Name: Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qPCR) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj metodę ilościowego PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania mikroRNA w tkankach raka prostaty. Technika ta umożliwia szybką i czułą analizę ekspresji mikroRNA, co może przyczynić się do rozwoju biomarkerów diagnostycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana przez Canadian Cancer Society Research Institute, grant nr 019038.

1. Pobieranie próbek prostaty
<ol>
 <li> Pobierz próbki prostaty podczas prostatektomii. Orientację preparatu ustalono na podstawie punktów orientacyjnych anatomicznych. Prostatę i pęcherzyki nasienne oznakowano w następujący sposób: prawą stronę kolorem zielonym, lewą stronę kolorem niebieskim. </li>
 <li> Wykonaj losowy przekrój poprzeczny środkowy prostaty prostopadle do powierzchni odbytnicy, zamroź go w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C9.</li>
 <li> Zarchiwizowane plasterki preparatów należy skopiować, zorientować (przód, tył, prawa i lewa strona) oraz podzielić na cztery części. Skrawki należy wyciąć przy użyciu kriostatu.</li>
 <li> Skrawki barwi się metodą H&amp;E, a następnie poddaje ocenie patomorfologicznej w celu określenia i wyznaczenia obszarów nowotworowych oraz prawidłowych na zabarwionych slajdach i odpowiadającym im obrazie. Zaznaczone obszary służą jako wskazówka do wycięcia tkanki nowotworowej, z której w kolejnych krokach zostanie wyizolowane RNA.</li>
</ol>

