Name: Przygotowanie komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC) od myszy naiwnych i z guzem trzustki przy użyciu cytometrii przepływowej i automatycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (AutoMACS) (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 15 s
Description: Naucz się izolować komórki MDSC z mysich śledzion przy użyciu cytometrii przepływowej i AutoMACS. Ta metoda umożliwia szybkie wzbogacanie leukocytów Gr-1+ o wysokiej żywotności do badań immunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność dla USF Flow Cytometry Core Facility. Dziękujemy dr Denise Cooper za udostępnienie zasobów. Dziękujemy również Mai Cohen, Laurze Pendleton i Dianie Latour za pomoc w przygotowaniu i nagraniu tego filmu. NN otrzymał wsparcie z funduszu NSF FG-LSAMP Bridge to the Doctorate Fellowship HRD #0929435. Praca ta została sfinansowana z grantu American Cancer Society Institutional Research Grant# 93-032-13/Moffitt Cancer Center przyznanego TG.

Przed rozpoczęciem przygotuj następujące roztwory:
3% pożywka do barwienia (SM):
3% płodowa surowica bydlęca (FBS) w 1X soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS)
Bufor MACS (MB):
- 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1XPBS
1. Pobranie śledzion z myszy
<ol>
 <li>Myszy C57BL/6 (Harlan) w wieku 6-8 tygodni poddać podskórnej iniekcji 1,5 x 105 mysich komórek Panc02 zawieszonych w 100 μl 1x PBS (grupa z nowotworem; TB). Myszy kontrolne (Naïve) otrzymują 100 μl 1XPBS.</li>
 <li>Około 4 tygodnie po iniekcji uśmiercić myszy poprzez duszenie dwutlenkiem węgla.</li>
 <li>Pobrać śledziony z myszy poprzez rozcięcie tępą metodą z użyciem pęsety i nożyczek, a następnie zważyć je na wadze. Umieścić śledziony w osobnych, oznakowanych stożkowych probówkach 50 ml zawierających 1 x PBS.</li>
</ol>
2. Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny leukocytów ze śledzion
Wszystkie procedury należy przeprowadzać w środowisku sterylnym, pod dygestorium z laminarnym przepływem powietrza (Biological Safety Hood), a komórki i przeciwciała przechowywać w lodzie.
<ol>
 <li>Złożyć sito do dysocjacji komórek, wkładając siatkę do otworu w kubku w kierunku dna. Następnie włożyć pierścień mocujący do obszaru z gwintem stroną z nacięciem do góry i za pomocą klucza do pierścienia dokręcić pierścień mocujący, aby unieruchomić siatkę. Umieścić złożone sito w szalce Petri zawierającej 10 ml 1 x PBS.</li>
 <li>Połączyć śledziony i za pomocą szklanego tłuczka rozetrzeć je o siatkę sita do dysocjacji komórek bezpośrednio do szalki Petri. Powtórzyć czynność dla każdej grupy myszy poddanych badaniu.</li>
 <li>Przefiltrować zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, używając sita komórkowego 70 μm oraz pipety serologicznej 5 ml. Centryfugować przy 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 5 ml 1 x buforu do lizy RBC na każdą śledzionę. Intensywnie pipetować w górę i w dół. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min. Przerwać reakcję, dodając 20 ml 1 x PBS. Intensywnie pipetować w górę i w dół. Centryfugować przy 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.</li>
 <li>Usunąć nadsącz i resuspendować osad w 20 ml sterylnego 1 x PBS. Intensywnie pipetować w górę i w dół.</li>
 <li>Policzyć komórki przy użyciu błękitu trypanu i hemocytometru, a następnie resuspendować do pożądanego stężenia w 3% SM tak, aby 50 μl odpowiadało 5x105-1x106 komórkom (1x107 cells/ml - 2x107 cells/ml).</li>
</ol>
3. Barwienie powierzchni komórek / immunofenotypowanie MDSC z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Oznakuj dołki płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dla próbek kontrolnych i doświadczalnych oraz dla pojedynczych barwień do kontroli kompensacji (brak barwienia, NS; Mac-1-FITC; Gr-1-APC oraz DAPI).</li>
 <li>Do odpowiednich dołków w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaj od 5x105 do 1x106 komórek splenocytów, co odpowiada 50 μl/dołek. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.</li>
 <li>W probówce mikrocentryfużowej 1,5 ml na lodzie przygotuj „Master Mix” (MM) z Mouse BD Fc Block (monoklonalne przeciwciało szczura przeciw mysiemu CD16/32) rozcieńczonego w 3% SM. Jako punkt wyjścia zastosuj 1 μg Fc Block w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek.</li>
 <li>Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V, szybko odwracając płytkę nad pojemnikiem na odpady lub zlewem, tak aby nie naruszyć osadów komórkowych.</li>
 <li>Wymieszaj na wirówce Vortex, krótko wiruj Fc Block MM przez 5 sekund i dodaj 50 μl do wszystkich osadów w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół, pozostawiając próbki w dołkach. Inkubuj płytkę przez 15 min w ciemności na lodzie. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min.</li>
 <li>Podczas inkubacji próbek z Fc Block, przygotuj w probówce mikrocentryfużowej 1,5 ml na lodzie „Master Mix” (MM) z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami rozcieńczonymi w 3% SM. Przeciwciała powinny zostać tytrowane w celu ustalenia optymalnych rozcieńczeń do procedur barwienia. Jako punkt wyjścia połącz rozcieńczenie 1:25 Mac-1-FITC oraz rozcieńczenie 1:20 Gr-1-APC w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek z próbką.</li>
 <li>Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V w sposób opisany wcześniej.</li>
 <li>Wymieszaj na wirówce Vortex, krótko wiruj MM przeciwciał barwiących sprzężonych z fluorochromami przez 5 sekund i dodaj 50 μl do osadów kontrolnych i doświadczalnych. Wymieszaj dokładnie, delikatnie pipetując w górę i w dół. Dla kompensacji pojedynczych barwień do odpowiednich dołków dodaj rozcieńczenie 1:25 Mac-1-FITC, rozcieńczenie 1:20 Gr-1-APC oraz 75 ng/ml DAPI w 3% SM do uzyskania objętości końcowej 50 μl na dołek. Do dołka niebarwionego (No Stain) dodaj 50 μl 3% SM. Wymieszaj dokładnie i inkubuj komórki w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V przez 30 min w ciemności na lodzie.</li>
 <li>Oznakuj probówki do FACS (5 ml, 12 mm x 75 mm, polistyrenowe z dnem okrągłym) zgodnie z każdym dołkiem w płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V. Do każdej probówki FACS dodaj 200 μl 3% SM.</li>
 <li>Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min i usuń nadsącz. Przemyj osady, dodając 100 μl 3% SM do każdego osadu i mieszając dokładnie przez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Wiruj płytkę z prędkością 12 000 rpm (250-300 x g) przez 5 min. Powtórz etap płukania jeszcze raz.</li>
 <li>Ostrożnie usuń nadsącz z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V w sposób opisany wcześniej. Resuspenduj każdy osad w 100 μl 3% SM i wymieszaj dokładnie.</li>
 <li>Przenieś 100 μl resuspendowanego osadu z każdego dołka płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V do odpowiednio oznakowanej probówki FACS.</li>
