Name: Reakcje wywołane zapachem zarejestrowane z neuronów receptorów węchowych przy użyciu techniki pipety ssącej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: Poznaj technikę pipety ssącej do rejestracji odpowiedzi neuronów receptorów węchowych myszy na bodźce zapachowe. Ta metoda umożliwia jednoczesny zapis prądów receptorowych i potencjałów czynnościowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH DC009613, Human Frontiers Science Program oraz stypendium Morley Care Fellowship (dla JR).

1. Konfiguracja rejestracji
Komora rejestracyjna jest zamontowana na odwróconym mikroskopie Nikon TE2000U Eclipse z optyką kontrastową fazową, który spoczywa na stole pneumatycznym i jest ekranowany elektrycznie za pomocą klatki Faradaya. Pleksiglasowa komora rejestracyjna składa się z dwóch sekcji częściowo oddzielonych barierą i przyklejonych do zylanyzowanego szkiełka przedmiotowego. Jedna sekcja komory służy do osadzania komórek, natomiast druga do ekspozycji na bodziec podczas rejestracji, aby zminimalizować przedwczesną ekspozycję osadzonych, ale jeszcze niewykorzystanych komórek na substancję zapachową. Układ rejestracyjny składa się z pipety ssącej (patrz poniżej) zamontowanej w uchwycie do pipet oraz elektrody uziemiającej. Pipeta ssąca jest pozycjonowana za pomocą mikromanipulatora. Roztwory bodźców są aplikowane za pomocą potrójnego szklanego kwadratowego kapilarnego układu rurek, gdzie każda rurka ma wymiary 0,7 mm x 0,7 mm. Potrójna szklana kapilara została podłączona do zmotoryzowanego systemu perfuzji szybkiego kroku zamontowanego na manipulatorze (Sutter SF-77B, Warner Instruments) i wprowadzona do komory rejestracyjnej pod kątem ~45°. Końcówka potrójnej szklanej kapilary została ścięta pod kątem 45°, tak aby końcowa powierzchnia (otwór) potrójnej kapilary była pionowa, co pozwala na bliskie pozycjonowanie pipety.
Elektroda pipety ssącej wypełniona standardowym roztworem Ringera dla ssaków oraz elektroda uziemiająca są podłączone do przedwzmacniacza 1 GΩ wzmacniacza patch clamp (PC-501A, Warner Instruments) pracującego w trybie voltage clamp. Sygnał analogowy z wzmacniacza (filtrowany dolnoprzepustowo przy 5 kHz) jest wyświetlany na cyfrowym oscyloskopie w celu monitorowania sygnału w czasie rzeczywistym, a także podłączony do 8-biegunowego filtra Bessela (Krohn-Hite), gdzie sygnał jest filtrowany dolnoprzepustowo przy 50 Hz. Oba sygnały (filtrowane dolnoprzepustowo przy 5 kHz i 50 Hz) są przesyłane do przetwornika A/D (Cambridge Electronic Design Micro 1401 mkII), który jest podłączony do komputera PC w celu akwizycji danych. Dane są rejestrowane przy użyciu oprogramowania do akwizycji Signal 3 (Cambridge Electronic Design) przy częstotliwości próbkowania 10 kHz. Sygnał jest rejestrowany w dwóch różnych szerokościach pasma, aby najpierw zarejestrować prąd receptorowy wraz z nałożonymi potencjałami czynnościowymi, a następnie sam prąd receptorowy (patrz. Rys. 2). System perfuzyjny jest wykorzystywany do szybkiego przełączania między roztworem Ringera (kontrolnym) a bodźcami zapachowymi lub dowolnym roztworem o pożądanym składzie i jest sterowany przez komputer PC oraz oprogramowanie Signal 3. Roztwory znajdują się w strzykawkach o pojemności 60 ml, a szybkość przepływu jest regulowana za pomocą medycznych regulatorów przepływu do infuzji dożylnych. Typowo szybkość przepływu jest ustawiona na 1 ml/min.
Ssanie w pipecie rejestrującej jest kontrolowane w następujący sposób: boczny otwór uchwytu pipety jest połączony z linią olejową, która z kolei jest podłączona do zbiornika olejowego o regulowanej wysokości. Podnoszenie lub opuszczanie zbiornika zapewnia, aby ciśnienie w pipecie, a tym samym przepływ płynu Ringera przez końcówkę pipety, był minimalny i lekko dodatni. Dodatkowe ssanie lub ciśnienie można przyłożyć za pomocą rurki podłączonej do przestrzeni powietrznej zbiornika z ustnikiem na drugim końcu, aby wciągnąć ciało komórkowe wyizolowanego ORN do końcówki pipety rejestrującej.