2. Izolowanie całkowitego RNA, w tym miRNA, z próbek
<ol>
 <li>Umieścić zamrożone próbki prostaty na suchym lodzie i, kierując się zaznaczonymi obszarami na kserokopii, wyciąć niewielki fragment guza prostaty (od 50 do 100 mg).</li>
 <li>Zhomogenizować tkankę guza prostaty w 1 mL odczynnika TRIzol. Ilości podane w kolejnych krokach opierają się na użyciu 1 mL odczynnika TRIzol.</li>
</ol>
 Uwaga: W niniejszym protokole do ekstrakcji RNA zastosowano odczynnik TRIzol, jednak można również użyć innych zestawów służących do izolacji całkowitego RNA zawierającego małe RNA.
<ol start="3">
 <li>Próbki po homogenizacji inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Do próbek dodać 0,2 mL chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund. Próbki inkubować przez 3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Bezbarwną górną fazę wodną przenieść do nowych probówek i dodać 0,5 mL alkoholu izopropylowego. Próbki inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wirować z prędkością 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać nadsącz, nie naruszając osadu zawierającego RNA. Osad RNA przemyć 1 mL 75% etanolu. Próbkę wymieszać na wortexie i ponownie osadzić poprzez wirowanie przez 5 minut z prędkością 7 500 x g w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Ostrożnie odessać nadsącz i suszyć osad RNA przez 5-10 minut, dbając o to, aby osad nie wyschł całkowicie. Rozpuścić ponownie w wodzie wolnej od nukleaz w ilości dostosowanej do wielkości osadu. Stężenie RNA zmierzyć za pomocą spektrofotometru NanoDrop 1000 (mierząc absorbancję przy 260 nm i 280 nm).</li>
 <li>Jakość i integralność próbek RNA sprawdzić za pomocą systemu Agilent Bioanalyzer.</li>
</ol>
3. Odwrotna transkrypcja RNA
<ol>
 <li>Odwrotą transkrypcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miScript Reverse Transcription Kit zgodnie z instrukcjami producenta (Qiagen). Zestaw ten zawiera odwrotną transkryptazę oraz polimerazę poly(A). Bufor miScript RT Buffer zawiera Mg2+, dNTP, startery oligo-dT oraz startery randomowe.</li>
 <li>Do syntezy cDNA należy użyć od 10 pg do 1 μg RNA. W przypadku zastosowania więcej niż 1 μg RNA, należy proporcjonalnie zwiększyć objętość reakcji.</li>
 <li>Należy przygotować mieszaninę główną (master mix) zawierającą 5X miScript RT Buffer (4 μl), miScript Reverse Transcription Mix (1 μl) oraz wodę wolną od RNaz, aby uzyskać końcową objętość reakcji 20 μl. Do mieszaniny głównej należy dodać również matrycowe RNA (do 1 μg).</li>
 <li>Próbki należy inkubować przez 60 minut w temperaturze 37 °C, a następnie niezwłocznie inkubować przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Krok ten można przeprowadzić w termocyklerze, bloku grzejnym lub kąpieli wodnej. Termocyklery są najbardziej odpowiednią i precyzyjną metodą. cDNA należy przechowywać na lodzie w przypadku krótkoterminowego przechowywania oraz w temperaturze -20 °C w przypadku przechowywania długoterminowego.</li>
</ol>
4. Tworzenie krzywej wzorcowej
<ol>
 <li>Przed przystąpieniem do eksperymentu z docelowymi miRNA należy wyznaczyć krzywą standardową, wykorzystując cDNA o znanych stężeniach w odniesieniu do ich punktów przecięcia (CP) (Rysunek 2).</li>
 <li>Przygotować szereg rozcieńczeń (2-krotne, 10-krotne, 50-krotne, 250-krotne i 1250-krotne) oryginalnego cDNA z próbki, o której wiadomo, że wykazuje ona znaczną ekspresję badanego genu.</li>
 <li>Przeprowadzić reakcję PCR zgodnie z opisem w sekcji 5 „Real-time PCR w detekcji miRNA”, z modyfikacją polegającą na zastosowaniu seryjnych rozcieńczeń cDNA zamiast stałego rozcieńczenia 40x.</li>
 <li>Przeprowadzić analizę za pomocą oprogramowania RelQuant (Roche) w celu wygenerowania krzywej standardowej.</li>
 </ol>
Uwaga: dla każdego badanego genu należy wygenerować nową krzywą standardową.
5. PCR w czasie rzeczywistym do detekcji miRNA
<ol>
 <li>Reakcję qPCR dla miRNA przeprowadzono przy użyciu zestawu miScript SYBR Green PCR Kit oraz miScript Primer Assay zgodnie z instrukcjami producenta (Qiagen). Należy przygotować master mix zawierający 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, 10x miScript Universal Primer, 10x miScript Primer Assay oraz wodę wolną od RNaz. Przygotować master mix dla objętości reakcji 20 μl.</li>
 <li>Primer Assay jest specyficzny dla badanego miRNA. Aby zrekonstytuować 10x miScript Primer Assay, należy krótko odwirować fiolkę, a następnie dodać 550 μl buforu TE, pH 8.0. Fiolkę należy krótko wymieszać na wirówce typu vortex, podzielić primery na mniejsze alikwoty i przechowywać w temperaturze -20 °C. Wymagane są dwa primery: dla genu docelowego oraz dla genu referencyjnego. Jako gen referencyjny wykorzystano RNU6B.</li>
 <li>cDNA należy rozcieńczyć 40-krotnie, a nadmiarowe alikwoty przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
