Name: Wbudowana izotacofoforeza do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Poznaj izotachoforezę (ITP) do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych w mikrofluidyce. Technika umożliwia prekoncentrację analitów, ekstrakcję DNA/RNA oraz detekcję aminokwasów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Z wdzięcznością potwierdzamy finansowanie z funduszy DARPA w ramach centrum Micro/Nano Fluidics Fundamentals Focus (MF3) na podstawie umowy nr N66001-10-1-4003 oraz z grantu DARPA nr N660001-09-C-2082.

<ol><li>Jung, B., Bharadwaj, R., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+millionfold+sample+stacking+using+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">On-chip millionfold sample stacking using transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 78 (7), 2319-2319 (2006).</li>
<li>Jung, B., Zhu, Y., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+100+am+fluorophores+using+a+high-sensitivity+on-chip+CE+system+and+transient+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Detection of 100 am fluorophores using a high-sensitivity on-chip CE system and transient isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 79 (1), 345-345 (2007).</li>
<li>Everaerts, F. M., Beckers, J. L., Verheggen, T. P. E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotachophoresis%3A+Theory%2C+instrumentation%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Elsevier+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Isotachophoresis: Theory, instrumentation, and applications.</a> Elsevier Science & Technology. , (1976).</li>
<li>Khurana, T. K., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preconcentration%2C+separation%2C+and+indirect+detection+of+nonfluorescent+analytes+using+fluorescent+mobility+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Preconcentration, separation, and indirect detection of nonfluorescent analytes using fluorescent mobility markers.</a> Anal. Chem. 80 (1), 279-279 (2008).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Backhouse, C. J., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+carrier+ampholytes+assay+for+portable%2C+label-free+detection+of+chemical+toxins+in+tap+water%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent carrier ampholytes assay for portable, label-free detection of chemical toxins in tap water.</a> Anal. Chem. 82 (5), 1858-1858 (2010).</li>
<li>Bercovici, M., Kaigala, G. V., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+analyte+identification+using+isotachophoresis+and+a+fluorescent+carrier+ampholyte+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Method for analyte identification using isotachophoresis and a fluorescent carrier ampholyte assay.</a> Anal. Chem. 82 (5), 2134-2134 (2010).</li>
<li>Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+system+for+isotachophoresis+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Miniaturized system for isotachophoresis assays.</a> Lab Chip. 10 (17), 2242-2242 (2010).</li>
<li>Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+quantification+of+isotachophoresis+zones+using+nonfocusing+fluorescent+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging and quantification of isotachophoresis zones using nonfocusing fluorescent tracers.</a> Anal. Chem. 81 (8), 3022-3022 (2009).</li>
<li>Schoch, R. B., Ronaghi, M., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+extraction%2C+isolation%2C+preconcentration%2C+and+quantitation+of+small+RNAs+from+cell+lysate+using+on-chip+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective extraction, isolation, preconcentration, and quantitation of small RNAs from cell lysate using on-chip isotachophoresis.</a> Lab Chip. 9 (15), 2145-2145 (2009).</li>
<li>Persat, A., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+from+whole+blood+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids from whole blood using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 81 (22), 9507-9507 (2009).</li>
<li>Bercovici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+urinary+tract+infections+using+isotachophoresis+and+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of urinary tract infections using isotachophoresis and molecular beacons.</a> Anal. Chem. 83 (11), 4110-4110 (2011).</li>
<li>Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+malaria-infected+erythrocytes+using+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from malaria-infected erythrocytes using isotachophoresis.</a> Anal. Chem. 83 (24), 9715-9715 (2011).</li>
<li>Persat, A., Chambers, R. D., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+principles+of+electrolyte+chemistry+for+microfluidic+electrokinetics.+Part+I%3A+Acid-base+equilibria+and+pH+buffers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Basic principles of electrolyte chemistry for microfluidic electrokinetics. Part I: Acid-base equilibria and pH buffers.</a> Lab Chip. 9 (17), 2437-2437 (2009).</li>
<li>Garcia-Schwarz, G., Bercovici, M., Marshall, L. A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+dispersion+in+isotachophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Fluid+Mech%22%5BJournal%5D)">Sample dispersion in isotachophoresis.</a> J. Fluid Mech. 1 (1), 1-1 (2011).</li>
<li>Kohlrausch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%C3%9Cber+concentrations-verschiebungen+durch+electrolyse+im+inneren+von+l%C3%96sungen+und+l%C3%96sungsgemischen%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Phys%22%5BJournal%5D)">Über concentrations-verschiebungen durch electrolyse im inneren von lÖsungen und lÖsungsgemischen.</a> Ann. Phys. 298 (10), 209-209 (1897).</li>
<li>Alberty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moving+boundary+systems+formed+by+weak+electrolytes.+Theory+of+simple+systems+formed+by+weak+acids+and+bases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Moving boundary systems formed by weak electrolytes. Theory of simple systems formed by weak acids and bases.</a> J. Am. Chem. Soc. 72 (6), 2361-2361 (1950).</li>