Doświadczenia przeprowadzane są w temperaturze 37 °C, aby dokładnie symulować naturalne warunki fizjologiczne komórki. Temperaturę kontroluje się poprzez przepuszczanie roztworów przez specjalnie wykonaną jednostkę grzejną, składającą się z rezystorów ceramicznych, przez które przechodzą stalowe rurki zawierające roztwory10. Temperaturę monitoruje się za pomocą termometru z termoparą (Fluke).
2. Roztwory
Roztwór Ringera dla ssaków (mM): 140 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl2, 2 CaCl2, 0,01 EDTA, 10 HEPES, 10 Glucose. pH skorygowano do 7,5 za pomocą NaOH. Do pomiaru prądu złączeniowego wykorzystano 10% rozcieńczony roztwór Ringera. Roztwory substancji zapachowych: Acetofenon i eugenol przygotowywano codziennie w roztworze Ringera z zapasów 20 mM DMSO.
3. Wykonywanie elektrod
<ol>
 <li>Umieść niefilamentowaną kapilarę borokrzemianową w wyciągarze do mikropipet Sutter P-97 i wyciągnij mikropipetę o długim zwężeniu.</li>
 <li>Przenieś pipetę do wykonanego na zamówienie uchwytu na mikropipety zamontowanego na mikroskopie Nikon E200 Eclipse, który jest wyposażony w siatkę pomiarową w okularze oraz ruchomy nóż diamentowy zamontowany na stoliku.</li>
 <li>Obserwując końcówkę pipety pod obiektywem 20x i korzystając z siatki pomiarowej jako prowadnicy, delikatnie nacinaj pipetę pod kątem 90° za pomocą wykonanego na zamówienie noża diamentowego w miejscu, gdzie szerokość (średnica zewnętrzna) pipety wynosi 10 μm.</li>
 <li>Przesuń nóż diamentowy dalej w stronę końcówki i stopniowo wywieraj nacisk na końcówkę nożem diamentowym. Końcówka pipety powinna czysto pęknąć w miejscu nacięcia.</li>
</ol>
Alternatywnie kroki od 3.1 do 3.4 można połączyć i wyciągnąć pipety o pożądanych wymiarach bezpośrednio, bez konieczności odcinania końcówki pipety, choć może to okazać się trudniejsze w przypadku niezawodnego wyciągania pipet o tak dużej średnicy końcówki i czysto odciętych krawędziach.
<ol start="5">
 <li>Pod obiektywem 40x wypoleruj końcówkę pipety za pomocą elektrycznie podgrzewanego włókna, aż do uzyskania średnicy wewnętrznej 5 μm. Po zakończeniu mikropipeta jest gotowa do rejestracji prądów z neuronów węchowych (ORN) myszy. Oporność otwartej pipety wypełnionej roztworem Ringera powinna wynosić około 1 MΩ.</li>
</ol>
4. Izolacja neuronów receptorowych węchu
<ol>
 <li>Uśmierć mysz zgodnie z wytycznymi i regulacjami instytucjonalnymi. Odetnij głowę, zdejmij skórę pokrywającą czaszkę i przetnij głowę wzdłuż linii środkowej na dwie połowy.</li>
 <li>Umieść obie połowy głowy pod stereomikroskopem sekcyjnym, usuń przegrodę nosową oraz turbinaty węchowe. Wszystkie tkanki umieść w szalce Petriego z roztworem Ringera dla ssaków zawierającym glukozę.</li>
 <li>Oddziel nabłonek węchowy od leżącej pod nim chrząstki w dwóch turbinatach i przenieś tkankę do probówki Eppendorfa zawierającej 250 μl roztworu Ringera. Używamy tkanki z 2 turbinatów, aby uzyskać odpowiednią gęstość komórek dla rozmiaru naszej komory rejestracyjnej. Pozostałą tkankę przechowuj w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.</li>
 <li>Dwie razy krótko wymieszaj probówkę Eppendorfa z nabłonkiem węchowym w wirówce typu vortex przez 1 s przy średniej prędkości. Krok ten prowadzi do mechanicznej dysocjacji ORN z nabłonka.</li>
 <li>Przenieś roztwór Ringera z dysocjowanymi ORN do komory rejestracyjnej. Za pomocą precyzyjnej pęsety usuń duże fragmenty tkanki obecne w zawiesinie.</li>
 <li>Pozostaw ORN do osadzenia na 20 min przed rozpoczęciem ciągłej superfuzyjności roztworem Ringera, a następnie przystąp do rejestracji.</li>
</ol>
5. Rejestracja
<ol>
 <li>Obniż elektrodę ssącą podłączoną do linii olejowej do komory rejestracyjnej i wyreguluj wysokość zbiornika z olejem, aby wytworzyć lekko dodatnie ciśnienie na końcówce pipety. Można to zrobić, obserwując np. przemieszczanie się szczątków komórkowych od (ciśnienie dodatnie) lub w stronę (ciśnienie ujemne) pipety. Staraj się nie zanieczyszczać końcówki pipety szczątkami komórkowymi.</li>
 <li>Przeskanuj komorę rejestracyjną w poszukiwaniu izolowanego ORN, który można rozpoznać po typowej morfologii bipolarnej, używając powiększenia 20-40x. Przesuń elektrodę rejestracyjną w bezpośrednie sąsiedztwo ciała komórki ORN. Delikatnie rozpocznij ssanie tak, aby ciało komórki weszło do końcówki pipety. Ostrożnie i powoli kontynuuj ssanie, aż całe ciało komórki zostanie wciągnięte do końcówki pipety ssącej, pozostawiając dendryt i rzęski wystawione na działanie roztworu w kąpieli. Obrazy zassanych ORN oraz kształty pipet przedstawiono w publikacjach7,11. Upewnij się, że po zaprzestaniu ssania ORN nie przesuwa się w głąb pipety ani z niej nie wysuwa. W przeciwnym razie odpowiednio dostosuj wysokość zbiornika z olejem.</li>
