Name: Zbieranie mysich makrofagów pęcherzykowych i ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząstki bezwodnika (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-08T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Poznaj metodę izolacji mysich makrofagów pęcherzykowych i oceny ich aktywacji przez nanocząstki bezwodnika przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia badanie immunomodulacji w układzie oddechowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Dowództwu Badań Medycznych i Materiałowych Armii USA (numery grantów W81XWH-09-1-0386 i W81XWH-10-1-0806) za wsparcie finansowe oraz dr. Shawna Rigby'ego z Flow Cytometry Facility na Iowa State University za ekspercką pomoc techniczną.

1. Pobieranie makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) z myszy za pomocą płukania płuc
<ol>
 <li>Należy stosować odpowiednie środki ochrony indywidualnej (ŚOI), takie jak fartuch laboratoryjny, jednorazowe rękawiczki oraz odpowiednią ochronę oczu.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem zbioru należy przygotować pełne pożywkę AMɸ (cAMɸ). Do 222,25 mL pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) należy dodać 2,5 mL roztworu penicyliny/streptomycyny (pen/strep), 250 μL β-merkaptoetanolu (2-merkaptoetanolu) oraz 25 mL inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy bydlęcej (FBS). Pożywkę cAMɸ należy wysterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra nakrętkowego o rozmiarze porów 0,2 μm pod próżnią.</li>
 <li>Zdrową mysz należy uśmiercić poprzez uduszenie CO2 w komorze euthanazyjnej. Chociaż na potrzeby tego projektu wykorzystano mysz C57BL/6 (w wieku 6-8 tygodni), technikę płukania płuc można zastosować u każdej szczepu myszy. Korzystając z butli z gazem sprężonym, należy dopuścić przepływ gazu do komory przez 1 min przed umieszczeniem w niej myszy, aby upewnić się, że komora jest całkowicie wypełniona CO2. Mysz należy pozostawić w komorze przez co najmniej jedną minutę w celu uśmiercenia. Dodatkowo, każdą mysz należy upuścić z krwi poprzez nakłucie serca jako fizyczną metodę potwierdzenia śmierci zwierzęcia, zgodnie z opisem w punkcie 1.4.</li>
 <li>Mysz należy położyć na grzbiecie (strona grzbietowa), spryskać 70% etanolem, zlokalizować mostek i pod kątem 30 stopni względem brzucha wprowadzić igłę 23G (dołączoną do strzykawki 1 mL) na głębokość około 50 mm do jamy klatki piersiowej. Przy prawidłowym umieszczeniu igły powinno być możliwe pobranie od 0,4 do 1 mL krwi, w zależności od wielkości myszy. Należy sprawdzić, czy u zwierzęcia ustały oznaki życiowe.</li>
 <li>Mysz należy położyć na stole laboratoryjnym na brzuchu (strona brzuszna). Mysz należy spryskać 70% etanolem, aby wysterylizować środowisko pracy. Należy uszczypnąć skórę w połowie długości kręgosłupa myszy. Za pomocą nożyc sekcyjnych wysterylizowanych 70% etanolem należy wykonać niewielkie nacięcie skóry.</li>
 <li>Należy chwycić skórę po obu stronach nacięcia i pociągnąć ją w przeciwnych kierunkach wzdłuż osi głowa-ogon myszy. Przy prawidłowym wykonaniu skóra zostanie oddzielona od znajdującego się pod nią tułowia.</li>
 <li>W obszarze szyi myszy powinny być teraz widoczne odsłonięte mięśnie i gruczoły. Należy ostrożnie wyciąć tę tkankę i odsunąć ją pęsetą w stronę przednią myszy, odsłaniając krtani, tchawicę i przełyk. Należy unikać przecięcia żyły szyjnej lub tętnicy szyjnej.</li>
 <li>Tchawica jest teraz widoczna i można ją zidentyfikować jako tkankę z otaczającymi ją pierścieniami chrzęstnymi. Należy delikatnie chwycić tchawicę pęsetą, a następnie ostrożnie unieść i oddzielić ją od przełyku, który znajduje się po stronie grzbietowej.</li>
 <li>Należy wykonać niewielkie nacięcie przed miejscem trzymania tchawicy, ale za krtanią. Nacięcie powinno być wykonane pod kątem około 45°. Nie wolno całkowicie przeciąć tchawicy, ponieważ uniemożliwiłoby to jej cofnięcie się do jamy ciała.</li>
 <li>Strzykawkę 1 cc z założonym cewnikiem Tom Cat należy napełnić sterylnym PBS w przygotowaniu do wprowadzenia cewnika do światła tchawicy. Trzymając tchawicę pęsetą, należy przytrzymać cewnik ręką blisko jego końcówki, aby zwiększyć kontrolę, i delikatnie wprowadzić go w miejsce nacięcia tchawicy. Cewnik należy delikatnie wprowadzić do tchawicy na głębokość około 20 mm. Należy uchwycić tchawicę wokół rurki cewnika, uwalniając drugą rękę.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 1 mL z założonym cewnikiem należy delikatnie wprowadzić do płuc 0,75 mL sterylnego PBS w temperaturze pokojowej, a następnie delikatnie odessać PBS z powrotem do strzykawki. Proces ten należy powtórzyć trzy razy, masując jednocześnie klatkę piersiową z zewnątrz. Należy odłączyć strzykawkę od cewnika i przelać płyn z płukania do probówki wirówkowej 15 mL. Po napełnieniu strzykawki 0,75 mL świeżego PBS i ponownym podłączeniu jej do cewnika, należy powtórzyć kroki 1.9 i 1.10 dwukrotnie dla każdej myszy. Odzysk płynu może być częściowy, a pobrana objętość może być mniejsza niż objętość wprowadzona. W przypadku pobierania komórek od więcej niż jednej myszy, probówkę 15 mL z zebranymi komórkami należy umieścić na lodzie do czasu wykonania wszystkich płukań płuc.</li>
</ol>
2. Przetwarzanie zebranego materiału z płukania opłucnego w celu uzyskania makrofagów pęcherzykowych (AMɸ)
<ol>
 <li>Odwiruj płyn z płukania płuc przy 250 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Stosując technikę sterylną, odlej nadsącz do odpowiedniego pojemnika na odpady wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza. Resuspenduj pellet komórkowy, delikatnie przesuwając probówkę wirówkową o górną krawędź statywu na probówki. Dodaj 1 mL pożywki cAMɸ w celu resuspensji komórek.</li>
 <li>Policz komórki za pomocą licznika cząstek Coulter Particle Counter Z1, pipetując 20 μL zawiesiny komórkowej do 10 mL rozcieńczalnika Isoton II w fiolce licznika Coulter. Dodaj do fiolki 3 do 4 kropli odczynnika litycznego Zap-oglobin II, delikatnie odwróć fiolkę 3 do 4 razy, a następnie umieść ją w liczniku, aby uzyskać stężenie komórek. Upewnij się, że licznik jest zaprogramowany z czynnikiem rozcieńczenia 2 x 104, aby wyświetlić stężenie komórek jako liczbę komórek na mL.</li>
 <li>Rozcieńcz komórki do stężenia 2,5 x 105 na mL, używając pożywki cAMɸ.</li>
 <li>Rozlej 2 mL zawiesiny o stężeniu 2,5 x 105 komórek/mL do każdego dołka 6-dołkowej płytki do hodowli tkanek.</li>