<li>Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiphasic+zone+electrophoresis.+I.+Steady-state+moving-boundary+systems+formed+by+different+electrolyte+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Multiphasic zone electrophoresis. I. Steady-state moving-boundary systems formed by different electrolyte combinations.</a> Biochem. 12 (5), 871-871 (1973).</li>
<li>Persat, A., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+profiling+by+simultaneous+selective+isotachophoresis+and+hybridization+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">MicroRNA profiling by simultaneous selective isotachophoresis and hybridization with molecular beacons.</a> Anal. Chem. , (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Metody ITP przedstawione w niniejszej pracy umożliwiają szybką, czułą i stabilną detekcję oraz manipulację cząsteczkami jonowymi. Głównym wyzwaniem w zastosowaniu ITP jest właściwy dobór buforów LE i TE. W anionowym ITP zazwyczaj wybieramy chlorek jako anion wiodący, ponieważ jest on silnym kwasem o bardzo wysokiej mobilności bezwzględnej, a zatem posiada bardzo przewidywalne właściwości. W związku z tym dobór bufora w anionowym ITP sprowadza się zazwyczaj do wyboru odpowiedniego TE i przeciwjonu. W eksperymentach z selektywnym ogniskowaniem wybór TE jest krytyczny dla wyeliminowania jonów zanieczyszczających. W zastosowaniach, w których nie występują zanieczyszczenia, niższa mobilność efektywna TE prowadzi do szybszego tempa ogniskowania. Zalecamy stosowanie następujących, stosunkowo stabilnych anionowych jonów TE: MES, MOPS, HEPES, tricine. Wybór przeciwjonu wpływa zarówno na pH układu, jak i na mobilność efektywną TE. Typowymi przeciwjonami są tris (pKa 8,1) i bis-tris (pKa 6,4). W przypadku analiz wymagających niższego lub wyższego pH zalecamy odpowiednio pirydynę (pKa 5,25) i etanolaminę (pKa 9,5). W Tabelach 1 i 2, odpowiednio dla anionowego i kationowego ITP, podsumowujemy kilka przydatnych przykładów buforów. Przyjmujemy HCl jako anionowy jon LE oraz sód jako kationowy jon LE, zakładając 100 mM mocno jonową bufora LE.
Czytelnik zauważy, że siła jonowa buforu w naszych protokołach (oraz w Tabelach 1–2) jest zawsze większa lub równa 10 mM. Chociaż teoretycznie fizyka ITP ma zastosowanie przy sile jonowej niższej niż 10 mM, naturalne zanieczyszczenia (np. kwas węglowy powstający w reakcji wody z dwutlenkiem węgla z atmosfery) na poziomie bliskim 1 mM często ograniczają praktyczne zastosowanie buforów o niskiej sile jonowej. 
 Zauważamy, że mechanizm transdukcji sygnału nie ogranicza się do analiz przedstawionych w niniejszym protokole. Jak krótko omówiono w Części 5, w trybie plateau oczyszczone strefy można wykrywać poprzez zmiany lokalnej przewodności, absorbancji UV, temperatury lub współczynnika załamania światła. W naszej grupie opracowaliśmy metodę wykorzystującą fluorescencyjne amfolity nośnikowe do czułego wykrywania i identyfikacji nieznanych analitów.5 W eksperymentach w trybie peak do znakowania sfokusowanych analitów można użyć specyficznych sond. W jednym z przykładów stosujemy molekularne latarnie (molecular beacons) – sondy oligonukleotydowe, które fluorescują po hybrydyzacji z sekwencją docelową – aby z wysoką specyficznością wykrywać docelowe cząsteczki DNA lub RNA.11,18
Choć ITP jest stosunkowo odporne na dyspersję spowodowaną przepływem wymuszonym ciśnieniem oraz EOF, nadmierny EOF może prowadzić do stagnacji interfejsu ITP w punkcie, w którym średnia prędkość EOF staje się równa prędkości ITP.14 Tak silny EOF występuje szczególnie w warunkach wysokiego pH i niskiej siły jonowej. Z tego powodu zalecamy stosowanie buforów o pH 8 lub niższym i sile jonowej rzędu 100 mM, jeśli jest to możliwe. Według naszego doświadczenia PVP jest najskuteczniejszą powłoką do tłumienia EOF w chipach borokrzemianowych. Jednak ze względu na właściwości przesiewające, PVP może być niewłaściwe dla niektórych zastosowań, takich jak ogniskowanie genomowego DNA. W eksperymentach obserwujemy, że dodanie PVP może znacznie zredukować bezwzględną mobilność genomowego DNA (do stopnia, w którym nie ulega ono ogniskowaniu). W takich przypadkach powłoka silanolowa, taka jak Sigmacote, w połączeniu z surfaktantem (np. Triton-X 100), może również być skuteczna w redukcji EOF.10
<table border="1">
<tbody>
<tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td colspan="4">Anion TE (pKa -1)</td>
</tr>
<tr>
 <td>Buforujący przeciwjon (pKa +1)</td>
 <td>MES (6.10)</td>
 <td>MOPS (7.20)</td>
 <td>HEPES (7.50)</td>
 <td>tricyna (8.15)</td>
</tr>
<tr>
 <td>etanolamina (9.50)</td>
 <td>21.41</td>
 <td>20.40</td>
 <td>17.38</td>
 <td>22.85</td>
</tr>
<tr>
 <td>tris (8.08)</td>
 <td>21.00</td>
 <td>19.23</td>
 <td>15.84</td>
 <td>17.56</td>
</tr>
<tr>
 <td>bis-tris (6.40)</td>
 <td>18.22</td>
 <td>10.41</td>
 <td>7.30</td>
 <td>5.23</td>
</tr>
<tr>
 <td>pirydyna (5.18)</td>
 <td>1.01</td>
 <td>3.72</td>
 <td>2.42</td>
 <td>1.48</td>
</tr>
</tbody>
</table> 
Tabela 1. Wielkość ruchomości efektywnej (× 10-9 m2/V/s) dostrojonej strefy czystego anality w anionowej ITP, gdzie LE to 100 mM HCl i 200 mM buforowego przeciwjonu. 
<table border="1"> 
<tbody>
<tr>
 <td>&nbsp;</td>
 <td colspan="4">Kation TE (pKa +1)</td>
</tr>
<tr>
 <td>Buforowy przeciwjon (pKa&nbsp;-1)</td>
 <td>etanolamina (9,50)</td>
 <td>tris (8,08)</td>
 <td>bis-tris (6,40)</td>
 <td>pirydyna (5,18)</td>
 </tr>
<tr>
 <td>MES (6,10)</td>
 <td>35,57</td>
 <td>21,96</td>
 <td>16,39</td>
 <td>10,45</td>
</tr>
<tr>
 <td>MOPS (7,20)</td>
 <td>35,47</td>
 <td>20,92</td>
 <td>9,76</td>
 <td>3,93</td>
</tr>
<tr>
 <td>HEPES (7,50)</td>
 <td>35,35</td>
 <td>19,97</td>
 <td>7,77</td>
 <td>2,88</td>
</tr>
<tr>
 <td>Tricyna (8,15)</td>
 <td>34,77</td>
 <td>16,72</td>
 <td>4,50</td>
 <td>1,44</td>
</tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 2. Wartość ruchomości efektywnej (× 10-9 m2/V/s) skorygowanej strefy czystego anality w kationowej ITP, gdzie LE to 100 mM sodu i 200 mM buforującego przeciwjonu.

