Name: Kariotypowanie spektralne w celu zbadania nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Poznaj kariotypowanie spektralne w celu identyfikacji aberracji chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek. Ta zaawansowana metoda cytogenetyczna pozwala wykryć złożone przestawienia niedostępne dla klasycznych technik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy pragną podziękować Brianowi Munteanowi, Shao Lo, Maki Takahashi oraz Blair Mell za pomoc techniczną. Praca ta była wspierana przez granty z NIH (DK080640) oraz The University of Toledo &amp; ProMedica Translational Research Stimulation Award przyznane dr. Suryi Nauli.

1. Obróbka wstępna komórek i przygotowanie metafazy
<ol>
	<li>Komórki hoduje się w pośrodku DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) zawierającym 10-15% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2, aż osiągną 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Komórki traktuje się roztworem kolcemidu w stężeniu 0,05 μg/ml przez 30-60 min.</li>
	<li>Pożywkę zawierającą wszystkie komórki pływające zbiera się do sterylnych probówek wirówkowych Falcon o pojemności 50 ml. Komórki na płytce płucze się sterylnym 1X-PBS. Po inkubacji ze sterylną trypsyną przez 1-2 min, pozostałe komórki należy zebrać i przenieść do tej samej probówki.</li>
	<li>Probówki wiruje się przy 1000 r.p.m. przez 5 min, odsysa się supernatant, pozostawiając 0,5 ml, a pellet rozbija się wyłącznie poprzez delikatne opukiwanie palcem.</li>
	<li>W zależności od wielkości pelletu dodaje się 5-10 ml hypotonicznego roztworu 0,56% KCl w dH2O i inkubuje zawiesinę w temperaturze 37°C przez 30-45 min.</li>
	<li>Do każdego 1 ml hypotonicznej zawiesiny komórkowej dodaje się jedną kroplę mieszaniny metanol/kwas octowy (3:1 obj./obj.) i delikatnie odwraca probówkę w celu wymieszania.</li>
	<li>Wiruje się przy 1200 r.p.m. przez 5 min i zbiera pellet zgodnie z krokiem 1.4, następnie kroplami dodaje się 5 ml świeżego roztworu fiksującego metanol/kwas octowy (3:1 obj./obj.), stale rozbijając pellet. Procedura ta jest krytyczna, aby rozprzestrzeniające się metafazy nie zostały uwięzione w skupiskach komórek, co mogłoby zakłócić eksperyment.</li>
	<li>Ponownie wiruje się przy 1200 r.p.m. przez 5 min i dodaje 5-10 ml lodowatego fiksatywu metanol/kwas octowy po ściance probówki. Na tym etapie, w razie potrzeby, komórki można przechowywać w roztworze fiksującym w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze -20°C krótkoterminowo lub -80°C długoterminowo (latami) do późniejszego użycia.</li>
	<li>Klaśki czyści się w etanolu absolutnym, a następnie zanurza w dH2O około 10 razy, aby utworzyć warstwę wody na powierzchni szkła. Klaśkę kładzie się na szklanej płycie i z wysokości 10" nanosi 15-20 μl zawiesiny komórkowej (z kroku 1.8). Klaśkę umieszcza się w kąpieli wodnej ustawionej na 65-70°C przez 1-2 min, a następnie pozostawia do wyschnięcia.</li>
	<li>Próbkę sprawdza się pod mikroskopem świetlnym przy użyciu obiektywów suchych 10X i 40X, upewniając się, że obecne są chromosomy w metafazie, a preparaty są równomiernie rozmieszczone. Sprawdza się obecność cytoplazmy otaczającej chromosomy. Jeśli cytoplazma jest obecna, przeprowadza się wstępne przygotowanie preparatu (trawienie pepsyną); jeśli cytoplazma nie występuje, a chromosomy mają prawidłową morfologię, wstępne przygotowanie preparatu nie jest konieczne.</li>
</ol>
2. Obróbka wstępna preparatu (traktowanie pepsyną)
<ol>
	<li>Nanieś 120 μl roztworu RNazy (20 mg/ml) w rozcieńczeniu 1:200 rozpuszczonego w 2X-SSC na szkiełko przedmiotowe o wymiarach 24 mm x 60 mm, odwróć preparat z metafazą stroną roboczą do dołu na szkiełko, a następnie ostrożnie obróć preparat z powrotem stroną górą i inkubuj w temperaturze 37°C przez 45 min.</li>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełko, aby nie porysować preparatu, i płucz w buforze 2X-SSC w naczyniu typu Coplin przez 15 min, zmieniając roztwór co 5 min przy jednoczesnym wstrząsaniu.</li>
