Name: Badania przesiewowe interakcji zewnątrzkomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) do skalowalnego wykrywania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy o niskim powinowactwie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Poznaj metodę AVEXIS do wykrywania słabych interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowych. Ta technika umożliwia skalowalne badanie rozpoznawania komórkowego i komunikacji międzykomórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant Wellcome Trust numer [077108] przyznany GJW.

<ol><li>Fagerberg, L., Jonasson, K., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+the+human+membrane+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Prediction of the human membrane proteome.</a> Proteomics. 10, 1141-1141 (2010).</li>
<li>Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+initiation+in+biological+systems%3A+the+properties+and+detection+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Signal initiation in biological systems: the properties and detection of transient extracellular protein interactions.</a> Molecular bioSystems. 5, 1405-1405 (2009).</li>
<li>Bushell, K. M., Sollner, C., Schuster-Boeckler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+screening+for+novel+low-affinity+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Large-scale screening for novel low-affinity extracellular protein interactions.</a> Genome research. 18, 622-622 (2008).</li>
<li>Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-level+and+high-throughput+recombinant+protein+production+by+transient+transfection+of+suspension-growing+human+293-EBNA1+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells.</a> Nucleic acids research. 30, e9-e9 (2002).</li>
<li>Bendtsen, J. D., Nielsen, H., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Prediction+of+Signal+Peptides%3A+SignalP+3.0%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Improved Prediction of Signal Peptides: SignalP 3.0.</a> Journal of molecular biology. 340, 783-783 (2004).</li>
<li>Krogh, A., Larsson, B., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+transmembrane+protein+topology+with+a+hidden+markov+model%3A+application+to+complete+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model: application to complete genomes.</a> Journal of molecular biology. 305, 567-567 (2001).</li>
<li>Brown, M. H., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+immunoglobulin+and+scavenger+receptor+superfamily+domains+as+chimeric+proteins+with+domains+3+and+4+of+CD4+for+ligand+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+engineering%22%5BJournal%5D)">Expression of immunoglobulin and scavenger receptor superfamily domains as chimeric proteins with domains 3 and 4 of CD4 for ligand analysis.</a> Protein engineering. 7, 515-515 (1994).</li>
<li>Wright, G. J., Puklavec, M. J., Willis, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphoid%2Fneuronal+cell+surface+OX2+glycoprotein+recognizes+a+novel+receptor+on+macrophages+implicated+in+the+control+of+their+function%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Lymphoid/neuronal cell surface OX2 glycoprotein recognizes a novel receptor on macrophages implicated in the control of their function.</a> Immunity. 13, 233-23 (2000).</li>
<li>Dustin, M. L., Golan, D. E., Zhu, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+affinity+interaction+of+human+or+rat+T+cell+adhesion+molecule+CD2+with+its+ligand+aligns+adhering+membranes+to+achieve+high+physiological+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Low affinity interaction of human or rat T cell adhesion molecule CD2 with its ligand aligns adhering membranes to achieve high physiological affinity.</a> The Journal of biological chemistry. 272, (1997).</li>
<li>Wright, G. J., Martin, S., Bushell, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+identification+of+transient+extracellular+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">High-throughput identification of transient extracellular protein interactions.</a> Biochemical Society transactions. 38, (2010).</li>