 <li>cDNA służy jako matryca dla PCR. Należy odmierzyć 2 μl 40-krotnie rozcieńczonego cDNA i przenieść do kapilar termocyklera (Roche) o objętości 20 μl.</li>
 <li>Do każdej kapilary należy dodać 18 μl master mixu, a następnie odwirować za pomocą adaptera do kapilar.</li>
 <li>Kapilary należy umieścić w termocyklerze czasu rzeczywistego opartym na kapilarach, takim jak system LightCycler 3.5 Real-Time PCR z karuzelą na 32 kapilary.</li>
 <li>Program cykli PCR należy przeprowadzić w następujący sposób: 
 W celu aktywacji polimerazy HotStarTaq zawartej w 2x QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix, należy przeprowadzić preinkubację w temperaturze 95 °C przez 15 minut. 
 Następnie wykonać 50 cykli obejmujących: 
 Denaturację, 15 s, 94 °C; 
 Przyłączanie, 30 s, 55 °C; 
 Ekstensję, 30 s, 70 °C.</li>
 <li>Należy wybrać próbkę, która będzie pełniła rolę kalibratora, i ustawić jej znormalizowaną ilość celu na 1. Następnie porównać względną ekspresję miRNA we wszystkich pozostałych próbkach względem kalibratora.</li>
 </ol>
 Uwaga: W ramach jednego badania należy używać tej samej próbki kalibracyjnej, aby zachować spójność wyników.
6. Analiza danych
<ol>
 <li>Krzywe amplifikacji dla reakcji PCR są przedstawione graficznie i numerycznie za pomocą oprogramowania Molecular Biochemicals LightCycler w wersji 3.5 (Roche). Przeprowadź kwantyfikację reakcji w zakładce „Quantification”, a następnie wyeksportuj dane do pliku tekstowego.</li>
 <li>Zaimportuj dane do oprogramowania analitycznego RelQuant (Roche), aby wygenerować wyniki kwantyfikacji. Zaimportuj oddzielne pliki dla danych genu docelowego, genu referencyjnego oraz krzywej wzorcowej.</li>
 <li>Określ pozycję kalibratora zarówno dla genu docelowego, jak i referencyjnego. Określ również pozycje próbek. Dane są wyrażone jako stosunek genu docelowego do referencyjnego dla poszczególnych próbek podzielony przez stosunek genu docelowego do referencyjnego dla kalibratora. Krzywa wzorcowa, wygenerowana wcześniej dla konkretnego miRNA i genu housekeepingowego, służy jako standard referencyjny do ekstrapolacji danych ilościowych dla celów miRNA o nieznanych stężeniach.</li>
 <li>Trzy powtórzenia próbek są analizowane jako grupa, a następnie obliczane są średnie stężenia i odchylenia standardowe dla tych powtórzeń. Jeśli jedno z powtórzeń jest niespójne z resztą zestawu, zostanie ono wykluczone przez program.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki
Przykład analizy qPCR próbek prostaty przedstawiono na Rysunku 3. Wyniki przedstawiono w formie numerycznej oraz graficznej. Wykresy obrazujące poziomy ekspresji genu referencyjnego, U6, wykazują początek amplifikacji wykładniczej około 20. cyklu, podczas gdy ekspresja genu docelowego, miR-98, wykazała opóźnioną amplifikację w okolicach 25. cyklu. Dane z tego eksperymentu zostały wyeksportowane jako plik tekstowy i przeanalizowane za pomocą oprogramowania RelQuant. Określono pozycje kapilar zawierających kalibrator i próbki. Rysunek 4 ilustruje sposób ustawienia kalibratora na wartość 1 oraz ekspresję pozostałych próbek w stosunku do kalibratora.
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig1.jpg" alt="Proces przygotowania całkowitego RNA; ogon Poly-A, odwrotna transkrypcja, synteza cDNA, schemat real-time PCR." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Różne etapy odwrotnej transkrypcji miScript i Real-time PCR.
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig2.jpg" alt="Wykresy krzywej standardowej dla analizy ekspresji genów miR-98 i RNU6B, stężenie względem CP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Krzywa standardowa została wygenerowana przy użyciu serii rozcieńczeń oryginalnej próbki cDNA w stosunku 2-krotnym, 10-krotnym, 50-krotnym, 250-krotnym i 1250-krotnym.
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig3.jpg" alt="PCR w czasie rzeczywistym, wykres fluorescencji w funkcji liczby cykli, wyniki kwantyfikacji DNA." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Oprogramowanie Roche Molecular Biochemicals LightCycler przedstawia pełne informacje z eksperymentu w formie graficznej i tekstowej. Wykresy amplifikacji ilościowej PCR w czasie rzeczywistym pokazują wzrost fluorescencji w różnych próbkach.
<img src="/files/ftp_upload/3874/3874fig4.jpg" alt="Tabela wyników ilościowego PCR przedstawiająca analizę danych punktu przecięcia (crossing point) i stosunku stężeń." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Dane zostały ilościowo określone przy użyciu oprogramowania analitycznego RelQuant LightCycler. Zazwyczaj analizuje się grupę trzech powtórzeń próbek, a próbki dające wyraźnie niespójne wyniki są wykluczane, po czym oblicza się średnie stężenia i odchylenia standardowe dla powtórzeń trzykrotnych.