	<li>Dodaj 5-15 μl roztworu stokowego pepsyny (100 mg/ml w dH2O) do czystego zlewka, a następnie dodaj 100 ml podgrzanego (37°C) 0,01M HCl. Ważne jest, aby pepsynę dodać najpierw do czystego zlewka, a nie bezpośrednio do roztworu HCl, w przeciwnym razie nie rozpuści się ona w roztworze. Inkubuj preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym roztwór HCl/pepsyna w temperaturze 37°C przez 3-5 min. Ten etap jest krytyczny, ponieważ zbyt silna trawienie spowoduje nadmierną degradację chromosomów, a zbyt słaba pozostawi nietrawioną cytoplazmę, co może prowadzić do niespecyficznego wiązania sondy i zakłócać sygnał hybrydyzacji.</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS przez 5 min, dwukrotnie, w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS/MgCl2 przez 5 min w temperaturze pokojowej (50 ml 1M MgCl2 w 950 ml 1X-PBS).</li>
	<li>Umieść preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1% formaldehydu na 10 min w temperaturze pokojowej (1,7 ml 37% formaldehydu w 100 ml 1X-PBS/MgCl2).</li>
	<li>Płucz preparat w naczyniu typu Coplin zawierającym 100 ml 1X-PBS przez 5 min.</li>
	<li>Obejrzyj preparat pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu suchego 40X, aby upewnić się, że preparaty zostały prawidłowo strawione, nie występuje cytoplazma, a morfologia chromosomów została zachowana. Wyznacz obszar do hybrydyzacji za pomocą rysika diamentowego.</li>
</ol>
3. Denaturacja i hybrydyzacja chromosomów oraz sond
<ol>
	<li>Przygotować świeży roztwór denaturujący (70% formamid/2X SSC, pH 7.0) i uprzednio podgrzać go do 70-80°C w naczyniu Copland w kąpieli wodnej. Umieścić preparat w naczyniu Copland z roztworem denaturującym w kąpieli wodnej o temperaturze 70°C dla chromosomów mysich i 80°C dla chromosomów ludzkich na okres od 30 s do 1,5 min.</li>
	<li>Natychmiast przenieść preparat do lodowatego 70% etanolu na 3 min, następnie do 80% i 100% etanolu na 3 min każdego z nich i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Ocenić morfologię chromosomów na preparacie. Prawidłowa morfologia chromosomów objawia się ciemnym zabarwieniem chromosomów; nie powinny one być „jasne w fazie” ani posiadać otoczki (halo).</li>
	<li>Podgrzać sondę SkyPaint (zestaw SKY paint; fiolka nr 1) w temperaturze 37°C z mieszaniem przez 20 min, wymieszać w wortexie i krótko odwirować przy 1000 r.p.m. przez kilka sekund.</li>
	<li>Zdenaturować sondę w termocyklerze zaprogramowanym na cykl dwuetapowy: 85°C przez 5 min, a następnie 37°C przez 60 min w celu przeprowadzenia wstępnej aneelacji znakowanego DNA sondy.</li>
	<li>Nanieść 10μl zdenaturowanej sondy na obszar hybrydyzacji i przykryć szkiełkiem dekrywacyjnym o wymiarach 22 mm x 40 mm, upewniając się, że nie powstały pęcherzyki powietrza. Uszczelnić krawędzie szkiełka cementem gumowym i inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37°C przez 48-72 h.</li>
</ol>
4. Detekcja za pomocą sond fluorescencyjnych
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń szkiełko coverglass i umieść preparat w naczyniu Coplina zawierającym podgrzany (45°C) roztwór piorący I (świeżo przygotowany 50% formamid w 2X SSC). Płucz przez 5 min trzykrotnie w temperaturze 45°C w wytrząsanej kąpieli wodnej z prędkością 45 r.p.m.</li>
	<li>Płucz preparat w roztworze piorącym II (1X SSC) w temperaturze 45°C przez 5 min dwukrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Płucz preparat w roztworze piorącym III (4X SSC/0,1% Tween 20) przez 5 min w temperaturze 45°C, wytrząsając.</li>
	<li>Nanieś 80 μl odczynnika blokującego (SKY paint kit; fiolka nr 2), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 min.</li>
	<li>Wyjmij preparat i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 80 μl odczynnika barwiącego Cy5 (Concentrated Antibody Detection CAD kit; fiolka nr 3), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 40 min.</li>
	<li>Płucz preparat roztworem piorącym III w temperaturze 45°C przez 5 min trzykrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Nanieś 80 μl odczynnika barwiącego Cy5.5 (Concentrated Antibody Detection CAD kit; fiolka nr 4), nałóż szkiełko coverglass i inkubuj w temperaturze 37°C przez 40 min.</li>
