Name: Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania TCR i powiązanych z nim białek sygnałowych w czasie rzeczywistym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 10 s
Description: Poznaj technikę mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania receptora TCR i białek sygnałowych w komórkach T. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki sygnalizacji immunologicznej w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te były wspierane przez Wydział Badań Wewnątrzinstytucjonalnych Narodowego Instytutu Alergii i Chorób Zakaźnych Narodowych Instytutów Zdrowia. Jesteśmy wdzięczni Johannesowi Huppie i Markowi Davisowi za udostępnienie scFv H57 wykorzystanego w tych badaniach. RV pragnie podziękować Keirowi Neumannowi za pomocne dyskusje podczas opracowywania tej techniki.

<ol><li>Call, M. E., Wucherpfennig, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+cell+receptor%3A+critical+role+of+the+membrane+environment+in+receptor+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The T cell receptor: critical role of the membrane environment in receptor assembly and function.</a> Annu. Rev. Immunol. 23, 101-125 (2005).</li>
<li>Smith-Garvin, J. E., Koretzky, G. A., Jordan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S.T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">S.T cell activation.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 591-619 (2009).</li>
<li>Bezbradica, J. S., Medzhitov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+cytokine+and+heterologous+receptor+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Integration of cytokine and heterologous receptor signaling pathways.</a> Nat. Immunol. 10, 333-339 (2009).</li>
<li>Fraser, I. D., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+the+network%3A+signaling+cross-talk+in+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Navigating the network: signaling cross-talk in hematopoietic cells.</a> Nat. Immunol. 10, 327-331 (2009).</li>
<li>Dustin, M. L., Starr, T., Varma, R., Thomas, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+planar+bilayers+for+study+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Supported planar bilayers for study of the immunological synapse.</a> Curr. Protoc. Immunol. Chapter 18, 13-13 (2007).</li>
<li>Vardhana, S., Dustin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+Planar+Bilayers+for+the+Formation+of+Study+of+Immunological+Synapses+and+Kinapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse.</a> J. Vis. Exp. (19), e947-e947 (2008).</li>
<li>Varma, R., Campi, G., Yokosuka, T., Saito, T., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor-proximal+signals+are+sustained+in+peripheral+microclusters+and+terminated+in+the+central+supramolecular+activation+cluster%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell receptor-proximal signals are sustained in peripheral microclusters and terminated in the central supramolecular activation cluster.</a> Immunity. 25, 117-127 (2006).</li>
<li>Yokosuka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+generated+T+cell+receptor+microclusters+initiate+and+sustain+T+cell+activation+by+recruitment+of+Zap70+and+SLP-76%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76.</a> Nat. Immunol. 6, 1253-1262 (2005).</li>
<li>Huppa, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TCR-peptide-MHC+interactions+in+situ+show+accelerated+kinetics+and+increased+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TCR-peptide-MHC interactions in situ show accelerated kinetics and increased affinity.</a> Nature. 463, 963-967 (2010).</li>
<li>Tolar, P., Pierce, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformation-induced+oligomerization+model+for+B+cell+receptor+microclustering+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A conformation-induced oligomerization model for B cell receptor microclustering and signaling.</a> Curr. Top. Microbiol. Immunol. 340, 155-169 (2010).</li>
<li>Treanor, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+skeleton+controls+diffusion+dynamics+and+signaling+through+the+B+cell+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The membrane skeleton controls diffusion dynamics and signaling through the B cell receptor.</a> Immunity. 32, 187-199 (2010).</li>
<li>Treanor, B., Batista, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insight+into+lymphocyte+activation+through+quantitative+imaging+and+theoretical+modelling%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insight into lymphocyte activation through quantitative imaging and theoretical modelling.</a> Curr. Opin. Immunol. 19, 476-483 (2007).</li>
<li>Sylvain, N. R., Nguyen, K., Bunnell, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vav1-mediated+scaffolding+interactions+stabilize+SLP-76+microclusters+and+contribute+to+antigen-dependent+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Vav1-mediated scaffolding interactions stabilize SLP-76 microclusters and contribute to antigen-dependent T cell responses.</a> Sci. Signal. 4, ra14-ra14 (2011).</li>
<li>Purbhoo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+subsynaptic+vesicles+and+surface+microclusters+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">Dynamics of subsynaptic vesicles and surface microclusters at the immunological synapse.</a> Sci. Signal. 3, ra36-ra36 (2010).</li>
<li>Lasserre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ezrin+tunes+T-cell+activation+by+controlling+Dlg1+and+microtubule+positioning+at+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Ezrin tunes T-cell activation by controlling Dlg1 and microtubule positioning at the immunological synapse.</a> EMBO. J. 29, 2301-2314 (2010).</li>
<li>Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+techniques+for+assaying+lymphocyte+activation+in+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action.</a> Nat. Rev. Immunol. 11, 21-33 (2011).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods Cell. Biol. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Williamson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-existing+clusters+of+the+adaptor+Lat+do+not+participate+in+early+T+cell+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Pre-existing clusters of the adaptor Lat do not participate in early T cell signaling events.</a> Nat. Immunol. 12, 655-662 (2011).</li>
</ol>

Wszystkie zwierzęta wykorzystane w tych eksperymentach były utrzymywane w środowisku wolnym od specyficznych patogenów, a eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Narodowych Instytutów Zdrowia (National Institutes of Health Animal Care and Use Committee).

