Name: Kariotypowanie spektralne w celu zbadania nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj kariotypowanie spektralne w celu identyfikacji aberracji chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek. Ta zaawansowana metoda cytogenetyczna pozwala wykryć złożone przestawienia niedostępne dla klasycznych technik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Brianowi Munteanowi, Shao Lo, Maki Takahashi oraz Blair Mell za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty z NIH (DK080640) oraz The University of Toledo &amp; ProMedica Translational Research Stimulation Award przyznane dr. Suryi Nauli.

1. Obróbka wstępna komórek i przygotowanie metafazy
<ol>
	<li>Komórki hoduje się w pośrodku DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) zawierającym 10-15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2, aż osiągną 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Komórki traktuje się roztworem kolcemidu w stężeniu 0,05 μg/ml przez 30-60 min.</li>
	<li>Pożywkę zawierającą wszystkie komórki pływające zbiera się do sterylnych probówek wirówkowych Falcon o pojemności 50 ml. Komórki na płytce płucze się sterylnym 1X-PBS. Po inkubacji ze sterylną trypsyną przez 1-2 min, pozostałe komórki należy zebrać i przenieść do tej samej probówki.</li>
	<li>Probówki wiruje się przy 1000 r.p.m. przez 5 min, odsysa się supernatant, pozostawiając 0,5 ml, a pellet rozbija się wyłącznie poprzez delikatne opukiwanie palcem.</li>
	<li>W zależności od wielkości pelletu dodaje się 5-10 ml hypotonicznego roztworu 0,56% KCl w dH2O i inkubuje zawiesinę w temperaturze 37°C przez 30-45 min.</li>
	<li>Do każdego 1 ml hypotonicznej zawiesiny komórkowej dodaje się jedną kroplę mieszaniny metanol/kwas octowy (3:1 obj./obj.) i delikatnie odwraca probówkę w celu wymieszania.</li>
	<li>Wiruje się przy 1200 r.p.m. przez 5 min i zbiera pellet zgodnie z krokiem 1.4, następnie kroplami dodaje się 5 ml świeżego roztworu fiksującego metanol/kwas octowy (3:1 obj./obj.), stale rozbijając pellet. Procedura ta jest krytyczna, aby rozprzestrzeniające się metafazy nie zostały uwięzione w skupiskach komórek, co mogłoby zakłócić eksperyment.</li>
	<li>Ponownie wiruje się przy 1200 r.p.m. przez 5 min i dodaje 5-10 ml lodowatego fiksatywu metanol/kwas octowy po ściance probówki. Na tym etapie, w razie potrzeby, komórki można przechowywać w roztworze fiksującym w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze -20°C krótkoterminowo lub -80°C długoterminowo (latami) do późniejszego użycia.</li>
	<li>Klaśki czyści się w etanolu absolutnym, a następnie zanurza w dH2O około 10 razy, aby utworzyć warstwę wody na powierzchni szkła. Klaśkę kładzie się na szklanej płycie i z wysokości 10" nanosi 15-20 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 1.8). Klaśkę umieszcza się w kąpieli wodnej ustawionej na 65-70°C przez 1-2 min, a następnie pozostawia do wyschnięcia.</li>
	<li>Próbkę sprawdza się pod mikroskopem świetlnym przy użyciu obiektywów suchych 10X i 40X, upewniając się, że obecne są chromosomy w metafazie, a preparaty są równomiernie rozmieszczone. Sprawdza się obecność cytoplazmy otaczającej chromosomy. Jeśli cytoplazma jest obecna, przeprowadza się wstępne przygotowanie preparatu (trawienie pepsyną); jeśli cytoplazma nie występuje, a chromosomy mają prawidłową morfologię, wstępne przygotowanie preparatu nie jest konieczne.</li>
</ol>
2. Obróbka wstępna preparatu (traktowanie pepsyną)
<ol>