 <li>Za pomocą mikromanipulatorów przesuń pipetę ssącą z sekcji zawierającej osiadłe ORN do sekcji rejestracyjnej komory. Ostrożnie umieść pipetę ssącą przed 3-kanałową rurką do wymiany roztworów. Pipeta ssąca powinna być umieszczona wystarczająco blisko otworu 3-kanałowej rurki, aby ORN był wystawiony na przepływ laminarny, co pozwoli uniknąć turbulencji mieszania i zapewni szybką wymianę roztworów. Wymiana roztworów odbywa się poprzez przesuwanie granicy między równoległymi strumieniami płynącego roztworu przez końcówkę pipety ssącej. Czas trwania wymiany roztworu wynosi zazwyczaj około 20 ms, mierząc od prądu złącza wywołanego przejściem komórki między roztworami o różnym składzie jonowym (patrz Rys. 2). Roztwory są podawane grawitacyjnie.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat mechanizmu neuronu węchowego; przedstawia aktywację receptorów, transdukcję sygnału i rolę kanałów jonowych." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig1.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. A) Bipolarne neurony receptorowe w opuszce węchowej. B) Aparat transdukcji sygnału w rzęskach prowadzi w ostateczności do napływu prądu pobudzającego. Następująca po tym depolaryzacja wyzwala generowanie potencjału czynnościowego w ciele komórki.
<img alt="Wykres średniego prądu (pA) w funkcji czasu (s), przedstawiający średnią i SD w danych elektrofizjologicznych." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig2.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2 przedstawia szybkość i niezawodność wymiany roztworów. Pipetę przełączono z roztworu normalnego na 10 % rozcieńczony roztwór Ringera na 100 ms i zarejestrowano prąd złącza wynikający z różnicy stężeń jonów. Czarna linia to średnia z 5 prób, czerwona linia to ich SD. Niewielka zmiana SD podczas wymiany roztworów świadczy o powtarzalności wymiany między próbami oraz braku nadmiernego szumu w obu strumieniach roztworów.
<img alt="Wpływ eugenolu na prąd ssawki; wykres elektrofizjologiczny; pomiary potencjałów czynnościowych." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig3.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rysunek 3."> 
Rysunek 3 przedstawia odpowiedź indukowaną eugenolem w neuronie receptorowym węchowym (ORN) z wykorzystaniem techniki pipety ssącej. ORN wystawiono na działanie 100 μM eugenolu przez 1 sekundę, co zaznaczono paskiem nad zapisem. Na Rys. 3A (ślad czarny) prąd receptorowy przefiltrowano w pasmie 0 - 50 Hz, aby wyświetlić wyłącznie prąd receptorowy. Rys. 3B pokazuje ten sam zapis, przefiltrowany w szerokim pasmie 0 - 5000 Hz (ślad czerwony), aby wyświetlić również potencjały czynnościowe (APs, wskazane strzałkami). Wstawka przedstawia ten sam ślad w powiększonej skali czasowej, aby wyraźniej zobrazować APs w momencie rozpoczęcia odpowiedzi.
<img alt="Wykresy prądów ssących dla eugenolu i acetofenonu; elektrofizjologia, analiza zależności odpowiedź-stężenie." src="/files/ftp_upload/3862/3862fig4.jpg" data-altupdatedat="1761809329000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Rodzina odpowiedzi dawka-reakcja dla ORN reagującego na eugenol (A). Eugenol stosowano w stężeniach od 0,3 μM do 100 μM, czas trwania bodźca wynosił 1 s, a sygnały filtrowano w zakresie 0 - 50 Hz. Stopniowe zwiększanie stężenia substancji zapachowej prowadziło do silniejszej i szybszej odpowiedzi, która również wolniej wygasała po zakończeniu ekspozycji na odorant.
ORN mogą wykazywać oscylacyjny wzorzec odpowiedzi podczas długotrwałych stymulacji przy pośrednich stężeniach substancji zapachowej (Ryc. 4B). Tutaj ORN reagujący na acetofenon (3 μM) był stymulowany przez 8 sekund. Po szybkim i przejściowym szczycie odpowiedzi na początku stymulacji obserwuje się serię mniejszych, powracających odpowiedzi. Pasmo przenoszenia rejestracji wynosiło 0 - 50 Hz.