<li>de Wildt, R. M., Tomlinson, I. M., Ong, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+receptor-ligand+pairs+by+capture+of+long-lived+multivalent+interaction+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Isolation of receptor-ligand pairs by capture of long-lived multivalent interaction complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, (2002).</li>
<li>Jiang, L., Barclay, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+leucocyte+surface+protein+interactions+by+high-throughput+screening+with+multivalent+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Identification of leucocyte surface protein interactions by high-throughput screening with multivalent reagents.</a> Immunology. 129, 55-55 (2010).</li>
<li>Urech, D. M., Lichtlen, P., Barberis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+growth+selection+system+to+detect+extracellular+and+transmembrane+protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Cell growth selection system to detect extracellular and transmembrane protein interactions.</a> Biochimica et biophysica acta. 1622, 117-117 (2003).</li>
<li>Voulgaraki, D., Mitnacht-Kraus, R., Letarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multivalent+recombinant+proteins+for+probing+functions+of+leucocyte+surface+proteins+such+as+the+CD200+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Multivalent recombinant proteins for probing functions of leucocyte surface proteins such as the CD200 receptor.</a> Immunology. 115, 337-337 (2005).</li>
<li>Wojtowicz, W. M., Wu, W., Andre, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vast+repertoire+of+Dscam+binding+specificities+arises+from+modular+interactions+of+variable+Ig+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A vast repertoire of Dscam binding specificities arises from modular interactions of variable Ig domains.</a> Cell. 130, 1134-1134 (2007).</li>
<li>Martin, S., Sollner, C., Charoensawan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Large+Extracellular+Protein+Interaction+Network+and+Its+Resolution+by+Spatiotemporal+Expression+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a Large Extracellular Protein Interaction Network and Its Resolution by Spatiotemporal Expression Profiling.</a> Mol. Cell. Proteomics. 9, 2654-2654 (2010).</li>
<li>Crosnier, C., Bustamante, L. Y., Bartholdson, S. J., Bei, A. K., Theron, M., Uchikawa, M., Mboup, S., Ndir, O., Kwiatkowski, D. P., Duraisingh, M. T., Rayner, J. C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basigin+is+a+receptor+essential+for+erythrocyte+invasion+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Basigin is a receptor essential for erythrocyte invasion by Plasmodium falciparum.</a> Nature. 480, 534-537 (2011).</li>
<li>Sollner, C., Wright, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+surface+interaction+network+of+neural+leucine-rich+repeat+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">A cell surface interaction network of neural leucine-rich repeat receptors.</a> Genome biology. 10, R99-R99 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Kiedy żywe komórki są obserwowane in vivo, ich błony plazmatyczne wykazują wysoce dynamiczne zachowania: wysuwają i chovają wypustki błonowe podczas kontaktu i komunikacji z sąsiadami2. Interakcje fizyczne między białkami receptorowymi osadzonymi w błonie, które pośredniczą w wielu z tych kontaktów, ewoluowały w taki sposób, aby były niezwykle słabe, co umożliwia to wysoce ruchliwe zachowanie. Szacuje się, że siły interakcji monomerowych tak słabe jak 50 μM mogą być wystarczające do wywołania spontanicznych oddziaływań przy fizjologicznych gęstościach receptorów9, co sprawia, że wykrywanie nowych interakcji jest niezwykle trudne2,10. Opisana tutaj metoda AVEXIS zapewnia czuły sposób wykrywania przejściowych zewnątrzkomórkowych interakcji białko-białko, który może być wdrażany w sposób skalowalny przy niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich. Choć opracowano inne skalowalne metody wykrywania interakcji zewnątrzkomórkowych11-15, jedną z zalet AVEXIS jest to, że parametry eksperymentalne, takie jak aktywności białek przynęty (bait) i ofiary (prey), zostały ilościowo określone w celu wykrywania nawet najsłabszych interakcji (t1/2 ≤ 0.1 s) przy jednoczesnym zachowaniu niskiego odsetka wyników fałszywie dodatnich3. Ponadto usprawnione i solidne procedury przygotowania próbek pozwoliły na wdrożenie tego testu na znacznie większą skalę niż w przypadku innych analiz; niedawno opisaliśmy systemowy screening interakcji obejmujący łącznie ponad ~16 500 potencjalnych oddziaływań16.