 <li>Przed analizą cytometryczną dodaj 75 ng/ml DAPI do próbek kontrolnych i doświadczalnych oraz do kontroli kompensacji dla pojedynczego barwienia DAPI.</li>
 <li>Przeprowadź akwizycję danych cytometrycznych dla procentowej zawartości MDSC. Wykonaj kompensację, korzystając z kontroli negatywnej (kontrola bez barwienia) oraz kontroli pojedynczo dodatnich. Ustaw wykres kropkowy (dot plot) wyświetlający rozproszenie przednie (FSC) względem bocznego (SSC) w skali logarytmicznej, aby można było zidentyfikować interesujące populacje leukocytów. Wyznacz szeroki bramkę (gate) na wszystkie leukocyty, wykluczając debris i agregaty o najniższym rozproszeniu przednim i bocznym. Z tej bramki nadrzędnej utwórz nowy wykres kropkowy wyświetlający SSC względem DAPI i wyznacz bramkę dla komórek DAPI- (żywych). Wybierz tę nowo wyznaczoną populację i utwórz wykres kropkowy wyświetlający Mac-1 względem Gr-1, a następnie wyznacz bramkę dla podwójnie dodatnich (Mac-1+ Gr-1+) MDSC.</li>
</ol>
4. Magnetyczne wzbogacanie leukocytów Gr-1+
<ol>
 <li>Rozdziel pozostałe niebarwione leukocyty w ilości 1x107 do odpowiednio oznakowanych probówek FACS i wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min.</li>
 <li>Przygotuj MM przeciwciała Gr-1-PE w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dla liczby komórek do 107 zastosuj rozcieńczenie przeciwciała Gr-1-PE 1:10 w 50 μl MB na próbkę. W przypadku większej liczby komórek zwiększ objętości proporcjonalnie. Krótko wiruj przez 5 sekund, dodaj do leukocytów w probówkach FACS i inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
 <li>Dodaj 2 ml MB do probówek FACS, wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min i odlej nadsącz.</li>
 <li>Przygotuj MM Anti-PE MicroBeads w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dla liczby komórek do 107 zastosuj rozcieńczenie anti-PE MicroBeads 1:4 w 200 μl MB na próbkę. W przypadku większej liczby komórek zwiększ objętości proporcjonalnie. Krótko wiruj przez 5 sekund, dodaj do leukocytów w probówkach FACS i inkubuj przez 15 min w temperaturze 4 °C w ciemności.</li>
 <li>Dodaj 2 ml MB do probówek FACS, wiruj przy 12 000 obr./min (250-300 x g) przez 5 min i odlej nadsącz. Resuspenduj osad w 3 ml SB. Przefiltruj przez sito 70 μm do nowej, oznakowanej probówki stożkowej 50 ml.</li>
 <li>Przygotuj i zapraw urządzenie Auto MACS Pro Separator. Napełnij wszystkie butelki odpowiednimi roztworami i w razie potrzeby opróżnij butelkę na odpady. Włącz instrument i sprawdź stan pojemników z cieczami oraz kolumny po inicjalizacji. Wszystkie symbole powinny być zielone. W menu wybierz „Separation” z górnego paska menu, a następnie „Wash Now” z dolnego paska menu. Z opcji wyskakującego okienka wybierz „Rinse”, a następnie „Run”, aby rozpocząć proces zaprawiania. Po pomyślnym zakończeniu procesu zaprawiania instrument wyświetli komunikat „Ready for Separation” w menu Status.</li>
 <li>Wybierz odpowiedni chłodzony statyw na probówki dopasowany do ich rozmiarów i umieść probówkę stożkową 50 ml z magnetycznie znakowanymi komórkami w rzędzie A, probówkę stożkową 50 ml do zbierania frakcji negatywnej w rzędzie B oraz probówkę stożkową 15 ml do zbierania frakcji pozytywnej w rzędzie C.</li>
 <li>Wybierz program separacji komórek „POSSEL_S” dla pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych w trybie czułym dla próbek. Magnetycznie znakowane komórki docelowe są zatrzymywane na kolumnie automatu; komórki nieznakowane są uwalniane do probówki zbierającej frakcję negatywną w rzędzie B. Po automatycznym cofnięciu magnesu znakowane komórki docelowe zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję pozytywną w rzędzie C statywu.</li>
</ol>
5. Analiza leukocytów wzbogaconych w Gr-1+ po sortowaniu
<ol>
 <li>Ponownie policz frakcje Gr-1+ i Gr-1-, wykorzystując błękit trypanu oraz hemacytometr. Resuspenduj komórki do pożądanego stężenia w 3% medium barwiącym w taki sposób, aby 50 μl odpowiadało 5x105-1x106 komórkom (1x107 cells/ml - 2x107 cells/ml), a następnie przenieś 50 μl do odpowiednio oznakowanych probówek FACS.</li>
 <li>Przygotuj MM zawierający tylko Mac-1, w rozcieńczeniu 1:25 w 3% SM, aby uzyskać objętość końcową 50 μl na próbkę. Obarw komórki i przygotuj próbki do kompensacji pojedynczego barwienia dla Gr-PE, Mac-1 FITC oraz DAPI do analizy cytometrycznej. Dodaj 200 μl 3% SM oraz barwnik żywotności DAPI zgodnie z wcześniejszym opisem.</li>
 <li>Przeprowadź akwizycję danych w cytometrii przepływowej, aby określić procentowy udział frakcji Gr-1+ i Gr-1-, a także porównać procentowy udział MDSC przed i po wzbogaceniu metodą autoMACS.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Przedstawiamy tutaj reprezentatywne wyniki wzbogacania leukocytów Gr-1+ z połączonych śledzion z osobników naiwnych przy użyciu systemu autoMACS w celu późniejszego sortowania MDSC metodą FACS (Rysunek 1). Przed sortowaniem autoMACS 1x106 naiwnych leukocytów barwiono przeciwciałami Mac-1-FITC oraz Gr-1-APC, aby określić procentowy udział MDSC za pomocą urządzenia BD LSRII. Następnie 1x107 naiwnych leukocytów barwiono przeciwciałami anty-Gr-1-PE oraz PE-MicroBeads w celu wzbogacenia frakcji leukocytów Gr-1+ przy użyciu separatora autoMACS Pro. Po wzbogaceniu metodą autoMACS oceniano procentowy udział Gr-1 w zebranych frakcjach Gr-1+ i Gr-1- za pomocą cytometrii przepływowej. Odizolowano 1x106 leukocytów Gr-1+ i barwiono je przeciwciałem Mac-1-FITC, aby za pomocą cytometrii przepływowej przeanalizować i porównać procentowy udział MDSC we wzbogaconych, połączonych leukocytach naiwnych z niewzbogaconymi, połączonymi leukocytami z osobników z nowotworem.
<img alt="Analiza cytometrii przepływowej, ekspresja Gr-1 i Mac-1 w komórkach naiwnych i nowotworowych, wykresy konturowe." src="/files/ftp_upload/3875/3875fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Wzbogacanie leukocytów Gr-1+ od myszy naiwnych za pomocą systemu AutoMACS w celu sortowania MDSC metodą FACS. Śledziony pobrano od myszy z nowotworem trzustki oraz myszy naiwnych, a następnie przygotowano z nich zawiesiny pojedynczych komórek. Analiza cytometrii przepływowej leukocytów naiwnych barwionych powierzchniowo przeciwciałami sprzężonymi z fluoresceincją przeciwko Mac-1 i Gr-1 przed wzbogaceniem systemem autoMACS (A). Analiza cytometrii przepływowej frakcji Gr-1+ (B) oraz Gr-1- (C) po wzbogaceniu komórek Gr-1+ systemem autoMACS z połączonych leukocytów naiwnych barwionych przeciwciałami Gr-1-PE i mikro kuleczkami anti-PE. Analiza cytometrii przepływowej procentowego udziału MDSC i Gr-1+ po wzbogaceniu komórek Gr-1+ systemem autoMACS z połączonych leukocytów naiwnych (D) w porównaniu do niewzbogaconych połączonych leukocytów od myszy z nowotworem (E) (myszy naiwne, n=5; myszy z nowotworem, n=3). Procentowy udział MDSC i Gr-1 wyznaczono na reprezentatywnych wykresach konturowych i histogramach.