	<li>Nanieś 120 μl roztworu RNazy (20 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:200 rozpuszczonego w 2X-SSC na szkiełko przedmiotowe o wymiarach 24 mm x 60 mm, odwróć preparat z metafazą stroną roboczą do dołu na szkiełko, a następnie ostrożnie obróć preparat z powrotem stroną górą i inkubuj w temperaturze 37°C przez 45 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełko, aby nie porysować preparatu, i płucz w buforze 2X-SSC w naczyniu typu Coplin przez 15 min, zmieniając roztwór co 5 min przy jednoczesnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Dodaj 5-15 μl roztworu stokowego pepsyny (100 mg/ml w dH2O) do czystego zlewka, a następnie dodaj 100 ml podgrzanego (37°C) 0,01M HCl. Ważne jest, aby pepsynę dodać najpierw do czystego zlewka, a nie bezpośrednio do roztworu HCl, w przeciwnym razie nie rozpuści się ona w roztworze. Inkubuj preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym roztwór HCl/pepsyna w temperaturze 37°C przez 3-5 min. Ten etap jest krytyczny, ponieważ zbyt silna trawienie spowoduje nadmierną degradację chromosomów, a zbyt słaba pozostawi nietrawioną cytoplazmę, co może prowadzić do niespecyficznego wiązania sondy i zakłócać sygnał hybrydyzacji.</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS przez 5 min, dwukrotnie, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS/MgCl2 przez 5 min w temperaturze pokojowej (50 ml 1M MgCl2 w 950 ml 1X-PBS).</li>
	<li>Umieść preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1% formaldehydu na 10 min w temperaturze pokojowej (1,7 ml 37% formaldehydu w 100 ml 1X-PBS/MgCl2).</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS przez 5 min.</li>
	<li>Obejrzyj preparat pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu suchego 40X, aby upewnić się, że preparaty zostały prawidłowo strawione, nie występuje cytoplazma, a morfologia chromosomów została zachowana. Wyznacz obszar do hybrydyzacji za pomocą rysika diamentowego.</li>
</ol>
3. Denaturacja i hybrydyzacja chromosomów oraz sond
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór denaturujący (70% formamid/2X SSC, pH 7.0) i uprzednio podgrzać go do 70-80°C w naczyniu Copland w kąpieli wodnej. Umieścić preparat w naczyniu Copland z roztworem denaturującym w kąpieli wodnej o temperaturze 70°C dla chromosomów mysich i 80°C dla chromosomów ludzkich na okres od 30 s do 1,5 min.</li>
	<li>Natychmiast przenieść preparat do lodowatego 70% etanolu na 3 min, następnie do 80% i 100% etanolu na 3 min każdego z nich i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Ocenić morfologię chromosomów na preparacie. Prawidłowa morfologia chromosomów objawia się ciemnym zabarwieniem chromosomów; nie powinny one być „jasne w fazie” ani posiadać otoczki (halo).</li>
	<li>Podgrzać sondę SkyPaint (zestaw SKY paint; fiolka nr 1) w temperaturze 37°C z mieszaniem przez 20 min, wymieszać w wortexie i krótko odwirować przy 1000 r.p.m. przez kilka sekund.</li>
	<li>Zdenaturować sondę w termocyklerze zaprogramowanym na cykl dwuetapowy: 85°C przez 5 min, a następnie 37°C przez 60 min w celu przeprowadzenia wstępnej aneelacji znakowanego DNA sondy.</li>
	<li>Nanieść 10μl zdenaturowanej sondy na obszar hybrydyzacji i przykryć szkiełkiem dekrywacyjnym o wymiarach 22 mm x 40 mm, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Uszczelnić krawędzie szkiełka cementem gumowym i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C przez 48-72 h.</li>
</ol>
4. Detekcja za pomocą sond fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełko coverglass i umieść preparat w naczyniu Coplina zawierającym podgrzany (45°C) roztwór piorący I (świeżo przygotowany 50% formamid w 2X SSC). Płucz przez 5 min trzykrotnie w temperaturze 45°C w wytrząsanej kąpieli wodnej z prędkością 45 r.p.m.</li>