Analizę można przeprowadzić dla każdego białka, dla którego możliwe jest uzyskanie ekspresji rozpuszczalnego fragmentu rekombinowanego białka. Obejmuje to zatem białka zawierające N-końcowy peptyd sygnałowy, takie jak białka typu I, białka zakotwiczone przez GPI oraz białka wydzielnicze. Opracowaliśmy niedawno zestaw wektorów, które umożliwiają nam obecnie wykorzystanie białek typu II jako białek przynęty (baits)17. Metoda ta nie jest zazwyczaj odpowiednia dla wieloprzepustowych białek błonowych, takich jak transportery jonowe lub pompy, ponieważ jest mało prawdopodobne, aby prawidłowo sfałdowały się one poza kontekstem błony plazmatycznej. Zastosowaliśmy tę procedurę w różnych systemach i z powodzeniem wyekspresowaliśmy białka zewnątrzkomórkowe z ryby *zebrafish*3,16,18, człowieka, myszy oraz P. falciparum w celu przeprowadzenia analiz interakcji.
Jeśli chodzi o zasoby wymagane do przygotowania badania przesiewowego AVEXIS, stwierdziliśmy, że istotnym wąskim gardłem jest wybór, konstrukcja i pełne sekwencjonowanie plazmidów ekspresyjnych. Ten etap metody może zająć do roku w celu stworzenia około 100 konstruktów przynęty (bait) i ofiary (prey); jednak, ze względu na spadające koszty syntezy genów, obecnie preferujemy outsourcing komercyjny tego etapu projektu. System ekspresji ssaczej wraz z dużym inkubatorem do hodowli tkanek z wytrząsaniem (używamy modelu INFORS HT Multitron Cell) umożliwia jednemu badaczowi ekspresję i normalizację do ok. 100 białek przynęty i ofiary miesięcznie. Po wyprodukowaniu i normalizacji białek proces przesiewania w celu wykrycia interakcji przebiega szybko, co pozwala na wygodne przetwarzanie do dwunastu płytek 96-dołkowych dziennie. Jedynym specjalistycznym urządzeniem, które opracowaliśmy w celu usprawnienia produkcji tak dużej liczby białek, jest tłok napędzany sprężonym powietrzem, który służy do równoległego przepuszczania do pięciu nadnadkładów przez filtr 0,22μm.
Główną klasą oddziaływań, które mogą zostać pominięte w porównaniu z oddziaływaniami oczekiwanymi na podstawie literatury (wyniki fałszywie ujemne), są oddziaływania homofilowe, choć niektóre z nich można wykryć3. W przypadkach, gdy nie wykryto oczekiwanych oddziaływań, uważamy, że wynika to z tworzenia oddziaływań homofilowych przez białka typu prey (efekt „maskowania” prey), co zapobiega dalszym oddziaływaniom z unieruchomionymi białkami typu bait. Częstotliwość wykrywania oddziaływań zależy od zawartości przesiewanej biblioteki białek. Dla orientacji czytelnika, przesiewanie &gt;30 000 oddziaływań w obrębie superrodziny immunoglobulin ryby danio-ostroboki zaowocowało 188 wynikami pozytywnymi – co stanowi częstotliwość 0,6%3,16,18. Bardzo szybkim sposobem weryfikacji wyników pozytywnych jest sprawdzenie, czy oddziaływanie można wykryć w obu orientacjach bait-prey; tzn. czy to samo oddziaływanie można wykryć niezależnie od tego, czy wiążące białka występują jako bait, czy jako prey. Ilekroć obserwowaliśmy takie wzajemne zachowanie, wykazano następnie, że wiązanie jest specyficzne, demonstrując bezpośrednie wiązanie nasycalne oczyszczonych białek za pomocą rezonansu plazmonowego powierzchni. Należy podkreślić, że ze względu na zwiększenie awidności wiązania poprzez sztuczną pentameryzację białek prey, nie uważamy tego testu za odpowiedni do ilościowego porównywania siły oddziaływań. W celu uzyskania biofizycznych parametrów wiązania oddziaływań stosujemy białka monomeryczne i rezonans plazmonowy powierzchni. Wreszcie, po zidentyfikowaniu oddziaływania, wysokoprzepustowy charakter testu sprawia, że stosunkowo łatwo jest go dostosować do przesiewania odczynników, takich jak przeciwciała lub małe cząsteczki, które blokują dane oddziaływanie.