 <li>Aby wzbogacić frakcję AMɸ, inkubuj płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 6 h, aby umożliwić przyleganie komórek do dna dołka. Delikatnie odessij nadsącz, tak aby nie uszkodzić przylegających komórek.</li>
 <li>Przepłucz dołki sterylnym PBS (bezwapniowym i beztlenkowym), aby usunąć nieprzylegające komórki i zanieczyszczenia. Dodaj 2 mL pożywki cAMɸ do każdego dołka.</li>
 <li>Inkubuj komórki przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przed dodaniem stymulatorów. Po tym etapie wzbogacenia około 87% komórek wykazuje pozytywny wynik dla markerów makrofagów CD11b i F4/80 (Ryc. 2c).</li>
</ol>
3. Dodanie nanocząstek polianhydrydu i traktowanie kontrolne
<ol>
 <li>Wytworzyć nanocząsteczki metodą nanoenkapsulacji polianhydrydu z użyciem przeciwrozpuszczalnika15. W tym procesie polimer rozpuszcza się w chlorku metylenu (4 °C przy stężeniu 25 mg/mL) i wytrąca w pentanie (-20 °C w stosunku 1:200 chlorek metylenu:pentan).</li>
 <li>Odważyć nanocząsteczki polianhydrydu na wysterylizowanym papierze wagowym przy użyciu wagi zdolnej do dokładnego pomiaru ilości rzędu mikrogramów. Przenieść cząsteczki do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.</li>
 <li>Resuspendować nanocząsteczki w lodowatym cAMɸ. Obliczenia należy przeprowadzić tak, aby do każdej studni dodać nie więcej niż 0,3 mL medium w celu uzyskania pożądanego stężenia nanocząsteczek. Przechowywać resuspendowane cząsteczki w lodzie do momentu dodania nanocząsteczek do studni z kulturą.</li>
 <li>Przed dodaniem nanocząsteczek do kultur AMɸ poddać cząsteczki sonikacji za pomocą sonikatora laboratoryjnego z mikrokońcówką. Przed sonikacją wysterylizować mikrokońcówkę, spryskując ją 70% etanolem i wycierając sterylną chusteczką Kimwipe. Sonikować przy energii 10-20 dżuli przez 30 do 45 s, utrzymując probówkę w lodzie. Makroskopowo ocenić zawiesinę nanocząsteczek. Jeśli cząsteczki nie są wystarczająco rozproszone, pozostawić zawiesinę w lodzie na 1 do 2 min, aby upewnić się, że nanocząsteczki znajdują się poniżej temperatury przejścia szklistego polimeru, a następnie ponownie sonikować przez 30 do 45 s. Celem tego etapu sonikacji jest odpowiednie rozproszenie nanocząsteczek, ponieważ nanocząsteczki 50:50 CPTEG:CPH mają tendencję do agregacji w środowisku wodnym. Niemniej jednak w zawiesinie mogą nadal pozostawać niewielkie agregaty nanocząsteczek.</li>
 <li>Zawiesinę nanocząsteczek (odpowiednio rozproszoną) należy przechowywać w lodzie i zużyć natychmiast, aby zapobiec przedwczesnej erozji powierzchni lub agregacji.</li>
 <li>Wyjąć szalki hodowlane zawierające AMɸ z inkubatora i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przechylić płytkę pod kątem około 45 stopni i odpipetować objętość medium, która zostanie dodana do zawiesiny nanocząsteczek (nie powinna ona przekraczać 0,3 mL). Podczas usuwania medium nie naruszać przylegających komórek.</li>
 <li>Krótko wymieszać zawiesinę nanocząsteczek polianhydrydu na wirówce typu vortex przed dodaniem jej do odpowiednich studni. Pipetować odpowiednią ilość zawiesiny nanocząsteczek (nie więcej niż 0,3 mL) do konkretnej studni lub studni; nie mieszać jednak poprzez pipetowanie w górę i w dół. Czynność ta mogłaby spowodować odklejenie przylegających AMɸ od dna studni. Cząsteczki opadną na dno studni i nawiążą kontakt z komórkami. W badaniach opisanych w niniejszym raporcie końcowe stężenie nanocząsteczek w ko-kulturze z AMɸ wynosiło 125 μg/mL. Postąpić analogicznie z kolejnymi studniami i grupami traktowania. Do wyznaczonych studni włączyć grupy kontrolne pozytywne i negatywne, takie jak samo medium oraz 200 ng/mL lipopolisacharydu (LPS).</li>
 <li>Przenieść szalki hodowlane do inkubatora z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i atmosferą 5% CO2 na 48 h. Badania kinetyczne w naszym laboratorium wykazały, że 48 godzin jest optymalnym okresem hodowli do oceny zarówno ekspresji markerów powierzchniowych komórek, jak i sekrecji cytokin, ponieważ pozwala to na odpowiedni czas transkrypcji i syntezy białek. Chociaż podczas przedłużonego okresu hodowli (np. 72 h) gromadzą się wyższe poziomy cytokin, ocena ekspresji markerów powierzchniowych komórek w tym punkcie czasowym może być zaburzona przez wpływ podwyższonego poziomu cytokin. Obserwowane zmiany w ekspresji markerów powierzchniowych mogą nie wynikać bezpośrednio ze stymulacji samymi nanocząsteczkami.</li>
</ol>
4. Ocena aktywacji makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) z wykorzystaniem cytometrii przepływowej
<ol>
 <li>Przed zebraniem wysianych makrofagów, które były współhodowane z nanocząsteczkami lub stymulantami, należy przygotować bufor do sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) (0,1 % azotku sodu i 0,1 % albuminy surowicy bydlęcej (BSA)) w 0,1 M roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (pH 7.4).</li>
 <li>Przygotować roztwory robocze buforu blokującego oraz przeciwciał monoklonalnych. Aby przygotować bufor blokujący, należy rozcieńczyć IgG szczura (Sigma) i przeciwciało anty-CD16/32 (eBioscience) w buforze FACS do stężeń odpowiednio 1 mg/mL i 10 μg/mL. Panel przeciwciał przeciwko markerom powierzchniowym należy rozcieńczyć w buforze FACS do stężenia zalecanego przez producenta lub stężenia zoptymalizowanego przez użytkownika. W wynikach przedstawionych w niniejszej pracy panel markerów powierzchniowych składa się z przeciwciał przeciwko MHC II, CD86, CD40 i CIRE (CD209). W panelu znajdują się również przeciwciała antymysie przeciwko markerom makrofagów F4/80 i CD11b, aby podczas analizy danych jednoznacznie zidentyfikować fenotyp makrofagów. Należy zachować ostrożność przy wyborze przeciwciał przeciwko cząsteczkom MHC II, ponieważ inbredowe linie myszy często różnią się haplotypami MHC II. Wybrane przeciwciała muszą reagować ze specyficznymi alloantygenami MHC ekspresjonowanymi przez badaną linię myszy.</li>
 <li>Po 48 h inkubacji z nanocząsteczkami i/lub stymulantami, naczynia hodowlane należy umieścić na lodzie na 20 min. Aby usunąć adherentne makrofagi z płytek, należy delikatnie zeskrobać zawartość dołków za pomocą skrobaczki do komórek o szerokości 24 cm.</li>
 <li>Używając pipety serologicznej 5 mL, należy delikatnie aspirować komórki wraz z medium góra-dół pięć razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek. Zawartość poszczególnych dołków należy przenieść pipetą do oddzielnych probówek polistyrenowych o pojemności 5 mL, aby nie wymieszać komórek z różnych grup badawczych.</li>