	<li>Płucz preparat roztworem piorącym III w temperaturze 45°C przez 5 min trzykrotnie, wytrząsając.</li>
	<li>Przechyl preparat i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 20 μl odczynnika anti-fade DAPI (SKY paint kit; fiolka nr 5) i nałóż szkiełko coverglass o wymiarach 24 mm x 60 mm. Ostrożnie usuń pęcherzyki powietrza, które mogły powstać. Preparaty można obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności nie dłużej niż przez 1 tydzień.</li>
</ol>
5. Pozyskiwanie i analiza obrazów
<ol>
	<li>Akwizycja obrazu odbywa się poprzez oglądanie preparatów w metafazie przy użyciu mikroskopu Olympus wyposażonego w obiektyw imersyjny 60X, kostkę spektralną (projektowany na zamówienie filtr pasmowy trójpasmowy), filtr DAPI oraz moduł interferometru Sagnaca z kamerą CCD.</li>
	<li>Spektralny kariotyp (SKY) wykonano przy użyciu oprogramowania SKY View (Applied spectral imaging wersja 1.62) zgodnie z instrukcją obsługi.</li>
	<li>Po analizie obrazów chromosomy można przeglądać jako obrazy kolorowe (z określonymi kolorami fluorescencyjnymi), obrazy w pseudokolorach (z kolorami służącymi do klasyfikacji) oraz odwrócone obrazy DAPI (specyficzny wzór prążkowania).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Pełna procedura SKY trwa zazwyczaj około jednego tygodnia (Rysunek 1). Obejmuje ona akwizycję obrazów i analizę, pod warunkiem zapewnienia odpowiedniej liczby komórek w metafazie. Analiza kariotypowania wykazuje prawidłowy kariotyp myszy (40,XY) w komórkach myszy typu dzikiego (Rysunek 2a). W przeciwieństwie do nich, komórki myszy Pkd1-/- (model mysi PKD) wykazują znaczący wzrost liczby chromosomów oraz anomalie strukturalne, takie jak delekcje chromosomowe (chromosom nr 8) i translokacje (chromosomy nr 11 i 19) (Rysunek 2b). Przeanalizowano również tkanki naczyniowe pacjentów z ADPKD. Proste badanie polegające na zliczeniu liczby chromosomów wskazało, że próbki naczyniowe nie-ADPKD oraz niektóre próbki ADPKD miały prawidłową liczbę chromosomów wynoszącą 23 pary (Rysunek 2c). Ogólnie jednak zaobserwowano błędy segregacji chromosomów, co skutkowało obecnością 46 par chromosomów w próbkach ADPKD zamiast 23 par (Rysunek 2d).
<img alt="Schemat fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ; denaturacja chromosomów, proces hybrydyzacji sondy." src="/files/ftp_upload/3887/3887fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat blokowy protokołu SKY. Schemat blokowy protokołu SKY przedstawia kolejne etapy przeprowadzenia eksperymentu, począwszy od wstępnego przygotowania komórek i preparatów metafaz, aż po akwizycję i analizę obrazów. Po lewej stronie przedstawiono przybliżony harmonogram tygodniowy z opisem procedur krok po kroku dla każdego dnia.
<img alt="Porównawcze schematy chromosomów; myszy typu dzikiego i mutanty Pkd1-; ludzie z ADPKD i bez ADPKD, kariotypy." src="/files/ftp_upload/3887/3887fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Spektralne karyotypowanie w unieśmielonych liniach komórkowych myszy i świeżo wyizolowanych ludzkich komórkach pierwotnych. Przed sortowaniem chromosomów przedstawiono kolorowe i odwrócone obrazy DAPI poszczególnych chromosomów. Po sortowaniu chromosomy zostały zaprezentowane w tabeli „klasyfikacji”. a) Obraz SKY preparatu metafazy od myszy typu dzikiego wykazuje prawidłowy kariotyp (40, XY). b) Obraz SKY preparatu metafazy od myszy Pkd1-/- wykazuje nieprawidłową liczbę chromosomów (68 zamiast 40) oraz aberracje chromosomowe, takie jak delecje chromosomów (chromosom nr 8) i translokacje chromosomów (chromosomy nr 11 i 19). c) Obraz SKY preparatu metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta bez ADPKD wykazuje prawidłowy kariotyp (46, XX). d) Obraz SKY preparatu metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta z ADPKD zawiera nieprawidłowy kariotyp (92, XXXX). Część danych została opublikowana wcześniej i wykorzystana ponownie za zgodą 14.

