Kariotypowanie spektralne w badaniu nieprawidłowości chromosomowych u ludzi i myszy z wielotorbielkowatą chorobą nerek

Celem niniejszej procedury jest znakowanie chromosomów za pomocą sond malujących w celu identyfikacji aberracji chromosomowych oraz defektów segregacji u myszy i ludzi z wielotorbielkowatością nerek. Jest to realizowane poprzez pobranie komórek od ludzi lub myszy i potraktowanie ich smid, a następnie utrwalenie i przygotowanie preparatów z rozrzutami metafaz na szkiełkach przedmiotowych. Następnie szkiełko poddaje się obróbce wstępnej w celu usunięcia nadmiaru RNA i cytoplazmy, które mogłyby zakłócić proces hybrydyzacji.

Proces ten przeprowadza się poprzez trawienie odpowiednio RNazami i pepsyną. Następnie wykonuje się denaturację chromosomów i sondy, a następnie hybrydyzację w celu znakowania chromosomów. Ostatnim etapem jest detekcja sondy przy użyciu barwników fluorescencyjnych.

W rezultacie można uzyskać dane wykazujące anomalie liczby oraz struktury chromosomów dzięki fluorescencji, mikroskopii oraz rejestracji i analizie obrazów za pomocą oprogramowania Skyview. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak klasyczne techniki zginania GIMs, jest dostarczenie dodatkowych informacji o złożonych aberracjach chromosomowych, takich jak translokacje chromosomowe oraz złożone reorganizacje chromosomowe, których nie można scharakteryzować za pomocą klasycznych technik zginania. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie wielotorbielkowatości nerek, takie jak mechanizm powstawania torbieli w nerkach.

Procedurę zaprezentuje dr Wiam Abu, przy udziale utalentowanego starszego stażysty podoktorskiego z naszego laboratorium. Należy hodować komórki śródbłonka w pożywce DMEM zawierającej 10 do 15% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny i streptomycyny w temperaturze 37 °C i przy 5% dwutlenku węgla, aż do momentu osiągnięcia przez komórki 70 do 80% konfluencji. Następnie komórki należy inkubować z roztworem Cole w końcowym stężeniu 0,05 mg/ml przez 30 do 60 minut w temperaturze 37 °C przed ich zebraniem. Aby zebrać komórki, w pierwszej kolejności należy zebrać pożywkę zawierającą wszelkie komórki pływające do sterylnych probówek wiriówkowych o pojemności 50 ml.

Przepłucz komórki na płytce sterylnym PBS raz, po inkubacji ze sterylnym tripsyną przez jedną do dwóch minut, a następnie zebrać i przenieść pozostałe komórki do tej samej probówki. Po odwirowaniu komórek przez wirowanie przy 1000 obr./min przez pięć minut, odessać większość supernatantu z probówki, pozostawiając około 0,5 ml nad osadem. Rozluźnić osad komórkowy, potrząsając probówką.

Następnie, w zależności od wielkości osadu, należy dodać od 5 do 10 ml hipertonicznego roztworu 0,56% chlorku potasu w wodzie destylowanej i inkubować zawiesinę w temperaturze 37°C przez 30 do 45 minut. Po inkubacji, za pomocą małej pipety o pojemności 1 ml, należy dodać jedną kroplę lodowatego roztworu utrwalającego na każdy 1 ml hipertonicznej zawiesiny komórkowej. Następnie należy delikatnie odwrócić probówkę, aby wymieszać zawartość, a potem odwirować komórki przez 5 minut przy prędkości 1 200 obr./min.

Odssać nadsącz w sposób opisany wcześniej. Następnie powoli dodać 1 mL świeżego roztworu utrwalającego, delikatnie wstrząsając probówką w celu resuspensji osadu. Następnie ostrożnie dodać kolejne 4 mL utrwalacza, kierując strumień cieczy na ściankę probówki.

Ta procedura jest kluczowa, aby zapobiec uwięzieniu preparatów metafaz w grudkach komórkowych. Po powtórzeniu etapu wirowania i odessaniu supernatantu, należy uzupełnić pięć do 10 ml utrwalacza, powoli pipetując go po ściankach probówki. Na tym etapie komórki mogą być przechowywane w szczelnie zamkniętej probówce w temperaturze -20 °C przez krótki czas lub w temperaturze -80 °C w przypadku przechowywania długoterminowego do momentu rozpoczęcia dalszych prac.