<table><tbody><tr><td>Pożywka Freestyle</td><td>Invitrogen</td><td>12338018</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocefina</td><td>Calbiochem</td><td>484400</td><td></td></tr><tr><td>Płytki mikrotitracyjne powlekane SA</td><td>Nalge Nunc international</td><td>734-1284</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało OX68</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1022R</td><td></td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>PN68100</td><td></td></tr><tr><td>Polymyksyna B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4932</td><td></td></tr><tr><td>D-biotyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639-5G</td><td></td></tr><tr><td>Substrat-104</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1040-506</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory wirówkowe Vivaspin-20</td><td>Sartorius AG</td><td>VS2002</td><td></td></tr><tr><td>Filtry 0.22 &amp;mu;m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>190-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (avexis) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Zewnątrzkomórkowe oddziaływania białko-białko pomiędzy białkami wydzielanymi lub zakotwiczonymi w błonie mają kluczowe znaczenie zarówno dla inicjowania komunikacji międzykomórkowej, jak i zapewnienia spójności organizmów wielokomórkowych. Białka, co do których przewiduje się, że tworzą oddziaływania zewnątrzkomórkowe, są kodowane przez około jedną czwartą ludzkich genów1, jednak mimo ich znaczenia i liczności, większość z tych białek nie ma udokumentowanego partnera wiążącego. Wynika to przede wszystkim z ich trudności biochemicznych: białka osadzone w błonie są trudne do solubilizacji w ich natywnej konformacji i zawierają istotne strukturalnie modyfikacje potranslacyjne. Ponadto powinowactwa oddziaływań między białkami receptorowymi często charakteryzują się niezwykle niską siłą oddziaływania (okresy półtrwania &lt; 1 sekundy), co uniemożliwia ich wykrycie za pomocą wielu powszechnie stosowanych metod wysokoprzepustowych2.
W niniejszej pracy opisujemy test AVEXIS (AVidity-based EXtracellular Interaction Screen), który pozwala przezwyciężyć te wyzwania techniczne, umożliwiając wykrywanie bardzo słabych oddziaływań białkowych (t1/2 ≤ 0,1 sec) przy niskim odsetku wyników fałszywie dodatnich3. Test ten jest zazwyczaj wdrażany w formacie wysokoprzepustowym, co umożliwia systematyczny screening tysięcy oddziaływań w wygodnym formacie płytek mikrotitracyjnych (Rys. 1). Metoda opiera się na produkcji rozpuszczalnych bibliotek białek rekombinowanych zawierających fragmenty ektodomeny receptorów powierzchni komórkowych lub białek wydzielniczych, w obrębie których poszukiwane są oddziaływania; w związku z tym podejście to jest odpowiednie dla receptorów powierzchni komórkowych typu I, typu II, receptorów związanych z GPI oraz białek wydzielniczych, lecz nie dla białek błonowych wieloprzepustowych, takich jak kanały jonowe czy transportery.
Biblioteki białek rekombinowanych są wytwarzane przy użyciu wygodnego systemu ekspresji ssaczej o wysokiej wydajności4, aby zapewnić wprowadzenie istotnych modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja i mostki dwusiarczkowe. Ekspresowane białka rekombinowane są wydzielane do pożywki i produkowane w dwóch formach: biotynilowanej przynęty (bait), która może zostać wychwycona na fazie stałej pokrytej streptawidyną odpowiedniej do przesiewania, oraz pentameryzowanej ofiary (prey) z dołączonym enzymem (β-laktamazą). Białka przynęty i ofiary są prezentowane sobie nawzajem w układzie binarnym w celu wykrycia bezpośrednich oddziaływań między nimi, w sposób podobny do konwencjonalnego testu ELISA (Rys. 1). Pentameryzacja białek w ofierze jest osiągana poprzez sekwencję peptydową z białka macierzy oligomerycznej chrząstki (COMP), co zwiększa lokalne stężenie ektodomen, zapewniając tym samym znaczący wzrost awidności, który umożliwia wykrycie nawet bardzo przejściowych oddziaływań. Poprzez normalizację aktywności zarówno przynęty, jak i ofiary do określonych poziomów przed przesiewaniem, wykazaliśmy, że oddziaływania o monomerowych okresach połowicznego rozpadu wynoszących 0,1 sec mogą być wykrywane przy niskim poziomie wyników fałszywie dodatnich3.