<ol><li>Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunosuppression+during+acute+Trypanosoma+cruzi+infection%3A+involvement+of+Ly6G+%28Gr1%28%2B%29%29CD11b%28%2B%29+immature+myeloid+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells.</a> Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).</li>
<li>Zhu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2BLy-6C%28hi%29+suppressive+monocytes+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+Ly-6C(hi) suppressive monocytes in experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J. Immunol. 179, 5228-5237 (2007).</li>
<li>Makarenkova, V. P., Bansal, V., Matta, B. M., Perez, L. A., Ochoa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD11b%2B%2FGr-1%2B+myeloid+suppressor+cells+cause+T+cell+dysfunction+after+traumatic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD11b+/Gr-1+ myeloid suppressor cells cause T cell dysfunction after traumatic stress.</a> J. Immunol. 176, 2085-2094 (2006).</li>
<li>Ghansah, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expansion+of+myeloid+suppressor+cells+in+SHIP-deficient+mice+represses+allogeneic+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Expansion of myeloid suppressor cells in SHIP-deficient mice represses allogeneic T cell responses.</a> J. Immunol. 173, 7324-7330 (2004).</li>
<li>Paraiso, K. H., Ghansah, T., Costello, A., Engelman, R. W., Kerr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+SHIP+deficiency+expands+myeloid+regulatory+cells+and+abrogates+graft-versus-host+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induced SHIP deficiency expands myeloid regulatory cells and abrogates graft-versus-host disease.</a> J. Immunol. 178, 2893-2900 (2007).</li>
<li>Yin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+prevent+type+1+diabetes+in+murine+models%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells prevent type 1 diabetes in murine models.</a> J. Immunol. 185, 5828-5834 (2010).</li>
<li>Gabrilovich, D. I., Nagaraj, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+as+regulators+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells as regulators of the immune system.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 162-174 (2009).</li>
<li>Gallina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+induce+a+subset+of+inflammatory+monocytes+with+immunosuppressive+activity+on+CD8%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Tumors induce a subset of inflammatory monocytes with immunosuppressive activity on CD8+ T cells.</a> J. Clin. Invest. 116, 2777-2790 (2006).</li>
<li>Zhao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+frequency+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+mice+with+spontaneous+pancreatic+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Increase in frequency of myeloid-derived suppressor cells in mice with spontaneous pancreatic carcinoma.</a> Immunology. 128, 141-149 (2009).</li>
<li>Greten, T. F., Manns, M. P., Korangy, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+derived+suppressor+cells+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Myeloid derived suppressor cells in human diseases.</a> Int Immunopharmacol. 11, 802-806 (2011).</li>
<li>Youn, J. I., Nagaraj, S., Collazo, M., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+myeloid-derived+suppressor+cells+in+tumor-bearing+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets of myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice.</a> J. Immunol. 181, 5791-5802 (2008).</li>
<li>Ribechini, E., Greifenberg, V., Sandwick, S., Lutz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets%2C+expansion+and+activation+of+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Subsets, expansion and activation of myeloid-derived suppressor cells.</a> Med. Microbiol. Immunol. 199, 273-281 (2010).</li>
<li>Pilon-Thomas, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+Pancreatic+Adenocarcinoma+Dampens+SHIP-1+Expression+and+Alters+MDSC+Homeostasis+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Murine Pancreatic Adenocarcinoma Dampens SHIP-1 Expression and Alters MDSC Homeostasis and Function.</a> PLoS One. 6, (2011).</li>
<li>Panopoulos, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAT3+governs+distinct+pathways+in+emergency+granulopoiesis+and+mature+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">STAT3 governs distinct pathways in emergency granulopoiesis and mature neutrophils.</a> Blood. 108, 3682-3690 (2006).</li>
<li>Preynat-Seauve, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extralymphatic+tumors+prepare+draining+lymph+nodes+to+invasion+via+a+T-cell+cross-tolerance+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Extralymphatic tumors prepare draining lymph nodes to invasion via a T-cell cross-tolerance process.</a> Cancer Res. 67, 5009-5016 (2007).</li>
<li>Davies, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+separations+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Cell separations by flow cytometry.</a> Methods Mol. Med. 58, 3-15 (2001).</li>
<li>Maecker, H., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selecting+reagents+for+multicolor+BD+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Postepy+Biochem%22%5BJournal%5D)">Selecting reagents for multicolor BD flow cytometry.</a> Postepy Biochem. 55, 461-467 (2009).</li>
<li>Bagwell, C. B., Adams, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Spectral+Overlap+Compensation+for+Any+Number+of+Flow+Cytometry+Parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Spectral Overlap Compensation for Any Number of Flow Cytometry Parameters.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 677, 167-184 (1993).</li>
<li>Perfetto, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine+reactive+dyes%3A+an+effective+tool+to+discriminate+live+and+dead+cells+in+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry.</a> J. Immunol. Methods. 313, 199-208 (2006).</li>
<li>Safarik, I., Safarikova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+magnetic+techniques+for+the+isolation+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Use of magnetic techniques for the isolation of cells.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 722, 33-53 (1999).</li>
<li>Collazo, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SHIP+limits+immunoregulatory+capacity+in+the+T-cell+compartment%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">SHIP limits immunoregulatory capacity in the T-cell compartment.</a> Blood. 113, 2934-2944 (2009).</li>
<li>Mack, E., Neubauer, A., Brendel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+RNA+yield+from+small+cell+populations+sorted+by+flow+cytometry+applying+different+isolation+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+A%22%5BJournal%5D)">Comparison of RNA yield from small cell populations sorted by flow cytometry applying different isolation procedures.</a> Cytometry. A. 71, 404-409 (2007).</li>
<li>Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+responses+of+human+regulatory+T+cells+%28Treg%29+and+effector+T+cells+to+rapamycin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin.</a> PLoS One. 4, e5994(2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Jest to szczegółowa metoda przetwarzania i immunofenotypowania populacji MDSC, która ma zastosowanie do różnych tkanek limfatycznych pochodzących z różnorodnych modeli zwierzęcych. W szczególności wzbogacanie autoMACS może być wykorzystane do izolacji różnych populacji leukocytów, w tym do usuwania Gr-1 ze splenocytów 4, oczyszczania podgrup mieloidalnych ze splenocytów i węzłów chłonnych 5, izolacji neutrofili z szpiku kostnego 14 oraz oczyszczania limfocytów T CD8+ ze śledzio...