Po przygotowaniu do dalszych czynności należy sprawdzić liczbę chromosomów w metafazie w preparacie komórkowym. Oczyścić szkiełko w bezwodnym etanolu. Następnie zanurzyć szkiełko w wodzie destylowanej około 10 razy, aby utworzyć na jego powierzchni warstwę ochronną z wody, położyć szkiełko na szklanej płycie i nanieść 15 do 20 µL zawiesiny komórkowej z wysokości około 10 cali nad szkiełkiem.

Umieść preparat w łaźni wodnej ustawionej na 65 do 70 °C na jedną do dwóch minut, a następnie pozostaw do wyschnięcia. Sprawdź preparat pod mikroskopem świetlnym, używając suchych obiektywów 10x i 40x. Upewnij się, że obecne są chromosomy w metafazie i że preparaty są równomiernie rozłożone. Sprawdź cytoplazmę otaczającą chromosomy.

Jeśli obecna jest cytoplazma, tak jak pokazano tutaj, należy przystąpić do przygotowania preparatu. Jeśli cytoplazma nie występuje, a chromosomy mają dobrą morfologię, przygotowanie preparatu nie jest konieczne; w przeciwnym razie nanieść 120 µl świeżo przygotowanego roztworu RNazy o stężeniu 20 mg/mL w 2x SSC na szkiełko cover glass o wymiarach 24 mm na 60 mm.

Odwróć preparat z metafazą powierzchnią skierowaną w dół na szkiełko nakrywkowe. Następnie ostrożnie odwróć preparat z metafazą powierzchnią do góry. Umieść preparat w komorze wilgotnościowej i inkubuj w temperaturze 37 degrees Celsius przez 45 minut.

Po upływie czasu inkubacji ostrożnie zdejmij szkiełko nakrywki, uważając, aby nie porysować preparasu, a następnie przemyj preparat dwukrotnie buforem 2×SSC w naczyniu do sprzęgania, trzykrotnie przez pięć minut przy każdym myciu, potrząsając naczyniem. W międzyczasie dodaj od 5 do 15 µL pepsyny o stężeniu 100 mg/mL w wodzie destylowanej do czystego zlewka, a następnie dodaj 100 mL 0,01 M kwasu solnego, uprzednio podgrzanego do 37 °C. Ważne jest, aby najpierw dodać pepsynę do czystego zlewka, w przeciwnym razie nie rozpuści się ona.

Przenieś ten roztwór do naczynia Coplan. Inkubuj slajd do płukania w naczyniu sprzęgającym w temperaturze 37 °C nie dłużej niż od trzech do pięciu minut po trawieniu. Przepłucz slajd dwukrotnie w naczyniu Copin zawierającym 1x PBS przez pięć minut każdego z płukań, potrząsając naczyniem.

Następnie przeprowadź pięciominutowe płukanie w naczyniu Copina zawierającym PBS uzupełniony o chlorek magnezu. Po tym wykonaj 10-minutową inkubację w naczyniu Copina zawierającym 1% formaldehydu, a następnie końcowe płukanie w naczyniu Copina zawierającym 1x PBS przez pięć minut. Następnie odwodnij preparaty w naczyniach Copina zawierających serię etanolu o stężeniach 70%, 80% i 100% przez dwie minuty dla każdego stężenia, a na koniec wysusz na powietrzu.

Obejrzyj preparat pod mikroskopem świetlnym przy użyciu suchego obiektywu o powiększeniu 40x, aby upewnić się, że preparaty zostały prawidłowo strawione, że nie występuje cytoplazma, a morfologia chromosomów została zachowana. Na koniec zaznacz obszar do hybrydyzacji za pomocą pisaka diamentowego. Po świeżym przygotowaniu roztworu denaturującego umieść go w naczyniu Copina i podgrzej wstępnie do 70 °C w łaźni wodnej.

Następnie umieść preparat w słoiku Cochin zawierającym podgrzany roztwór denaturujący w kąpieli wodnej o temperaturze 70 °C na okres od 30 sekund do jednej minuty. Po inkubacji niezwłocznie przenieś preparat do lodowatego 70% etanolu na trzy minuty, a następnie do 80% i 100% etanolu na trzy minuty każdego z nich, po czym pozostaw do wyschnięcia na powietrzu. Zbadaj preparat pod kątem morfologii chromosomów, zwracając uwagę na obecność ciemnych chromosomów, które nie wydają się blade ani błyszczące.