 <li>Do każdej probówki należy dodać 2 mL buforu FACS.</li>
 <li>Probówki z komórkami należy wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Należy odlać nadsącz i delikatnie resuspendować osad komórkowy w pozostałej cieczy, przesuwając probówki po górnej krawędzi statywu.</li>
 <li>Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał monoklonalnych, do każdej probówki z komórkami należy dodać 10 μL buforu blokującego (przygotowanego w pkt 4.2). Probówki należy wymieszać na wirówce typu vortex i inkubować na lodzie przez 30 min.</li>
 <li>Do każdej probówki należy dodać odpowiednią objętość rozcieńczonych przeciwciał monoklonalnych i inkubować w ciemności na lodzie przez 15 min. Probówki zawierające próbki do analizy powinny otrzymać kombinację przeciwciał z panelu polichromatycznego (indywidualne laboratoria powinny wcześniej przeprowadzić optymalizację kombinacji przeciwciał). Należy uwzględnić dodatkowe grupy kontrolne w celu prawidłowego ustawienia parametrów akwizycji na cytometrze przepływowym, w tym probówkę z komórkami nieznakowanymi oraz probówki do kompensacji odpowiadające komórkom znakowanym każdym pojedynczym kolorem osobno. Aby prawidłowo ustawić bramki do analizy cytometrycznej, podczas akwizycji należy uwzględnić kontrole FMO (Fluorescence Minus One). Kontrole FMO to komórki znakowane wszystkimi przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami używanymi w panelu, z wyjątkiem jednego, które zostaje zastąpione odpowiednią kontrolą izotypową. W probówkach kontrolnych FMO i kompensacyjnych powinny znaleźć się również populacje pozytywne i negatywne (tj. oddzielne aliquoty komórek traktowanych stymulantem kontrolnym pozytywnym oraz samym medium).</li>
 <li>Do każdej probówki należy dodać 2 mL buforu FACS, wymieszać na vortexie i wirować przy 250 x g w temperaturze 4 °C przez 10 min.</li>
 <li>Należy odlać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w pozostałej cieczy, przesuwając probówki po górnej krawędzi statywu.</li>
 <li>Jeśli panel przeciwciał zawiera przeciwciało niesprzężone bezpośrednio z fluorochromem, lecz sprzężone z biotyną, do wizualizacji markera powierzchniowego konieczne jest zastosowanie streptawidyny sprzężonej z fluorochromem. Na tym etapie należy dodać odpowiednią objętość rozcieńczonej streptawidyny sprzężonej z fluorochromem i inkubować w ciemności przez 15 min na lodzie. Podobnie jak w pkt 4.2, streptawidynę rozcieńcza się do stężenia zalecanego przez producenta lub zoptymalizowanego przez użytkownika. Krok ten jest wymagany tylko w przypadku paneli zawierających biotynjlowane przeciwciała pierwotne.</li>
 <li>Należy wykonać etap płukania zgodnie z opisem w pkt 4.10.</li>
 <li>Należy rozcieńczyć odpowiednią objętość stabilizującego fiksatywa BD w stosunku 1:3 w wodzie dejonizowanej. Do każdej probówki należy dodać 100 μL rozcieńczonego fiksatywu, delikatnie mieszając na vortexie, aby zapobiec aglomeracji komórek. Znakowane i utrwalone komórki można stabilnie przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez około jeden tydzień przed akwizycją na cytometrze przepływowym.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne dane
Nanocząstki otrzymane w kroku 3.1 miały średnicę 163 ± 24 nm oraz morfologię zgodną z wynikami uzyskanymi w poprzednich badaniach5,16. Nanocząstki w roztworze przed i po sonikacji przedstawiono na Rysunku 1, aby wykazać konieczność zastosowania sonikacji w celu zapewnienia odpowiedniej dyspersji cząstek. Analiza cytometryczna makrofagów pęcherzykowych (AMɸs) uzyskanych poprzez lavage płuc przedstawiona jest na Rysunku 2. Oznakowanie komórek kombinacją przeciwciał anty-mysich CD11b i anty-mysich F4/80, a także odpowiednimi kontrolami FMO, pozwala na ustalenie poziomu tła, identyfikację AMɸs oraz wyznaczenie bramkowania do dalszej analizy. Traktowanie makrofagów pęcherzykowych nanocząstkami polianhydrydowymi zwiększa ich aktywację, co objawia się wzrostem średniej intensywności fluorescencji dla MHC II, CD40, CD86 oraz CIRE (Rysunek 3).
<img alt="Różowy roztwór w probówkach do mikrocentryfugi; porównanie wyników eksperymentu wytrącania białek." src="/files/ftp_upload/3883/3883fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Nanocząsteczki CPTEG:CPH w stosunku 50:50 przed (A) i po (B) 30 s sonikacji.
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej przedstawiający analizę izotypową CD11b i F4/80; punkty danych wskazują markery komórkowe." src="/files/ftp_upload/3883/3883fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza cytometryczna zebranych makrofagów pęcherzykowych znakowanych za pomocą (A) Alexa Fluor 700 anty-CD11b i kontroli FMO PE-Cy7, (B) kontroli FMO Alexa Fluor 700 i PE-Cy7 anty-F4/80 oraz (C) Alexa Fluor 700 anty-CD11b i PE-Cy7 anty-F4/80. Liczba w prawym górnym rogu przedstawia procent komórek podwójnie dodatnich.
<img alt="Wykresy histogramowe cytometrii przepływowej dla MHC II, CD40, CD86, CIRE; analiza odpowiedzi immunologicznej." src="/files/ftp_upload/3883/3883fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Histogramy wykazujące wzrost intensywności fluorescencji dla ekspresji powierzchniowej MHC II (A), CD40 (B), CD86 (C) i CIRE (D) po 48-godzinnej kokulturze makrofagów pęcherzykowych z nanocząsteczkami polianhydrydowymi CPTEG:CPH w stosunku 50:50. Histogramy przedstawiają wyniki dla makrofagów pęcherzykowych (AMɸ) oznaczonych jako kontrole FMO (<img alt="Struktura atomowa, konfiguracja elektronowa, schemat modelu Bohra, edukacyjny koncept z fizyki." src="/files/ftp_upload/3883/3883line1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Linia wykresu 1">), nieleczonych AMɸ oznaczonych przeciwciałami przeciwko wszystkim markerom powierzchniowym komórek (<img alt="Chromatografia; rozdział barw, cztery zielone prążki; analiza chemiczna, schemat eksperymentu laboratoryjnego." src="/files/ftp_upload/3883/3883line3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Linia wykresu 3">) oraz AMɸ hodowanych z nanocząsteczkami i oznaczonych przeciwciałami przeciwko wszystkim markerom powierzchniowym komórek (<img alt="Równanie równowagi statycznej ΣFx=0; schemat ilustrujący równowagę sił; narzędzie edukacyjne z fizyki." src="/files/ftp_upload/3883/3883line2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Linia wykresu 2">).