Opisujemy tutaj system do badania sygnalizacji w antygenowo specyficznych pierwotnych limfocytach T myszy z wykorzystaniem TIRFM oraz szklanych wspieranych dwuwarstw lipidowych jako sztucznych APC. Technika ta opiera się na pomyślnej ekspresji białek znakowanych GFP w tych komórkach. Transfekcja limfocytów T jest zawsze trudnym zadaniem. Zazwyczaj stosuje się elektroporację lub dostarczanie genów za pomocą retrowirusów lub lentiwirusów. Żadna z tych technik nie jest lepsza od pozostałych; każda z nich ma swoje ograniczenia i zalety. Stwierdzamy, że elektroporacja posiada następujące zalety: 1) komórki nie muszą aktywnie się dzielić, co jest wymagane w przypadku retrowirusów, ale nie lentiwirusów, oraz 2) poziom ekspresji można kontrolować poprzez zmianę czasu inkubacji komórek przed obrazowaniem. Największą wadą jest to, że ekspresja białek o dużym rozmiarze w komórkach pierwotnych jest bardzo trudna. Przedstawiliśmy metodę, która zapewnia bardzo dobrą żywotność komórek po elektroporacji. W rezultacie można ją zastosować do wyciszania genów za pomocą siRNA.
Opisujemy tutaj również dostosowany mikroskop TIRF z dwukanałową symultaniczną akwizycją, który jest skorygowany chromatycznie i nie wymaga osobnego ustawiania dla różnych długości fal. Możliwości te są jednak dostępne w rozwiązaniach komercyjnych. Nasz system opiera się na zasadach mikroskopii TIRF opublikowanych przez ekspertów w tej dziedzinie i jest tańszy niż alternatywy komercyjne. Jedną z możliwych krytyk naszej konstrukcji może być fakt, że stosujemy ten sam kąt padania dla różnych długości fal wzbudzenia. Wynikowałoby to z różnej głębokości penetracji TIRF dla różnych długości fal wzbudzenia. Uważamy, że efekty te są niewielkie, ponieważ fala ewanescentna jest polem zanikającym wykładniczo, a głębokość pola TIRF jest funkcją liniową długości fali. Fluorofory znajdujące się blisko powierzchni szkła nie odczują różnicy w intensywności lasera między dwiema długościami fal. Dla fluoroforów znajdujących się w pobliżu głębokości penetracji, różnica intensywności wyniesie 1,3-krotność dla długości fal 488 i 640 nm oraz 1,15-krotność dla długości fal 488 i 561 nm. Ten sam system może być stosowany w połączeniu z technikami superrozdzielczości, które wykorzystują oświetlenie TIRF.
Opisaliśmy również system dwukamerowy wykonany na specjalne zamówienie. Podobnie jak w przypadku systemu TIRF, analogiczne urządzenia są dostępne w sprzedaży. Nasz system oferuje elastyczność w kwestii wymiany filtrów i luster dichroicznych, co umożliwia jego zastosowanie z różnymi kombinacjami długości fal. Wadą naszego systemu jest konieczność rotacji w jednej osi w celu wyrównania dwóch obrazów. Problem ten można rozwiązać, stosując statywy kamer sterowane piezoelektrycznie, które oferują możliwość regulacji kąta obrotu. Z sukcesem zaimplementowaliśmy w tym mikroskopie system dwukamerowy, w którym zastosowano różne kamery o odmiennych rozmiarach pikseli. Taki system byłby przydatny w sytuacjach, gdy wymagana jest wysoka czułość w jednym kanale i szeroki zakres dynamiczny w drugim, co rzadko zdarza się w przypadku jednej kamery. Użyliśmy kamery Photometrics HQ-2 z binningiem 2x2, co dało efektywny rozmiar piksela 12,9 μm, oraz kamery Photometrics Quant-EM, która posiada rozmiar piksela 16 μm. Dla kamery Quant-EM zastosowano soczewkę tubusową o ogniskowej 180 mm, a dla kamery HQ-2 soczewkę tubusową o ogniskowej 145 mm. Kamera HQ-2 była sterowana za pomocą oprogramowania Metamorph, natomiast Quant-EM była sterowana poprzez oprogramowanie micro-manager na osobnym komputerze w trybie wyzwalania zewnętrznego. Sygnał wyzwalający dla kamery Quant-EM był dostarczany przez wyjście cyfrowe karty DAC systemu measurement computing, co zostało zaimplementowane jako dodatkowa migawka w ustawieniach konfiguracji oświetlenia programu Metamorph. Stosunek ogniskowych soczewek tubusowych odpowiada stosunkowi efektywnych rozmiarów pikseli. Reprezentatywne wyrównanie przedstawiono na Rysunku 5.