	<li>Płucz preparat w roztworze piorącym II (1X SSC) w temperaturze 45°C przez 5 min dwukrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Płucz preparat w roztworze piorącym III (4X SSC/0,1% Tween 20) przez 5 min w temperaturze 45°C, wytrząsając.</li>
	<li>Nanieś 80 μl odczynnika blokującego (SKY paint kit; fiolka nr 2), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 min.</li>
	<li>Wyjmij preparat i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 80 μl odczynnika barwiącego Cy5 (Concentrated Antibody Detection CAD kit; fiolka nr 3), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 40 min.</li>
	<li>Płucz preparat roztworem piorącym III w temperaturze 45°C przez 5 min trzykrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Nanieś 80 μl odczynnika barwiącego Cy5.5 (Concentrated Antibody Detection CAD kit; fiolka nr 4), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 40 min.</li>
	<li>Płucz preparat roztworem piorącym III w temperaturze 45°C przez 5 min trzykrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Przechyl preparat i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 20 μl odczynnika anti-fade DAPI (SKY paint kit; fiolka nr 5) i nałóż szkiełko coverglass o wymiarach 24 mm x 60 mm. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza, które mogły powstać. Preparaty można obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności nie dłużej niż przez 1 tydzień.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie i analiza obrazów
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu odbywa się poprzez oglądanie preparatów w metafazie przy użyciu mikroskopu Olympus wyposażonego w obiektyw imersyjny 60X, kostkę spektralną (projektowany na zamówienie filtr pasmowy trójpasmowy), filtr DAPI oraz moduł interferometru Sagnaca z kamerą CCD.</li>
	<li>Spektralny kariotyp (SKY) wykonano przy użyciu oprogramowania SKY View (Applied spectral imaging wersja 1.62) zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Po analizie obrazów chromosomy można przeglądać jako obrazy kolorowe (z określonymi kolorami fluorescencyjnymi), obrazy w pseudokolorach (z kolorami służącymi do klasyfikacji) oraz odwrócone obrazy DAPI (specyficzny wzór prążkowania).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Pełna procedura SKY trwa zazwyczaj około jednego tygodnia (Rysunek 1). Obejmuje ona akwizycję obrazów i analizę, pod warunkiem zapewnienia odpowiedniej liczby komórek w metafazie. Analiza kariotypowania wykazuje prawidłowy kariotyp myszy (40,XY) w komórkach myszy typu dzikiego (Rysunek 2a). W przeciwieństwie do nich, komórki myszy Pkd1-/- (model mysi PKD) wykazują znaczący wzrost liczby chromosomów oraz anomalie strukturalne, takie jak delekcje chromosomowe (chromosom nr 8) i translokacje (chromosomy nr 11 i 19) (Rysunek 2b). Przeanalizowano również tkanki naczyniowe pacjentów z ADPKD. Proste badanie polegające na zliczeniu liczby chromosomów wskazało, że próbki naczyniowe nie-ADPKD oraz niektóre próbki ADPKD miały prawidłową liczbę chromosomów wynoszącą 23 pary (Rysunek 2c). Ogólnie jednak zaobserwowano błędy segregacji chromosomów, co skutkowało obecnością 46 par chromosomów w próbkach ADPKD zamiast 23 par (Rysunek 2d).
<img alt="Schemat fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ; denaturacja chromosomów, proces hybrydyzacji sondy." src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy protokołu SKY. Schemat blokowy protokołu SKY przedstawia kolejne etapy przeprowadzenia eksperymentu, począwszy od wstępnego przygotowania komórek i preparatów metafaz, aż po akwizycję i analizę obrazów. Po lewej stronie przedstawiono przybliżony harmonogram tygodniowy z opisem procedur krok po kroku dla każdego dnia.