<ol><li>Reisert, J., Zhao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on%3A+Information+and+coding+in+mammalian+sensory+physiology%3A+Response+kinetics+of+olfactory+receptor+neurons+and+the+implications+in+olfactory+coding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding.</a> J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).</li>
<li>Kaupp, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+signalling+in+vertebrates+and+insects%3A+differences+and+commonalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Olfactory signalling in vertebrates and insects: differences and commonalities.</a> Nat. Rev. Neurosci. 11, 188-200 (2010).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kleene, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electrochemical+basis+of+odor+transduction+in+vertebrate+olfactory+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Senses%22%5BJournal%5D)">The electrochemical basis of odor transduction in vertebrate olfactory cilia.</a> Chem. Senses. 33, 839-859 (2008).</li>
<li>Baylor, D. A., Lamb, T. D., Yau, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+retinal+rods+to+single+photons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Responses of retinal rods to single photons.</a> J. Physiol. 288, 613-634 (1979).</li>
<li>Wang, J., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+Suction+Recordings+from+Mouse+Cone+Photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Single-cell Suction Recordings from Mouse Cone Photoreceptors.</a> J. Vis. Exp. (35), e1681(2010).</li>
<li>Lowe, G., Gold, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatial+distributions+of+odorant+sensitivity+and+odorant-induced+currents+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatial distributions of odorant sensitivity and odorant-induced currents in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 442, 147-168 (1991).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2B-dependent+Ca2%2B+extrusion+governs+response+recovery+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Na+-dependent Ca2+ extrusion governs response recovery in frog olfactory receptor cells.</a> J. Gen. Physiol. 112, 529-535 (1998).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+odour-induced+response+in+frog+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the odour-induced response in frog olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 519, 801-813 (1999).</li>
<li>Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+compact+modular+flow+heater+for+the+superfusion+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A compact modular flow heater for the superfusion of mammalian cells.</a> J. Physiol. 518P, 13(1999).</li>
<li>Reisert, J., Matthews, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+receptor+current+and+intraciliary+Ca2%2B+concentration+in+salamander+olfactory+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of receptor current and intraciliary Ca2+ concentration in salamander olfactory receptor cells.</a> J. Physiol. 535, 637-645 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Technika pipety ssącej jest metodą elektrofizjologiczną wykorzystywaną do jednoczesnej rejestracji indukowanego zapachem powolnego prądu receptorowego oraz szybkich dwufazowych potencjałów czynnościowych z ORN. Ponieważ błona plazmatyczna komórki nie zostaje przerwana, metoda ta pozostawia środowisko wewnątrzkomórkowe niezakłócone, co gwarantuje, że odpowiedzi na odoranty nie ulegną zmianie w wyniku zmian stężeń jonów w cytoplazmie lub rozcieńczenia czynników wewnątrzkomórkowych. Rejestracja z komórek może być prowadzon...