<table><tbody><tr><td>Woda destylowana</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10977</td><td>Wolna od RNazy/DNazy</td></tr><tr><td>Clorox Ultra</td><td>Clorox</td><td>02489CT</td><td></td></tr><tr><td>wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7708</td><td></td></tr><tr><td>kwas solny (HCl)</td><td>EMD Millipore</td><td>HX0603-4</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>poliwinylobutyral (PVP)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>06067</td><td>MW 1,000,000</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-4034</td><td></td></tr><tr><td>Kwas karboksylowy Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>tricyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9784</td><td></td></tr><tr><td>bis-tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4429</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green II</td><td>Invitrogen</td><td>S7564</td><td></td></tr><tr><td>etanolamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411000</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 6G</td><td>Acros Organics</td><td>CAS 989-38-8</td><td></td></tr><tr><td>L-aminokwasy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Power&lt;/em&gt; SYBR Green RNA-to-C&lt;sub&gt;T&lt;/sub&gt; &lt;em&gt;1-Step Kit&lt;/em&gt;</td><td>Applied Biosystems</td><td>4389986</td><td></td></tr><tr><td>Startery PCR</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borokrzemianowy chip mikroprzepływowy</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>NS12A</td><td>Dostarczany z plastikowym uchwytem lub bez niego</td></tr><tr><td>Pompa próżniowa</td><td>Gast Manufacturing, Inc.</td><td>DOA-P104-AA</td><td></td></tr><tr><td>Sourcemeter</td><td>Keithley</td><td>2410</td><td>Tryby pracy ze stałym prądem i stałym napięciem</td></tr><tr><td>Odwrócony mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX70</td><td>Do oświetlenia należy użyć lampy rtęciowej (Olympus) lub LED (Thorlabs)</td></tr><tr><td>Kostka filtrująca</td><td>Omega Engineering, Inc.</td><td>XF115-2</td><td>Wzbudzenie/emisja: niebieski/zielony</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi z blokadą Safe-lock</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td>Pojemność 1.5mL</td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5417C</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Tabela 3.&lt;/strong&gt; Specyficzne odczynniki i sprzęt.</td></tr></tbody></table>

izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

On-chip Isotachophoresis for Separation of Ions and Purification of Nucleic Acids

Techniki elektrokinetyczne są podstawą zastosowań w mikroskali ze względu na ich wyjątkową zdolność do przeprowadzania różnorodnych procesów fluidycznych i elektroforetycznych w prostych, kompaktowych systemach bez ruchomych części. Izotachoforeza (ITP) jest prostą i bardzo niezawodną techniką elektrokinetyczną, która pozwala na milionkrotną prekonecentrację1,2 oraz wydajne rozdzielanie i ekstrakcję w oparciu o ruchliwość jonową.3 Na przykład zademonstrowaliśmy zastosowanie ITP do rozdzielania i czułego wykrywania nieoznakowanych cząsteczek jonowych (np. toksyn, DNA, rRNA, miRNA) przy niewielkim przygotowaniu próbki lub całkowicie bez niego4-8, a także do ekstrakcji i oczyszczania kwasów nukleinowych z złożonych matryc, w tym z kultur komórkowych, moczu i krwi.9-12
ITP umożliwia ogniskowanie i rozdział dzięki zastosowaniu pola elektrycznego oraz dwóch buforów w obrębie mikroprzepływowego układu kanałów. W przypadku analitów anionowych bufor elektrolitu prowadzącego (LE) jest dobierany tak, aby jego aniony miały wyższą efektywną ruchomość elektroforetyczną niż aniony buforu elektrolitu podążającego (TE) (ruchomość efektywna opisuje obserwowalną prędkość dryfu jonu i uwzględnia stan jonizacji jonu, co zostało szczegółowo opisane przez Persat et al.13). Po utworzeniu granicy między TE a LE przyłożone zostaje pole elektryczne w taki sposób, aby jony LE przemieszczały się z dala od obszaru zajmowanego przez jony TE. Jony próbki o pośredniej ruchomości efektywnej wyprzedzają jony TE, ale nie mogą wyprzedzić jonów LE, w związku z czym ogniskują się na granicy LE-TE (zwanej dalej „granicą ITP”). Ponadto TE i LE tworzą obszary odpowiednio niskiej i wysokiej przewodności, co generuje stromy gradient pola elektrycznego na granicy ITP. Gradient ten powoduje prekondensację składników próbki podczas ich ogniskowania. Odpowiedni dobór TE i LE pozwala na ogniskowanie i oczyszczanie docelowych składników z innych składników nieogniskowanych, a w konsekwencji na rozdział i segregację składników próbki.
W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne leżące u podstaw ITP oraz dyskutujemy dwa standardowe tryby pracy: tryb „szczytowy” (peak) oraz tryb „płaskowyżowy” (plateau). W trybie szczytowym stosunkowo rozcieńczone jony próbki ogniskują się wspólnie w nakładających się na siebie wąskich szczytach na interfejsie ITP. W trybie płaskowyżowym jony próbki występujące w większej ilości osiągają stężenie stanu stacjonarnego i rozdzielają się na sąsiadujące strefy o charakterze płaskowyżu, uporządkowane według ich ruchomości efektywnej. Tryby szczytowy i płaskowyżowy wynikają z tych samych podstaw fizycznych, ale reprezentują odmienne reżimy, które różnią się początkowym stężeniem analitytu i/lub czasem przeznaczonym na akumulację próbki.
W pierwszej kolejności szczegółowo opisujemy modelowy eksperyment w trybie szczytowym (peak mode), a następnie prezentujemy analizę w tym trybie służącą do ekstrakcji kwasów nukleinowych z hodowli komórkowej E. coli. Na koniec przedstawiamy analizę w trybie plateau, w której wykorzystujemy gatunek nieogniskującego znacznika (NFT) do wizualizacji rozdziału oraz przeprowadzenia ilościowego oznaczenia aminokwasów.

