Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania TCR i powiązanych z nim białek sygnałowych w czasie rzeczywistym

Ten film opisuje procedurę śledzenia zdarzeń sygnalizacyjnych receptora komórek T przy użyciu jednoczesnej akwizycji dwukanałowej. Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem lub mikroskopia darniowa pierwsze komórki T są transfekowane plazmidem kodującym GFP oznaczonym ZAP 70, dwuwarstwą lipidową na podłożu szklanym, która zawiera peptyd zakotwiczony w lipidach. Przygotowywane są kompleksy MHC, cząsteczki adhezyjne i cząsteczki kostymulujące.

Transfekowane limfocyty T ZAP 70 są dodawane do dwuwarstwy, gdy receptory komórek T są angażowane przez peptydowe kompleksy MHC. Łańcuchy CD three związane z receptorem komórek T są fosforylowane przez kinazę z rodziny SARC LCK, a kinaza zap 70 jest rekrutowana z cytoplazmy. Receptor limfocytów T jest następnie znakowany fluorescencyjnie i przeprowadza się obrazowanie, w którym komórki są zanurzane w ośrodku o niższym współczynniku załamania światła niż szkło nakrywkowe i oświetlane wiązką laserową pod kątem, który ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu.

Generuje to ulotną falę na granicy faz szklanej wody, która rozpada się wykładniczo do ośrodka, umożliwiając penetrację na głębokość od 100 do 200 nanometrów. W ten sposób wzbudzane są tylko czwórki fluorowe w błonie plazmatycznej lub bardzo blisko niej. Analiza uzyskanych obrazów ujawnia, że sygnalizacja zachodzi w mikroklastrach receptorów limfocytów T.

Główną zaletą mikroskopii murawy lub konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej jest uzyskanie lepszej rozdzielczości, dzięki czemu klastry sygnałowe lub kompleksy sygnałowe, takie jak mikroklastry TCR, są łatwo wizualizowane. Travis Crites i Chen. Obaj doktorzy w moim laboratorium zademonstrują, jak transfekować pierwotne mysie limfocyty T za pomocą technologii maxi nucleo affection, a następnie zobrazować je za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia lub murawy M stymulowanej szkłem ptasiej lipidowej warstwy żółciowej zawierającej antygen.

Metoda ta jest szeroko stosowana do badania sygnalizacji w różnych komórkach odpornościowych, w tym limfocytach T, limfocytach B, komórkach NK i komórkach głównych. Metoda ma szerokie zastosowanie i może być stosowana do badania większości układów receptorowych w komórkach ssaków, zwłaszcza jeśli sygnalizacja występuje w klastrach. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą początkowo mieć problemy, ponieważ limfocyty T są bardzo trudne do transfekcji.

Ponadto wymagana jest precyzyjna koordynacja, aby żywotność limfocytów T i wydajność transfekcji, jakość bilarna oraz wyrównanie mikroskopu były na najwyższym poziomie. Pierwszym krokiem tej procedury jest transfekcja pierwotnych lub aktywowanych in vitro pierwotnych komórek T z plazmidami ekspresyjnymi i kodującymi cząsteczkami sygnałowymi oznaczonymi GFP przy użyciu zestawu efektorów nukleokomórkowych komórek T myszy AM maxa. Wszystkie limfocyty T użyte w tym badaniu wykazywały ekspresję A-N-D-T-C-R, który rozpoznaje peptyd MCC znajdujący się w cząsteczce MHC IE K. Przedstawiona tutaj procedura transfekcji jest przeprowadzana zgodnie z zaleceniami producenta.

Przedstawiono jednak kilka wskazówek, które promują żywotność limfocytów T po transfekcji. Zarówno żywotność, jak i skuteczność transfekcji są wyższe w komórkach T aktywowanych in vitro niż w komórkach naiwnych, dlatego w protokole tym wykorzystuje się limfocyty T aktywowane in vitro przed rozpoczęciem. Przygotuj dwa mililitry uzupełnionej pożywki z komórek T do każdej transfekcji, łącząc 1,9 mililitra pożywki dostarczonej w zestawie, 20 mikrolitrów składnika, A 20 mikrolitrów składnika B i 100 mikrolitrów płodowej surowicy bydlęcej w dwumililitrowej probówce.