<ol><li>Caspersson, T., Farber, S., Foley, G. E., Kudynowski, J., Modest, E. J., Simonsson, E., Wagh, U., Zech, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+differentiation+along+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Chemical differentiation along metaphase chromosomes.</a> Experimental Cell Research. 49, 219-222 (1968).</li>
<li>Seabright, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+banding+technique+for+human+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">A rapid banding technique for human chromosomes.</a> Lancet. 2, 971-972 (1971).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nature Protocols. 1, 3129-3142 (2006).</li>
<li>Schrock, E., Zschieschang, P., O'Brien, P., Helmrich, A., Hardt, T., Matthaei, A., Stout-Weider, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+karyotyping+of+human%2C+mouse%2C+rat+and+ape+chromosomes--applications+for+genetic+diagnostics+and+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Spectral karyotyping of human, mouse, rat and ape chromosomes--applications for genetic diagnostics and research.</a> Cytogenetic and Genome Research. 114, 199-221 (2006).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Heselmeyer-Haddad, K., Wangsa, D., Zhang, H., Ghadimi, B. M., Macville, M., Augustus, M., Schrock, E., Hilgenfeld, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jumping+translocations+are+common+in+solid+tumor+cell+lines+and+result+in+recurrent+fusions+of+whole+chromosome+arms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Jumping translocations are common in solid tumor cell lines and result in recurrent fusions of whole chromosome arms.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 30, 349-363 (2001).</li>
<li>Veldman, T., Vignon, C., Schrock, E., Rowley, J. D., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+chromosome+abnormalities+in+haematological+malignancies+detected+by+multicolour+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hidden chromosome abnormalities in haematological malignancies detected by multicolour spectral karyotyping.</a> Nature Genetics. 15, 406-410 (1997).</li>
<li>Karpf, A. R., Matsui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disruption+of+cytosine+DNA+methyltransferase+enzymes+induces+chromosomal+instability+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Genetic disruption of cytosine DNA methyltransferase enzymes induces chromosomal instability in human cancer cells.</a> Cancer Research. 65, 8635-8639 (2005).</li>
<li>Matsui, S., Faitar, S. L., Rossi, M. R., Cowell, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+spectral+karyotyping+to+the+analysis+of+the+human+chromosome+complement+of+interspecies+somatic+cell+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics+and+Cytogenetics%22%5BJournal%5D)">Application of spectral karyotyping to the analysis of the human chromosome complement of interspecies somatic cell hybrids.</a> Cancer Genetics and Cytogenetics. 142, 30-35 (2003).</li>
<li>Nestor, A. L., Hollopeter, S. L., Matsui, S. I., Allison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+genetic+complementation+controlling+the+chromosomal+abnormalities+and+loss+of+heterozygosity+formation+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+Genome+Research%22%5BJournal%5D)">A model for genetic complementation controlling the chromosomal abnormalities and loss of heterozygosity formation in cancer.</a> Cytogenetic and Genome Research. 116, 235-247 (2007).</li>
<li>Ried, T., Liyanage, M., du Manoir, S., Heselmeyer, K., Auer, K., Macville, M., Schrock, E. Tumor cytogenetics revisited: comparative genomic hybridization and spectral karyotyping. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRied%2C+T+%22Journal+of+Molecular+Medicine+%28Berlin%2C+Germany%29%22">Journal of Molecular Medicine (Berlin, Germany)</a>. 75, 801-814 (1997).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Takahashi, M., Mell, B. R., Jones, T. J., Ratnam, S., Kolb, R. J., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+polycystin-2+is+a+mechanosensitive+calcium+channel+involved+in+nitric+oxide+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Ciliary polycystin-2 is a mechanosensitive calcium channel involved in nitric oxide signaling cascades.</a> Circulation Research. 104, 860-869 (2009).</li>
<li>Nauli, S. M., Alenghat, F. J., Luo, Y., Williams, E., Vassilev, P., Li, X., Elia, A. E., Lu, W., Brown, E. M., Quinn, S. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polycystins+1+and+2+mediate+mechanosensation+in+the+primary+cilium+of+kidney+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Polycystins 1 and 2 mediate mechanosensation in the primary cilium of kidney cells.</a> Nature Genetics. 33, 129-137 (2003).</li>
