Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest szybkie wygenerowanie populacji wzbogaconych leukocytów wykazujących pozytywną ekspresję GR1, zawierających żywe mieloidalne supresoryjne komórki szpiku lub mDSC, wyizolowane z śledzion myszy do zastosowania w badaniach in vivo oraz in vitro. Najpierw śledziony od kilku myszy są łączone i przetwarzane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Aby określić procentowy udział mDSC przed wzbogaceniem, niewielka porcja połączonych komórek jest przenoszona do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.

Antygeny powierzchniowe MAC-1 i GR-1 zostają oznakowane, a oznakowane komórki przeniesione do probówek typu fax w celu analizy cytometrycznej. Pozostałe połączone leukocyty barwi się przeciwciałem koniugatem fluorochromu przeciwko GR-1 i inkubuje z magnetycznymi mikrokulkami, które wiążą się z fluorochromem na przeciwciałach anty-GR-1. Następnie populacje GR-1-dodatnie oraz GR-1-ujemne są rozdzielane przy użyciu separatora AutoMax pro, aby ocenić skuteczność wzbogacenia populacji o komórki GR-1.

Pobiera się małą alikwotę i analizuje ją pod kątem ekspresji GR one oraz MAC one w celu oceny procentowej zawartości MDSC. Porównanie uzyskanych danych z immunofenotypowania wykazuje wzrost procentowego udziału MDSC w populacji leukocytów wzbogaconej o GR one w porównaniu z populacją niewzbogaconą. Ponadto obserwuje się wzrost liczby naiwnych MDSC, co prowadzi do uzyskania populacji porównywalnej z MDSC pochodzącymi z organizmów z nowotworem.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne barwienie przepływowe oraz sortowanie mDSC z tkanek limfatycznych przy użyciu szybkich cytometrów przepływowych, jest to, że zastosowanie master mixu zapobiega znacznym rozbieżnościom w wynikach poprzez zapewnienie równomiernego barwienia powierzchni leukocytów z puli, co umożliwia typowanie oraz sortowanie mDSC i komórek GR1+ za pomocą systemu AutoMax. Procedury zaprezentują Nadine Nelson, doktorantka z naszego laboratorium, oraz dr Hawsra, dyrektor centrum cytometrii przepływowej USF. Poniższą procedurę należy przeprowadzić w środowisku sterylnym, pod dygestorium z biologicznego bezpieczeństwa, utrzymując komórki i przeciwciała w lodzie.

W miarę możliwości zmontuj sito do dysocjacji komórek, wkładając siatkę do otworu w kubku w kierunku dna. Następnie włóż pierścień mocujący do obszaru z gwintem stroną z nacięciem do góry i za pomocą klucza do pierścienia dokręć pierścień mocujący, aby zabezpieczyć siatkę. Umieść zmontowane sito w szalce Petri zawierającej 10 milliliters puli XPBS.

Śledziony pobrane od myszy C 57 black six w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, z guzami lub naiwne myszy kontrolne, należy umieścić w siatce sita do dysocjacji komórek. Następnie, używając szklanego tłuczka, należy rozetrzeć śledziony przez siatkę do szalki Petriego. Powtórzyć ten proces dla każdej grupy myszy poddanych określonej procedurze.

Następnie, używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml, nanieś zawiesinę komórkową na sito komórkowe o oczkach 70 µm i pozwól jej przefiltrować do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 250–300 ×g przez pięć minut. Usuń supernatant i resuspenduj osad, dodając 5 ml buforu do lizy RBC na każdą śledzionę, i intensywnie pipetuj w górę i w dół; inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając 20 ml PBS i intensywnie pipetując w górę i w dół.

Następnie odwiruj próbkę przy 250 do 300 ×g przez pięć minut, po czym usuń supernatant, zawiesić osad w 20 ml sterylnego PBS i policzyć komórki. Używając błękitu trypanowego i komory licznej, resuspenduj komórki do stężenia od 1 × 10⁷ do 2 × 10⁷ komórek na ml w 3% medium barwiącym. Osiągnięcie optymalnego barwienia jest najtrudniejszym elementem tej procedury.