Izotachforeza (ITP) jest wydajną elektrokinetyczną techniką rozdziału i prekonecentracji, znajdującą zastosowanie w wielu obszarach, od detekcji toksyn po przygotowanie próbek. W niniejszym opracowaniu omawiamy zasady fizyczne ITP oraz metodologię zastosowania tej techniki w dwóch konkretnych przykładach: rozdziału i detekcji małych cząsteczek oraz oczyszczaniu kwasów nukleowych z lizatu kultur komórkowych.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Techniki elektrokinetyczne stanowią podstawę zastosowań w mikroskali ze względu na ich unikalną zdolność do przeprowadzania różnorodnych procesów fluidycznych i elektroforetycznych ...

Ogólnym celem tego filmu jest przedstawienie elektrokinetycznej techniki zwanej izotacherezą, w skrócie ITP, oraz jej zastosowań mikroprzepływowych w czułej detekcji i rozdziałie jonów. W pierwszej kolejności omówiono zasady fizyczne leżące u podstaw ITP oraz dwa standardowe tryby pracy, mianowicie tryb piku oraz tryb plateau. Następnie zaprezentowano ITP na chipie w trzech eksperymentach, zaczynając od prostego protokołu wstępnego zagęszczania próbki, w którym fluorofory są wykrywane poprzez ich ogniskowanie w ostrym piku. Po drugie, pokazano test ITP wykorzystywany do przygotowania próbki na chipie, w którym DNA i RNA są selektywnie ekstrahowane z lizatu komórek bakteryjnych.Na koniec, do oczyszczania i oznaczania ilościowego aminokwasów z wykorzystaniem ITP w trybie plateau zastosowano analizę detekcyjną bez użycia znaczników. Ostatecznie za pomocą ITP można osiągnąć oczyszczanie aminokwasów, wstępne zagęszczenie analitycznych składników oraz selektywną ekstrakcję kwasów nukleinowych. Dzisiaj przedstawimy Państwu podstawy fizyczne oraz metodologię wszechstronnej techniki elektrokinetycznej zwanej izotaforezą.Nasza grupa opracowała pionierskie metody ITP w zakresie detekcji bez znaczników, przygotowania próbek oraz szybkich testów hybrydyzacyjnych. Przedstawimy trzy reprezentatywne analizy, które demonstrują zdolność ITP do wstępnego zagęszczania analitów, ekstrakcji kwasów litycznych oraz oczyszczania i detekcji aminokwasów. Analizy te podkreślają wszechstronność ITP i prezentują proste kroki niezbędne do zapewnienia powtarzalności eksperymentów.W laboratorium. W próbce ITP jony skupiają się selektywnie na granicy między elektrolitem wiodącym a podążającym, odpowiednio w skrócie LE i TE. Jony próbki przemieszczają się przez mikrokanał ze stałą prędkością, która jest określona przez prędkość jonów wiodących.Jony próbki ulegają ogniskowaniu, jeśli ich efektywna ruchomość elektroforetyczna mieści się w przedziale wyznaczonym przez ruchomość jonów LE i TE, gdzie ruchomość definiuje się jako stosunek prędkości dryfu jonów do lokalnego pola elektrycznego. Jony próbki zmieszane z TE poruszają się szybciej niż otaczające je jony TE i w związku z tym gromadzą się na granicy faz LE-TE. Co więcej, granica ITP jest samoostrzona: jony LE, które mogą dyfundować do strefy TE, doświadczają silnego strumienia przywracającego i wracają do strefy wiodącej. To samo dotyczy jonów TE w strefie LE.Właściwości samowyostrzania i ogniskowania I two P przyczyniają się do solidności tej techniki i czynią ją niewrażliwą na zakłócenia na granicy faz, takie jak przepływ wymuszony ciśnieniem. W trybie szczytowym stężenia jonów próbki są znacznie niższe niż stężenia jonów LE i TE. W związku z tym jony próbki wnoszą pomijalny wkład w lokalną przewodność w tych warunkach.W obszarze interfejsu ITP często dochodzi do nakładania się pików wielu ognisk analityków. W pewnym momencie jony próbki mogą osiągnąć wystarczająco wysokie stężenie, aby rozdzielić się i skupić w trybie plateau. W trybie