<ol><li>Reinhart, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs in plants.</a> Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).</li>
<li>Xu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+microRNA+Mir-14+suppresses+cell+death+and+is+required+for+normal+fat+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism.</a> Curr. Biol. 13, 790(2003).</li>
<li>Bueno, M. J., Perez, deC. astro, I,, Malumbres, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+proliferation+pathways+by+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Control of cell proliferation pathways by microRNAs.</a> Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).</li>
<li>Friedman, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92(2009).</li>
<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs%3A+genomics%2C+biogenesis%2C+mechanism%2C+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-281 (2004).</li>
<li>Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+microRNA+dysregulation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 704(2009).</li>
<li>Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+and+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr.+Relat.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs and prostate cancer.</a> Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).</li>
<li>Gordanpour, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-221+Is+down-regulated+in+TMPRSS2%3AERG+fusion-positive+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer.</a> Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).</li>
<li>Nam, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+TMPRSS2%3AERG+fusion+gene+predicts+cancer+recurrence+after+surgery+for+localised+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer.</a> Br. J. Cancer. 97, 1690(2007).</li>
<li>Ambs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+of+microRNA+and+messenger+RNA+reveals+deregulated+microRNA+expression+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer.</a> Cancer Res. 68, 6162(2008).</li>
<li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microRNA+miR-34a+inhibits+prostate+cancer+stem+cells+and+metastasis+by+directly+repressing+CD44%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44.</a> Nat. Med. 17, 211(2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W guzach prostaty w porównaniu z tkanką prawidłową konsekwentnie stwierdza się aberracyjną ekspresję niektórych miRNA10, a niektóre z tych miRNA zostały wskazane jako potencjalne nowe środki terapeutyczne w walce z rakiem prostaty11. Zatem aberracyjne poziomy ekspresji miRNA mogą służyć jako przydatne biomarkery diagnostyczne i/lub prognostyczne. Przedstawiona tutaj metoda Real-Time qPCR umożliwia dokładną kwantyfikację poziomów miRNA w tkankach guza prostaty. Zastosowany system miScript PCR pozwala...