Można to skutecznie przeprowadzić, wykonując wcześniej miareczkowanie przeciwciał. Do przygotowania mieszanin głównych (master mixes) oraz barwienia powierzchniowego należy używać małych objętości, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. W celu zabarwienia komórek do analizy cytometrycznej, należy opisać studzienki płytki V-bottom 96-dołkowej dla próbek kontrolnych, doświadczalnych oraz barwień pojedynczych.

W celu wykonania kontroli kompensacji, do każdego z oznakowanych dołków dodaj od 5×10⁵ do 1×10⁶ komórek w 50 µL. Następnie wiruj płytkę z prędkością 250–300 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu obejrzyj płytkę od spodu.

Upewniając się, że w dołkach znajdują się pellety, należy przygotować w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml na lodzie mieszaninę główną (master mix) do blokowania mysich BDFC, zawierającą monoklonalne przeciwciało szczurze anty-muse CD 1632 rozcieńczone w 3% medium do barwienia, a następnie wymieszać całość wirówką vortex. Następnie krótko wirować przez pięć sekund, trzymając płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V nad pojemnikiem na odpady lub zlewem. Szybko odwrócić płytkę i przywrócić ją do pozycji wyjściowej, aby usunąć nadosad bez naruszania pelletów komórkowych.

Następnie do wszystkich pelletów na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaj 50 µL master mixu FC block, mieszając poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Umieść płytkę na lodzie i inkubuj przez 15 minut w ciemności, a następnie wiruj płytkę z prędkością od 250 do 300 ×g przez pięć minut. W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml na lodzie przygotuj master mix przeciwciał Mac 1 fitzy oraz GR 1 A PC rozcieńczonych w 3% medium barwiącym.

Krótko wirować w wirówce typu vortex przez pięć sekund. Po wirowaniu odwrócić płytkę, aby usunąć nadsącz z każdej studzienki, a następnie dodać 50 µL mieszaniny przeciwciał do osadów kontrolnych lub eksperymentalnych. Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. W przypadku kompensacji dla pojedynczego barwienia dodać 50 µL rozcieńczonego MAC one F GR one A PC lub DPI w 3% medium do barwienia do odpowiednich studzienek. W przypadku kontroli bez barwienia dodać 50 µL 3% medium do barwienia do odpowiedniej studzienki i wymieszać.

Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w ciemności na lodzie. Podczas inkubacji opisz probówki do FACS tak, aby odpowiadały poszczególnym dołkom płytki, i dodaj do każdej probówki 200 µL 3% medium barwiącego. Po upływie 30-minutowego czasu inkubacji odwiruj płytkę z prędkością od 250 do 300 ×g przez pięć minut.

Po wirowaniu usunąć nadfiltr w taki sam sposób jak poprzednio. Następnie przemyć osady, dodając 100 µl 3% medium barwiącego do każdego osadu. Wymieszać dokładnie, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół.

Ponownie odwiruj płytkę przez pięć minut. Po wirowaniu powtórz krok płukania, usuń natin w taki sam sposób jak poprzednio i resuspenduj każdy osad w 100 µL 3% medium barwiącego, a następnie dokładnie wymieszaj. Następnie przenieś 100 µL resuspendowanych komórek z każdego dołka płytki do odpowiednio oznakowanych probówek FACS.

Następnie dodaj 75 ng/mL DPI do próbek kontrolnych i eksperymentalnych oraz do kontroli kompensacji dla pojedynczego barwienia DPI. Przeprowadź akwizycję danych cytometrycznych w celu wyznaczenia procentowej zawartości MDSC zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; następnie wzbogać alikwot leukocytów dodatnich dla GR1 w ilości 1x10⁷ z pozostałych niebarwionych leukocytów w odpowiednio oznakowanych probówkach do cytometrii przepływowej i wiruj je z prędkością 250-300 ×g przez 5 minut. Dodaj 50 µL rozcieńczenia 1:10 przeciwciała GR1 PE w buforze MACS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.