<ol><li>Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory biomaterials.</a> Int. J. Pharm. 364, 265-271 (2008).</li>
<li>Torres, M. P., Vogel, B. M., Narasimhan, B., Mallapragada, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+novel+polyanhydrides+with+tailored+erosion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of novel polyanhydrides with tailored erosion mechanisms.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 76, 102-110 (2006).</li>
<li>Lopac, S. K., Torres, M. P., Wilson-Welder, J. H., Wannemuehler, M. J., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+polymer+chemistry+and+fabrication+method+on+protein+release+and+stability+from+polyanhydride+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+B%3A+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of polymer chemistry and fabrication method on protein release and stability from polyanhydride microspheres.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 91, 938-947 (2009).</li>
<li>Torres, M. P., Determan, A. S., Anderson, G. L., Mallapragada, S. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphiphilic+polyanhydrides+for+protein+stabilization+and+release%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Amphiphilic polyanhydrides for protein stabilization and release.</a> Biomaterials. 28, 108-116 (2007).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+Protective+Single-Dose+Intranasal+Nanoparticle-Based+Vaccine+Platform+for+Respiratory+Infectious+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Design of a Protective Single-Dose Intranasal Nanoparticle-Based Vaccine Platform for Respiratory Infectious Diseases.</a> PLoS ONE. 6, e17642(2011).</li>
<li>Petersen, L. K., Xue, L., Wannemuehler, M. J., Rajan, K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+simultaneous+effect+of+polymer+chemistry+and+device+geometry+on+the+in+vitro+activation+of+murine+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The simultaneous effect of polymer chemistry and device geometry on the in vitro activation of murine dendritic cells.</a> Biomaterials. 30, 5131-5142 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+innate+immune+responses+in+a+pathogen-mimicking+manner+by+amphiphilic+polyanhydride+nanoparticle+adjuvants%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Activation of innate immune responses in a pathogen-mimicking manner by amphiphilic polyanhydride nanoparticle adjuvants.</a> Biomaterials. 32, 6815-6822 (2011).</li>
<li>Torres, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyanhydride+microparticles+enhance+dendritic+cell+antigen+presentation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta.+Biomater%22%5BJournal%5D)">Polyanhydride microparticles enhance dendritic cell antigen presentation and activation.</a> Acta. Biomater. 7, 2857-2864 (2011).</li>
<li>Kirby, A. C., Coles, M. C., Kaye, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+transport+pathogens+to+lung+draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages transport pathogens to lung draining lymph nodes.</a> J. Immunol. 183, 1983-1989 (2009).</li>
<li>Barletta, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+compartments+in+the+mouse+lung%3A+Distinguishing+between+marginated%2C+interstitial%2C+and+alveolar+cells+in+response+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Leukocyte compartments in the mouse lung: Distinguishing between marginated, interstitial, and alveolar cells in response to injury.</a> J. Immunol. Methods. , (2011).</li>
<li>Rubins, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages%3A+wielding+the+double-edged+sword+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages: wielding the double-edged sword of inflammation.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 167, 103-104 (2003).</li>
<li>Sun, K., Gan, Y., Metzger, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Murine+Genetic+Predisposition+to+Pneumococcal+Infection+Reveals+a+Critical+Role+of+Alveolar+Macrophages+in+Maintaining+the+Sterility+of+the+Lower+Respiratory+Tract%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Analysis of Murine Genetic Predisposition to Pneumococcal Infection Reveals a Critical Role of Alveolar Macrophages in Maintaining the Sterility of the Lower Respiratory Tract.</a> Infect. Immun. 79, 1842-1847 (2011).</li>
<li>Morimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+Macrophages+that+Phagocytose+Apoptotic+Neutrophils+Produce+Hepatocyte+Growth+Factor+during+Bacterial+Pneumonia+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alveolar Macrophages that Phagocytose Apoptotic Neutrophils Produce Hepatocyte Growth Factor during Bacterial Pneumonia in Mice.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 24, 608-615 (2001).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Ulery, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+chemistry+influences+monocytic+uptake+of+polyanhydride+nanospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polymer chemistry influences monocytic uptake of polyanhydride nanospheres.</a> Pharm. Res. 26, 683-690 (2009).</li>
<li>Petersen, L. K., Sackett, C. K., Narasimhan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+protein+stability+in+polyanhydride+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of protein stability in polyanhydride nanoparticles.</a> Acta Biomater. 6, 3873-3881 (2010).</li>
<li>Irvin, C. G., Bates, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+the+lung+function+in+the+mouse%3A+the+challenge+of+size%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Measuring the lung function in the mouse: the challenge of size.</a> Respir. Res. 4, 4(2003).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Platformy szczepionkowe oparte na nanocząsteczkach polianhydrydów wykazały skuteczność po podaniu donosowym w pojedynczych dawkach5. Pomiar aktywacji populacji komórek fagocytujących obecnych w płucach, wywołanej przez tę platformę dostarczania szczepionki, pozwala na ocenę jej potencjalnej zdolności do ostatecznego stymulowania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych.
	W szczególności pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych z płynu z przemywania płuc i poddawanie ich działaniu róż...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;pożywka cAM&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>15-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>50 mM 2-merkapt&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna 10 000 &amp;mu;g/ml roztworu</td><td>Cellgro</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Bufor FACS&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu</td><td>Fisher Scientific</td><td>MK7868500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-200</td><td></td></tr><tr><td>BSA (albuminy surowicy bydlęcej)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7888</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Przeciwciała&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>IgG szczura</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I4341</td><td></td></tr><tr><td>anty-Ms CD16/32</td><td>eBioscience</td><td>16-0161</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko MHC II mysiem haplotypom I-A/I-E, klon M5/114.15.2, sprzężone z izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC)</td><td>eBioscience</td><td>11-5321</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD86, klon GL-1, koniugowane z allofikocyjaniną (APC)-Cy7</td><td>Biolegend</td><td>105030</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD40, klon 1C10, koniugowane z APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0401</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD209, klon 5H10, koniugowane z biotyną</td><td>eBioscience</td><td>13-2091</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-mysie CD11b, klon M1/70, koniugowane z Alexa Fluor 700</td><td>eBioscience</td><td>56-0112</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało przeciw mysiej białku F4/80, klon BM8, koniugowane z phycoerytryną&amp;#8211;rythrin (PE)-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4801</td><td></td></tr><tr><td>streptawidyna sprzężona z PE-Texas red</td><td>BD Biosciences</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Pozostałe materiały i odczynniki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A405-20</td><td>Stosowany w stężeniu 70% (v/v)</td></tr><tr><td>Sprężony CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Linweld</td><td>16000060</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Sovereign 3 &amp;frac12;&quot; Cewnik typu Tom Cat</td><td>Kendall</td><td>703021</td><td></td></tr><tr><td>Komora z laminarnym przepływem powietrza z systemem bezpieczeństwa biologicznego</td><td>NUAIRE</td><td>Seria 22</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sekcyjne</td><td>Fisher Scientific</td><td>138082</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-8254</td><td></td></tr><tr><td>PBS, 1X bez wapnia i magnezu</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml z nakrętką</td><td>VWR international</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Płytki sześciodołkowe do hodowli tkankowej</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Statywy na probówki z tworzywa sztucznego</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5970</td><td></td></tr><tr><td>Skrobacz do komórek 24 cm</td><td>Techno Plastic Products</td><td>99002</td><td></td></tr><tr><td>probówka polistyrenowa z okrągłym dnem o pojemności 5 ml</td><td>Falcon BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-aid XL</td><td>Drummond Scientific</td><td>4-000-105</td><td></td></tr><tr><td>Pipety o pojemności 10, 5 i 2 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675</td><td></td></tr><tr><td>200 i 10 &amp;mu;mikropipety L</td><td>Gilson Pipetman</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>200 i 10 &amp;mu;końcówki do pipet L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707</td><td></td></tr><tr><td>Stabilizator utrwalający BD</td><td>BD Biosciences</td><td>338036</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik Isoton II</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>8546719</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik lityczny Zap-oglobin II</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>7546138</td><td></td></tr><tr><td>Probówki polistyrenowe do licznika Coulter'a</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>14310-684</td><td></td></tr><tr><td>Probówki</td><td>BD Biosciences</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;silny&gt;Sprzęt&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Wirówka chłodząca</td><td>Labnet International</td><td>50075040</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z nawilżaniem CO2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Nuaire</td><td>Model Autoflow 8500</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy FACSCanto</td><td>BD Biosciences</td><td>338960</td><td></td></tr><tr><td>Licznik cząstek Coulter Z1</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>WS-Z1DUALPC</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do sonikacji cieczy z mikrokońcówką</td><td>Misonix</td><td>Model nr S-4000</td><td></td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Harvesting Murine Alveolar Macrophages and Evaluating Cellular Activation Induced by Polyanhydride Nanoparticles