<table><tbody><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do odwrotnej transkrypcji miScript</td><td>Qiagen</td><td>218061</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy starterów miScript</td><td>Qiagen</td><td>Specyficzne dla eksperymentu</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw PCR miScript SYBR Green</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td></td></tr><tr><td>System Real-Time PCR LightCycler 3.5</td><td>Roche Group</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapilary Light Cycler</td><td>Roche Group</td><td>04929292001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop 1000</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>2538</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizator Agilent 2100</td><td>G2943CA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie mikrorna w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji pcr w czasie rzeczywistym (qpcr)

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MikroRNA (miRNA) to jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA o długości od 18 do 24 nukleotydów. Są one zaangażowane w niemal każdy proces komórkowy, w tym rozwój1, apoptozę2 oraz regulację cyklu komórkowego3. Szacuje się, że miRNA regulują ekspresję od 30% do 90% ludzkich genów4 poprzez wiązanie się z docelowymi cząsteczkami mRNA (matrycowym RNA)5. Powszechna dysregulacja miRNA została zgłoszona w różnych chorobach i podtypach nowotworów6. Ze względu na ich rozpowszechnienie i unikalną strukturę, małe cząsteczki te prawdopodobnie staną się kolejną generacją biomarkerów, czynników terapeutycznych i/lub celów terapeutycznych.
Metody stosowane do badania ekspresji miRNA obejmują qPCR oparty na barwniku SYBR green I oraz qPCR z wykorzystaniem sond TaqMan. Aby miRNA mogły być skutecznie wykorzystywane w praktyce klinicznej, niezbędne jest, aby ich detekcja w świeżych i/lub archiwalnych próbkach klinicznych była dokładna, powtarzalna i specyficzna. qPCR jest powszechnie stosowany do walidacji ekspresji miRNA w analizach całego genomu, takich jak badania mikromacierzy7. Próbki wykorzystane w niniejszym protokole pochodziły od pacjentów, u których przeprowadzono radykalną prostatektomię z powodu klinicznie zlokalizowanego raka prostaty; można jednak zastosować inne tkanki i linie komórkowe. Próbki prostaty zostały zamrożone szokowo w ciekłym azocie po resekcji. Zmienne kliniczne oraz informacje z obserwacji dla każdego pacjenta zostały zebrane do późniejszej analizy8.
Ilościowe oznaczenie poziomów miRNA w próbkach guza prostaty. Główne etapy analizy qPCR guzów to: ekstrakcja całkowitego RNA, synteza cDNA oraz detekcja produktów qPCR przy użyciu specyficznych starterów do miRNA. Całkowite RNA, obejmujące mRNA, miRNA oraz inne małe RNA, wyekstrahowano z próbek przy użyciu odczynnika TRIzol. Do syntezy cDNA i przeprowadzenia qPCR wykorzystano system miScript firmy Qiagen (Rysunek 1). Endogenne miRNA nie są poliadenylowane, dlatego podczas procesu odwrotnej transkrypcji polimeraza poli(A) przeprowadza poliadenylację miRNA. miRNA służy jako matryca do syntezy cDNA z wykorzystaniem oligo-dT i odwrotnej transkryptazy. Uniwersalna sekwencja tagu na końcu 5' starterów oligo-dT ułatwia amplifikację cDNA w etapie PCR. Amplifikację produktu PCR wykrywa się na podstawie poziomu fluorescencji emitowanej przez SYBR Green, barwnik, który wbudowuje się w dwuniciowe DNA. Specyficzne startery miRNA, wraz z uniwersalnym starterem wiążącym się z uniwersalną sekwencją tagu, pozwalają na amplifikację specyficznych sekwencji miRNA.
Zestawy starterów miScript Primer Assays są dostępne dla ponad tysiąca miRNA specyficznych dla ludzi oraz setek miRNA specyficznych dla myszy. W niniejszej pracy do ilościowego oznaczenia ekspresji miRNA zastosowano metodę kwantyfikacji względnej. Aby skorygować zmienność między różnymi próbkami, poziom ekspresji docelowego miRNA normalizuje się względem poziomu ekspresji genu referencyjnego. Wybór genu, względem którego normalizowana jest ekspresja celów, ma krytyczne znaczenie w metodzie analizy kwantyfikacji względnej. Przykładami genów referencyjnych typowo stosowanych w tym celu są małe RNA RNU6B, RNU44 i RNU48, ponieważ uznaje się, że wykazują one stabilną ekspresję w większości próbek. W niniejszym protokole jako gen referencyjny wykorzystano RNU6B.

Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qPCR) jest szybką i czułą metodą badania poziomów ekspresji różnych cząsteczek mikroRNA (miRNA) w próbkach nowotworowych. Zastosowanie tej metody pozwala na amplifikację, kwantyfikację i analizę ekspresji setek różnych cząsteczek miRNA z tej samej matrycy cDNA.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