<img alt="Porównawcze schematy chromosomów; myszy typu dzikiego i mutanty Pkd1-; ludzie z ADPKD i bez ADPKD, kariotypy." src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Spektralne karyotypowanie w unieśmielonych liniach komórkowych myszy i świeżo wyizolowanych ludzkich komórkach pierwotnych. Przed sortowaniem chromosomów przedstawiono kolorowe i odwrócone obrazy DAPI poszczególnych chromosomów. Po sortowaniu chromosomy zostały zaprezentowane w tabeli „klasyfikacji”. a) Obraz SKY preparatu metafazy od myszy typu dzikiego wykazuje prawidłowy kariotyp (40, XY). b) Obraz SKY preparatu metafazy od myszy Pkd1-/- wykazuje nieprawidłową liczbę chromosomów (68 zamiast 40) oraz aberracje chromosomowe, takie jak delecje chromosomów (chromosom nr 8) i translokacje chromosomów (chromosomy nr 11 i 19). c) Obraz SKY preparatu metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta bez ADPKD wykazuje prawidłowy kariotyp (46, XX). d) Obraz SKY preparatu metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta z ADPKD zawiera nieprawidłowy kariotyp (92, XXXX). Część danych została opublikowana wcześniej i wykorzystana ponownie za zgodą 14.

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
<li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li>
<li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+of+human%2C+mouse%2C+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).</li>
<li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li>
<li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li>
<li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li>
<li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li>
<li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRied%2C+T+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22">Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany)</a>. 75, 801-814 (1997).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li>
<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest techniką cytogenetyczną wykorzystywaną do badania składu genomicznego i chromosomalnego. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, a detekcja tych sond odbywa się za pomocą interferometru Sagnaca. Cały proces SKY trwa zazwyczaj około jednego tygodnia i obejmuje kilka kluczowych etapów (Ryc. 1). W metodzie SKY stosowany jest standardowy protokół, który został po raz pierwszy opisany przez zespół Padilla-Nash et al 3. Protokół ten zost...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Kolcemid</td><td>Roche Group</td><td>10 295 892 001</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S77375-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sond SKY paint (człowiek)</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000028</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sond SKY paint (mysz)</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do detekcji przeciwciał w postaci stężonej</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000033</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Roche Group</td><td>10 109 169 001</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>2106-02</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Promega Corp.</td><td>V4261</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td>przygotować bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24x60mm</td><td>VWR international</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Klej gumowy</td><td>Elmer&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do hybrydyzacji / komora wilgotnościowa / kuweta</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>na dno położyć mokre ręczniki papierowe</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>Epgradient S</td><td></td></tr><tr><td>Platforma wstrząsowa / mieszadło orbitalne</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wstrząsaniem</td><td>Precision Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrów DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrów SKY</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraCube</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop do hodowli komórkowych</td><td>Nikon Instruments</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX70</td><td>60X imersja olejowa</td></tr></tbody></table>

kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Konwencjonalna metoda identyfikacji i klasyfikacji poszczególnych chromosomów opiera się na unikalnym wzorze prążkowania każdego chromosomu w analizowanym gatunku 1, 2. Ta klasyczna technika prążkowania nie jest jednak niezawodna w identyfikacji złożonych aberracji chromosomalnych, takich jak te związane z nowotworami. Aby przełamać ograniczenia techniki prążkowania, wprowadzono spektralne kariotypowanie (SKY), które dostarcza znacznie bardziej wiarygodnych informacji o nieprawidłowościach chromosomowych.
SKY jest techniką wielokolorowej hybrydyzacji in-situ fluorescencyjnej (FISH), służącą do wykrywania chromosomów w metafazie przy użyciu mikroskopu spektralnego 3, 4. Wykazano, że SKY jest cennym narzędziem w analizie cytogenetycznej szerokiego zakresu aberracji chromosomowych związanych z licznymi chorobami genetycznymi i nowotworami 5, 6. Metoda SKY opiera się na zastosowaniu wielokolorowych sond DNA znakowanych fluorescencyjnie, przygotowanych metodą PCR z degenerowanych starterów oligonukleotydowych. W rezultacie każdy chromosom po hybrydyzacji in-situ z sondami, które są różnicowo znakowane mieszaniną barwników fluorescencyjnych (Rodaminą, Texas Red, Cy5, FITC i Cy5.5), przyjmuje unikalny kolor spektralny. Sondy stosowane w metodzie SKY obejmują do 55 sond specyficznych dla danych chromosomów 7-10.