AVEXIS to wysokoprzepustowy test interakcji białkowych opracowany w celu systematycznego przesiewania nowych zewnątrzkomórkowych par receptor-ligand zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego. Został on zaprojektowany specjalnie do wykrywania przejściowych interakcji białkowych, które są trudne do zidentyfikowania przy użyciu innych metod wysokoprzepustowych.

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Zewnątrzkomórkowe oddziaływania białko-białko pomiędzy białkami wydzielanymi lub zakotwiczonymi w błonie mają kluczowe znaczenie zarówno dla inicjacji komunikacji międzykomórkowej, jak i...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest odkrycie nowych zewnątrzkomórkowych oddziaływań białkowych zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego, w szczególności w przypadku białek receptorowych osadzonych w błonie. Metoda AveXis została opracowana, aby obejść problem bardzo słabych powinowactw oddziaływań, które są charakterystyczne dla tej klasy interakcji białkowych, a także fakt, że białka błonowe są trudne do manipulacji biochemicznej. Osiąga się to poprzez wstępne stworzenie biblioteki białek rekombinowanych obejmującej regiony zewnątrzkomórkowe receptorów powierzchni komórki.Osiąga się to poprzez zaprojektowanie plazmidów ekspresyjnych produkujących regiony domeny zewnątrzkomórkowej receptorów jako fragmenty rozpuszczalne, zarówno w formie monomerycznych biotynilowanych przynęt (baits), jak i pentamerycznych białek prey z tagiem enzymatycznym. Drugim krokiem jest ekspresja i normalizacja białek w celu przygotowania ich do przesiewania oddziaływań. Wszystkie białka są produkowane w komórkach ssaków, aby zapewnić wprowadzenie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak mostki dwusiarczkowe i glikozylacja.Kluczowym krokiem w protokole jest zapewnienie, że białka przynęty (bait) i białka ofiary (prey) w bibliotece są znormalizowane do poziomów mieszczących się w określonych wartościach progowych. Następnie przechodzi się do najważniejszego etapu, czyli przesiewania w poszukiwaniu nowych oddziaływań. Przynęty są rozmieszczone w poszczególnych dołkach płytki mikrotitracyjnej, a następnie badane pod kątem oddziaływań z wykorzystaniem ofiar.Następnie przeprowadza się etap płukania. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu dla enzymu w celu wykrycia wszelkich uchwyconych ofiar na matrycach białek-przynęt. W ostateczności wyniki przesiewania VEX mogą wykazać, które receptory powierzchniowe komórek są zdolne do tworzenia partnerów wiążących i mogą być zatem zaangażowane w procesy rozpoznawania i komunikacji między komórkami.Główną zaletą tej techniki w porównaniu do popularnych metod ekstrakcji białek, takich jak system drożdżowy dwuhybrydowy czy oczyszczanie biochemiczne, jest to, że została ona zaprojektowana specjalnie do wykrywania zewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-białko. Jest ona szczególnie odpowiednia do odkrywania nowych interakcji między receptorami zakotwiczonymi w błonie. Oddziaływania te są trudne do wykrycia przy użyciu innych technik, ponieważ białka błonowe są trudne do manipulacji biochemicznej, a ich typowe interakcje z receptorami przeciwstawnymi są niezwykle słabe.Ta metoda może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób komórki rozpoznają się i komunikują ze sobą. Na poziomie molekularnym można ją wykorzystać do badania podstawowych procesów biologicznych, takich jak określenie, które białka receptorowe występujące na powierzchni komórek jajowych i plemników łączą się ze sobą, lub które interakcje ligand-receptor odpowiadają za zjawiska komórkowe, takie jak fuzja miocytów czy formowanie się grzebienia neuronalnego. Głównym wyzwaniem w tym podejściu jest stworzenie bibliotek białek typu „bait and pray”, w których prowadzone jest przesiewanie w celu znalezienia interakcji.Bardzo ważne jest również upewnienie się, że stężenia białek przynęty (bait) i ofiary (prey) są znormalizowane w ramach poziomów progowych wymaganych dla danego testu. Pozwala to ograniczyć częstotliwość występowania wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas studiów doktoranckich, kiedy próbowałem zidentyfikować partnera wiążącego dla białka powierzchni komórkowej CD 200.W zasadzie zadawałem pytanie: jaki jest wzór wiązania dla tego konkretnego receptora powierzchniowego komórki? Nawet dzisiaj pozostaje to pytanie trudne do udzielenia odpowiedzi od strony technicznej, jednak w tamtym czasie sekwencjonowanie genomu ludzkiego było bliskie ukończenia i zdałem sobie sprawę, że skoro dysponujemy teraz pełną listą wszystkich receptorów powierzchniowych komórki w genomie, możemy zamiast tego zapytać, które z tego zestawu białek receptorowych mogą wchodzić ze sobą w interakcje techniczne.Odpowiedź na to pytanie jest znacznie prostsza, a metoda AveXis została opracowana właśnie po to, aby ją uzyskać. Po utworzeniu biblioteki wektorów dla białek przynęty (bait) i białek ofiary (prey), należy przygotować się do ich transfekcji do komórek HEC 2 9 3 E. Rozpocznij od wysiania komórek w dniu poprzedzającym transfekcję, z gęstością 250 000 komórek na mililitr w 50 mililitrach pożywki freestyle 2 9 3, aby zapewnić efektywną biotinylację. Pożywkę używaną do produkcji białek przynęty, a nie białek ofiary, uzupełnij o d biotin. Po przygotowaniu wszystkich płytek inkubuj komórki przez noc w standardowych warunkach.Ze względu na niską rozpuszczalność biotyny i trudności w przygotowaniu dokładnego roztworu, zaleca się odważenie dodatkowej biotyny, dodanie jej do medium, a następnie energiczne wstrząsanie w dniu następnym. Przeprowadzić transfekcję 50 ml hodowli komórek za pomocą 25 µg plazmidu przynęty (bait) lub ofiary (prey), używając odpowiedniego odczynnika do transfekcji w celu wytworzenia biotynilowanych przynęt. Współtransfekcję konstruktu przynęty z plazmidami kodującymi wydzielaną formę białka ligazy biotyny ELI należy przeprowadzić w stosunku 10:1 przed zbiorem.Kultury pięć dni po transfekcji poddano najpierw wirowaniu komórek przy 3000 ×g przez 20 minut, a następnie przefiltrowano supernatant przez filtr 0,22 µm. Jedną z kluczowych cech systemu AveXis jest to, że białka rekombinowane są wydzielane, dzięki czemu można je rozcieńczać lub zagęszczać do uzyskania aktywności mieszczącej się w zakresach progowych. Stwierdzono, że białka rekombinowane wykazują zmienną ekspresję w zakresie do czterech rzędów wielkości, zatem etap normalizacji zmniejsza występowanie wyników fałszywie dodatnich podczas etapów przesiewania.Aby rozpocząć normalizację przynęty, należy usunąć z medium nie sprzężoną biotynę za pomocą dializy, ponieważ będzie ona konkurować o wiązanie biotynilowanego białka przynęty w miejscach wiązania streptawidyny; proces ten należy rozpocząć od umieszczenia przynęty w tubie dializacyjnej. Aby zapewnić skuteczną dializę białek rekombinowanych, ustalono, że ważne jest zapewnienie nadmiarowej powierzchni membrany tuby dializacyjnej. Zazwyczaj stosuje się od dwóch do trzech razy więcej tuby, niż jest to faktycznie wymagane dla dializowanej objętości.Przez okres 24 godzin przeprowadzić intensywną dializę przynęty przeciwko odpowiedniemu buforowi, np. PBS. Test ELISA rozpocząć od blokowania dołków płytki mikrotytryjnej z unieruchomionym streptawidyną za pomocą PBST zawierającego BSA przez 15 minut. W międzyczasie, na czystej płytce, przygotować serię czterech rozcieńczeń białek przynęty w stosunku 1:3 w PBST z 2% BSA.Po 15-minutowej inkubacji przenieś rozcieńczenie na płytkę kodowaną strep TTR i inkubuj płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Po godzinie wypłucz dołki, a następnie do każdego z nich dodaj 100 µL OX 68 w stężeniu 2 µg/mL. Inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejną godzinę. Po drugiej inkubacji przeprowadź ponowną serię płukań i nałóż na płytkę przeciwciała anty-US sprzężone z fosfatazą alkaliczną.Inkubuj płytkę przez trzecią godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przemyj płytkę trzy razy w PBST, a na koniec przemyj ją w PBS. Aby usunąć pozostałości detergentu, po godzinie dodaj 100 µL substratu 1 0 4 o stężeniu 1 mg/mL w buforze z dietanolaminą.W temperaturze pokojowej zmierz absorbancję