<table><tbody><tr><td>Stół pneumatyczny</td><td>sprzęt</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pompa powietrzna</td><td>sprzęt</td><td>Newport Corp.</td><td>ACGP</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz pipet</td><td>sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe</td><td>sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop Nikon Eclipse</td><td>sprzęt</td><td>Nikon Instruments</td><td>TE2000U</td><td>Wyposażony w lampę Hg, filtr GFP oraz obiektywy co najmniej 20X i 5X</td></tr><tr><td>Wzmacniacz PC-501A</td><td>sprzęt</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0008</td><td>Przedwzmacniacz (headstage) 1 G&amp;#937;</td></tr><tr><td>Nóż diamentowy</td><td>Sprzęt</td><td>Custom Made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digitalizator Mikro1401 A/D</td><td>sprzęt</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtracyjna 3382</td><td>sprzęt</td><td>Krohn-Hite Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Signal</td><td>oprogramowanie</td><td>Cambridge Electronic Design</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Formowany pelet Ag/AgCl</td><td>sprzęt</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>64-1297</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do pipet</td><td>sprzęt</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0997</td><td>Zmodyfikowany specjalnie, aby pasował do przedwzmacniacza (headstage)&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Komora rejestracyjna</td><td>Sprzęt</td><td>Custom Made</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator MP85-1028</td><td>sprzęt</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>Micromanipulator MP85-1028</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>roztwór</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330779-1L</td><td></td></tr><tr><td>Oscyloskop TDS 1001</td><td>sprzęt</td><td>Tektronix, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trzykanałowa kwadratowa rurka szklana</td><td>Sprzęt</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0119</td><td>ID 0,6 mm, długość 5 cm</td></tr><tr><td>Zawór</td><td>sprzęt</td><td>The Lee Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valvelink 8.2</td><td>sprzęt</td><td>AutoMate Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF-77B Szybki krok perfuzyjny</td><td>sprzęt</td><td>Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Zwierzęta badają otaczające je pachnące środowisko za pomocą systemów chemorecepcyjnych znajdujących się w jamie nosowej. Sygnały chemorecepcyjne wpływają na złożone zachowania, takie jak wybór pokarmu, rozpoznawanie drapieżników, przedstawicieli własnego gatunku oraz partnerów, a także inne istotne sygnały społeczne. Neurony receptorowe węchu (ORNs) znajdują się w grzbietowej części jamy nosowej, wbudowane w nabłonek węchowy. Te neurony dwubiegunowe wysyłają akson do opuszki węchowej (patrz Rys. 1, Reisert &amp; Zhao1, pierwotnie opublikowano w Journal of General Physiology) i wysyłają pojedynczy dendryt do brzegu nabłonka, z którego rzęski promieniują do śluzu pokrywającego nabłonek węchowy. Rzęski zawierają mechanizm transdukcji sygnału, który ostatecznie prowadzi do napływu prądu pobudzającego przez ciliarne kanały transdukcyjne, kanał sterowany cyklicznymi nukleotydami (CNG) oraz kanał Cl- aktywowany jonami Ca2+ (Rys. 1). Następująca po tym depolaryzacja wyzwala generowanie potencjału czynnościowego w ciele komórki2-4.
W tym filmie opisujemy zastosowanie „techniki pipety ssącej” do rejestracji odpowiedzi wywołanych zapachami w neuronach receptorowych węchu (ORN). Metoda ta została pierwotnie opracowana do rejestracji z fotoreceptorów pręcikowych5, a jej wariant, zmodyfikowany do rejestracji z fotoreceptorów czopkowych myszy, dostępny jest na stronie jove.com6. Technika pipety ssącej została później zaadaptowana również do rejestracji z ORN7,8. W skrócie, po dysocjacji nabłonka węchowego i izolacji komórek, całe ciało komórkowe ORN jest wciągane do końcówki pipety rejestrującej. Dendryt i rzęski pozostają wystawione na roztwór kąpieli, a tym samym są dostępne na zmiany w roztworze, co umożliwia np. aplikację substancji zapachowych lub blokerów farmakologicznych. W tej konfiguracji nie uzyskuje się dostępu do środowiska wewnątrzkomórkowego (brak clampowania napięcia w całej komórce), a napięcie wewnątrzkomórkowe pozostaje zmienne. Pozwala to na jednoczesną rejestrację powolnego prądu receptorowego powstającego w rzęskach oraz szybkich potencjałów czynnościowych generowanych przez ciało komórkowe9. Różnica w kinetyce tych dwóch sygnałów pozwala na ich rozdzielenie przy użyciu różnych ustawień filtrów. Technikę tę można stosować u myszy typu dzikiego lub knockout, a także do selektywnej rejestracji z ORN wykazujących ekspresję GFP w celu oznaczenia specyficznych podgrup ORN, np. wykazujących ekspresję danego receptora zapachowego lub kanału jonowego.

