Badania przesiewowe interakcji zewnątrzkomórkowych oparte na awidności (AVEXIS) do skalowalnego wykrywania interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy o niskim powinowactwie

Ogólnym celem tej procedury jest odkrycie nowych interakcji białek zewnątrzkomórkowych zaangażowanych w procesy rozpoznawania komórkowego, w szczególności białek receptorowych osadzonych w błonie. Podejście AveXis ma na celu obejście bardzo słabych powinowactw interakcji, które są typowe dla tej klasy oddziaływań białkowych, oraz faktu, że białka błonowe są trudne do biochemicznej manipulacji. Osiąga się to poprzez najpierw skompilowanie rekombinowanej biblioteki białek zewnątrzkomórkowych regionów receptorów na powierzchni komórki.

Osiąga się to poprzez zaprojektowanie plazmidów ekspresyjnych do wytwarzania regionów domeny ektogenicznej receptorów jako rozpuszczalnych fragmentów, zarówno monomerycznych przynęt biotynylowanych, jak i enzymów pentamerowych. Drugim krokiem jest ekspresja i normalizacja białek, aby były gotowe do badań przesiewowych interakcji. Wszystkie białka są wytwarzane w komórkach ssaków, aby zapewnić dodanie modyfikacji potranslacyjnych, takich jak diss, siarczek, wiązania i glikozylacja.

Kluczowym krokiem w protokole jest upewnienie się, że białka przynęty i ofiary w bibliotece są znormalizowane do poziomów progowych. Następnie następuje ekscytująca część, czyli badanie przesiewowe pod kątem nowych interakcji. Bate'y są umieszczane w indywidualnych studzienkach na mikrotonowej płytce, a następnie badane pod kątem interakcji za pomocą pochwały.

Następnie wykonywany jest etap prania. Ostatnim krokiem jest dodanie substratu dla enzymu, aby wykryć wszelkie przechwycone pochwały na tablicach białek przynęty. Ostatecznie wyniki badania przesiewowego VEX mogą pokazać, które receptory surferów komórkowych są zdolne do tworzenia partnerów wiążących, a zatem mogą być zaangażowane w procesy rozpoznawania i komunikacji między komórkami.

Główną zaletą tej techniki popularnych metod ekstrakcji białek, takich jak drożdże dwa hybrydowe lub biochemiczne oczyszczanie, jest to, że jest ona specjalnie zaprojektowana do wykrywania zewnątrzkomórkowych interakcji białek białkowych. Jest szczególnie przydatny do odkrywania nowych interakcji między białkami receptora błonowego na uwięzi. Interakcje te są trudne do wykrycia przy użyciu innych technik, ponieważ białka błonowe są biochemicznie trudne do manipulowania i typowe są ich interakcje z przeciwreceptorami są bardzo słabe.

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, jak komórki rozpoznają się i komunikują ze sobą. Na poziomie molekularnym można go wykorzystać do udzielenia odpowiedzi na pytania dotyczące podstawowych procesów biologicznych, takich jak to, które białka receptorowe wyświetlane na powierzchni komórek jajowych i plemników łączą się ze sobą lub które interakcje ligandów receptorowych są odpowiedzialne za zachowania komórkowe, takie jak fuzja miocytów lub tworzenie grzebienia nerwowego. Głównym wyzwaniem związanym z tym podejściem jest skompilowanie bibliotek białek przynęty i modlitwy, w których można przeprowadzić badania przesiewowe pod kątem interakcji.

Bardzo ważne jest również, aby upewnić się, że białka przynęty i ofiary są znormalizowane w ramach poziomów progowych wymaganych dla testu. Zmniejsza to częstotliwość wyników fałszywie ujemnych i fałszywie dodatnich. Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody podczas mojego doktoratu, kiedy próbowałem zidentyfikować partnera wiążącego białko powierzchniowe komórki CD 200.

Zasadniczo zadawałem pytanie, jaki jest wzór wiązania dla tego konkretnego receptora na powierzchni komórki? Nawet dzisiaj? W tamtym czasie odpowiedź na to pytanie była technicznie trudna, jednak ludzki genom był bliski ukończenia i zdałem sobie sprawę, że ponieważ mamy teraz pełną listę wszystkich receptorów powierzchniowych komórek w genomie, możemy teraz zapytać w tym zestawie białek receptorowych, które mogą wchodzić w interakcje techniczne.