Przenieś dwa mililitry pożywki do każdej studzienki 12-dołkowej płytki. Umieścić płytkę w nawilżonym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza na co najmniej godzinę, aby umożliwić pożywce zrównoważenie śmierci komórek wynikającej z zawieszenia Resus transfekowanych komórek w pożywce, która jest zimna lub nie ma pH 7,2. Aby przygotować mieszaninę transfekcji, połącz 82 mikrolitry roztworu efektorowego nukleoskopu mysich komórek T z 18 mikrolitrami suplementu dwa i pięć mikrogramów plazmidowego DNA wolnego od endotoksyn w stężeniu nie niższym niż 0,5 mikrograma na mikrolitr, dokładnie wymieszane przez opukiwanie.

Przenieś od pięciu do 10 milionów komórek do 15-mililitrowej probówki wirówkowej, wiruj przy 75 razy G przez pięć minut w temperaturze pokojowej po wirowaniu. Użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć jak najwięcej supernatantu, aby delikatnie zawiesić osad komórkowy w mieszaninie transfekcyjnej i powoli zasysać osad komórkowy trzy do czterech razy, aż nie pozostaną żadne duże grudki komórek. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś zawiesinę do certyfikowanego amaxa vete, upewniając się, że nie ma w nim pęcherzyków.

Zakryj program efektora jądrowego qve select X 0 0 1 na urządzeniu efektora nukleo. Włóż vete do uchwytu Q vete i naciśnij przycisk, aby zastosować wybrany program. Następnie natychmiast przenieś pożywkę weterynaryczną i wstępnie zrównoważoną pożywkę hodowlaną do kaptura.

Za pomocą dołączonej plastikowej pipety dodaj około 500 mikrolitrów wstępnie zrównoważonej pożywki do vete. Następnie dodać zawiesinę komórkową do pożywki w płytce. Kropla po kropli.

Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez cztery godziny, aby umożliwić niski poziom ekspresji białek znakowanych GFP i zminimalizować pojawianie się artefaktów spowodowanych nadekspresją. W tej sekcji opisano metodę ustawiania mikroskopu do jednoczesnego obrazowania dwukanałowego przed uruchomieniem zasilania wszystkich elementów mikroskopu. Uruchom komputer i oprogramowanie.

Następnie upewnij się, że wszystkie komponenty sprzętowe są rozpoznawane przez oprogramowanie. Ponieważ oprogramowanie uruchamia się bez żadnych komunikatów o błędach, wszystkie komponenty zostały wykryte. Rozcieńczyć jeden mikrolitr subrozdzielczości

Jasne mikrosfery wielofluorescencyjne Flores do dwóch mililitrów PBS do stosowania jako standard kolokalizacji. Następnie dodaj 0,25 mililitra zawiesiny mikrosfery do każdej studzienki systemu szkła nakrywkowego z ośmioma komorami laboratoryjnymi. Umieść system przesuwu komory na platformie nad obiektywem.

Następnie ustaw ostrość koralików wchłoniętych przez szkło na podglądzie na żywo. Lewe okienko to kanał, w którym będą widoczne komórki transfekowane GFP. W prawym okienku zostanie wyświetlony oznaczony jako TCR podczas eksperymentów obrazowania żywych komórek.

Korzystając z wyrównania Y wystrzeliwania światłowodu XY, Z, wyreguluj położenie wiązki laserowej tak, aby wiązka wychodziła z obiektywu i była rzutowana na sufit. Ważne jest, aby to zrobić, gdy obiektyw znajduje się w pozycji, w której płaszczyzna szkła jest ostra. Jeśli belka na suficie jest rozproszona, belka nie jest łączona.

Dostosuj mikrometr Z, aby uzyskać pełne sortowanie testowe sortowania dla każdej z linii laserowych, które mają być użyte w eksperymencie. Następnie za pomocą miernika mocy lasera dostosuj moc lasera do 20 do 30 mikrowatów dla każdego kanału. Limfocyty T są niezwykle wrażliwe na promieniowanie laserowe, a oświetlenie jest ograniczone do łącznej mocy 50 mikrowatów.