plateau jony próbki rozdzielają się i oczyszczają w strefy o lokalnie jednorodnym i stałym stężeniu, w kolejności wyznaczonej przez ich ruchliwość elektroforetyczną.Jony w trybie plateau określają lokalną przewodność. Bardzo rozcieńczone jony mogą nadal skupiać się w trybie szczytowym pomiędzy strefami plateau. W analizach przedstawionych w niniejszym protokole zastosowano mikrofluidyczny chip szklany z kanałami w układzie krzyżowym, wytrawiony izotropowo metodą trawienia mokrego.ITP można jednak przeprowadzać również w prostych kanałach lub kapilarach bez przecięć i połączeń. Przed przystąpieniem do eksperymentów należy przeprowadzić następującą procedurę czyszczenia, aby zapewnić powtarzalność wyników oraz pomyślne zastosowanie powłok dynamicznych używanych do tłumienia przepływu elektroosmotycznego. Aby odkazić kanał, należy napełnić zbiorniki północny, wschodni i południowy od 10 do 20 µL 10% roztworu wybielacza.W przypadku korzystania ze standardowego uchwytu na chipy typu caliper, należy przymocować szeroki koniec końcówki do pipety 200 µL do zachodniego zbiornika chipa, a linię próżni podłączyć do rurki o średnicy wewnętrznej 2 mm. Próżnię należy stosować przez dwie minuty, a następnie opróżnić zbiorniki i dokładnie je oczyścić, wypełniając je wodą dejonizowaną i opróżniając za pomocą linii próżni. Płukanie wodą DI należy powtórzyć kilkakrotnie.Powtórz ten proces z użyciem jednego molowego wodorotlenku sodu. Powierzchnie kanałów zostaną lekko wytrawione, co zapewni czystą powierzchnię borokrzemianową, pomagając uzyskać jednorodne właściwości powierzchniowe. Oczyść zbiorniki wodą DI, a następnie przepłucz kanały za pomocą le.W tym czasie właściwości powierzchniowe i powłoki dynamiczne w kanałach ulegną wyrównaniu. Aby rozpocząć eksperyment, należy przygotować jeden mililitr elektrolitu wiodącego i jeden mililitr elektrolitu podążającego. Następnie wymieszaj 90 µL TE z 10 µL roztworu o stężeniu jeden mikromolar.Alexa Fluor 488. Po wypłukaniu z LE opróżnij zachodni zbiornik i kilkukrotnie przepłucz go wodą di, aby silnie rozcieńczyć pozostałe w nim LE. Na koniec napełnij ten zbiornik 20 µL buforu TE zawierającego barwnik.Umieść elektrodę dodatnią w zbiorniku wschodnim, a elektrodę uziemiającą lub ujemną w zbiorniku zachodnim i przyłóż stały prąd o natężeniu dwóch mikroamperów. Piki próbek będą migrować ze stałą prędkością, a napięcie między zbiornikami będzie rosło w miarę napełniania się TE o niższej przewodności. Kwasy nukleinowe z nieoczyszczonego lizatu komórkowego można oczyścić za pomocą ITP, wybierając anion towarzyszący o module ruchliwości elektroforetycznej niższym niż docelowy kwas nukleinowy, ale wyższym niż w przypadku jonowych inhibitorów PCR.Inhibitory cząsteczki PCR migrują w przeciwnym kierunku, w związku z czym również pozostają w osadzie. Aby rozpocząć proces, resuspenduj pellet komórek E. coli zawierający 10⁸ jednostek tworzących kolonie w 80 µL wody wolnej od RNaz, dodaj 10 µL środka litycznego, delikatnie wymieszaj i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po inkubacji dodaj 10 µL 1 M wodorotlenku sodu, aby podnieść pH lizatu do około 12,5. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aż stanie się on klarowny, co oznacza zakończenie procesu lizy.Następnie dodaj 10 µL lizatu do 90 µL 50 mM Racine i 100 mM bis triss. Roztwór ten może teraz służyć jako te. Przygotuj również 1 mL LE zawierającego barwnik Cyber Green zgodnie z opisem w protokole pisemnym; użyj LE do napełnienia chipa mikrofluidycznego, tak jak pokazano wcześniej. Po płukaniu zastąp zawartość zbiornika wschodniego substancją kompatybilną z PCR.Opłucz zachodni zbiornik wodą DI i napełnij go 20 µL te. Przyłóż 1000 V pomiędzy zbiornikami wschodnim i zachodnim, aby rozpocząć eksperyment. Natężenie prądu pomiędzy tymi zbiornikami spadnie pod koniec eksperymentu.Próbka eluuje do zbiornika LA wraz z tym roztworem. Natężenie prądu w funkcji czasu dla układu zazwyczaj osiąga wartość plateau. Delikatnie wymieszaj zawartość zbiornika, kilkukrotnie zasysając i wypuszczając ciecz pipetą.Następnie pobierz objętość 5 µL do analizy ilościowej za pomocą qRT-PCR. Metodę R-T-P-C-R-I-T-P można również wykorzystać do oddzielania i koncentrowania małych jonów na sąsiadujących i wykrywalnych płaskowyżach pomiędzy TE a LE, co umożliwia detekcję opartą na wykazanych właściwościach fizykochemicznych. Poniżej przedstawiono test z niekoncentrującym znacznikiem, w którym do LE dodano fluorescencyjny gatunek jonowy.Gatunek fluorescencyjny nie ulega ogniskowaniu, lecz jego stężenie dostosowuje się do lokalnego pola elektrycznego, co umożliwia wizualizację oczyszczonych stref plateau. Należy rozpocząć od przygotowania jednego mililitra elektrolitu wiodącego zawierającego kationowy Fluor four rod Domine six G oraz jednego mililitra elektrolitu podążającego. Następnie należy połączyć 90 µL TE z 10 µL 50 mM argininy oraz 10 µL 50 mM lizyny w celu przygotowania próbki do iniekcji skończonej.Nanieś 20 µL Ellie do zbiorników zachodniego i północnego oraz próbkę aminokwasu do zbiornika wschodniego. Następnie przyłóż podciśnienie do zbiornika południowego przez jedną minutę. Po wypłukaniu zbiornika wschodniego wodą dejonizowaną, zastąp jego zawartość buforem TE.W końcowym kroku, w eksperymentach w trybie szczytowym z wykorzystaniem fluorescencyjnego reportera Alexa Fluor 4 88, przyłóż napięcie 500 volt między rezerwuarem wschodnim a zachodnim. Całkowitą intensywność fluorescencji można zintegrować i porównać z krzywą kalibracyjną w celu uzyskania ilościowego stężenia. Przedstawione tutaj informacje dotyczą eksperymentów przeprowadzonych w zakresie zastosowanych prądów, ujawniających tę próbkę.Szerokość piku jest odwrotnie proporcjonalna do natężenia prądu. Jest to przykład ekstrakcji kwasów nukleinowych z lizatu całych komórek z zastosowaniem ITP w trybie piku. Pik ITP dla całkowitej zawartości kwasów nukleinowych często przyjmuje nieidealny kształt.W eksperymentach z ekstrakcji kwasów nukleinowych próbka jest eluowana do zbiornika LE, a następnie pobierana pipetą do analizy za pomocą ilościowej R-T-P-C-R w celu uzyskania wyników ilościowej transkrypcji odwrotnej. PCR potwierdza pomyślne oczyszczenie 16 s RNA rybosomalnego oraz 16 s DNA rybosomalnego z kultury bakteryjnej; wartości progowe cykli dla 16 s RNA rybosomalnego i 16 s DNA rybosomalnego w kontroli negatywnej wyniosły odpowiednio powyżej 30 cykli, zgodnie z oczekiwaniami. W trybie plateau przeprowadzono ITP dla dwóch aminokwasów, argininy i lizyny, stosując test NFT z użyciem RUMINE six G jako fluorescencyjnego znacznika o niskiej prędkości.W tym przypadku do identyfikacji stref można wykorzystać intensywność fluorescencji względem intensywności strefy LE lub TE, natomiast szerokości stref umożliwiają kwantyfikację. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę fizyczną na temat ITP oraz metodologii stojącej za trzema różnymi analizami opartymi na ITP. W szczególności pokazaliśmy, jak wykorzystać ITP do oczyszczania aminokwasów, wstępnego zagęszczania analitów oraz selektywnej ekstrakcji kwasów nukle nowych.Należy pamiętać, że praca z wysokim napięciem może być niezwykle niebezpieczna. Zawsze należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie urządzeń ograniczających natężenie prądu oraz zachowanie odpowiedniej odległości od elektrod.