Procedura SKY składa się z kilku etapów (Rysunek 1). Metoda SKY wymaga dostępności komórek o wysokim indeksie mitotycznym, pochodzących z tkanki zdrowej, zmienionej chorobowo lub z krwi. Chromosomy pojedynczej komórki, będącej świeżo wyizolowaną komórką pierwotną lub komórką z linii komórkowej, nanosi się na szkiełko przedmiotowe. Tak przygotowany preparat chromosomowy jest znakowany różnymi kombinacjami barwników fluorescencyjnych specyficznych dla każdego chromosomu. Do detekcji sond i akwizycji obrazu wykorzystuje się system obrazowania spektralnego, składający się z interferometru Sagnaca oraz kamery CCD. Pozwala to na pomiar widma światła widzialnego emitowanego przez próbkę i uzyskanie obrazu spektralnego poszczególnych chromosomów. Oprogramowanie HiSKY, służące do analizy uzyskanych obrazów, umożliwia łatwą identyfikację anomalii chromosomowych. Wynikiem końcowym jest obraz metafazy oraz klasyfikacja kariotypu, w której każda para chromosomów ma odrębny kolor (Rysunek 2). Pozwala to na łatwą identyfikację tożsamości chromosomów oraz translokacji. Więcej szczegółów można znaleźć na stronie internetowej Applied Spectral Imaging (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
Metoda SKY została niedawno wykorzystana do identyfikacji defektów segregacji chromosomów oraz nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), chorobą genetyczną charakteryzującą się dysfunkcją rzęsek pierwotnych 11-13. Wykorzystując tę technikę, wykazaliśmy obecność nieprawidłowej segregacji chromosomów oraz defektów chromosomalnych u pacjentów z ADPKD i w modelach mysich 14. Dalsze analizy z użyciem SKY pozwoliły nam nie tylko określić liczbę i tożsamość chromosomów, ale także precyzyjnie wykryć bardzo złożone aberracje chromosomalne, takie jak delecje i translokacje chromosomowe (Rycina 2).

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest zaawansowaną techniką cytogenetyczną służącą do identyfikacji aberracji genomicznych i chromosomalnych. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, które umożliwiają klasyfikację wszystkich chromosomów. SKY pozwala również na identyfikację złożonych aberracji chromosomalnych oraz wad segregacji u myszy i ludzi z różnymi schorzeniami, w tym z wielotorbielkową chorobą nerek.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Konwencjonalna metoda identyfikacji i klasyfikacji poszczególnych chromosomów opiera się na założeniu, że każdy chromosom u konkretnego gatunku posiada unikalny wzór prążkowania...