Następnie, aby ustawić kąt dla murawy. Obróć mikrometr wyrównujący Y na wystrzeleniu światłowodu, aby odsunąć belkę od sufitu aż do jej kąta. Jeśli chodzi o obiektywy, oś optyczna zbliża się do 90 stopni.

Po osiągnięciu krytycznego kąta całkowitego odbicia wewnętrznego światło lasera nie będzie już opuszczać celu Aby ocenić, czy osiągnięto wyrównanie murawy, ustaw ostrość w górę iw dół przez płaszczyznę szkła nakrywkowego. Zauważ tutaj, że gdy kulki wchłaniające się na powierzchnię są wybijane z ostrości, wiele koralików można zobaczyć unoszących się w roztworze. Aby uzyskać dobre wyrównanie murawy, konieczne jest zwiększenie kąta wiązki w stosunku do celu.

Wraz ze wzrostem kąta wiązki koraliki unoszące się blisko powierzchni zaczynają znikać, a koraliki pochłaniane na granicy faz zwiększają swoją intensywność. Teraz, gdy koraliki dodane do interfejsu są nieostre, żadne kulki unoszące się w roztworze nie pozostają widoczne. W tym momencie murawa jest odpowiednio wyrównana, ponieważ tylko koraliki, które są wchłaniane przez szkiełko nakrywkowe, są w stanie się w niej znaleźć. Ognisko.

Następnie, aby wyrównać czerwony i zielony kanał fluorescencyjny względem siebie, skup się na koralikach i porównaj położenie rozpoznawalnych cech na obrazach utworzonych w obu kanałach. Używając mikrometrycznych X i Y na jednym statywie aparatu, umieść względne położenie koralików jak najbliżej siebie. Tu. Zwróć uwagę na jasny koralik w lewym dolnym kwadrancie obu obrazów, aby zapewnić wyrównanie przestrzenne między dwoma kanałami.

Ta funkcja jest przenoszona do tego samego położenia względnego na obu obrazach. Przechwyć i zapisz obraz z obu kanałów. Obrazy te zostaną wykorzystane jako standard kolokalizacji w celu wyrównania dwóch kanałów.

Przykład tego wyrównania jest widoczny tutaj przed wyrównaniem. Jeden z kanałów jest obrócony względem drugiego, jak pokazano na tym obrazie, w którym obrazy z dwóch kanałów koralików o niższej rozdzielczości są nałożone na siebie. Po dostosowaniu obrazy są wyrównywane, jak pokazano tutaj.

Jakość dopasowania może być dalej badana poprzez porównanie obrazów żywych komórek transfekowanych GFP. Zwróć uwagę, że podium Laila z dwóch kanałów jest idealnie wyrównane. Po wyrównaniu dwóch obrazów za pomocą kalibracji ustalonej za pomocą mikrokulek fluorescencyjnych.

Po ustawieniu mikroskopu przygotowuje się komory przepływowe zawierające dwuwarstwy lipidowe na podłożu szklanym prezentujące antygen i wykonuje się murawę M w celu wizualizacji TRANSFEKOWANYCH limfocytów T oddziałujących najpierw z substratem. Postępując zgodnie z protokołem opisanym przez Anę i Dustina, zmontuj komorę przepływową z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi na szklanym szkiełku nakrywkowym zawierającym lipidy NI NTA, cząsteczkę adhezyjną ICAM one i peptydowe kompleksy MHC. IEFK załadowane MCC są włączone do dwuwarstwy za pomocą znaczników histydyny.

Cząsteczka kostymulująca CD 80 jest włączona. Za pomocą kotwicy GPI umieść komórkę przepływową na stoliku mikroskopu i ustabilizuj ją, mocując komorę do płytki adaptera na stoliku mikroskopu za pomocą pręta napinającego, aby ją unieruchomić. Następnie przymocuj dostarczony przez producenta element grzejny do komory przepływowej, aby kontrolować jej temperaturę.

Umieść obiektyw na dwuwarstwie i ustaw ostrość na płaszczyźnie dwuwarstwowej, aby umożliwić ogrzewanie obiektywu, a komora przepływowa przełącza się na komorę przepływową i grzałki obiektywowe, aby podnieść temperaturę komory do 37 stopni Celsjusza. Po czterech godzinach inkubacji przenieś transektowane limfocyty T do 15-mililitrowej probówki i odwiruj z prędkością 80 razy G. Ponownie zawiesić komórki w 300 mikrolitrach buforu H-B-S-B-S-A. Następnie dodać H 57 FAB lub H 57 jednołańcuchowy zmienny fragment, aby oznaczyć TCR do końcowego stężenia 10 mikrogramów na mililitr w przypadku fab lub 20 mikrogramów na mililitr w przypadku pojedynczego fragmentu łańcucha.