<table><tbody><tr><td>1X fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30028.02</td><td>Bez Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/bez czerwieni fenolowej</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Pozostawić BSA do całkowitego rozpuszczenia w PBS; środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SV3001403HI</td><td>Inaktywowana ciepłem; środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwmysie monoklonalne przeciwciało anty-CD16/32 (Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD11b (Mac-1) FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-0112</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Ly6G (Gr-1) APC</td><td>eBioscience</td><td>17-5931</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie Ly6G (Gr-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-5931</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Rozcieńczenie seryjne w środowisku sterylnym</td></tr><tr><td>Sito do dysocjacji komórek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CD1-1KT</td><td>Autoklawować przed użyciem</td></tr><tr><td>Sito 70-&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>1X bufor do lizy erytrocytów (RBC)</td><td>eBioscience</td><td>00-4333-57</td><td>Przegrzać do temperatury pokojowej przed użyciem; środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-12</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Probówki stożkowe 50 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>339652</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Polistyrenowe probówki z okrągłym dnem 5 ml 12X75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td>Znane jako probówki FACS; środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Płytki 96-dołkowe z dnem w kształcie litery V</td><td>Corning</td><td>3897</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Błękit Trypanu</td><td>Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Mikrokulki PE (PE MicroBeads)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-801</td><td>Środowisko sterylne</td></tr><tr><td>Separator AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Kolumny AutoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Bufor roboczy AutoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (mdsc) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (automacs)

