Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowe określenie poziomów ekspresji cząsteczek mikro RNA w raku prostaty oraz w prawidłowej tkance prostaty przy użyciu ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednią ekstrakcję całkowitego RNA z tkanek prostaty, co obejmuje mRNA, mikro RNA oraz inne małe RNA.

Następnie RNA poddawane jest odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA. Dalej przeprowadzana jest reakcja PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem barwnika Cybergreen, w której cDNA służy jako matryca do amplifikacji i ilościowego oznaczenia ekspresji mikroRNA w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki wykazują względną ekspresję mikroRNA w różnych próbkach prostaty na podstawie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest wysoka czułość, dokładność i powtarzalność, a także szybkość i efektywność kosztowa. Metoda ta może być wykorzystywana do odpowiadania na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, ponieważ ekspresja microRNA często koreluje z genami silnie zaangażowanymi w proces nowotworowy. Możemy zatem wykorzystać QPCR do oceny ekspresji microRNA i sprawdzenia, jak koreluje ona ze zmiennymi klinicznymi.

Biomarkery te mogą potencjalnie służyć zarówno jako narzędzia diagnostyczne, jak i prognostyczne. Mogą one pomóc w diagnozowaniu raka prostaty, a także w określeniu, które nowotwory prostaty mają charakter agresywny. Ponadto istnieje potencjał wykorzystania tych biomarkerów jako czynników terapeutycznych.

Metoda ta nie tylko pozwala na uzyskanie wglądu w genezę guzów prostaty, ale może być również zastosowana w przypadku innych nowotworów i chorób. Pobierz próbki prostaty w momencie przeprowadzenia ektomii i zorientuj preparat, korzystając z punktów anatomicznych. Oznacz prostatę oraz pęcherzyki nasienne w następujący sposób: stronę prawą kolorem zielonym, a stronę lewą kolorem niebieskim.

Pobierz losowy poprzeczny przekrój środkowy tkanki prostopadle do powierzchni odbytnicy, zamroź próbkę i przechowuj ją w temperaturze -80 °C. Wykonaj zdjęcie i zorientuj przekroje preparatów, a następnie podziel je na cztery równe części. Skonsultuj się z patomorfologiem w celu wyznaczenia obszarów nowotworowych oraz obszarów prawidłowych na odpowiadającym im obrazie.

Należy wykorzystać zaznaczone obszary jako wskazówkę do identyfikacji tkanki nowotworowej w celu ekstrakcji RNA w celu izolacji RNA. Pracę należy rozpocząć od umieszczenia zamrożonych próbek prostaty na suchym lodzie i odniesienia się do wykonanej kserokopii z wyznaczonymi obszarami. Należy wyciąć niewielki fragment guza prostaty.

Zhomogenizować tkankę guza prostaty w 1 ml odczynnika triol. Inkubować zhomogenizowane próbki przez pięć minut. W temperaturze pokojowej dodać do próbek 0,2 ml chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund.

Inkubuj próbki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś bezbarwną, górną fazę wodną do nowych probówek i dodaj 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Ostrożnie odessaj nadsącz, aby nie naruszyć osadu zawierającego RNA. Do osadu RNA dodaj 1 mL 75% etanolu, wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przez 5 minut przy 7 500 ×g w temperaturze 4 °C. Ponownie odessaj nadsącz i susz osad RNA przez 5 do 10 minut, dbając o to, aby nie wyschł całkowicie.

Następnie rozpuść osad w wodzie wolnej od nukleaz i użyj spektrofotometru do pomiaru stężenia RNA. Wykorzystaj bioanalizator, aby sprawdzić jakość i integralność próbek RNA. Przeprowadź odwrotną transkrypcję RNA do cDNA, używając zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.

Aby wygenerować krzywą standardową, przygotuj serię rozcieńczeń oryginalnego CD NA z próbki, o której wiadomo, że wykazuje znaczącą ekspresję badanego genu. Przeprowadź reakcję real-time PCR, przygotowując mieszaninę master mix w oparciu o objętość reakcji 20 µL, składającą się z 2x quant. Detect cyber green PCR master mix, 10x microscript universal primer, 10x microscript primer assay oraz RN a's free water.

Należy przygotować dwa zestawy starterów: jeden dla genu docelowego, a drugi dla genu referencyjnego, którym w tym przypadku jest RNU6B. Do poszczególnych kapilar urządzenia light cycler należy pipetować po 2 µL każdego rozcieńczenia cDNA, a następnie dodać 18 µL master mixu. Próbki należy odwirować, korzystając z odpowiedniego adaptera do kapilar. Kapilary należy umieścić w systemie real-time PCR opartym na kapilarach i przeprowadzić program PCR według następującego schematu: 95 °C przez 15 minut, a następnie 50 cykli obejmujących 94 °C przez 15 sekund.

55 °C przez 30 sekund i 70 °C przez 30 sekund. Wybierz próbkę, która będzie służyć jako kalibrator, i ustaw jej znormalizowaną wartość docelową na jeden. Porównaj względną ekspresję mikro-RNA we wszystkich pozostałych próbkach z kalibratorem, aby wygenerować krzywe amplifikacji.

W przypadku reakcji PCR należy użyć oprogramowania molecular biochemicals light cycler w wersji 3.5 w zakładce quantification. Przeprowadź kwantyfikację reakcji i wyeksportuj dane do pliku tekstowego. Zaimportuj dane do oprogramowania REL quant analysis w celu wygenerowania wyników ilościowych.

Zaimportuj osobne pliki dla danych genu docelowego, genu referencyjnego oraz krzywej standardowej. Określ pozycję kalibratora zarówno dla genu docelowego, jak i referencyjnego, a także pozycje próbek. Dane są wyrażone jako stosunek genu docelowego do referencyjnego dla poszczególnych próbek podzielony przez stosunek genu docelowego do referencyjnego dla kalibratora.

Wykorzystaj krzywą standardową, wygenerowaną wcześniej dla konkretnego mikroRNA i genu referencyjnego, jako standard odniesienia do ekstrapolacji danych ilościowych dla mikroRNA o nieznanym stężeniu. Przeanalizuj trzy próbki jako grupę, a następnie oblicz średnie stężenia i odchylenia standardowe dla powtórzeń trzykrotnych.

Jeśli jedna z trzech powtórek jest niespójna z resztą zestawu, program ją wykluczy. Przedstawiono tutaj przykład analizy A-Q-P-C-R próbek prostaty. Wykresy obrazujące poziomy ekspresji genu referencyjnego U six wykazują początek amplifikacji wykładniczej około 20 cyklu, podczas gdy ekspresja genu docelowego, MIR 98, wykazała opóźnioną amplifikację około 25 cyklu.

Dane z tego eksperymentu zostały wyeksportowane do pliku tekstowego i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do analizy, w którym określono pozycje kapilar zawierających kalibrator oraz próbki. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia. Niezawodność tej metody zależy od jakości RNA.

W związku z tym należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z RNA, ponieważ ulega ono bardzo łatwej degradacji.