<li>Nauli, S. M., Kawanabe, Y., Kaminski, J. J., Pearce, W. J., Ingber, D. E., Zhou, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cilia+are+fluid+shear+sensors+that+regulate+calcium+signaling+and+nitric+oxide+production+through+polycystin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Endothelial cilia are fluid shear sensors that regulate calcium signaling and nitric oxide production through polycystin-1.</a> Circulation. 117, 1161-1171 (2008).</li>
<li>AbouAlaiwi, W. A., Ratnam, S., Booth, R. L., Shah, J. V., Nauli, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+from+humans+and+mice+with+polycystic+kidney+disease+are+characterized+by+polyploidy+and+chromosome+segregation+defects+through+survivin+down-regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells from humans and mice with polycystic kidney disease are characterized by polyploidy and chromosome segregation defects through survivin down-regulation.</a> Human Molecular Genetics. 20, 354-367 (2011).</li>
<li>Padilla-Nash, H. M., Nash, W. G., Padilla, G. M., Roberson, K. M., Robertson, C. N., Macville, M., Schrock, E., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cytogenetic+analysis+of+the+bladder+carcinoma+cell+line+BK-10+by+spectral+karyotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Chromosomes+%26+Cancer%22%5BJournal%5D)">Molecular cytogenetic analysis of the bladder carcinoma cell line BK-10 by spectral karyotyping.</a> Genes, Chromosomes & Cancer. 25, 53-59 (1999).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest techniką cytogenetyczną wykorzystywaną do badania składu genomicznego i chromosomalnego. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, a detekcja tych sond odbywa się za pomocą interferometru Sagnaca. Cały proces SKY trwa zazwyczaj około jednego tygodnia i obejmuje kilka kluczowych etapów (Ryc. 1). W metodzie SKY stosowany jest standardowy protokół, który został po raz pierwszy opisany przez zespół Padilla-Nash et al 3. Protokół ten zost...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30088-03</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Kolcemid</td><td>Roche Group</td><td>10 295 892 001</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S77375-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30256-01</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sond SKY paint (człowiek)</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000028</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sond SKY paint (mysz)</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000030</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do detekcji przeciwciał w postaci stężonej</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td>SKY000033</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>SH30236.01</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A433P-4</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Roche Group</td><td>10 109 169 001</td><td></td></tr><tr><td>Pepsyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-5G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fluka</td><td>63069-500ML</td><td></td></tr><tr><td>37% Formaldehyd</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>2106-02</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Promega Corp.</td><td>V4261</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fluka</td><td>47671</td><td>przygotować bezpośrednio przed użyciem</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka przedmiotowe do mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe 24x60mm</td><td>VWR international</td><td>16004-312</td><td></td></tr><tr><td>Klej gumowy</td><td>Elmer&amp;rsquo;s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komora do hybrydyzacji / komora wilgotnościowa / kuweta</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>na dno położyć mokre ręczniki papierowe</td></tr><tr><td>Termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>Epgradient S</td><td></td></tr><tr><td>Platforma wstrząsowa / mieszadło orbitalne</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna z wstrząsaniem</td><td>Precision Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrów DAPI</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kostka filtrów SKY</td><td>Chroma Technology Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpectraCube</td><td>Applied Spectral Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop do hodowli komórkowych</td><td>Nikon Instruments</td><td>Nikon Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX70</td><td>60X imersja olejowa</td></tr></tbody></table>

kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Spectral Karyotyping to Study Chromosome Abnormalities in Humans and Mice with Polycystic Kidney Disease

Konwencjonalna metoda identyfikacji i klasyfikacji poszczególnych chromosomów opiera się na unikalnym wzorze prążkowania każdego chromosomu w analizowanym gatunku 1, 2. Ta klasyczna technika prążkowania nie jest jednak niezawodna w identyfikacji złożonych aberracji chromosomalnych, takich jak te związane z nowotworami. Aby przełamać ograniczenia techniki prążkowania, wprowadzono spektralne kariotypowanie (SKY), które dostarcza znacznie bardziej wiarygodnych informacji o nieprawidłowościach chromosomowych.
SKY jest techniką wielokolorowej hybrydyzacji in-situ fluorescencyjnej (FISH), służącą do wykrywania chromosomów w metafazie przy użyciu mikroskopu spektralnego 3, 4. Wykazano, że SKY jest cennym narzędziem w analizie cytogenetycznej szerokiego zakresu aberracji chromosomowych związanych z licznymi chorobami genetycznymi i nowotworami 5, 6. Metoda SKY opiera się na zastosowaniu wielokolorowych sond DNA znakowanych fluorescencyjnie, przygotowanych metodą PCR z degenerowanych starterów oligonukleotydowych. W rezultacie każdy chromosom po hybrydyzacji in-situ z sondami, które są różnicowo znakowane mieszaniną barwników fluorescencyjnych (Rodaminą, Texas Red, Cy5, FITC i Cy5.5), przyjmuje unikalny kolor spektralny. Sondy stosowane w metodzie SKY obejmują do 55 sond specyficznych dla danych chromosomów 7-10.
Procedura SKY składa się z kilku etapów (Rysunek 1). Metoda SKY wymaga dostępności komórek o wysokim indeksie mitotycznym, pochodzących z tkanki zdrowej, zmienionej chorobowo lub z krwi. Chromosomy pojedynczej komórki, będącej świeżo wyizolowaną komórką pierwotną lub komórką z linii komórkowej, nanosi się na szkiełko przedmiotowe. Tak przygotowany preparat chromosomowy jest znakowany różnymi kombinacjami barwników fluorescencyjnych specyficznych dla każdego chromosomu. Do detekcji sond i akwizycji obrazu wykorzystuje się system obrazowania spektralnego, składający się z interferometru Sagnaca oraz kamery CCD. Pozwala to na pomiar widma światła widzialnego emitowanego przez próbkę i uzyskanie obrazu spektralnego poszczególnych chromosomów. Oprogramowanie HiSKY, służące do analizy uzyskanych obrazów, umożliwia łatwą identyfikację anomalii chromosomowych. Wynikiem końcowym jest obraz metafazy oraz klasyfikacja kariotypu, w której każda para chromosomów ma odrębny kolor (Rysunek 2). Pozwala to na łatwą identyfikację tożsamości chromosomów oraz translokacji. Więcej szczegółów można znaleźć na stronie internetowej Applied Spectral Imaging (<a href="http://www.spectral-imaging.com/" target="_blank">http://www.spectral-imaging.com/</a>).
Metoda SKY została niedawno wykorzystana do identyfikacji defektów segregacji chromosomów oraz nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z autosomalną dominującą wielotorbielowatością nerek (ADPKD), chorobą genetyczną charakteryzującą się dysfunkcją rzęsek pierwotnych 11-13. Wykorzystując tę technikę, wykazaliśmy obecność nieprawidłowej segregacji chromosomów oraz defektów chromosomalnych u pacjentów z ADPKD i w modelach mysich 14. Dalsze analizy z użyciem SKY pozwoliły nam nie tylko określić liczbę i tożsamość chromosomów, ale także precyzyjnie wykryć bardzo złożone aberracje chromosomalne, takie jak delecje i translokacje chromosomowe (Rycina 2).