przy 405 nm. Serię rozcieńczeń czterech różnych dializowanych nadsączów przynęty wykryto metodą ELISA przy użyciu przeciwciała monoklonalnego przeciwko znacznikowi CD4. Jeśli nierozcieńczone białka przynęty nie są wystarczające do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny na płytce pokrytej streptawidyną, należy skoncentrować białko za pomocą koncentratora VivaSpin. W przeciwnym razie należy użyć białka przynęty w rozcieńczeniu w buforze PBST z 2% BSA.Jest to ilość wystarczająca do nasycenia miejsca wiązania biotyny w teście. Ilościowo określ względne poziomy ekspresji białek prekursorowych, wykorzystując aktywność enzymatyczną beta-laktamazy. Rozpocznij od przygotowania serii rozcieńczeń naddatku zawierającego paraproteiny w buforze PBST 2% BSA.Następnie dodaj 20 µL rozcieńczenia do 60 µL roztworu nitrous stepin naniesionego na płytkę. Bezzwłocznie przenieś płytkę do czytnika płytek i mierz absorbancję przy 485 nm co minutę przez kolejne 20 minut, używając koncentratorów odśrodkowych lub rozcieńczając w PBST z 2% BSA. Ustaw końcowe stężenie próbek tak, aby wszystkie nitrosy w teście uległy hydrolizie w około siedmiu minutach, co odpowiada obrotowi około dwóch ol nitros na minutę.Przesiewanie AveXis należy rozpocząć od przemycia płytki powlekanej strep TAVR ENC w PBST, a następnie osuszenia jej poprzez delikatne uderzenie o ręcznik papierowy. Następnie do każdego dołka należy dodać PBST z BSA i inkubować płytkę przez 30 minut. Pozwala to zablokować niespecyficzne miejsca wiązania białek.Z każdego dołka usuń roztwór blokujący, energicznie odchylając płytkę nad zlewem, a następnie dodaj 100 µL znormowanego biotynilowanego monomeru przynęci do odpowiednich dołków. Inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń próbki przynęci z płytki poprzez ponowne odchylenie jej nad zlewem i przemyj ją trzykrotnie buforem PBST.Następnie po trzecim przemyciu osusz płytkę, delikatnie uderzając nią o blat. Do każdej studni dodaj 100 µL znormalizowanego konstruktu przynęty pentamerowej i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez jedną godzinę. Po godzinie przemyj płytkę ponownie trzy razy buforem PBST, a na koniec raz samym buforem PBS.Na koniec do każdej studzienki dodaj 60 µL roztworu nitrous seven i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny lub najlepiej inkubuj płytki przez 16 godzin w temperaturze 4 °C. Następnego dnia pozytywne interakcje zmienią kolor na czerwony. Wykonaj zdjęcie płytki w celu dokumentacji wizualnej, a następnie zmierz ilościowo reakcje przy absorbancji 485 nm przy użyciu czytnika płytek.Około 10 minut po rozpoczęciu reakcji przesiewowej AveXis zaobserwowano zmianę barwy z żółtej na czerwoną zarówno w kontroli wychwytu ofiary pośredniczonego przez przeciwciała, jak i w interakcji kontrolnej dodatniej. Zmiana barwy ta świadczy o hydrolizie podłoża azotynowego. W tej skali czasowej można zaobserwować niektóre interakcje dodatnie, jednak większość z nich pojawiła się po kilku godzinach.Zazwyczaj obserwuje się odsetek trafień na poziomie około 0,4 do 0,6% wyników dodatnich. Po przygotowaniu bibliotek białek część przesiewowa tej techniki może zostać przeprowadzona szybko. Po zidentyfikowaniu oddziaływania możliwe jest przesiewanie nawet 12 płytek w ciągu jednego dnia.Najważniejszym kolejnym krokiem jest po pierwsze wykazanie, że oddziaływanie można powtórzyć, wykorzystując świeże, niezależne preparaty białek. Po drugie, zawsze sprawdzamy, czy oddziaływanie jest niezależne od orientacji białka przynęty (bait) i białka ofiary (prey), czyli czy może ono zachodzić wzajemnie. Wiąże się to z klonowaniem domen z wektora przynęty do wektora ofiary i odwrotnie.Interakcje, które można powtórzyć i które wykazują wzajemność, są uznawane za wiarygodne i zawsze okazywały się być dodatnie. W celu dodatkowej walidacji zidentyfikowanych interakcji wykorzystujemy techniki takie jak powierzchniowy rezonans plazmonowy. Co istotne, pozwala to na wykazanie, że dwa oczyszczone komponenty mogą oddziaływać bezpośrednio, a także udowodnić, że wiązanie ulega nasyceniu, a zatem jest swoiste.