Neurony receptorowe węchu (ORNs) przekształcają sygnały zapachowe najpierw w prąd receptorowy, który z kolei wywołuje potencjały czynnościowe przekazywane do neuronów drugiego rzędu w opłatce węchowej. W niniejszej pracy opisujemy technikę pipety ssącej służącą do jednoczesnego rejestrowania indukowanego substancją zapachową prądu receptorowego oraz potencjałów czynnościowych z ORNs myszy.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Zwierzęta badają otaczające je środowisko zapachowe za pomocą systemów chemosensorycznych zlokalizowanych w jamie nosowej. Sygnały chemosensoryczne wpływają na złożone...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest rejestracja odpowiedzi indukowanych zapachami w neuronach receptorowych węchu myszy. Jest to realizowane poprzez najpierw wypreparowanie nabłonka węchowego i izolację neuronów receptorowych węchu myszy. Drugim krokiem jest umieszczenie wyizolowanych neuronów receptorowych węchu w komorze rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie odwróconym.Mikromanipulatory utrzymują elektrodę rejestrującą oraz układ wymiany roztworów. Następnie zassaj zidentyfikowany neuron receptora węchowego do końcówki elektrody z pipety ssącej. Ostatnim krokiem jest umieszczenie pipety z zassaną w jej końcówce komórką przed układem wymiany roztworów w celu poddania neuronu działaniu substancji zapachowych.Ostatecznie metoda rejestracji za pomocą pipety ssącej jest wykorzystywana do badania funkcji neuronów receptorowych węchu. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak technika clampy napięciowej całego komórki, jest możliwość prowadzenia długotrwałych rejestracji przy zastosowaniu szybkich i precyzyjnych zmian roztworów. Demonstracja wizualna tej metody jest kluczowa, ponieważ istotny jest kształt pipety rejestrującej, a stabilne umieszczenie komórek w jej końcówce jest trudne do opanowania.Procedurę rozpoczynamy od wyciągnięcia mikropipety z borokrzemianowej kapilary szklanej UNFI w wyciągaczu mikropipet, aby uzyskać długi stożek. Następnie przenosimy pipetę do wykonanego na zamówienie uchwytu do mikropipet zamontowanego na mikroskopie pionowym. Mikroskop jest wyposażony w celownik w okularze oraz ruchomy nóż diamentowy zamontowany na stole.Następnie należy obserwować końcówkę pipety pod obiektywem 20 x. Jako prowadnicę należy wykorzystać redle. Delikatnie naciąć pipetę pod kątem 90 stopni za pomocą specjalnie wykonanego noża diamentowego na zewnętrznej średnicy pipety wynoszącej 10 micrometers.Przesuń nóż diamentowy bliżej końcówki. Stopniowo wywieraj na niego nacisk. Końcówka pipety powinna przełamać się w sposób czysty w miejscu nacięcia.Następnie, pod obiektywem 40x, wypoleruj końcówkę pipety za pomocą elektrycznie podgrzewanego włókna, aż do uzyskania średnicy wewnętrznej wynoszącej 5 µm. Po zakończeniu mikropipeta jest gotowa do rejestracji prądów z neuronów myszy. W kolejnym kroku uśmierć mysz i odetnij jej głowę.Następnie zdejmij skórę pokrywającą czaszkę, a w dalszej kolejności przedziel głowę wzdłuż linii środkowej. Następnie przenieś obie połowy głowy pod stereo mikroskop sekcyjny. Usuń przegrodę nosową oraz małżowiny nosowe.Umieść tkankę w płytce Petriego z roztworem Ringera dla ssaków zawierającym glukozę. Następnie oddziel nabłonek węchowy od leżącej pod nim chrząstki z dwóch małżowin nosowych. Przenieś tkankę do probówki typu Eppendorf zawierającej 250 µL roztworu Ringera.Następnie pozostałą tkankę przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza do późniejszego użycia. Probówkę EOR zawierającą nabłonek węchowy wymieszać krótko dwukrotnie przez jedną sekundę na średnich obrotach za pomocą wortexa. Ten etap prowadzi do mechanicznej dysocjacji NS z nabłonka.Następnie umieść roztwór Ringera zawierający dysocjowane ORN w komorze rejestracyjnej zamontowanej na mikroskopie, a za pomocą pęsety precyzyjnej usuń z zawiesiny duże fragmenty tkanki. Pozostaw ORN do osadzenia na 20 minut przed rozpoczęciem ciągłej perfuzji roztworem Ringera i przystąpieniem do rejestracji w ramach tej procedury; napełnij pipetę roztworem Ringera. Umieść pipetę w uchwycie i przymocuj uchwyt do głowicy wzmacniacza patch-clamp.Następnie podłącz linię olejową do bocznego portu uchwytu pipety. Następnie opuść pipetę do komory rejestracyjnej. Wyreguluj wysokość zbiornika z olejem, aby wytworzyć lekko dodatnie ciśnienie na końcówce pipety.Można to zrobić, obserwując, czy szczątki komórkowe oddalają się od pipety, czy się do niej zbliżają. Należy starać się nie zanieczyścić końcówki pipety szczątkami komórkowymi. Następnie należy przeszukać komorę pomiarową w poszukiwaniu odosobnionego neuronu receptorowego węchowego (ORN), który można rozpoznać po typowej morfologii dwubiegunowej przy powiększeniu od 20 do 40 x.Następnie przesuń elektrodę rejestrującą w bezpośrednie sąsiedztwo ciała komórki ORN. Delikatnie zassać powietrze z przewodu podłączonego do zbiornika z olejem, aby ciało komórki weszło w końcówkę pipety. Kontynuuj ostrożne i powolne zasysanie, aż całe ciało komórki zostanie wciągnięte do końcówki pipety ssącej, pozostawiając dendryt i rzęski wystawione na roztwór kąpieli.Przenieś pipetę ssącą z sekcji zawierającej osadzone ORN do sekcji rejestracyjnej komory. Ostrożnie umieść pipetę ssącą przed trójkanałową rurką służącą do wymiany roztworu. Pipeta ssąca powinna zostać umieszczona wystarczająco blisko otworu trójkanałowej rurki, aby ORN był wystawiony na przepływ laminarny, co pozwoli uniknąć turbulencji mieszania. Aby przeprowadzić wymianę roztworu, przesuń granicę między równoległymi strumieniami płynącego roztworu z trójkanałowej rurki wymiennika roztworów przez końcówkę pipety ssącej, aby monitorować jakość i niezawodność wymiany roztworu.Można zmierzyć prąd złącza wywołany przemieszczeniem komórki pomiędzy roztworami o różnym składzie jonowym. Czas trwania wymiany roztworów wynosi zazwyczaj około 20 milisekund. W momencie przeniesienia neuronu receptorowego węchu do roztworu z substancją zapachową, można tutaj wywołać odpowiedź indukowaną przez odorant.ORN był wystawiony na działanie 100 µM eugenolu przez jedną sekundę, co zaznaczono paskiem nad zapisem. Na górnym panelu prąd receptorowy został przefiltrowany przy szerokości pasma od 0 do 50 Hz, aby wyświetlić jedynie prąd receptorowy. Dolny panel przedstawia ten sam zapis przefiltrowany przy szerokim pasmie od 0 do 5 000 Hz, aby wyświetlić również potencjały czynnościowe. Przedstawiono tutaj odpowiedzi na dawkę eugenolu dla ORN reagującego na ten związek. Eugenol stosowano w stężeniach od 0,3 µM do 100 µM.Czas trwania bodźca wynosił jedną sekundę, a ślady zostały przefiltrowane w zakresie od 0 do 50 hertz. Progresywny wzrost stężenia substancji zapachowej prowadził do silniejszej i szybciej narastającej odpowiedzi, która również wolniej wygasała. Po zakończeniu ekspozycji na substancję zapachową, ORNS mogą wykazywać oscylacyjny wzorzec odpowiedzi podczas długich stymulacji przy pośrednich stężeniach substancji zapachowej.W tym przypadku stymulowano przez osiem sekund ORN reagujący na acetofenon. Po szybkim i przejściowym szczycie odpowiedzi na początku stymulacji, podczas wykonywania tej procedury obserwuje się serię mniejszych, powtarzających się odpowiedzi. Ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z neuronami receptorowymi węchu i wykazać się dużą cierpliwością.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