Spektralne kariotypowanie (SKY) jest zaawansowaną techniką cytogenetyczną służącą do identyfikacji aberracji genomicznych i chromosomalnych. Technika ta wykorzystuje sondy do malowania chromosomów, które umożliwiają klasyfikację wszystkich chromosomów. SKY pozwala również na identyfikację złożonych aberracji chromosomalnych oraz wad segregacji u myszy i ludzi z różnymi schorzeniami, w tym z wielotorbielkową chorobą nerek.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Konwencjonalna metoda identyfikacji i klasyfikacji poszczególnych chromosomów opiera się na założeniu, że każdy chromosom u konkretnego gatunku posiada unikalny wzór prążkowania...

Celem niniejszej procedury jest znakowanie chromosomów za pomocą sond malujących w celu identyfikacji aberracji chromosomowych oraz defektów segregacji u myszy i ludzi z wielotorbielkowatością nerek. Jest to realizowane poprzez pobranie komórek od ludzi lub myszy i potraktowanie ich smid, a następnie utrwalenie i przygotowanie preparatów z rozrzutami metafaz na szkiełkach przedmiotowych. Następnie szkiełko poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia nadmiaru RNA i cytoplazmy, które mogłyby zakłócić proces hybrydyzacji.Proces ten przeprowadza się poprzez trawienie odpowiednio RNazami i pepsyną. Następnie wykonuje się denaturację chromosomów i sondy, a następnie hybrydyzację w celu znakowania chromosomów. Ostatnim etapem jest detekcja sondy przy użyciu barwników fluorescencyjnych.W rezultacie można uzyskać dane wykazujące anomalie liczby oraz struktury chromosomów dzięki fluorescencji, mikroskopii oraz rejestracji i analizie obrazów za pomocą oprogramowania Skyview. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne techniki zginania GIMs, jest dostarczenie dodatkowych informacji o złożonych aberracjach chromosomowych, takich jak translokacje chro

spectral-karyotyping-to-study-chromosome-abnormalities-humans-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Karyotypowanie spektralne w badaniach nad nieprawidłowościami chromosomów u ludzi i myszy z torbielowatą chorobą nerek

Opisano nowatorską metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH), która pozwala na jednoczesne badanie zmian numerycznych i strukturalnych chromosomów, w szczególności specyficznych translokacji chromosomowych związanych z białaczką i chłoniakiem, dla wszystkich 24 ludzkich chromosomów na jednym urządzeniu w ramach jednej hybrydyzacji.