MikroRNA (miRNA) to jednoniciowe, niekodujące cząsteczki RNA o długości od 18 do 24 nukleotydów. Uczestniczą one w niemal każdym procesie komórkowym...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest ilościowe określenie poziomów ekspresji cząsteczek mikro RNA w raku prostaty oraz w prawidłowej tkance prostaty przy użyciu ilościowej PCR w czasie rzeczywistym. Osiąga się to poprzez uprzednią ekstrakcję całkowitego RNA z tkanek prostaty, co obejmuje mRNA, mikro RNA oraz inne małe RNA.Następnie RNA poddawane jest odwrotnej transkrypcji w celu otrzymania cDNA. Dalej przeprowadzana jest reakcja PCR w czasie rzeczywistym z wykorzystaniem barwnika Cybergreen, w której cDNA służy jako matryca do amplifikacji i ilościowego oznaczenia ekspresji mikroRNA w czasie rzeczywistym. Uzyskane wyniki wykazują względną ekspresję mikroRNA w różnych próbkach prostaty na podstawie ilościowego PCR w czasie rzeczywistym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami jest wysoka czułość, dokładność i powtarzalność, a także szybkość i efektywność kosztowa. Metoda ta może być wykorzystywana do odpowiadania na kluczowe pytania z zakresu biologii nowotworów, ponieważ ekspresja microRNA często koreluje z genami silnie zaangażowanymi w proces nowotworowy. Możemy zatem wykorzystać QPCR do oceny ekspresji microRNA i sprawdzenia, jak koreluje ona ze zmiennymi klinicznymi.Biomarkery te mogą potencjalnie służyć zarówno jako narzędzia diagnostyczne, jak i prognostyczne. Mogą one pomóc w diagnozowaniu raka prostaty, a także w określeniu, które nowotwory prostaty mają charakter agresywny. Ponadto istnieje potencjał wykorzystania tych biomarkerów jako czynników terapeutycznych.Metoda ta nie tylko pozwala na uzyskanie wglądu w genezę guzów prostaty, ale może być również zastosowana w przypadku innych nowotworów i chorób. Pobierz próbki prostaty w momencie przeprowadzenia ektomii i zorientuj preparat, korzystając z punktów anatomicznych. Oznacz prostatę oraz pęcherzyki nasienne w następujący sposób: stronę prawą kolorem zielonym, a stronę lewą kolorem niebieskim.Pobierz losowy poprzeczny przekrój środkowy tkanki prostopadle do powierzchni odbytnicy, zamroź próbkę i przechowuj ją w temperaturze -80 °C. Wykonaj zdjęcie i zorientuj przekroje preparatów, a następnie podziel je na cztery równe części. Skonsultuj się z patomorfologiem w celu wyznaczenia obszarów nowotworowych oraz obszarów prawidłowych na odpowiadającym im obrazie.Należy wykorzystać zaznaczone obszary jako wskazówkę do identyfikacji tkanki nowotworowej w celu ekstrakcji RNA w celu izolacji RNA. Pracę należy rozpocząć od umieszczenia zamrożonych próbek prostaty na suchym lodzie i odniesienia się do wykonanej kserokopii z wyznaczonymi obszarami. Należy wyciąć niewielki fragment guza prostaty.Zhomogenizować tkankę guza prostaty w 1 ml odczynnika triol. Inkubować zhomogenizowane próbki przez pięć minut. W temperaturze pokojowej dodać do próbek 0,2 ml chloroformu i energicznie wstrząsać przez 15 sekund.Inkubuj próbki przez trzy minuty w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12 000 ×g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przenieś bezbarwną, górną fazę wodną do nowych probówek i dodaj 0,5 ml alkoholu izopropylowego. Inkubuj próbki przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wiruj przy 12 000 ×g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie odessaj nadsącz, aby nie naruszyć osadu zawierającego RNA. Do osadu RNA dodaj 1 mL 75% etanolu, wymieszaj próbkę na wirówce typu vortex, a następnie odwiruj przez 5 minut przy 7 500 ×g w temperaturze 4 °C. Ponownie odessaj nadsącz i susz osad RNA przez 5 do 10 minut, dbając o to, aby nie wyschł całkowicie.Następnie rozpuść osad w wodzie wolnej od nukleaz i użyj spektrofotometru do pomiaru stężenia RNA. Wykorzystaj bioanalizator, aby sprawdzić jakość i integralność próbek RNA. Przeprowadź odwrotną transkrypcję RNA do cDNA, używając zestawu do odwrotnej transkrypcji zgodnie z instrukcjami producenta.Aby wygenerować krzywą standardową, przygotuj serię rozcieńczeń oryginalnego CD NA z próbki, o której wiadomo, że wykazuje znaczącą ekspresję badanego genu. Przeprowadź reakcję real-time PCR, przygotowując mieszaninę master mix w oparciu o objętość reakcji 20 µL, składającą się z 2x quant. Detect cyber green PCR master mix, 10x microscript universal primer, 10x microscript primer assay oraz RN a's free water.Należy przygotować dwa zestawy starterów: jeden dla genu docelowego, a drugi dla genu referencyjnego, którym w tym przypadku jest RNU6B. Do poszczególnych kapilar urządzenia light cycler należy pipetować po 2 µL każdego rozcieńczenia cDNA, a następnie dodać 18 µL master mixu. Próbki należy odwirować, korzystając z odpowiedniego adaptera do kapilar. Kapilary należy umieścić w systemie real-time PCR opartym na kapilarach i przeprowadzić program PCR według następującego schematu: 95 °C przez 15 minut, a następnie 50 cykli obejmujących 94 °C przez 15 sekund.55 °C przez 30 sekund i 70 °C przez 30 sekund. Wybierz próbkę, która będzie służyć jako kalibrator, i ustaw jej znormalizowaną wartość docelową na jeden. Porównaj względną ekspresję mikro-RNA we wszystkich pozostałych próbkach z kalibratorem, aby wygenerować krzywe amplifikacji.W przypadku reakcji PCR należy użyć oprogramowania molecular biochemicals light cycler w wersji 3.5 w zakładce quantification. Przeprowadź kwantyfikację reakcji i wyeksportuj dane do pliku tekstowego. Zaimportuj dane do oprogramowania REL quant analysis w celu wygenerowania wyników ilościowych.Zaimportuj osobne pliki dla danych genu docelowego, genu referencyjnego oraz krzywej standardowej. Określ pozycję kalibratora zarówno dla genu docelowego, jak i referencyjnego, a także pozycje próbek. Dane są wyrażone jako stosunek genu docelowego do referencyjnego dla poszczególnych próbek podzielony przez stosunek genu docelowego do referencyjnego dla kalibratora.Wykorzystaj krzywą standardową, wygenerowaną wcześniej dla konkretnego mikroRNA i genu referencyjnego, jako standard odniesienia do ekstrapolacji danych ilościowych dla mikroRNA o nieznanym stężeniu. Przeanalizuj trzy próbki jako grupę, a następnie oblicz średnie stężenia i odchylenia standardowe dla powtórzeń trzykrotnych.Jeśli jedna z trzech powtórek jest niespójna z resztą zestawu, program ją wykluczy. Przedstawiono tutaj przykład analizy A-Q-P-C-R próbek prostaty. Wykresy obrazujące poziomy ekspresji genu referencyjnego U six wykazują początek amplifikacji wykładniczej około 20 cyklu, podczas gdy ekspresja genu docelowego, MIR 98, wykazała opóźnioną amplifikację około 25 cyklu.Dane z tego eksperymentu zostały wyeksportowane do pliku tekstowego i przeanalizowane za pomocą oprogramowania do analizy, w którym określono pozycje kapilar zawierających kalibrator oraz próbki. Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zostać zrealizowana w ciągu jednego dnia. Niezawodność tej metody zależy od jakości RNA.W związku z tym należy zachować szczególną ostrożność podczas pracy z RNA, ponieważ ulega ono bardzo łatwej degradacji.