avidity-based-extracellular-interaction-screening-avexis-for-scalable

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oparty na avidynę ekstrakomórkowy ekran interakcji (AVEXIS) w celu skalowalnego wykrywania nisko-afinicznych ekstrakomórkowych interakcji receptor-ligand

Niniejszy materiał wideo przedstawia eksperymenty wraz z późniejszą analizą oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem powierzchni mikrowzorowanych. Podejście to umożliwia wykrywanie oddziaływań białkowych w żywych komórkach, łącząc wysoką przepustowość z możliwością uzyskania informacji ilościowych.

In-vivo detekcja oddziaływań białko-białko na powierzchniach mikrowzorowanych

W tym filmie pokazujemy test jednorodności zbliżeniowej ze wzmocnioną luminescencją - test zbliżeniowy oparty na koralikach. Wykorzystuje kulki akceptora i dawcy o jednorodnej wielkości, unieruchomione dwoma białkami, które mają tendencję do oddziaływania w celu przesiewania potencjalnych małych cząsteczek hamujących interakcje białek.

Amplifikowany luminescencyjny test jednorodny zbliżeniowy: Test zbliżeniowy oparty na kulkach do badania przesiewowego małych cząsteczek hamujących interakcje białko-białko

Badanie przesiewowe macierzy peptydowej to wysokoprzepustowy test do identyfikacji miejsc interakcji białko-białko. Pozwala to na mapowanie wielu interakcji białka docelowego i może służyć jako metoda identyfikacji miejsc dla inhibitorów, które celują w białko. Tutaj opisujemy protokół badania przesiewowego i analizy macierzy peptydowych.

Identyfikacja miejsc interakcji białko-białko za pomocą macierzy peptydowych

Prezentowane protokoły opisują dwie techniki oparte na enzymatycznym metodzie immunopochłaniania (ELISA) do szybkiego badania interakcji ligand-receptor: Pierwsza metoda pozwala na określenie stałej dysocjacji między ligandem a receptorem. Druga metoda umożliwia szybkie przesiewowe badanie peptydów blokujących interakcje ligand-receptor.

Metoda wiązania i konkurencji oparta na technice ELISA do szybkiego określania interakcji ligand-receptor

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Pomiary zaangażowania docelowego leku są kluczowe dla skutecznego rozwoju leków i walidacji sond chemicznych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół pomiaru zaangażowania leku w cel za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości w kompatybilnej z mikropłytką adaptacji komórkowego testu przesunięcia termicznego (CETSA).

Wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do ilościowego określenia zaangażowania celu w przylegających komórkach

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Obecny protokół opisuje nowe narzędzia do testowania wiązania SPR do badania wiązania CV-N z HA, glikoproteiną S, pokrewnymi glikanami typu hybrydowego i oligosacharydami o wysokiej zawartości mannozy. SPR służy do oznaczaniaK D do wiązania dimerycznego lub monomerycznego CV-N z tymi glikanami.

Inżynieria środków przeciwwirusowych za pomocą powierzchniowego rezonansu plazmonowego

Ten artykuł proponuje nową generację wieloparametrycznych platform analitycznych o zwiększonej przepustowości do charakterystyki podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Metoda opiera się na połączeniu multipleksowanych metod biodetekcji z analizami metrologicznymi i morfomechanicznymi za pomocą mikroskopii sił atomowych, w połączeniu ze spektroskopią Ramana, w celu kwalifikacji celów pęcherzykowych uwięzionych na biochipie mikromacierzy.

Multimodalna platforma analityczna na multipleksowanym chipie do obrazowania powierzchniowego rezonansu plazmonowego do analizy podzbiorów pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Poznaj metodę AVEXIS do wykrywania słabych interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowych. Ta technika umożliwia skalowalne badanie rozpoznawania komórkowego i komunikacji międzykomórkowej.

Badania przesiewowe interakcji zewnątrzkomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) do skalowalnego wykrywania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy o niskim powinowactwie (Wideo) | JoVE Journal

Przesiewowe badanie oddziaływań pozakomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) w celu skalowalnej detekcji słabych oddziaływań między pozakomórkowymi receptorami a ligandami

Przeglądaj więcej filmów