odorant-induced-responses-recorded-from-olfactory-receptor-neurons

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Reakcje wywołane zapachem zarejestrowane z neuronów receptorów węchowych przy użyciu techniki pipety ssącej

Rejestracja elektroolfaktogramu (EOG) jest informacyjną, łatwą do przeprowadzenia i niezawodną metodą oceny funkcji węchowych na poziomie nabłonka węchowego. Niniejszy protokół opisuje konfigurację układu rejestracyjnego, przygotowanie tkanek mysich, gromadzenie danych oraz podstawową analizę danych.

Analiza odpowiedzi neuronów sensorycznych węchu myszy z wykorzystaniem zapisu elektroolfaktogramu w fazie gazowej

Ten film demonstruje elektrofizjologiczny zapis węchowych neuronów czuciowych (OSN) u myszy przy użyciu techniki perforowanego patch-clamp. Nabłonek węchowy, zawierający OSN z receptorami zapachowymi znakowanymi fluoroforem, jest izolowany od myszy i umieszczany w komorze rejestracyjnej. Pipeta rejestrująca jest zaciśnięta na dendrytycznym pokrętle OSN, a nystatyna w pipecie perforuje membranę, tworząc połączenie elektryczne z komórką. Na koniec za pomocą kolejnej pipety dostarcza się...