Preparation of Myeloid Derived Suppressor Cells (MDSC) from Naive and Pancreatic Tumor-bearing Mice using Flow Cytometry and Automated Magnetic Activated Cell Sorting (AutoMACS)

MDSC stanowią heterogenną populację niedojrzałych makrofagów, komórek dendrytycznych i granulocytów, które gromadzą się w narządach limfatycznych w stanach patologicznych, takich jak zakażenia pasożytnicze, stany zapalne, stres urazowy, choroba przeszczep przeciw gospodarzowi, cukrzyca i nowotwory1-7. U myszy MDSC wykazują ekspresję antygenów powierzchniowych Mac-1 (CD11b) oraz Gr-1 (Ly6G i Ly6C)7. Należy zauważyć, że MDSC są dobrze przebadane u różnych gospodarzy z nowotworami, u których ulegają one znacznej ekspansji i tłumią przeciwnowotworowe odpowiedzi immunologiczne w porównaniu z osobnikami naiwnymi7-10. Jednak w zależności od stanu patologicznego występują różne subpopulacje MDSC o odmiennych mechanizmach i celach supresji11,12. Dlatego skuteczne metody izolacji żywotnych populacji MDSC są istotne dla wyjaśnienia ich różnorodnych molekularnych mechanizmów supresji in vitro oraz in vivo.
Niedawno grupa Ghansaha zgłosiła ekspansję MDSC w mysim modelu raka trzustki. MDSC pobrane od myszy z nowotworem wykazują utratę homeostazy i zwiększoną funkcję supresyjną w porównaniu z naiwnymi MDSC 13. Procentowy udział MDSC jest znacznie mniejszy w przedziałach limfatycznych myszy naiwnych w porównaniu z myszami z nowotworem. Stanowi to istotne ograniczenie, które często utrudnia dokładne analizy porównawcze tych MDSC. Dlatego wzbogacenie leukocytów Gr-1+ z myszy naiwnych przed fluorescencyjnym sortowaniem komórek (FACS) zwiększa czystość, żywotność i znacznie skraca czas sortowania. Jednak wzbogacenie leukocytów Gr-1+ z myszy z nowotworem jest opcjonalne, ponieważ występują one w obfitości, co pozwala na szybki sorting FACS. W związku z tym w niniejszym protokole opisujemy wysoce wydajną metodę immunofenotypowania MDSC oraz wzbogacania leukocytów Gr-1+ ze śledzion myszy naiwnych w celu sprawnego sortowania MDSC. Immunokompetentne myszy C57BL/6 są poddawane podskórnej inokulacji mysimi komórkami Panc02, natomiast myszy naiwne otrzymują 1X PBS. Około 30 dni po inokulacji śledziony są pobierane i przetwarzane na zawiesiny pojedynczych komórek przy użyciu sita do dysocjacji komórek. Następnie przeprowadzana jest liza erytrocytów (RBC) splenocytów, a aliczkwota tych leukocytów jest barwiona przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami przeciwko Mac-1 i Gr-1 w celu immunofenotypowania procentowego udziału MDSC za pomocą cytometrii przepływowej. W równoległym eksperymencie całe leukocyty z myszy naiwnych są barwione przeciwciałami Gr-1 sprzężonymi z fluorescencją, inkubowane z PE-MicroBeads i selekcjonowane pozytywnie przy użyciu automatycznego separatora do magnetycznego sortowania komórek (autoMACS) Pro Separator. Następnie aliczkwota leukocytów Gr-1+ jest barwiona przeciwciałami Mac-1 w celu zidentyfikowania wzrostu procentowego udziału MDSC za pomocą cytometrii przepływowej. Tak przygotowane leukocyty wzbogacone o Gr-1+ są gotowe do sortowania FACS dla MDSC, które zostaną wykorzystane w analizach porównawczych (naiwne vs. z nowotworem) w badaniach in vivo oraz in vitro.

Jest to szybka i kompleksowa metoda immunofenotypowania mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) oraz wzbogacania populacji leukocytów Gr-1+ z śledziony mysiej. Metoda ta wykorzystuje cytometrię przepływową oraz sortowanie komórek AutoMACS w celu wyizolowania żywych leukocytów Gr-1+ przed sortowaniem MDSC metodą FACS do późniejszych analiz in vivo oraz in vitro.