Jest to o wiele łatwiejsze pytanie, a AveXis był metodą, którą opracowaliśmy, aby na nie odpowiedzieć. Po ustaleniu biblioteki wektorów przynęty i preekspresji, przygotuj się do transfekcji ich do komórek HEC 2 9 3 E, zaczynając od wysiewu komórek dzień przed transfekcją o gęstości 250 000 komórek na mililitr w 50 mililitrach pożywki freestyle 2 9 3, aby zapewnić wydajną eulekcję biotyny. Uzupełnij podłoże używane do produkcji białek przynęty, a nie białek zdobyczy biotyną d ze wszystkimi przygotowanymi płytkami, inkubuj komórki przez noc w standardowych warunkach.

Ponieważ biotyna ma niską rozpuszczalność i dokładny roztwór, wolimy odważyć dodatkową biotynę, a następnie dodać do podłoża i energicznie wstrząsnąć następnego dnia. Transfekcję 50 mililitrów hodowanych komórek za pomocą 25 mikrogramów plazmidu przynęty lub ofiary za pomocą odpowiedniego odczynnika do transfekcji w celu wytworzenia przynęty biotynylowanej transfekcji. Konstrukcja przynęty w stosunku 10 do jednego z plazmidami kodującymi wydzielaną formę ligazy biotyny białka ELI na zbiory.

Hodowle przeprowadza się pięć dni po transfekcji, najpierw przez odwirowanie w 3000-krotności grawitacji przez 20 minut, a następnie filtrowanie supernatantu S przez filtr 0,22 mikrona. Jedną z kluczowych cech AveXis jest to, że rekombinowane białka są wydzielane, mogą być rozcieńczane lub skoncentrowane do aktywności progowej. Odkryliśmy, że rekombinowane białka mają zmienną ekspresję do czterech rzędów wielkości, więc etap normalizacji zmniejsza występowanie wyników fałszywie dodatnich podczas etapów badań przesiewowych.

Aby rozpocząć normalizację przynęty, niesprzężona de biotyna musi zostać usunięta z pożywki za pomocą dializy, ponieważ będzie ona konkurować o biotynylowane białko przynęty o wiązanie z paciorkowcami w miejscach wiązania, zaczynając od zabezpieczenia przynęty w probówce do dializy. Stwierdziliśmy, że aby zapewnić skuteczną dializę rekombinowanych białek, ważne jest zapewnienie nadmiernej powierzchni rurki do dializy. Zazwyczaj dostarczamy od dwóch do trzech razy więcej rurek, niż jest to faktycznie wymagane dla objętości dializyzowanej.

W ciągu 24 godzin intensywnie dializowano przynętę w stosunku do odpowiedniego bufora, takiego jak PBS, po wykonaniu dializy. Test ELIZA rozpoczyna się od zablokowania studzienek na płytce mikrotowej zakodowanej paciorkowcami z PBST zawierającym BSA na 15 minut. W międzyczasie, na czystej szalce, wykonaj serię czterech rozcieńczeń po jednym do trzech rozcieńczeń białek przynęty w PBST z 2% BSA.

Po 15 minutowej inkubacji przenieść rozcieńczenie na płytkę zakodowaną w strep TTR i inkubować płytkę przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej po godzinie, umyć studzienki, a następnie do każdej z nich dobrze dodać 100 mikrolitrów po dwa mikrogramy na mililitr OX 68. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez kolejną godzinę. Po drugiej inkubacji wykonaj kolejną serię mycia i załaduj płytkę anty-amerykańską fosfatazą alkaliczną.

Inkubować płytkę przez trzecią godzinę w temperaturze pokojowej. Teraz umyj płytkę trzy razy w PBST i poddaj ją końcowemu myciu PBS. Aby usunąć resztki detergentu, po godzinie dodaj 100 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr substratu 1 0 4 w buforze aminowo-etanolowym di.

W temperaturze pokojowej zmierz absorbancję 4 0 5 nanometrów, Eliza wykryła serię rozcieńczeń czterech różnych dializowanych supinianów przynęty za pomocą przeciwciała monoklonalnego anty CD z czterema znacznikami. Jeśli nierozcieńczone białka przynęty ekspresowej są niewystarczające do nasycenia wszystkich miejsc wiązania biotyny na płytce pokrytej paciorkowcem ENC, należy zagęścić białko za pomocą koncentratora wirowego Viva. W przeciwnym razie należy użyć białka przynęty w rozcieńczonym stężeniu w PBST z 2% BSA.

