Aspiracja mikropipetą komórek przytwierdzonych do podłoża w celu oszacowania sztywności komórek

Celem następującego eksperymentu jest analiza lepko-sprężystych właściwości komórek w różnych warunkach fizjologicznych i patologicznych. Osiąga się to poprzez przyłożenie ciśnienia ujemnego do błony komórkowej za pomocą mikro pipety szklanej połączonej z przetwornikiem ciśnienia, który został wykonany z kapilar szklanych przy użyciu wyciągarki do mikro pipet. Pipetę montuje się na precyzyjnym mikromanipulatorze umieszczonym na stole mikroskopu odwróconego, a końcówkę pipety zbliża się do komórki.

Następnie tworzona jest szczelna połączenie między końcówką pipety a błoną komórkową, po czym mierzy się deformację błony wnikającej do pipety w odpowiedzi na przyłożony skokowy wzrost podciśnienia. Otrzymane wyniki wykazują wpływ różnych zabiegów na biomechaniczne właściwości komórek na podstawie stopnia deformacji błony w odpowiedzi na zdefiniowaną siłę. Celem naszego laboratorium jest zbadanie wpływu dyslipidemii na właściwości biofizyczne i biomechaniczne komórek śródbłonka naczyniowego; przedstawimy dzisiaj metodę zwaną aspiracją mikropipetą, której używamy do pomiaru sztywności komórek.

Implikacje tej techniki rozciągają się na podstawowe zrozumienie biomechaniki komórkowej w wielu mechanizmach, takich jak angiogeneza, mechanosensoryka, migracja i inne. Chociaż metoda ta może dostarczyć wglądu w biomechanikę komórkową, może być ona również zastosowana do innych układów, takich jak membrany modelowe, organella wewnątrzkomórkowe lub tkanki. Aby zwizualizować błonę komórkową i zaobserwować jej wypchnięcie do pipety, błony komórkowe śródbłonka naczyniowego barwi się lipofilowym barwnikiem fluorescencyjnym.

Aby rozpocząć, należy rozcieńczyć roztwór zapasu barwnika do stężenia roboczego w podgrzanym roztworze PBS, a następnie poddać mieszaninę sonikacji przez pięć minut w celu rozbicia agregatów barwnika. Po pięciominutowym wirowaniu w mikrocentry fudze należy usunąć nadsącz i wypłukać komórki śródbłonka naczyniowego, dodając 0,5 ml PBS. Po pięciu minutach należy odessać roztwór i powtórzyć czynność płukania jeszcze dwukrotnie.

Następnie dodać roztwór DiCE do komórek i inkubować przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Po inkubacji ponownie przemyć komórki buforem PBS w ten sam sposób co wcześniej. Mikropipety są wyciągane poprzez podgrzanie kapilary szklanej w jej środkowej części.

Gdy szkło zaczyna się topić, obie połowy kapilary są rozciągane w celu utworzenia dwóch mikropipet. Końcówki pipet stosowanych w tych eksperymentach mają zazwyczaj średnicę od dwóch do sześciu mikronów. Średnica zewnętrzna, w zależności od wielkości komórki, a kształt końcówki powinien przypominać rurkę cylindryczną przed wprowadzeniem kapilary szklanej do wyciągacza pipet.

W niniejszej demonstracji zastosowano poziomy wyciągacz pipet Suter P 97 z zoptymalizowanym programem. Urządzenie to oferuje wiele programowalnych opcji pozwalających na zmianę prędkości oraz innych parametrów wyciągania. Przejdź do aktywacji programu wyciągania.

Po wyciągnięciu każdej mikropipety należy zweryfikować kształt końcówki pod mikroskopem. Po wypolerowaniu końcówki ogniem, należy napełnić mikropipetę roztworem soli fizjologicznej, takim jak PBS, lub niefluorescencyjną pożywką wzrostową. Ważne jest, aby roztwór był uzupełniony o 30% serum, co umożliwi płynne wsunięcie się błony komórkowej do pipety. W niniejszym pokazie wykorzystano odwrócony mikroskop fluorescencyjny z możliwością dekonwolucji 3D, z podłączoną do komputera kamerą wideo, przetwornikiem ciśnienia, stacją wibroizolacyjną oraz mikromanipulatorem, aby rozpocząć umieszczanie komórek w komorze mikroaspiracyjnej poprzez podniesienie ich z podłoża i przeniesienie pipetą do płytkiej komory podłużnej zamontowanej na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.

Uzasadnieniem zastosowania płytkiej komory podłużnej jest umożliwienie mikropipecie podejścia do komórek pod bardzo małym kątem, jak najbliższym poziomem. Ma to na celu umożliwienie wizualizacji błony wciągniętej do mikropipety w jednej płaszczyźnie ostrości. Umieść napełnioną mikropipetę w uchwycie do pipety połączonym z przetwornikiem mocy za pomocą elastycznej rurki, której średnica została dopasowana do złącza uchwytu pipety w celu zapewnienia szczelnego dopasowania.

Przed rozpoczęciem każdego eksperymentu ciśnienie w pipecie należy wyrównać z ciśnieniem atmosferycznym, a następnie zamocować pipetę na mikromanipulatorze, który umożliwia precyzyjną kontrolę ruchów pipety w zakresie mikronów. Pipetę należy ustawić pod niewielkim kątem względem dna komory i doprowadzić jej końcówkę do centrum pola widzenia. Trzon pipety, będący cylindryczną częścią końcówki pipety, do której aspirowana jest błona, powinien być wyrównany poziomo do płaszczyzny ogniskowej.