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

MDSC stanowią heterogenną populację niedojrzałych makrofagów, komórek dendrytycznych i granulocytów, które gromadzą się w organach limfatycznych w stanach patologicznych...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest szybkie wygenerowanie populacji wzbogaconych leukocytów wykazujących pozytywną ekspresję GR1, zawierających żywe mieloidalne supresoryjne komórki szpiku lub mDSC, wyizolowane z śledzion myszy do zastosowania w badaniach in vivo oraz in vitro. Najpierw śledziony od kilku myszy są łączone i przetwarzane w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek. Aby określić procentowy udział mDSC przed wzbogaceniem, niewielka porcja połączonych komórek jest przenoszona do płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.Antygeny powierzchniowe MAC-1 i GR-1 zostają oznakowane, a oznakowane komórki przeniesione do probówek typu fax w celu analizy cytometrycznej. Pozostałe połączone leukocyty barwi się przeciwciałem koniugatem fluorochromu przeciwko GR-1 i inkubuje z magnetycznymi mikrokulkami, które wiążą się z fluorochromem na przeciwciałach anty-GR-1. Następnie populacje GR-1-dodatnie oraz GR-1-ujemne są rozdzielane przy użyciu separatora AutoMax pro, aby ocenić skuteczność wzbogacenia populacji o komórki GR-1.Pobiera się małą alikwotę i analizuje ją pod kątem ekspresji GR one oraz MAC one w celu oceny procentowej zawartości MDSC. Porównanie uzyskanych danych z immunofenotypowania wykazuje wzrost procentowego udziału MDSC w populacji leukocytów wzbogaconej o GR one w porównaniu z populacją niewzbogaconą. Ponadto obserwuje się wzrost liczby naiwnych MDSC, co prowadzi do uzyskania populacji porównywalnej z MDSC pochodzącymi z organizmów z nowotworem.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak konwencjonalne barwienie przepływowe oraz sortowanie mDSC z tkanek limfatycznych przy użyciu szybkich cytometrów przepływowych, jest to, że zastosowanie master mixu zapobiega znacznym rozbieżnościom w wynikach poprzez zapewnienie równomiernego barwienia powierzchni leukocytów z puli, co umożliwia typowanie oraz sortowanie mDSC i komórek GR1+ za pomocą systemu AutoMax. Procedury zaprezentują Nadine Nelson, doktorantka z naszego laboratorium, oraz dr Hawsra, dyrektor centrum cytometrii przepływowej USF. Poniższą procedurę należy przeprowadzić w środowisku sterylnym, pod dygestorium z biologicznego bezpieczeństwa, utrzymując komórki i przeciwciała w lodzie.W miarę możliwości zmontuj sito do dysocjacji komórek, wkładając siatkę do otworu w kubku w kierunku dna. Następnie włóż pierścień mocujący do obszaru z gwintem stroną z nacięciem do góry i za pomocą klucza do pierścienia dokręć pierścień mocujący, aby zabezpieczyć siatkę. Umieść zmontowane sito w szalce Petri zawierającej 10 milliliters puli XPBS.Śledziony pobrane od myszy C 57 black six w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, z guzami lub naiwne myszy kontrolne, należy umieścić w siatce sita do dysocjacji komórek. Następnie, używając szklanego tłuczka, należy rozetrzeć śledziony przez siatkę do szalki Petriego. Powtórzyć ten proces dla każdej grupy myszy poddanych określonej procedurze.Następnie, używając pipety serologicznej o pojemności 5 ml, nanieś zawiesinę komórkową na sito komórkowe o oczkach 70 µm i pozwól jej przefiltrować do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Wirować przy 250–300 ×g przez pięć minut. Usuń supernatant i resuspenduj osad, dodając 5 ml buforu do lizy RBC na każdą śledzionę, i intensywnie pipetuj w górę i w dół; inkubuj w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji zatrzymaj reakcję, dodając 20 ml PBS i intensywnie pipetując w górę i w dół.Następnie odwiruj próbkę przy 250 do 300 ×g przez pięć minut, po czym usuń supernatant, zawiesić osad w 20 ml sterylnego PBS i policzyć komórki. Używając błękitu trypanowego i komory licznej, resuspenduj komórki do stężenia od 1 × 10⁷ do 2 × 10⁷ komórek na ml w 3% medium barwiącym. Osiągnięcie optymalnego barwienia jest najtrudniejszym elementem tej procedury.Można to skutecznie przeprowadzić, wykonując wcześniej miareczkowanie przeciwciał. Do przygotowania mieszanin głównych (master mixes) oraz barwienia powierzchniowego należy używać małych objętości, zgodnie z opisem w niniejszym protokole. W celu zabarwienia komórek do analizy cytometrycznej, należy opisać studzienki płytki V-bottom 96-dołkowej dla próbek kontrolnych, doświadczalnych oraz barwień pojedynczych.W celu wykonania kontroli kompensacji, do każdego z oznakowanych dołków dodaj od 5×10⁵ do 1×10⁶ komórek w 50 µL. Następnie wiruj płytkę z prędkością 250–300 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu obejrzyj płytkę od spodu.Upewniając się, że w dołkach znajdują się pellety, należy przygotować w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml na lodzie mieszaninę główną (master mix) do blokowania mysich BDFC, zawierającą monoklonalne przeciwciało szczurze anty-muse CD 1632 rozcieńczone w 3% medium do barwienia, a następnie wymieszać całość wirówką vortex. Następnie krótko wirować przez pięć sekund, trzymając płytkę 96-dołkową z dnem w kształcie litery V nad pojemnikiem na odpady lub zlewem. Szybko odwrócić płytkę i przywrócić ją do pozycji wyjściowej, aby usunąć nadosad bez naruszania pelletów komórkowych.Następnie do wszystkich pelletów na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V dodaj 50 µL master mixu FC block, mieszając poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół. Umieść płytkę na lodzie i inkubuj przez 15 minut w ciemności, a następnie wiruj płytkę z prędkością od 250 do 300 ×g przez pięć minut. W probówce do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml na lodzie przygotuj master mix przeciwciał Mac 1 fitzy oraz GR 1 A PC rozcieńczonych w 3% medium barwiącym.Krótko wirować w wirówce typu vortex przez pięć sekund. Po wirowaniu odwrócić płytkę, aby usunąć nadsącz z każdej