To wystarczy, aby nasycić miejsce wiązania biotyny w teście. Określić ilościowo względne poziomy, na których białka pre ulegają ekspresji, wykorzystując aktywność enzymu beta-laktamazy. Rozpocząć od wykonania serii rozcieńczeń supinianu zawierającego paraproteiny w buforze PBST 2% BSA.

Następnie dodać 20 mikrolitrów rozcieńczenia do 60 mikrolitrów roztworu azotu umieszczonego na płytce. Natychmiast przenieść płytkę do czytnika płytek i mierzyć absorbancję 4 85 nanometrów raz na minutę przez następne 20 minut za pomocą koncentratorów odśrodkowych lub rozcieńczenia PBST z 2% BSA. Ustaw końcowe stężenie próbek, aby zhydrolizować wszystkie nitro w teście w ciągu około siedmiu minut, co daje około dwóch starych obrotów nitrowe na minutę.

Rozpocznij badanie przesiewowe AveXis od umycia płytki pokrytej paciorkowcem TAVR ENC w PBST i stuknięcia płytki do sucha o ręcznik papierowy. Następnie dodaj PBST z BSA do każdej studzienki i inkubuj płytkę przez 30 minut. Blokuje to fałszywe miejsca wiązania białek.

W każdym z nich dobrze usuń roztwór blokujący sprytnym ruchem talerza nad zlewem i dodaj 100 mikrolitrów znormalizowanej biotynylowanej przynęty monomerycznej do odpowiednich studzienek. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usuń próbki przynęty z płytki kolejnym ruchem i zmyj ją trzykrotnie PBST.

Następnie stuknij do sucha po trzecim praniu. Teraz dodaj 100 mikrolitrów znormalizowanego konstruktu ofiary pentamerowej do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez godzinę. Po godzinie przemyj płytkę jeszcze trzykrotnie PBST i ostatnie umyj samą PBS.

Na koniec dodaj 60 mikrolitrów roztworu azotu siedem do każdej studzienki i inkubuj płytkę w temperaturze pokojowej przez dwie godziny, a najlepiej inkubuj płytki przez 16 godzin w czterech stopniach SIU. Następnego dnia pozytywne interakcje zmienią kolor na czerwony. Należy sporządzić zdjęcie płytki w celu uzyskania dokumentacji wizualnej, a następnie określić ilościowo reakcje przy absorbancji 4,85 nanometra za pomocą czytnika płytek.

Po około 10 minutach od rozpoczęcia reakcji przesiewowej AveXis zaobserwowano zmiany koloru od żółtego do czerwonego zarówno w kontroli chwytania zdobyczy za pośrednictwem przeciwciał, jak i w interakcji kontroli pozytywnej. Ta zmiana koloru wskazuje na hydrolizę azotu w podłożu. W tej skali czasowej można zaobserwować pewne pozytywne interakcje, ale większość z nich pojawiła się dopiero po kilku godzinach.

Zazwyczaj zaobserwowano wskaźnik trafień wynoszący około 0,4 do 0,6%pozytywnych. Po przygotowaniu bibliotek białek można szybko przeprowadzić część przesiewową tej techniki. Całkiem możliwe jest przesiewanie do 12 płytek w ciągu jednego dnia po zidentyfikowaniu interakcji.

Najważniejszym kolejnym krokiem jest po pierwsze wykazanie, że interakcję można powtórzyć przy użyciu świeżych, niezależnych preparatów białkowych. Po drugie, zawsze określamy, czy interakcja jest niezależna od orientacji ofiary przynęty, to znaczy, czy można ją odwzajemnić? Wiąże się to z klonowaniem domen wektorów przynęty do wektora ofiary i odwrotnie.

Interakcje, które mogą być powtarzane i odwzajemniane, są uważane za wysoce ufne i zawsze okazywały się pozytywne. Korzystając z innych technik, takich jak rezonans plazmy powierzchniowej, lubimy używać plazmy powierzchniowej w rezonansie, aby dodatkowo zweryfikować wszelkie interakcje, które ponownie identyfikujemy. Co ważne, pozwala to wykazać, że dwa oczyszczone składniki mogą oddziaływać bezpośrednio, a także mogą być wykorzystane do pokazania, że wiązanie jest osadzone, a zatem specyficzne.