Aby uzyskać tę pierwszą pozycję, ustaw pipetę pod możliwie najmniejszym kątem, a następnie zegnij jej trzonek o dno komory. Ponieważ trzonek jest bardzo cienki, jest on wystarczająco elastyczny, aby ślizgać się po dnie komory podczas zbliżania się do komórki. Powoli opuszczaj mikropipetę w stronę pojedynczej komórki, korzystając z manipulatora grubokrokowe, aż znajdzie się ona w pobliżu płaszczyzny ostrości komórki.

Następnie, korzystając z precyzyjnego manipulatora, przesuń mikropipetę do krawędzi komórki, aż końcówka pipety delikatnie dotknie błony. Wykonaj jedno zdjęcie, aby sprawdzić położenie pipety. Szczelne połączenie powstaje wtedy, gdy cała końcówka pipety w pełni przylega do powierzchni komórki, a kontakt jest stabilny.

Następnie, za pomocą przetwornika przyłóż podciśnienie i utrzymuj je do czasu ustabilizowania się wypukłości błony. Wartość ciśnienia niezbędna do zassania błony do pipety różni się w zależności od typu komórek i konkretnych warunków eksperymentalnych. Początkową deformację obserwuje się zazwyczaj przy stosowaniu ciśnienia w zakresie od minus 2 do minus 15 mmHg.

Po przyłożeniu ciśnienia membrana stopniowo odkształca się w stronę pipety, aż ustabilizuje się na określonej długości. Proces ten zazwyczaj trwa od dwóch do trzech minut; w tym czasie co 30 sekund należy wykonywać obrazy odkształcenia membrany, aby śledzić postęp wciągania membrany do pipety. Na koniec należy zwiększyć ciśnienie do kolejnego poziomu w krokach od 2 do 5 mmHg.

Powtarzaj całą procedurę, aż wypukłość błony oddzieli się od komórki i przesunie do wnętrza pipety, w którym momencie eksperyment zostaje zakończony. Aby określić stopień deformacji błony, mierzy się długość zasysaną od końcówki pipety do wierzchołka obwodu wypukłości błony. Większa pipeta wywrze większą siłę na błonę komórkową przy tym samym poziomie ciśnienia, aby uwzględnić zmienność średnic pipet.

Długość zasysania jest normalizowana do średnicy pipety mierzonej dla każdego eksperymentu w celu walidacji zastosowania techniki mikroaspiracji dla komórek przytwierdzonych do podłoża; przetestowano ją, wykazując, że rozpad aktyny F skutkuje zmniejszeniem sztywności komórek śródbłonka aorty bydlęcej w ocenie przeprowadzonej tą metodą. Przedstawiono tutaj, zgodnie z oczekiwaniami, typową serię obrazów fluorescencyjnych błony śródbłonka ulegającej progresywnej deformacji w odpowiedzi na podciśnienie przyłożone za pomocą mikropipety. Błona jest stopniowo zasysana do wnętrza pipety, a długość zasysania zwiększa się w funkcji przyłożonego ciśnienia; przebiegi czasowe deformacji wykazują, że rozpad aktyny F znacząco zwiększa długość zasysania wypustek we wszystkich warunkach ciśnienia.

Stosując to podejście, odkryto, że sztywność komórek wzrasta, gdy błony komórkowe są pozbawione cholesterolu, podczas gdy wzbogacenie w cholesterol nie miało żadnego wpływu. Tutaj przedstawiono komórkę wzbogaconą w cholesterol, komórkę kontrolną oraz komórkę pozbawioną cholesterolu po osiągnięciu maksymalnych długości aspiracji przy ciśnieniu minus 15 mmHg. Projekcje zazwyczaj zaczynały się rozwijać przy minus 10 mmHg, a czas trwania deformacji błony można było zmierzyć dla ujemnych ciśnień 10, 15 i 20 mmHg.

Poniżej przedstawiono wykres maksymalnych długości aspiracji w funkcji przyłożonego ciśnienia. Maksymalna znormalizowana długość w komórkach z ubytkiem była znacząco niższa niż w komórkach kontrolnych przy ciśnieniach wynoszących minus 15 mmHg oraz minus 20 mmHg. Przyłożenie ujemnego ciśnienia powyżej 25 mmHg spowodowało oderwanie aspirowanego wypustka, tworząc oddzielną pęcherzykowatą strukturę.

Poziom ciśnienia, który doprowadził do odwarstwienia błony, był podobny przy różnych stężeniach cholesterolu, co było nieoczekiwaną obserwacją. Jak wykazują poprzednie badania, zwiększenie zawartości cholesterolu w błonie zwiększa sztywność lipidowych dwuwarstw błonowych. Po opanowaniu techniki, jej wykonanie zajmuje od dwóch do trzech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Podczas stosowania tej metody należy pamiętać, że eksperyment jest przeprowadzany na pojedynczych komórkach.

Z tego względu w ramach każdego eksperymentu należy przeanalizować od trzech do pięciu komórek na każdą warunkę, przeprowadzając łącznie trzy niezależne eksperymenty.