Celem niniejszej procedury jest znakowanie chromosomów za pomocą sond malujących w celu identyfikacji aberracji chromosomowych oraz defektów segregacji u myszy i ludzi z wielotorbielkowatością nerek. Jest to realizowane poprzez pobranie komórek od ludzi lub myszy i potraktowanie ich smid, a następnie utrwalenie i przygotowanie preparatów z rozrzutami metafaz na szkiełkach przedmiotowych. Następnie szkiełko poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia nadmiaru RNA i cytoplazmy, które mogłyby zakłócić proces hybrydyzacji.Proces ten przeprowadza się poprzez trawienie odpowiednio RNazami i pepsyną. Następnie wykonuje się denaturację chromosomów i sondy, a następnie hybrydyzację w celu znakowania chromosomów. Ostatnim etapem jest detekcja sondy przy użyciu barwników fluorescencyjnych.W rezultacie można uzyskać dane wykazujące anomalie liczby oraz struktury chromosomów dzięki fluorescencji, mikroskopii oraz rejestracji i analizie obrazów za pomocą oprogramowania Skyview. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne techniki zginania GIMs, jest dostarczenie dodatkowych informacji o złożonych aberracjach chromosomowych, takich jak translokacje chromosomowe oraz złożone reorganizacje chromosomowe, których nie można scharakteryzować za pomocą klasycznych technik zginania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wielotorbielkowatości nerek, takie jak mechanizm powstawania torbieli w nerkach.Procedurę zaprezentuje dr Wiam Abu, przy udziale utalentowanego starszego stażysty podoktorskiego z naszego laboratorium. Należy hodować komórki śródbłonka w pożywce DMEM zawierającej 10 do 15% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C i przy 5% dwutlenku węgla, aż do momentu osiągnięcia przez komórki 70 do 80% konfluencji. Następnie komórki należy inkubować z roztworem Cole w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 °C przed ich zebraniem. Aby zebrać komórki, w pierwszej kolejności należy zebrać pożywkę zawierającą wszelkie komórki pływające do sterylnych probówek wiriówkowych o pojemności 50 ml.Przepłucz komórki na płytce sterylnym PBS raz, po inkubacji ze sterylnym tripsyną przez jedną do dwóch minut, a następnie zebrać i przenieść pozostałe komórki do tej samej probówki. Po odwirowaniu komórek przez wirowanie przy 1000 obr./min przez pięć minut, odessać większość supernatantu z probówki, pozostawiając około 0,5 ml nad osadem. Rozluźnić osad komórkowy, potrząsając probówką.Następnie, w zależności od wielkości osadu, należy dodać od 5 do 10 ml hipertonicznego roztworu 0,56% chlorku potasu w wodzie destylowanej i inkubować zawiesinę w temperaturze 37°C przez 30 do 45 minut. Po inkubacji, za pomocą małej pipety o pojemności 1 ml, należy dodać jedną kroplę lodowatego roztworu utrwalającego na każdy 1 ml hipertonicznej zawiesiny komórkowej. Następnie należy delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość, a potem odwirować komórki przez 5 minut przy prędkości 1 200 obr./min.Odssać nadsącz w sposób opisany wcześniej. Następnie powoli dodać 1 mL świeżego roztworu utrwalającego, delikatnie wstrząsając probówką w celu resuspensji osadu. Następnie ostrożnie dodać kolejne 4 mL utrwalacza, kierując strumień cieczy na ściankę probówki.Ta procedura jest kluczowa, aby zapobiec uwięzieniu preparatów metafaz w grudkach komórkowych. Po powtórzeniu etapu wirowania i odessaniu supernatantu, należy uzupełnić pięć do 10 ml utrwalacza, powoli pipetując go po ściankach probówki. Na tym etapie komórki mogą być przechowywane w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze -20 °C przez krótki czas lub w temperaturze -80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego do momentu rozpoczęcia dalszych prac.Po przygotowaniu do dalszych czynności należy sprawdzić liczbę chromosomów w metafazie w preparacie komórkowym. Oczyścić szkiełko w bezwodnym etanolu. Następnie zanurzyć szkiełko w wodzie destylowanej około 10 razy, aby utworzyć na jego powierzchni warstwę ochronną z wody, położyć szkiełko na szklanej płycie i nanieść 15 do 20 µL zawiesiny komórkowej z wysokości około 10 cali nad szkiełkiem.Umieść