Oznacza prawidłowy chromosom lub morfologię. Podgrzać barwnik. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 20 minut.

Następnie wymieszaj na wortexie i krótko odwiruj przy 1000 obr./min przez kilka minut. Denaturuj sondę w termocyklerze w temperaturze 85°C przez pięć minut, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C. Nałóż 10 µL zdenaturowanej sondy na obszar hybrydyzacji i przykryj szkiełkiem podstawowym o wymiarach 22 mm na 40 mm na jedną godzinę.

Upewniając się, że nie uwięziono pęcherzyków powietrza, należy uszczelnić krawędzie szkiełka podstawowego cementem gumowym, a następnie inkubować w komorze wilgotnościowej w temperaturze 37 °C przez 48 do 72 godzin. Ostrożnie zdjąć szkiełko zakrywające i umieścić preparat w naczyniu do sprzęgania zawierającym świeżo przygotowany roztwór piorący, uprzednio ogrzany do 45 °C. Płukać przez pięć minut, trzykrotnie w temperaturze 45 °C, w wytrząsanej łaźni wodnej przy 45 obr./min.

Następnie przemyj preparaty dwa razy w roztworze piorącym dwa w temperaturze 45°C przez pięć minut przy każdym myciu z wytrząsaniem, a następnie przez pięć minut w roztworze piorącym trzy w temperaturze 45°C z wytrząsaniem. Następnie nanieś 80 µL odczynnika blokującego. Po tym nałóż szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut.

Zdejmij szkiełko nakrywkę i pozwól cieczy spłynąć. Nanieś 80 µL odczynnika barwiącego sci-fi. Nałóż szkiełko nakrywkowe i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 40 minut. Po inkubacji przemyj preparat roztworem płuczącym three of w temperaturze 45 °C przez pięć minut, powtarzając czynność trzykrotnie przy jednoczesnym wstrząsaniu.

Następnie nanieś 80 µL odczynnika barwiącego PS 5.5. Nałóż szkiełko nakrywki i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 40 minut; po inkubacji przemyj trzykrotnie roztworem płuczącym trzy, analogicznie jak wcześniej. Na koniec przechyl preparat i pozwól cieczy spłynąć.

Nanieś 20 µL odczynnika Antifa dappy i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywki o wymiarach 24 mm na 60 mm, usuwając pęcherzyki powietrza, które mogły powstać. Preparaty można obrazować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności nie dłużej niż przez jeden tydzień. Powyższy obraz prawidłowego rozprzestrzenienia metafazy myszy typu dzikiego został wykonany przy użyciu mikroskopu Olympus wyposażonego w obiektyw imersyjny 60x.

Niestandardowy potrójny filtr pasmowo-przepustowy, znany jako kostka spektralna, filtr dappy oraz moduł interferometru sac z kamerą CCD. Kariotypy spektralne wykonano przy użyciu oprogramowania skyview. Górny lewy panel przedstawia znakowany rozprzestrzenie metafazowe, a górny prawy panel obraz rozprzestrzenienia w jasnym polu.

Dolny panel przedstawia chromosomy uporządkowane rosnąco przy użyciu oprogramowania skyview. Ten obraz SKY preparatu metafazy pochodzącego od myszy z homozygotycznym nokautem pkd one wykazuje nieprawidłową liczbę chromosomów, gdzie obecnych jest 68 chromosomów zamiast 40. Widoczne są również aberracje chromosomowe, takie jak delecja chromosomu 8 oraz translokacje, na przykład między chromosomami 5 i 16, a także między chromosomami 11 i 19.

Ten obraz SKY preparatu metafazy chromosomów ludzkich z tkanki naczyniowej pacjenta bez A-D-P-K-D wykazuje prawidłowy żeński kariotyp składający się z 44 autosomów i dwóch chromosomów XXX. Ten końcowy obraz SKY przedstawia preparat metafazy z tkanki naczyniowej pacjenta z A-D-P-K-D z nieprawidłowym kariotypem obejmującym 88 autosomów i cztery chromosomy płci XXXX. Jeden master.

Technikę tę można przeprowadzić w ciągu pięciu dni, jeśli zostanie ona wykonana prawidłowo.