Perforowany zapis węchowych neuronów czuciowych u myszy

Wideo z protokołem opisuje tworzenie klamry do rejestracji elektrofizjologicznej z całych komórek z neuronów czuciowych narządu lemieszowo-nosowego (VNO) u myszy. Koronalny wycinek VNO z fluorescencyjnie znakowanymi neuronami czuciowymi umieszcza się w konfiguracji rejestracyjnej. Znakowany neuron jest łatany pipetą rejestrującą w konfiguracji całej komórki w celu zapisu elektrofizjologicznego w odpowiedzi na bodźce chemiczne.

Ustanowienie klamry krosowej dla całej komórki do zapisu elektrofizjologicznego z neuronów czuciowych lemieszowo-nosowych

W tym filmie żywa mucha Drosophila jest zamontowana w tubie do badań elektrofizjologicznych. Elektrody są umieszczone u podstawy czułki, aby rejestrować specyficzne odpowiedzi neuronalne na feromony za pomocą neuronów receptorów węchowych muchy.

Zapisy elektrofizjologiczne z Drosophila sensilla w odpowiedzi na lotne substancje zapachowe

Pokazujemy różne warianty techniki wewnątrzkomórkowego zapisu wielojednostkowego, aby scharakteryzować reakcje wywołane zapachem w pierwszych trzech etapach szlaku węchowego bezkręgowców. Techniki te można łatwo zaadaptować do badania aktywności zespołu również w innych systemach neuronowych.

Wielojednostkowe metody rejestracji w celu scharakteryzowania aktywności neuronalnej w obwodach węchowych szarańczy (Schistocerca americana)

Analiza fizjologicznych właściwości węchowych neuronów czuciowych nadal napotyka na techniczne ograniczenia. Tutaj rejestrujemy je przez perforowany patch-clamp w nienaruszonym preparowaniu nabłonka węchowego u myszy ukierunkowanych na geny. Technika ta pozwala na scharakteryzowanie właściwości błony i odpowiedzi na określone ligandy neuronów wyrażających określone receptory węchowe.

Perforowany zapis patch-clamp węchowych węchowych neuronów czuciowych myszy w nienaruszonym neuroepithelium: analiza funkcjonalna neuronów wyrażających zidentyfikowany receptor zapachowy

Pluskwy polegają na neuronach receptorów węchowych umieszczonych w ich czułkach węchowych do wykrywania substancji semiochemicznych w środowisku. Wykorzystując rejestrację pojedynczego czujnika, demonstrujemy metodę oceny reakcji pluskiew na substancje semiochemiczne i badamy związany z tym proces kodowania.

Wykorzystanie pojedynczego zapisu sensillum do wykrywania reakcji neuronów węchowych pluskiew na substancje semiochemiczne

Scharakteryzowanie funkcji receptorów zapachowych jest nieodzowną częścią procesu desierotyzacji. Opisujemy metodę pomiaru aktywacji receptorów zapachowych w czasie rzeczywistym za pomocą testu cAMP.

Pomiar aktywacji receptora zapachowego na żywych komórkach za pomocą testu cAMP w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem tego protokołu jest pokazanie, jak prezentować substancje zapachowe o niskiej lotności do rejestracji pojedynczej sensyllum z neuronów receptora węchowego Drosophila, które reagują na długołańcuchowe feromony kutykularne.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila trichoid Sensilla w odpowiedzi na substancje zapachowe o niskiej lotności

Fizjologicznie, receptory zapachowe są aktywowane przez cząsteczki odorantu wdychane w fazie gazowej. Jednak większość systemów in vitro wykorzystuje stymulację odorantem w fazie ciekłej. W tym artykule przedstawiamy metodę, która pozwala na monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego po stymulacji odoranta w fazie gazowej.

Monitorowanie in vitro w czasie rzeczywistym aktywacji receptora zapachowego przez nawaniacz w fazie gazowej

Zewnątrzkomórkowy zapis wielopunktowy z nerwu węchowego jest czułą, solidną i powtarzalną metodą oceny wrażliwości węchowej u ryb morskich. Rejestruje pierwotne bodźce sensoryczne i jest niezależny od zewnętrznego zasolenia.

Zewnątrzkomórkowy zapis wielojednostkowy z nerwu węchowego teleostów

Poznaj technikę pipety ssącej do rejestracji odpowiedzi neuronów receptorów węchowych myszy na bodźce zapachowe. Ta metoda umożliwia jednoczesny zapis prądów receptorowych i potencjałów czynnościowych.

Rejestracja odpowiedzi indukowanych substancjami zapachowymi w neuronach receptorowych węchowych z wykorzystaniem techniki pipety ssącej

Przeglądaj więcej filmów