preparat w łaźni wodnej ustawionej na 65 do 70 °C na jedną do dwóch minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Sprawdź preparat pod mikroskopem świetlnym, używając suchych obiektywów 10x i 40x. Upewnij się, że obecne są chromosomy w metafazie i że preparaty są równomiernie rozłożone. Sprawdź cytoplazmę otaczającą chromosomy.Jeśli obecna jest cytoplazma, tak jak pokazano tutaj, należy przystąpić do przygotowania preparatu. Jeśli cytoplazma nie występuje, a chromosomy mają dobrą morfologię, przygotowanie preparatu nie jest konieczne; w przeciwnym razie nanieść 120 µl świeżo przygotowanego roztworu RNazy o stężeniu 20 mg/mL w 2x SSC na szkiełko cover glass o wymiarach 24 mm na 60 mm.Odwróć preparat z metafazą powierzchnią skierowaną w dół na szkiełko nakrywkowe. Następnie ostrożnie odwróć preparat z metafazą powierzchnią do góry. Umieść preparat w komorze wilgotnościowej i inkubuj w temperaturze 37 degrees Celsius przez 45 minut.Po upływie czasu inkubacji ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywki, uważając, aby nie porysować preparasu, a następnie przemyj preparat dwukrotnie buforem 2×SSC w naczyniu do sprzęgania, trzykrotnie przez pięć minut przy każdym myciu, potrząsając naczyniem. W międzyczasie dodaj od 5 do 15 µL pepsyny o stężeniu 100 mg/mL w wodzie destylowanej do czystego zlewka, a następnie dodaj 100 mL 0,01 M kwasu solnego, uprzednio podgrzanego do 37 °C. Ważne jest, aby najpierw dodać pepsynę do czystego zlewka, w przeciwnym razie nie rozpuści się ona.Przenieś ten roztwór do naczynia Coplan. Inkubuj slajd do płukania w naczyniu sprzęgającym w temperaturze 37 °C nie dłużej niż od trzech do pięciu minut po trawieniu. Przepłucz slajd dwukrotnie w naczyniu Copin zawierającym 1x PBS przez pięć minut każdego z płukań, potrząsając naczyniem.Następnie przeprowadź pięciominutowe płukanie w naczyniu Copina zawierającym PBS uzupełniony o chlorek magnezu. Po tym wykonaj 10-minutową inkubację w naczyniu Copina zawierającym 1% formaldehydu, a następnie końcowe płukanie w naczyniu Copina zawierającym 1x PBS przez pięć minut. Następnie odwodnij preparaty w naczyniach Copina zawierających serię etanolu o stężeniach 70%, 80% i 100% przez dwie minuty dla każdego stężenia, a na koniec wysusz na powietrzu.Obejrzyj preparat pod mikroskopem świetlnym przy użyciu suchego obiektywu o powiększeniu 40x, aby upewnić się, że preparaty zostały prawidłowo strawione, że nie występuje cytoplazma, a morfologia chromosomów została zachowana. Na koniec zaznacz obszar do hybrydyzacji za pomocą pisaka diamentowego. Po świeżym przygotowaniu roztworu denaturującego umieść go w naczyniu Copina i podgrzej wstępnie do 70 °C w łaźni wodnej.Następnie umieść preparat w słoiku Cochin zawierającym podgrzany roztwór denaturujący w kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C na okres od 30 sekund do jednej minuty. Po inkubacji niezwłocznie przenieś preparat do lodowatego 70% etanolu na trzy minuty, a następnie do 80% i 100% etanolu na trzy minuty każdego z nich, po czym pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zbadaj preparat pod kątem morfologii chromosomów, zwracając uwagę na obecność ciemnych chromosomów, które nie wydają się blade ani błyszczące.Oznacza prawidłowy chromosom lub morfologię. Podgrzać barwnik. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 20 minut.Następnie wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj przy 1000 obr./min przez kilka minut. Denaturuj sondę w termocyklerze w temperaturze 85°C przez pięć minut, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C. Nałóż 10 µL zdenaturowanej sondy na obszar hybrydyzacji i przykryj szkiełkiem podstawowym o wymiarach 22 mm na 40 mm na jedną godzinę.Upewniając się, że nie uwięziono pęcherzyków powietrza, należy uszczelnić krawędzie szkiełka podstawowego cementem gumowym, a następnie inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 48 do 72 godzin. Ostrożnie zdjąć szkiełko zakrywające i umieścić preparat w naczyniu do sprzęgania zawierającym świeżo przygotowany roztwór piorący, uprzednio ogrzany do 45 °C. Płukać przez pięć minut, trzykrotnie w