studzienki, a następnie dodać 50 µL mieszaniny przeciwciał do osadów kontrolnych lub eksperymentalnych. Dokładnie wymieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. W przypadku kompensacji dla pojedynczego barwienia dodać 50 µL rozcieńczonego MAC one F GR one A PC lub DPI w 3% medium do barwienia do odpowiednich studzienek. W przypadku kontroli bez barwienia dodać 50 µL 3% medium do barwienia do odpowiedniej studzienki i wymieszać.Następnie inkubuj płytkę przez 30 minut w ciemności na lodzie. Podczas inkubacji opisz probówki do FACS tak, aby odpowiadały poszczególnym dołkom płytki, i dodaj do każdej probówki 200 µL 3% medium barwiącego. Po upływie 30-minutowego czasu inkubacji odwiruj płytkę z prędkością od 250 do 300 ×g przez pięć minut.Po wirowaniu usunąć nadfiltr w taki sam sposób jak poprzednio. Następnie przemyć osady, dodając 100 µl 3% medium barwiącego do każdego osadu. Wymieszać dokładnie, delikatnie pipetując ciecz w górę i w dół.Ponownie odwiruj płytkę przez pięć minut. Po wirowaniu powtórz krok płukania, usuń natin w taki sam sposób jak poprzednio i resuspenduj każdy osad w 100 µL 3% medium barwiącego, a następnie dokładnie wymieszaj. Następnie przenieś 100 µL resuspendowanych komórek z każdego dołka płytki do odpowiednio oznakowanych probówek FACS.Następnie dodaj 75 ng/mL DPI do próbek kontrolnych i eksperymentalnych oraz do kontroli kompensacji dla pojedynczego barwienia DPI. Przeprowadź akwizycję danych cytometrycznych w celu wyznaczenia procentowej zawartości MDSC zgodnie z opisem w załączonym dokumencie; następnie wzbogać alikwot leukocytów dodatnich dla GR1 w ilości 1x10⁷ z pozostałych niebarwionych leukocytów w odpowiednio oznakowanych probówkach do cytometrii przepływowej i wiruj je z prędkością 250-300 ×g przez 5 minut. Dodaj 50 µL rozcieńczenia 1:10 przeciwciała GR1 PE w buforze MACS i inkubuj przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.Po inkubacji należy dodać dwa mililitry buforu max do każdej probówki fax i wirować przy 250 do 300 ×g przez pięć minut. Po wirowaniu należy usunąć nadsącz. Następnie do każdej probówki dodaje się 200 µL rozcieńczenia 1:4 mikrokulek anti PE w buforze max i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.Do probówek FACS dodać dwa mililitry buforu max i wirować przy 250 do 300 ×g przez pięć minut. Następnie osad zawiesić w trzech mililitrach buforu barwiącego, przefiltrować przez sitko 70 μm do nowej, opisanej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. W tym protokole stosujemy automatyczną separację magnetyczną.Separacja magnetyczna jest doskonałym wyborem metodycznym. Jeśli potrzebujesz szybko i w sposób kosztowo efektywny wyizolować dużą liczbę komórek w oparciu o marker powierzchniowy, upewnij się, że na koniec zweryfikujesz wyniki za pomocą cytometrii przepływowej. Aby przygotować i zainicjować separator AutoMax pro, upewnij się, że wszystkie butelki są napełnione odpowiednimi roztworami.Włącz urządzenie. Po inicjalizacji sprawdź stan pojemników na ciecze i kolumn. Wszystkie symbole powinny być zielone.W następnym kroku wybierz opcję separation z górnego paska menu, a następnie wash. Teraz z dolnego paska menu wybierz funkcję rinse z listy rozwijanej, a następnie run, aby rozpocząć proces przygotowania układu (priming). Po pomyślnym zakończeniu procesu przygotowania instrument wyświetli komunikat o gotowości do separacji.W menu stanu umieść 50 ml probówkę stożkową z komórkami znakowanymi magnetycznie w rzędzie A odpowiednio dopasowanego, schłodzonego statywu na probówki. Następnie w rzędzie B umieść 50 ml probówkę stożkową do zbierania frakcji negatywnej, a w rzędzie C 15 ml probówkę stożkową do zbierania frakcji pozytywnej. Wybierz program separacji komórek POS cell S w celu pozytywnej selekcji znakowanych komórek docelowych w trybie czułym z próbek. Po rozpoczęciu programu magnetycznie znakowane komórki docelowe zostaną zatrzymane na kolumnie AutoMax, podczas gdy komórki nieznakowane zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję negatywną w rzędzie B. Następnie magnes zostanie wycofany, a znakowane komórki docelowe zostaną uwolnione do probówki zbierającej frakcję pozytywną w rzędzie C statywu.Po wzbogaceniu, użyj błękitu trypanu oraz komory countingowej (hemo-cytometru), aby ponownie policzyć frakcje GR1-dodatnie i GR1-ujemne. Następnie resuspender komórki w medium barwiącym 3% w stężeniu od 1 × 10⁷ komórek/ml do 2 × 10⁷ komórek/ml i przenieś 50 µL do odpowiednio oznakowanych probówek typu fax. Zabarw komórki MAC-1 oraz barwnikiem żywotności DPI do cytometrii przepływowej i kompensacji dla pojedynczych barwień.Przeprowadź akwizycję danych z cytometrii przepływowej, aby oznaczyć procentowy udział komórek GR one dodatnich oraz GR one ujemnych, a także porównać procentowy udział MDSC przed i po wzbogaceniu metodą AutoMax. Śledziony pobrano od myszy z guzami trzustki oraz myszy naiwnych, a następnie przygotowano zawiesiny pojedynczych komórek zgodnie z opisem w niniejszym artykule wideo. Cytometrię przepływową wykonano w celu zbadania leukocytów naiwnych, których powierzchnię barwiono przeciwciałami koniugowanymi z fluorochromami przeciwko MAC one i GR one. Jak pokazano tutaj, przed wzbogaceniem metodą AutoMax widoczny jest jedynie bardzo niski odsetek (1,19%) naiwnych komórek MDC dodatnich dla MAC one i GR one. Jednak po wzbogaceniu populacji GR one dodatniej, ta subpopulacja komórek jest znacznie liczniejsza (10,5% u myszy naiwnych) i jest obecnie porównywalna z wynikiem 25,3% u myszy z guzami.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, w tym przyspieszone MDSC, sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej w eksperymentach z transferem in vivo, ilościową PCR w czasie rzeczywistym oraz western blotting, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące mechanizmów molekularnych odpowiedzialnych za ekspansję, migrację i różnicowanie MDSC oraz ich wpływ na supresję odpowiedzi immunologicznych.