Biodegradowalne nanocząsteczki stały się wszechstronną platformą do projektowania i wdrażania nowych szczepionek donosowych przeciwko zakaźnym chorobom dróg oddechowych. W szczególności nanocząsteczki polianhydrydowe składające się z alifatycznego kwasu sebacynowego (SA), aromatycznego 1,6-bis(p-karboksyfenoksy)heksanu (CPH) lub amfifilowego 1,8-bis(p-karboksyfenoksy)-3,6-dioksaoctanu (CPTEG) wykazują unikalną kinetykę erozji objętościowej i powierzchniowej1,2 i mogą być wykorzystane do powolnego uwalniania funkcjonalnych biomolekuł (np. antygenów białkowych, immunoglobulin itp.) in vivo3,4,5. Nanocząsteczki te posiadają również wrodzoną aktywność adiuwantową, co czyni je doskonałym wyborem jako platforma do dostarczania szczepionek6,7,8.
	W celu wyjaśnienia mechanizmów rządzących aktywacją odporności wrodzonej po donosowej szczepionce śluzówkowej, należy ocenić odpowiedzi molekularne i komórkowe komórek prezentujących antygen (APCs) odpowiedzialnych za inicjację odpowiedzi immunologicznej. Komórki dendrytyczne są głównymi APCs występującymi w drogach oddechowych, podczas gdy w miąższu płuc przeważają makrofagi pęcherzykowe (AMɸ)9,10,11. AMɸ są wysoce efektywne w oczyszczaniu płuc z patogenów drobnoustrojowych i szczątków komórkowych12,13. Dodatkowo typ komórki ten odgrywa istotną rolę w transporcie antygenów drobnoustrojowych do drenujących węzłów chłonnych, co stanowi ważny pierwszy krok w inicjacji adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej9. AMɸ wykazują również podwyższony poziom wrodzonych receptorów rozpoznawania wzorców oraz receptorów scavengerowych, wydzielają mediatory prozapalne i aktywują naiwne limfocyty T12,14. Stosunkowo czystą populację AMɸ (np. powyżej 80%) można łatwo uzyskać poprzez płukanie płuc w celu przeprowadzenia badań laboratoryjnych. Rezydentne AMɸ pobrane od zwierząt immunokompetentnych zapewniają reprezentatywny fenotyp makrofagów, które zetkną się z szczepionką opartą na cząsteczkach in vivo. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły stosowane do izolacji i hodowli AMɸ z myszy oraz analizy fenotypu aktywacji makrofagów po traktowaniu nanocząsteczkami polianhydrydowymi in vitro.

