkę EOR zawierającą nabłonek węchowy wymieszać krótko dwukrotnie przez jedną sekundę na średnich obrotach za pomocą wortexa. Ten etap prowadzi do mechanicznej dysocjacji NS z nabłonka.

Następnie umieść roztwór Ringera zawierający dysocjowane ORN w komorze rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie, a za pomocą pęsety precyzyjnej usuń z zawiesiny duże fragmenty tkanki. Pozostaw ORN do osadzenia na 20 minut przed rozpoczęciem ciągłej perfuzji roztworem Ringera i przystąpieniem do rejestracji w ramach tej procedury; napełnij pipetę roztworem Ringera. Umieść pipetę w uchwycie i przymocuj uchwyt do głowicy wzmacniacza patch-clamp.

Następnie podłącz linię olejową do bocznego portu uchwytu pipety. Następnie opuść pipetę do komory rejestracyjnej. Wyreguluj wysokość zbiornika z olejem, aby wytworzyć lekko dodatnie ciśnienie na końcówce pipety.

Można to zrobić, obserwując, czy szczątki komórkowe oddalają się od pipety, czy się do niej zbliżają. Należy starać się nie zanieczyścić końcówki pipety szczątkami komórkowymi. Następnie należy przeszukać komorę pomiarową w poszukiwaniu odosobnionego neuronu receptorowego węchowego (ORN), który można rozpoznać po typowej morfologii dwubiegunowej przy powiększeniu od 20 do 40 x.

Następnie przesuń elektrodę rejestrującą w bezpośrednie sąsiedztwo ciała komórki ORN. Delikatnie zassać powietrze z przewodu podłączonego do zbiornika z olejem, aby ciało komórki weszło w końcówkę pipety. Kontynuuj ostrożne i powolne zasysanie, aż całe ciało komórki zostanie wciągnięte do końcówki pipety ssącej, pozostawiając dendryt i rzęski wystawione na roztwór kąpieli.

Przenieś pipetę ssącą z sekcji zawierającej osadzone ORN do sekcji rejestracyjnej komory. Ostrożnie umieść pipetę ssącą przed trójkanałową rurką służącą do wymiany roztworu. Pipeta ssąca powinna zostać umieszczona wystarczająco blisko otworu trójkanałowej rurki, aby ORN był wystawiony na przepływ laminarny, co pozwoli uniknąć turbulencji mieszania. Aby przeprowadzić wymianę roztworu, przesuń granicę między równoległymi strumieniami płynącego roztworu z trójkanałowej rurki wymiennika roztworów przez końcówkę pipety ssącej, aby monitorować jakość i niezawodność wymiany roztworu.

Można zmierzyć prąd złącza wywołany przemieszczeniem komórki pomiędzy roztworami o różnym składzie jonowym. Czas trwania wymiany roztworów wynosi zazwyczaj około 20 milisekund. W momencie przeniesienia neuronu receptorowego węchu do roztworu z substancją zapachową, można tutaj wywołać odpowiedź indukowaną przez odorant.

ORN był wystawiony na działanie 100 µM eugenolu przez jedną sekundę, co zaznaczono paskiem nad zapisem. Na górnym panelu prąd receptorowy został przefiltrowany przy szerokości pasma od 0 do 50 Hz, aby wyświetlić jedynie prąd receptorowy. Dolny panel przedstawia ten sam zapis przefiltrowany przy szerokim pasmie od 0 do 5 000 Hz, aby wyświetlić również potencjały czynnościowe. Przedstawiono tutaj odpowiedzi na dawkę eugenolu dla ORN reagującego na ten związek. Eugenol stosowano w stężeniach od 0,3 µM do 100 µM.

Czas trwania bodźca wynosił jedną sekundę, a ślady zostały przefiltrowane w zakresie od 0 do 50 hertz. Progresywny wzrost stężenia substancji zapachowej prowadził do silniejszej i szybciej narastającej odpowiedzi, która również wolniej wygasała. Po zakończeniu ekspozycji na substancję zapachową, ORNS mogą wykazywać oscylacyjny wzorzec odpowiedzi podczas długich stymulacji przy pośrednich stężeniach substancji zapachowej.

W tym przypadku stymulowano przez osiem sekund ORN reagujący na acetofenon. Po szybkim i przejściowym szczycie odpowiedzi na początku stymulacji, podczas wykonywania tej procedury obserwuje się serię mniejszych, powtarzających się odpowiedzi. Ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z neuronami receptorowymi węchu i wykazać się dużą cierpliwością.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.