preparation-myeloid-derived-suppressor-cells-mdsc-from-naive

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Przygotowanie komórek supresorowych pochodzenia mieloidalnego (MDSC) z myszy naiwnych i noszących guzy trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek (AutoMACS)

W niniejszym raporcie opisujemy protokół izolacji wysoko oczyszczonych populacji leukocytów infiltrujących guzy. Protokół ten został opracowany na podstawie metody firmy Miltenyi Biotech w celu zwiększenia wydajności i czystości izolacji komórek z złożonej tkanki nowotworowej.

Izolacja komórek odpornościowych z guzów pierwotnych

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Zgłaszamy protokół wykorzystujący sortowanie komórek aktywowane fluorescencją do izolowania plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (pDC) o wysokiej czystości ze szpiku kostnego myszy podatnych na toczeń do badań funkcjonalnych pDC.

Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją w celu oczyszczenia plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych ze szpiku kostnego myszy

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Opisujemy zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT) do oceny potencjału nowotworowego genetycznie modyfikowanych komórek krwiotwórczych. HSCT jest przydatny do oceny różnych złośliwych komórek krwiotwórczych in vivo, a także do generowania dużej kohorty myszy z zespołami mielodysplastycznymi (MDS) lub białaczką w celu oceny nowych terapii.

Zastosowanie przeszczepu krwiotwórczych komórek macierzystych do oceny pochodzenia zespołu mielodysplastycznego

Opisujemy tutaj protokół badania cytotoksyczności wstępnie aktywowanych limfocytów T CD8+ przeciwko komórkom rakowym poprzez wykrywanie apoptotycznych komórek rakowych za pomocą mikroskopii w czasie rzeczywistym. Protokół ten może badać mechanizmy stojące za supresją limfocytów T indukowaną przez komórki szpikowe i oceniać związki mające na celu uzupełnienie limfocytów T poprzez blokadę immunologicznych komórek szpikowych.

Wykrywanie w czasie rzeczywistym apoptozy komórek nowotworowych in vitro indukowanej przez limfocyty T CD8 + w celu zbadania funkcji immunosupresyjnych komórek szpikowych naciekających nowotwór

Tutaj prezentujemy protokół izolacji i oczyszczania pierwotnego mikrogleju w zwierzęcych modelach chorób demielinizacyjnych, wykorzystując kolumnowe sortowanie komórek aktywowane magnetycznie.

Izolacja pierwotnego mikrogleju myszy przez sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie w zwierzęcych modelach demielinizacji

Opisujemy metodę wykorzystania limfocytów naciekających nowotwór (TIL) od myszy za pomocą cytometrii przepływowej do adoptywnego transferu komórek. Protokół ten ma na celu weryfikację specyficznej cytotoksyczności TIL wobec nowotworów w mysim modelu syngenicznego raka trzustki, dostarczając informacji na temat rozwoju adoptywnych terapii komórkowych w raku trzustki.

Izolacja oparta na cytometrii przepływowej i ocena terapeutyczna limfocytów naciekających nowotwór w mysim modelu raka trzustki

Dokładna i praktyczna metoda pomiaru parametrów takich jak odkształcenie (strain) w tkance mięśnia sercowego ma dużą wartość kliniczną, ponieważ wykazano, że odkształcenie jest czulszym i wcześniejszym markerem dysfunkcji kurczliwości niż często stosowany parametr EF.

Ocena odkształcenia mięśnia sercowego w rezonansie magnetycznym z wykorzystaniem śledzenia cech (feature tracking)

Identyfikacja komórek inicjujących guz mózgu (BTICs), czyli rzadkich komórek w obrębie heterogennego guza posiadających właściwości komórek macierzystych, dostarcza nowych informacji na temat patogenezy nowotworów mózgu u ludzi. Zoptymalizowaliśmy specyficzne warunki hodowli w celu wzbogacenia populacji BTICs, a do dalszej selekcji tych populacji rutynowo wykorzystujemy cytometrię przepływową. Następnie w tych wyizolowanych komórkach można przeprowadzić testy samoodnawiania oraz analizę...

Opracowywanie tkanki pierwotnego guza mózgu do testów komórek macierzystych i sortowania przepływowego

Naucz się izolować komórki MDSC z mysich śledzion przy użyciu cytometrii przepływowej i AutoMACS. Ta metoda umożliwia szybkie wzbogacanie leukocytów Gr-1+ o wysokiej żywotności do badań immunologicznych.

Przygotowanie komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC) od myszy naiwnych i z guzem trzustki przy użyciu cytometrii przepływowej i automatycznego sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (AutoMACS) (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie mieloidalnych komórek supresorowych (MDSC) od myszy naiwnych oraz myszy z nowotworem trzustki z wykorzystaniem cytometrii przepływowej i zautomatyzowanego magnetycznego sortowania komórek aktywowanych (AutoMACS)

Przeglądaj więcej filmów