Po inkubacji należy dodać dwa mililitry buforu max do każdej probówki fax i wirować przy 250 do 300 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu należy usunąć nadsącz. Następnie do każdej probówki dodaje się 200 µL rozcieńczenia 1:4 mikrokulek anti PE w buforze max i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.

Do probówek FACS dodać dwa mililitry buforu max i wirować przy 250 do 300 ×g przez pięć minut. Następnie osad zawiesić w trzech mililitrach buforu barwiącego, przefiltrować przez sitko 70 μm do nowej, opisanej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. W tym protokole stosujemy automatyczną separację magnetyczną.

Separacja magnetyczna jest doskonałym wyborem metodycznym. Jeśli potrzebujesz szybko i w sposób kosztowo efektywny wyizolować dużą liczbę komórek w oparciu o marker powierzchniowy, upewnij się, że na koniec zweryfikujesz wyniki za pomocą cytometrii przepływowej. Aby przygotować i zainicjować separator AutoMax pro, upewnij się, że wszystkie butelki są napełnione odpowiednimi roztworami.

Włącz urządzenie. Po inicjalizacji sprawdź stan pojemników na ciecze i kolumn. Wszystkie symbole powinny być zielone.

W następnym kroku wybierz opcję separation z górnego paska menu, a następnie wash. Teraz z dolnego paska menu wybierz funkcję rinse z listy rozwijanej, a następnie run, aby rozpocząć proces przygotowania układu (priming). Po pomyślnym zakończeniu procesu przygotowania instrument wyświetli komunikat o gotowości do separacji.

W menu stanu umieść 50 ml probówkę stożkową z komórkami znakowanymi magnetycznie w rzędzie A odpowiednio dopasowanego, schłodzonego statywu na probówki. Następnie w rzędzie B umieść 50 ml probówkę stożkową do zbierania frakcji negatywnej, a w rzędzie C 15 ml probówkę stożkową do zbierania frakcji pozytywnej. Wybierz program separacji komórek POS cell S w celu pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych w trybie czułym z próbek. Po rozpoczęciu programu magnetycznie znakowane komórki docelowe zostaną zatrzymane na kolumnie AutoMax, podczas gdy komórki nieznakowane zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję negatywną w rzędzie B. Następnie magnes zostanie wycofany, a znakowane komórki docelowe zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję pozytywną w rzędzie C statywu.

Po wzbogaceniu, użyj błękitu trypanu oraz komory countingowej (hemo-cytometru), aby ponownie policzyć frakcje GR1-dodatnie i GR1-ujemne. Następnie resuspender komórki w medium barwiącym 3% w stężeniu od 1 × 10⁷ komórek/ml do 2 × 10⁷ komórek/ml i przenieś 50 µL do odpowiednio oznakowanych probówek typu fax. Zabarw komórki MAC-1 oraz barwnikiem żywotności DPI do cytometrii przepływowej i kompensacji dla pojedynczych barwień.

Przeprowadź akwizycję danych z cytometrii przepływowej, aby oznaczyć procentowy udział komórek GR one dodatnich oraz GR one ujemnych, a także porównać procentowy udział MDSC przed i po wzbogaceniu metodą AutoMax. Śledziony pobrano od myszy z guzami trzustki oraz myszy naiwnych, a następnie przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z opisem w niniejszym artykule wideo. Cytometrię przepływową wykonano w celu zbadania leukocytów naiwnych, których powierzchnię barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami przeciwko MAC one i GR one. Jak pokazano tutaj, przed wzbogaceniem metodą AutoMax widoczny jest jedynie bardzo niski odsetek (1,19%) naiwnych komórek MDC dodatnich dla MAC one i GR one. Jednak po wzbogaceniu populacji GR one dodatniej, ta subpopulacja komórek jest znacznie liczniejsza (10,5% u myszy naiwnych) i jest obecnie porównywalna z wynikiem 25,3% u myszy z guzami.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, w tym przyspieszone MDSC, sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej w eksperymentach z transferem in vivo, ilościową PCR w czasie rzeczywistym oraz western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za ekspansję, migrację i różnicowanie MDSC oraz ich wpływ na supresję odpowiedzi immunologicznych.