microrna-detection-prostate-tumors-quantitative-real-time-pcr

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Wykrywanie microRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej bieżącej reakcji PCR (qPCR)

Zaprezentujemy konfigurację i analizę tablic 96-dołkowych pre-microRNA do QPCR, przeprowadzonych zarówno przy użyciu robota, jak i ręcznie za pomocą wielokanałowej pipety Thermo Scientific Matrix.

Profilowanie pre-microRNA i microRNA z wykorzystaniem matryc ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

W niniejszej pracy opisujemy zoptymalizowany protokół multipleksowej ilościowej reakcji polimerazy w odwrotnej transkrypcji (qRT-PCR) w połączeniu z platformą mikroprzepływową, stanowiący efektywne pod względem kosztów i czasu narzędzie do wysokoprzepustowego przesiewowania poziomów ekspresji mikroRNA (miRNA), szczególnie w przypadku pracy z ograniczoną ilością materiału próbnego.

Wysokoprzepustowe profilowanie mikroRNA: zoptymalizowana wielokanałowa qRT-PCR w skali nanolitrowej na IFC Fluidigm Dynamic ArrayTM

Opisujemy protokół PCR w czasie rzeczywistym do profilowania mikroRNA w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF). Z wyjątkiem protokołów ekstrakcji RNA, procedura może zostać rozszerzona na RNA wyekstrahowane z innych płynów ustrojowych, hodowanych komórek lub próbek tkanek.