on-chip-isotachophoresis-for-separation-ions-purification-nucleic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroprocesowa izotachoforezy do separacji jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

W tym wywiadzie dr Klapperich omawia wytwarzanie termoplastycznych urządzeń mikroprzepływowych oraz ich zastosowanie w opracowywaniu nowych metod diagnostycznych.

Zastosowania mikroprzepływowe w diagnostyce jednorazowej

Opisano narzędzie oraz odczynniki do sekwencyjnej izolacji kwasów nukleinowych, a następnie białek z próbki, bez konieczności użycia energii elektrycznej. Narzędzie składa się z sorbentu umieszczonego w pipecie transferowej, natomiast odczynniki do izolacji opierają się na zasadach ekstrakcji do fazy stałej. Izolowane makrocząsteczki mogą być analizowane za pomocą testów immunologicznych oraz PCR.

Sekwencyjna izolacja kwasów nukleinowych i białek bez użycia energii elektrycznej

W tym filmie demonstrujemy technikę chromatografii anionowo-wymiennej do oczyszczania ludzkiego białka wiążącego wapń S100A12 na podstawie ładunku powierzchniowego netto białka z hodowli Escherichia coli.

Oczyszczanie białek oparte na chromatografii anionowej: technika rozdzielania mająca na celu wyizolowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania z dializowanego lizatu bakteryjnego na podstawie ładunku netto

Ten film opisuje technikę mikroprzepływowej elektroforezy kapilarnej do rozdzielania amplikonów PCR na podstawie ich wielkości. Ta technika pomaga w wymiarowaniu fragmentów przy użyciu barwników fluorescencyjnych i standardowych markerów wielkości molekularnej.

Mikroprzepływowa elektroforeza kapilarna do wymiarowania fragmentów produktów PCR: technika separacji elektroforetycznej oparta na mikroprocesorach w celu oddzielenia fragmentów DNA na podstawie wielkości

Prezentujemy dyskretny system wprowadzania próbek kropel do spektrometrii mas z plazmą sprzężoną indukcyjnie (ICPMS). Opiera się na tanim i jednorazowym chipie mikroprzepływowym, który generuje wysoce monodyspersyjne kropelki w zakresie wielkości 40−60 μm przy częstotliwościach od 90 do 7 000 Hz.

Układ mikroprzepływowy do próbki ICPMS Wprowadzenie

Celem jest frakcjonowanie i izolowanie bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów z złożonego ekstraktu roślinnego oraz białek z drobnoustrojów chorobotwórczych za pomocą metody ogniskowania izoelektrycznego w fazie ciekłej (IEF). Ponadto zidentyfikowano oddzielone cząsteczki i potwierdzono ich bioaktywność.

Separacja bioaktywnych małych cząsteczek, peptydów ze źródeł naturalnych i białek od drobnoustrojów metodą preparatywnego ogniskowania izoelektrycznego (IEF)

Technika iChip wykorzystuje niedrogie i proste urządzenie do izolacji in-situ, które zwiększa tempo odkrywania nowych mikroorganizmów z gleby. Nowe mikroorganizmy mogą być wykorzystywane m.in. do dalszych badań nad mikrobiomem glebowym lub odkrywaniem produktów naturalnych.

Izolacja mikroorganizmów glebowych z wykorzystaniem technologii iChip

Komórki nowotworowe krążące (CTC) są kluczowe dla badania postępu nowotworów i przerzutów. Niniejszy artykuł przedstawia wysokoprzepustowy, zintegrowany protokół wzbogacania CTC oraz sekwencjonowania pojedynczego CTC, poprawiający efektywność przechwytywania i czystość CTC, jednocześnie zmniejszając koszty zanieczyszczenia i sekwencjonowania, co przyczynia się do rozwoju badań i zastosowań klinicznych w precyzyjnej onkologii.

Technologia sortowania komórek nowotworowych o wysokiej przepustowości i sekwencjonowania pojedynczych komórek oparta na mikrofluidice

Czujniki „e-DNA”, czyli bezodczynnikowe biosensory elektrochemiczne, które wykazują wysoką skuteczność nawet podczas bezpośredniej analizy krwi i innych złożonych matryc, zostały zaadaptowane do wykrywania szerokiego zakresu analitów w postaci kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek. W niniejszej pracy przedstawiamy ogólną procedurę wytwarzania i stosowania takich czujników.

Wytwarzanie elektrochemicznych biosensorów DNA do bezodczynnikowej detekcji kwasów nukleinowych, białek i małych cząsteczek

Bezsoczewkowa tomografia optyczna to trójwymiarowa technika mikroskopowa oferująca rozdzielczość przestrzenną &lt;1 μm × &lt;1 μm × &lt;3 μm odpowiednio w wymiarach x, y i z, przy dużej objętości obrazowania wynoszącej 15-100 mm3, co może być szczególnie użyteczne w integracji z platformami typu lab-on-a-chip.

Bezosobnikowa tomograficzna mikroskopia na chipie z wykorzystaniem wielokątnego oświetlenia i superrozdzielczości pikselowej

Poznaj izotachoforezę (ITP) do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych w mikrofluidyce. Technika umożliwia prekoncentrację analitów, ekstrakcję DNA/RNA oraz detekcję aminokwasów.

Izotachoforeza na chipie do rozdzielania jonów i oczyszczania kwasów nukleinowych

Przeglądaj więcej filmów