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Nanocząstki biodegradowalne stały się wszechstronną platformą do projektowania i wdrażania nowych szczepionek donosowych przeciwko infekcjom dróg oddechowych...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena zdolności nanocząsteczek polianhydrydu do aktywacji oczyszczonych makrofagów pęcherzykowych. W pierwszej kolejności chirurgicznie odsłania się tchawicę myszy, a następnie przeprowadza płukanie w celu pobrania komórek z dróg oddechowych. Makrofagi pęcherzykowe są następnie wirowane w celu ich izolacji i inkubowane przez noc.Następnie przygotowuje się zawiesinę nanopartykuł polianhydrydu i dodaje ją do makrofagów pęcherzykowych. Makrofagi inkubuje się przez 48 godzin, aby umożliwić ich aktywację. Ekspresję markerów powierzchniowych komórek analizuje się za pomocą cytometrii przepływowej.Analiza danych umożliwia zidentyfikowanie formulacji nanocząsteczek polianhydrydu zdolnych do aktywacji makrofagów pęcherzykowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu biomateriałów i immunologii. W szczególności pozwala ona na zidentyfikowanie biomateriałów o wewnętrznej aktywności adiuwantowej, przejawiającej się zdolnością do aktywacji komórek prezentujących antygen, w tym makrofagów pęcherzykowych.Pomysł zastosowania tej metody w naszych badaniach pojawił się po odkryciu, że nanoplatforma szczepionkowa na bazie polianhydrydu przeciwko patogenom układu oddechowego zapewnia pełną ochronę przed bakteryjnym zapaleniem płuc. W niniejszej pracy postanowiliśmy zbadać specyficzne oddziaływania platformy szczepionkowej z komórkami odpornościowymi układu oddechowego. Rozpocznij tę procedurę, kładąc uśpioną mysz na plecach.Spryskać mysz 70% etanolem; choć w tym przypadku użyto myszy szczepu C 57 BL six w wieku od sześciu do ośmiu tygodni, technikę tę można zastosować u każdego szczepu myszy. Zlokalizować mostek i pod kątem 30 stopni względem brzucha wprowadzić igłę 23 G z jednofazową strzykawką o pojemności 1 ml. Na głębokości około 50 mm w jamie klatki piersiowej pobrać od 0,4 do 1 ml krwi, zazwyczaj z naczyń krwionośnych.Przeprowadzenie tej procedury może utrudnić uzyskanie wyników poza zakresem sprzedaży dla ich eksperymentów. Dlatego bardzo ważne jest, aby wykonać ją starannie, tak jak pokazano w tym materiale. Aby przeprowadzić płukanie, połóż mysz na brzuchu i spryskaj ją 70% ethanol.Następnie chwyć skórę mniej więcej w połowie długości kręgosłupa, używając nożyc do sekcji wysterylizowanych 70% etanolem. Wykonaj niewielkie nacięcie skóry. Chwyć skórę po obu stronach nacięcia i rozszerz ją, ciągnąc w przeciwnych kierunkach wzdłuż osi głowowej myszy.Po odsłonięciu mięśni i gruczołów szyi należy ostrożnie naciąć tkankę mięśniową. Następnie, używając pęsety, odciągnąć tkankę w kierunku przednim myszy, aby odsłonić krtań, tchawicę i przełyk.Należy unikać przecięcia żyły szyjnej lub tętnicy szyjnej. Trachea jest rozpoznawalna jako tkanka z otaczającymi ją pierścieniami chrzęstnymi. Za pomocą pęsety delikatnie chwyć tchawicę, a następnie ostrożnie unieś ją i oddziel od przełyku, który znajduje się po stronie grzbietowej.Napełnić strzykawkę o pojemności 1 cc wyposażoną w cewnik typu Tomcat sterylnym PBS. Następnie, pod kątem 45 stopni, wykonać małe nacięcie w tchawicy przed kleszczami, ale za krtanią.Należy unikać całkowitego przecięcia tchawicy, aby zapobiec jej cofnięciu się do jamy ciała. Używając pęsety, należy przytrzymać tchawicę i delikatnie wprowadzić cewnik na około 20 milimetrów w miejsce nacięcia tchawicy. Następnie należy chwycić tchawicę w miejscu, w którym znajduje się rurka cewnika, aby zwolnić drugą rękę i móc wykonywać zewnętrzny masaż klatki piersiowej.Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z przymocowanym cewnikiem należy delikatnie wstrzyknąć 0,75 ml sterylnego PBS o temperaturze pokojowej do płuc. Następnie należy delikatnie odessać PBS z powrotem do strzykawki. Proces ten należy powtórzyć trzykrotnie.Odłącz strzykawkę od cewnika i przelej płyn płuczący do probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów. Napełnij strzykawkę 0,75 mililitrami świeżego PBS, podłącz ją ponownie do cewnika i powtórz płukanie. Odzyskanie płynu może być częściowe, w związku z czym uzyskana objętość może być mniejsza niż objętość podana.Jeśli komórki będą pobierane od więcej niż jednej myszy, należy umieścić probówkę 15 ml z zebranymi komórkami na lodzie aż do czasu wykonania wszystkich płukań płuc. Aby wzbogacić populację makrofagów pęcherzykowych w zebranych komórkach, należy odwirować płyn z płukania płuc przy 250 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.Stosując technikę sterylną, zlej supernatat do odpowiedniego pojemnika na odpady wewnątrz komory z bezpieczną manipulacją (BSC). Resuspenduj pellet komórkowy, delikatnie potrząsając probówką wirówkową o górną krawędź statywu na probówki. Dodaj jeden mililitr kompletnej pożywki dla makrofagów pęcherzykowych, aby przesuspendować komórki w celu ich przeliczenia.Pipetą przenieś 20 µL komórek do 10 mL rozcieńczalnika isotone two w fiolce do licznika kultur. Do fiolki dodaj od trzech do czterech kropli odczynnika litycznego zog globin two i delikatnie odwróć fiolkę trzy lub cztery razy. Następnie umieść fiolkę z próbką w liczniku cząstek colter particle counter Z one.Należy zaprogramować licznik z uwzględnieniem współczynnika rozcieńczenia 2 × 10⁴, aby stężenie komórek było wyświetlane jako liczba komórek na mililitr. Po wyznaczeniu stężenia komórek, rozcieńczyć je do poziomu 2,5 × 10⁵ na mililitr przy użyciu pełnej