Profilowanie mikroRNA płynu mózgowo-rdzeniowego za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Sygnalizacja molekularna zarówno przez estrogen, jak i mikroRNA jest kluczowa dla rozwoju i wzrostu raka piersi. Estrogen aktywuje receptory estrogenowe, które są czynnikami transkrypcyjnymi. Wiele czynników transkrypcyjnych może regulować ekspresję mikroRNA, a mikroRNA regulowane estrogenem można profilować przy użyciu różnych technik na dużą skalę.

Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi

Krążące mikroRNA pojawiły się ostatnio jako obiecujące i nowe biomarkery dla różnych nowotworów i innych chorób. Celem tego artykułu jest omówienie trzech różnych platform i metod PCR w czasie rzeczywistym opartych na sondach, które są dostępne do ilościowego określania i określania obfitości krążących mikroRNA.

Oparte na sondzie podejścia PCR w czasie rzeczywistym do ilościowego pomiaru mikroRNA

Tutaj opisujemy uproszczony protokół analiz ekspresji mikroRNA (miRNA) w archiwalnych tkankach klinicznych z utrwalonym formaliną, parafiną (FFPE) lub świeżo mrożonym rakiem prostaty (PCa) z wykorzystaniem ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) i hybrydyzacji in situ (ISH).

Analizy ekspresji miRNA w tkankach klinicznych raka gruczołu krokowego

Celem tego protokołu jest wykorzystanie mikro-dysekcji laserowej jako skutecznej metody izolowania czystych populacji typów komórek z heterogenicznych tkanek prostaty do dalszej analizy RNA.

Laserowa mikrodysekcja ludzkiego nabłonka gruczołu krokowego do analizy RNA

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym. Metoda ta nadaje się do badania profilu ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczura w kilku stanach patologicznych.

Wykrywanie ekspresji mikroRNA w błonie otrzewnowej szczurów za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Ten raport opisuje protokół pomiaru bezwzględnych poziomów miRNA w osoczu, przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym z lub bez wstępnej amplifikacji. Protokół ten pozwala lepiej zrozumieć ilość miRNA w osoczu i umożliwia jakościową ocenę odpowiednich danych z różnych badań lub laboratoriów.

Bezwzględna kwantyfikacja poziomów mikroRNA w osoczu u małp Cynomolgus przy użyciu ilościowego PCR z odwrotną transkrypcją w czasie rzeczywistym

Oporność na terapię często rozwija się u pacjentów z zaawansowanym rakiem prostaty, a w niektórych przypadkach rak rozwija się do śmiertelnego podtypu zwanego neuroendokrynnym rakiem prostaty. Ocena niewielkich zmian molekularnych za pośrednictwem niekodującego RNA, które ułatwiają to przejście, pozwoliłaby na lepszą stratyfikację choroby i identyfikację mechanizmów przyczynowych, które prowadzą do rozwoju neuroendokrynnego raka gruczołu krokowego.

Sekwencjonowanie małego niekodującego RNA z tkanek utrwalonych formaliną i egzosomów pochodzących z surowicy od pacjentów z opornym na kastrację rakiem prostaty

Protokół opisuje tandemowy test hybrydyzacji immunofluorescencji z tkanką formalinowo-zafiksowaną w parafinę, mającą na celu jednoczesne wykrywanie i ilościowe mikroRNA oraz multipleksowane białka.

Amplifikacja i rozpoznawanie mikroRNA poprzez hybrydyzację in situ z użyciem kwasów nukleinowych z zamkniętymi nukleinami jako nowatorska metoda wykrywania i ilościowania

Poznaj metodę ilościowego PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania mikroRNA w tkankach raka prostaty. Technika ta umożliwia szybką i czułą analizę ekspresji mikroRNA, co może przyczynić się do rozwoju biomarkerów diagnostycznych.

Wykrywanie mikroRNA w guzach prostaty za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Przeglądaj więcej filmów