Przenieś komórki do pięciomililitrowej rurki faksowej. Następnie, za pomocą jednomililitrowej strzykawki z końcówką ślizgową, wstrzyknij komórki do komory przepływowej za pomocą zaworu trójdrogowego. Skonfiguruj warunki obrazowania tak, aby dwukanałowa akwizycja na żywo pokazywała podgląd na żywo kanałów TCR i GFP i znajdowała pole z transfekowanymi komórkami.

Ze względu na różnice w intensywności między TCR i GFP, skalowanie obrazów może wymagać dostosowania w czasie rzeczywistym, aby komórki mogły być wizualizowane w obu kanałach. Podobnie jak w tym przypadku, potwierdź oświetlenie murawy, skupiając się w górę płaszczyzny szkła, aby wykryć wszelkie boczne przebarwienia membrany. Jeśli membrany boczne nie są ostre, oznacza to, że wyrównanie murawy jest dobre.

W tym podglądzie na żywo boczne barwienie membrany jest widoczne zarówno w płaszczyźnie szkiełka nakrywkowego, jak i po rozostrzeniu szkiełka nakrywkowego, aby ustawić mikroskop w dobrym ustawieniu murawy. Kąt lasera w stosunku do obiektywu zostaje zwiększony, a błona boczna traci ostrość. Rozpocznij rejestrowanie pojedynczych zdjęć i sekwencji poklatkowych w odstępie 10 sekund.

Przez pięć minut komórki inkubowano na dwuwarstwach INTA na podłożu szklanym i INTA zawierających sześć cząsteczek na kwadrat. Mikrometr załadowany peptydem oznaczony hist oznaczony IEFK 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy Alexa 6 4 7 sprzężonych hist oznaczonych ICAM jeden i 100 cząsteczek na kwadrat. Mikrometr dwukanałowego CD 80 zakotwiczonego w GPI Jednoczesna mikroskopia murawowa z akwizycją przeprowadzono w ciągłej obecności Alexa 5 46 sprzężonego fragmentu H pięć siedem FAB.

Aby zabarwić, komórki TCR zostały zobrazowane do godziny po pierwszym kontakcie z dwuwarstwą. Liczbę klastrów ZAP 70 na komórkę analizowano za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do zliczania klastrów. W każdym przypadku przeanalizowano co najmniej 40 komórek.

Załadowane peptydy są wskazane we wstawce. ICAM jeden odnosi się do komórek na dwuwarstwach zawierających 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy Alexa 6, 4, 7 sprzężonych. Jego oznaczona ICAM jeden, jak pokazano na rysunku zap 70 sygnalizacja zależna występuje w mikroklastrach TCR i tylko w odpowiedzi na ligandy agonistyczne, jak można zobaczyć na tym filmie, zrobionym z prędkością 10 sekund na klatkę.

Sygnalizacja TCR w odpowiedzi na peptydy agonistyczne jest podtrzymywana przez ciągłe generowanie mikroklastrów TCR na obrzeżach obszaru kontaktu, które rekrutują ZAP 70. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak transfekować pierwotne limfocyty T za pomocą technologii maxa nuclear affection i prawidłowo obrazować rekrutację cząsteczek sygnałowych GFPT do mikroklastrów TCR za pomocą mikroskopii darniowej. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu siedmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby być bardzo delikatnym w stosunku do komórek pierwotnych. Im zdrowe są komórki na każdym etapie eksperymentu, tym wyższa będzie wydajność transfekcji i tym więcej komórek zostanie uchwyconych w obrazowaniu. Limfocyty T mają wysoką wartość mt, w wyniku czego sekwencyjne obrazowanie kanału TCR i GFP powoduje, że oba obrazy nie są idealnie wyrównane z powodu ruchu mikroklastrów i komórek TCR.

Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy dwukanałowy mikroskop z jednoczesną akwizycją murawy.