pożywki dla makrofagów pęcherzykowych w probówce o pojemności 15 ml. Następnie odmierzyć dwa mililitry roztworu do każdego dołka sześciodołkowej płytki do hodowli tkanek.Aby wzbogacić populację makrofagów pęcherzykowych, inkubuj naczynia hodowlane w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez sześć godzin. W czasie inkubacji makrofagi przylegną do dna dołka; po zakończeniu inkubacji ostrożnie odessaj nadsącz, uważając, aby nie uszkodzić przywartej warstwy komórek. Następnie wypłucz dołki, używając sterylnego PBS pozbawionego wapnia i magnezu.Aby usunąć nieprzyległe komórki i zanieczyszczenia, należy dodać dwie mililitry kompletnego medium dla makrofagów pęcherzykowych do każdej studni, a następnie inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez noc. Po tym etapie wzbogacania około 87% komórek będzie wykazywać pozytywny wynik dla markerów makrofagów CD 11 B oraz F four 80.Po wzbogaceniu populacji makrofagów pęcherzykowych następnym krokiem procedury jest dodanie nanocząsteczek polianhydrydu; najpierw należy przygotować nanocząsteczki za pomocą nanokapsułkowania polianhydrydu w przeciwrozpuszczalniku. W procesie tym polimer jest rozpuszczany w chlorku metylenu, a następnie wytrącany w pentanie. Odważyć odpowiednią ilość nanocząsteczek polianhydrydu, używając sterylnego papieru ważkiego.W tym przypadku do każdego mililitra hodowli dodaje się 125 µg cząsteczek. Przenieś cząsteczki do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, resuspenduj nanocząsteczki w odpowiedniej ilości lodowatego, kompletnego medium dla makrofagów pęcherzykowych i umieść probówkę w lodzie. Następnie wysterylizuj końcówkę sonikatora laboratoryjnego.Spryskaj probówkę 70% etanolem i przetrzyj sterylną chusteczką Kim wipe, utrzymując probówkę w lodzie. Poddaj sonikacji z energią od 10 do 20 jouli przez 30 do 45 sekund. Jeśli cząsteczki nie są wystarczająco rozproszone, dokonaj makroskopowej obserwacji zawiesiny nanocząsteczek.Umieść zawiesinę w lodzie na jedną do dwóch minut, aby upewnić się, że nanocząsteczki znajdują się poniżej temperatury przejścia szklistego polimeru. Następnie ponownie poddaj próbkę sonikacji przez 30 do 45 sekund. Celem etapu sonikacji jest odpowiednie rozproszenie nanocząsteczek jako 50 50 CCP tag.Nanocząsteczki CPH mają tendencję do agregacji w środowisku wodnym. Niemniej jednak w zawiesinie mogą nadal występować niewielkie agregaty nanocząsteczek. Zawiesinę nanocząsteczek należy przechowywać w lodzie i zużyć niezwłocznie, aby zapobiec przedwczesnej erozji powierzchni lub agregacji.Wyjmij naczynia hodowlane zawierające makrofagi pęcherzykowe z inkubatora i umieść je w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Przechyl płytkę, uważając, aby nie zdezorganizować adherentnych komórek, i odpipetuj ilość medium, która zostanie dodana do zawiesiny nanocząstek. Krótko wymieszaj zawiesinę nanocząstek polianhydrydowych w vorteksie, a następnie pipetuj do 0,3 ml zawiesiny nanocząstek do odpowiednich dołków.Ponownie, należy uważać, aby nie zakłócić warstwy komórek przylegających. Cząstki opadną na dno dołka i wejdą w kontakt z komórkami. Postępuj analogicznie w przypadku kolejnych dołków i wybranych grup badawczych.Należy uwzględnić grupy kontrolne pozytywne i negatywne, takie jak samo medium oraz 200 nanogramów na mililitr lipopolisarydu w wyznaczonych dołkach, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Po inkubacji aktywację pęcherzyków płucnych można ocenić za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z opisem w dołączonym dokumencie.Makrofagi pęcherzykowe pozyskano od myszy C 57 BL/6 i wzbogacono zgodnie z opisem w artykule wideo w celu oceny aktywacji komórkowej. Do 5 × 10⁵ komórek/ml wzbogaconych makrofagów pęcherzykowych dodano nanocząsteczki polianhydrydu CPT-CPH (50:50) w stężeniu 125 µg/ml na 48 godzin. Ekspresję markerów makrofagów pęcherzykowych: MHC II, CD 40, CD 86 oraz SIRPα, oceniono następnie za pomocą barwienia przeciwciałami i cytometrii przepływowej, co przedstawiono na tym histogramie.Makrofagi pęcherzykowe inkubowane z nanocząsteczkami (oznaczone ciągłą niebieską linią) wykazywały zwiększoną ekspresję powierzchniową MHC II, cząsteczki niezbędnej do prezentacji antygenu komórkom T CD4, w porównaniu do komórek nieleczonych nanocząsteczkami, co było zgodne z oczekiwaniami. Niższy poziom barwienia zaobserwowano w kontrolach FMO (fluorescence minus one), co wskazuje, że obserwowany sygnał nie wynika z autofluorescencji. Makrofagi pęcherzykowe inkubowane z nanocząsteczkami (oznaczone ciągłą niebieską linią) wykazywały zwiększoną ekspresję CD40, cząsteczki kostymulującej niezbędnej do właściwej aktywacji limfocytów T, w porównaniu do komórek nieleczonych.Ekspresja kolejnej cząsteczki kostymulującej limfocytów T, CD 86, również wzrosła po 48-godzinnej inkubacji z nanocząsteczkami polianhydrydowymi. Ekspresja CY, receptora lektynowego typu C, który wiąże motywy węglowodanowe obecne na powierzchni patogenów, jest znacznie zwiększona w makrofagach pęcherzykowych po traktowaniu nanocząsteczkami polianhydrydowymi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak przeprowadzić płukanie pęcherzyków płucnych w celu pozyskania makrofagów pęcherzykowych, jak hodować te komórki, a także jak je stymulować w celu pomiaru lub oceny aktywacji komórkowej za pomocą nanocząsteczek polihydroksylowych.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest stosowanie sterylnych technik laboratoryjnych, aby zapobiec kontaminacji pozyskiwanych komórek pierwotnych oraz uniknąć wprowadzenia zanieczyszczeń do preparatów.