Chromosomika: jednoczesne wykrywanie aberracji numerycznych i strukturalnych we wszystkich 24 chromosomach ludzkich z wykorzystaniem nowej metody FISH OctoChrome

Szlaki naprawy DNA są niezbędne do utrzymania integralności genomu oraz zapobiegania mutacjom i nowotworom. Celem tego protokołu jest ilościowe określenie niestabilności genomu poprzez bezpośrednią obserwację aberracji chromosomowych w rozprzestrzenianiu się metafazy z mysich komórek B przy użyciu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) dla powtórzeń telomerowego DNA.

Szybka analiza aberracji chromosomowych w mysich limfocytach B przez PNA-FISH

Danio pręgowany jest popularnym narzędziem do modelowania przewlekłej choroby nerek (PChN). Jednak ich niewielkie rozmiary uniemożliwiają ocenę funkcji nerek tradycyjnymi metodami. Opisujemy fluorescencyjny test usuwania nerekbarwnika 1, który umożliwia analizę ilościową funkcji nerek danio pręgowanego w PChN.

Ocena funkcji nerek danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego testu klirensu

Opisano zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu jako nieinwazyjny sposób uzyskiwania informacji fenotypowych o modelach gryzoni dla wielotorbielowatości nerek i monitorowania interwencji. W porównaniu z tradycyjnym podejściem histologicznym, obrazy MRI można uzyskać in vivo, co pozwala na długotrwałą obserwację.

Zastosowanie rezonansu magnetycznego o ultrawysokim polu w modelach wielotorbielowatości nerek u małych gryzoni do fenotypowania in vivo i monitorowania leków

Kanały jonowe wyrażane w nabłonku kanalików nerkowych odgrywają znaczącą rolę w patologii wielotorbielowatości nerek. W tym miejscu opisujemy protokoły eksperymentalne stosowane do przeprowadzania analizy patch-clamp i wewnątrzkomórkowych pomiarów poziomu wapnia w nabłonku torbielowatym świeżo wyizolowanym z nerek gryzoni.

Wdrożenie patch clampu i mikroskopii fluorescencyjnej na żywo w celu monitorowania właściwości funkcjonalnych świeżo wyizolowanego nabłonka PKD

Pierwotne rzęski wpływają na różne szlaki sygnałowe. Ślimak ssaków jest idealny do badania sygnalizacji biegunowości komórek płaskich (PCP). Dysfunkcja rzęsek wpływa na rozrost ślimaka, wzór komórkowy i orientację komórek rzęsatych, odczyty PCP. Naszym celem jest analiza sygnalizacji PCP w ślimaku myszy za pomocą analizy fenotypowej, immunohistochemii i skaningowej mikroskopii elektronowej.

Ocena fenotypów polaryzacji komórek płaskich w ślimaku myszy z mutacją ciliopatii

Niniejszy protokół opisuje przydatność wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) w identyfikacji stabilnych międzychromosomowych aberracji w komórkach szpiku kostnego myszy po ekspozycji na promieniowanie całego ciała.

Wykrywanie stabilnych aberracji międzychromosomowych za pomocą wielokrotnej fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (mFISH) i kariotypowania spektralnego (SKY) u napromieniowanych myszy

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Ten protokół demonstruje ultrasonografię robotyczną (US) jako praktyczną, opłacalną i szybką alternatywę dla tradycyjnych, nieinwazyjnych metod obrazowania.

Zastosowanie zrobotyzowanego ultrasonografu 3D do analizy in vivo nerek myszy

Opisujemy technikę, w której fragment aorty brzusznej myszy jest przeszczepiany ortotopowo tuż poniżej tętnic nerkowych u biorcy allogenicznego lub syngenicznego. Technika ta może być przydatna w badaniach, w których za korzystne uznaje się przeszczepienie dużych tętnic o jednolitym rozmiarze.

Ortotopowy przeszczep aorty u myszy do badań nad chorobami naczyniowymi

Poznaj kariotypowanie spektralne w celu identyfikacji aberracji chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielowatością nerek. Ta zaawansowana metoda cytogenetyczna pozwala wykryć złożone przestawienia niedostępne dla klasycznych technik.

Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Przeglądaj więcej filmów