temperaturze 45 °C, w wytrząsanej łaźni wodnej przy 45 obr./min.Następnie przemyj preparaty dwa razy w roztworze piorącym dwa w temperaturze 45°C przez pięć minut przy każdym myciu z wytrząsaniem, a następnie przez pięć minut w roztworze piorącym trzy w temperaturze 45°C z wytrząsaniem. Następnie nanieś 80 µL odczynnika blokującego. Po tym nałóż szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut.Zdejmij szkiełko nakrywkę i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 80 µL odczynnika barwiącego sci-fi. Nałóż szkiełko nakrywkowe i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Po inkubacji przemyj preparat roztworem płuczącym three of w temperaturze 45 °C przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie przy jednoczesnym wstrząsaniu.Następnie nanieś 80 µL odczynnika barwiącego PS 5.5. Nałóż szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 40 minut; po inkubacji przemyj trzykrotnie roztworem płuczącym trzy, analogicznie jak wcześniej. Na koniec przechyl preparat i pozwól cieczy spłynąć.Nanieś 20 µL odczynnika Antifa dappy i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywki o wymiarach 24 mm na 60 mm, usuwając pęcherzyki powietrza, które mogły powstać. Preparaty można obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności nie dłużej niż przez jeden tydzień. Powyższy obraz prawidłowego rozprzestrzenienia metafazy myszy typu dzikiego został wykonany przy użyciu mikroskopu Olympus wyposażonego w obiektyw imersyjny 60x.Niestandardowy potrójny filtr pasmowo-przepustowy, znany jako kostka spektralna, filtr dappy oraz moduł interferometru sac z kamerą CCD. Kariotypy spektralne wykonano przy użyciu oprogramowania skyview. Górny lewy panel przedstawia znakowany rozprzestrzenie metafazowe, a górny prawy panel obraz rozprzestrzenienia w jasnym polu.Dolny panel przedstawia chromosomy uporządkowane rosnąco przy użyciu oprogramowania skyview. Ten obraz SKY preparatu metafazy pochodzącego od myszy z homozygotycznym nokautem pkd one wykazuje nieprawidłową liczbę chromosomów, gdzie obecnych jest 68 chromosomów zamiast 40. Widoczne są również aberracje chromosomowe, takie jak delecja chromosomu 8 oraz translokacje, na przykład między chromosomami 5 i 16, a także między chromosomami 11 i 19.Ten obraz SKY preparatu metafazy chromosomów ludzkich z tkanki naczyniowej pacjenta bez A-D-P-K-D wykazuje prawidłowy żeński kariotyp składający się z 44 autosomów i dwóch chromosomów XXX. Ten końcowy obraz SKY przedstawia preparat metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta z A-D-P-K-D z nieprawidłowym kariotypem obejmującym 88 autosomów i cztery chromosomy płci XXXX. Jeden master.Technikę tę można przeprowadzić w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo.

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Karyotypowanie spektralne w badaniach nad nieprawidłowościami chromosomów u ludzi i myszy z torbielowatą chorobą nerek

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Opisano zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu jako nieinwazyjny sposób uzyskiwania informacji fenotypowych o modelach gryzoni dla wielotorbielowatości nerek i monitorowania interwencji. W porównaniu z tradycyjnym podejściem histologicznym, obrazy MRI można uzyskać in vivo, co pozwala na długotrwałą obserwację.

Zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu w modelach wielotorbielowatości nerek u małych gryzoni do fenotypowania in vivo i monitorowania leków

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Ten protokół demonstruje ultrasonografię robotyczną (US) jako praktyczną, opłacalną i szybką alternatywę dla tradycyjnych, nieinwazyjnych metod obrazowania.

Zastosowanie zrobotyzowanego ultrasonografu 3D do analizy in vivo nerek myszy

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Poznaj kariotypowanie spektralne w celu identyfikacji aberracji chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek. Ta zaawansowana metoda cytogenetyczna pozwala wykryć złożone przestawienia niedostępne dla klasycznych technik.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Przeglądaj więcej filmów