harvesting-murine-alveolar-macrophages-evaluating-cellular-activation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Pobieranie makrofagów pęcherzykowych u myszy i ocena aktywacji komórkowej wywołanej przez nanocząstki polianhydrydowe

Metoda oceny zdolności izolowanych makrofagów pęcherzykowych myszy do kontrolowania wzrostu fagocytozowanych zarodników Aspergillus za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Ocena aktywności przeciwgrzybiczej izolowanych makrofagów pęcherzykowych za pomocą mikroskopii konfokalnej

Komórki szpiku kostnego hodowane za pomocą czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów granulocytów (GM-CSF) generują heterogeniczną hodowlę zawierającą makrofagi i komórki dendrytyczne (DC). Metoda ta kładzie nacisk na wykorzystanie wiązania MHCII i hialuronianu (HA) w celu odróżnienia makrofagów od DC w kulturze GM-CSF. Makrofagi w tej kulturze mają wiele podobieństw do makrofagów pęcherzykowych.

Generowanie i identyfikacja makrofagów i komórek dendrytycznych pochodzących z GM-CSF

Tutaj opisujemy model i podejście do badania funkcji makrofagów pęcherzyków płucnych w przerzutach raka. Aby zademonstrować rolę tych komórek w przerzutach, wykorzystano syngeniczny (4T1) model raka piersi w połączeniu z wyczerpaniem makrofagów pęcherzykowych za pomocą liposomów klodronianowych.

Badanie roli makrofagów pęcherzykowych w przerzutach raka piersi

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

Ta komunikacja opisuje metodologie izolacji i hodowli makrofagów pęcherzykowych od ludzi oraz modeli mysich do celów eksperymentalnych.

Izolacja i hodowla in vitro mysich i ludzkich makrofagów pęcherzykowych

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa.  Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Opisujemy metodę przetwarzania płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi obwodowej od osób przewlekle zakażonych wirusem HIV na terapii antyretrowirusowej w celu oceny rezerwuarów HIV w płucach. Metody te prowadzą do pozyskania wysoce czystych limfocytów T CD4 i makrofagów pęcherzykowych, które można następnie wykorzystać do immunofenotypowania i kwantyfikacji HIV DNA/RNA za pomocą ultraczułej reakcji łańcuchowej polimerazy.

Przetwarzanie płynu z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego i dopasowanej krwi do makrofagów pęcherzykowych i immunofenotypowania limfocytów T CD4+ oraz oceny rezerwuaru HIV

Ten manuskrypt opisuje protokół określający, czy narażenie na ozon, podstawowe zanieczyszczenie powietrza, upośledza efferocytozę makrofagów pęcherzykowych in vivo. Protokół ten wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki i techniki i może być dostosowany do wielu modeli uszkodzenia płuc w celu określenia wpływu na efferocytozę makrofagów pęcherzykowych.

Ocena in vivo efferocytozy makrofagów pęcherzykowych po ekspozycji na ozon

Ten protokół dostarcza badaczom szybkiej, pośredniej metody pomiaru aktywności czynnika transkrypcyjnego NF-кB/AP-1 zależnego od TLR w linii komórkowej mysich makrofagów w odpowiedzi na różnorodne powierzchnie polimerowe i zaadsorbowane warstwy białek, które modelują mikrośrodowisko implantu biomateriału.

Test komórek reporterowych makrofagów do zbadania sygnalizacji NF-kB/AP-1 za pośrednictwem receptora toll-podobnego na zaadsorbowanych warstwach białek na powierzchniach polimerowych

Prezentowany tutaj jest protokół pierwotnej izolacji monocytów ludzkiej krwi, jak również ich różnicowania na makrofagi i komórki dendrytyczne oraz łączenia z komórkami nabłonkowymi w wielokomórkowy model ludzkiego płuca. Porównano reakcje biologiczne kokultur złożonych z komórek odpornościowych zróżnicowanych ze świeżo wyizolowanych lub rozmrożonych monocytów, po ekspozycji na bodźce prozapalne.

Wielokomórkowy model wyrostka zębodołowego człowieka złożony z komórek nabłonka i pierwotnych komórek odpornościowych do oceny zagrożeń

Poznaj metodę izolacji mysich makrofagów pęcherzykowych i oceny ich aktywacji przez nanocząstki bezwodnika przy użyciu cytometrii przepływowej. Protokół umożliwia badanie immunomodulacji w układzie oddechowym.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Przeglądaj więcej filmów