<table><tbody><tr><td>Zestaw Amaxa Nucleofector do limfocytów T mysich</td><td>Lonza Inc.</td><td>VPA-1006</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw PureLink HiPure Plasmid Midiprep</td><td>Life Technologies</td><td>K2100-05</td><td>Do preparatyki DNA wolnego od endotoksyn</td></tr><tr><td>Urządzenie Amaxa Nucleofector</td><td>Lonza Inc.</td><td>AAD-1001</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowana mysia IL-2</td><td>PeproTech Inc</td><td>212-12</td><td></td></tr><tr><td>Wielobarwne fluorescencyjne mikrosfery Fluoresbrite 0,20&amp;mu;m</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>24050-5</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywki z 8 komorami Lab-Tek II</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>155409</td><td></td></tr></tbody></table>

technika mikroskopii tirf do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym tcr oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

A TIRF Microscopy Technique for Real-time, Simultaneous Imaging of the TCR and its Associated Signaling Proteins

Sygnalizacja jest inicjowana poprzez receptor limfocytów T (TCR), gdy zostaje on zaangażowany przez fragmenty peptydów antygenowych związanych z białkami głównego układu zgodności tkankowej (pMHC) eksprymowanymi na powierzchni komórek prezentujących antygen (APC). Kompleks TCR składa się z heterodimeru TCRαβ wiążącego ligand, który łączy się niekowalencyjnie z dimerami CD3 (heterodimerami εδ i εγ oraz homodimerem ζζ)1. Po zaangażowaniu receptora łańcuchy CD3 ζ są fosforylowane przez kinazę z rodziny Src, Lck. Prowadzi to do rekrutacji kinazy z rodziny Syk, Zap70, która następnie jest fosforylowana i aktywowana przez Lck. Po tym etapie Zap70 fosforyluje białka adaptorowe LAT i SLP76, inicjując tworzenie proksymalnego kompleksu sygnałowego zawierającego dużą liczbę różnych cząsteczek sygnałowych2.
Powstanie tego kompleksu prowadzi ostatecznie do aktywacji czynników transkrypcyjnych zależnych od wapnia i białka Ras, a w konsekwencji do uruchomienia złożonej serii programów ekspresji genów, które prowadzą do różnicowania limfocytów T2. Sygnały TCR (i wynikający z nich stan różnicowania) są modulowane przez wiele innych czynników, w tym siłę antygenu oraz interakcje z receptorami kostymulującymi/koinhibicyjnymi, chemokinowymi i cytokinowymi 3-4. Badanie organizacji przestrzennej i czasowej proksymalnego kompleksu sygnałowego w różnych warunkach stymulacji jest zatem kluczowe dla zrozumienia szlaku sygnałowego TCR, a także jego regulacji przez inne szlaki sygnałowe.
Bardzo użytecznym systemem modelowym do badania sygnalizacji inicjowanej przez TCR w błonie plazmatycznej limfocytów T są wspierane szklaną powierzchnią dwuwarstwy lipidowe, opisane wcześniej5-6. Mogą one służyć do prezentacji kompleksów pMHC antygenowych, cząsteczek adhezyjnych oraz kostymulujących limfocytom T, pełniąc rolę sztucznych APC. Dzięki obrazowaniu limfocytów T oddziałujących z dwuwarstwą lipidową za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRFM), możemy ograniczyć wzbudzenie do obszaru 100 nm w przestrzeni między szkłem a powierzchnią komórki 7-8. Pozwala to na obrazowanie przede wszystkim zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących w błonie plazmatycznej. Ponieważ interesuje nas obrazowanie rekrutacji białek sygnalizacyjnych do kompleksu TCR, opisujemy dwukamerowy system obrazowania TIRF, w którym TCR, znakowany fluorescencyjnymi fragmentami Fab (fragment antigen binding) przeciwciała H57 (oczyszczonego z hybridomy H57-597, ATCC, numer ATCC:HB-218) specyficznego dla TCRβ, oraz białka sygnalizacyjne, znakowane GFP, mogą być obrazowane jednocześnie i w czasie rzeczywistym. Strategia ta jest niezbędna ze względu na wysoką dynamikę zarówno limfocytów T, jak i zdarzeń sygnalizacyjnych zachodzących przy TCR. Ta metoda obrazowania pozwoliła badaczom na obrazowanie pojedynczych ligandów 9-11, jak również rekrutację cząsteczek sygnalizacyjnych do aktywowanych receptorów i stanowi doskonały system do badania biochemii in-situ12-16.

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Sygnalizacja jest inicjowana poprzez receptor limfocytów T (TCR) w momencie jego zaangażowania przez fragmenty peptydów antygenowych związanych z głównym kompleksem zgodności tkankowej...

Niniejszy film opisuje procedurę śledzenia zdarzeń sygnalizacyjnych receptorów limfocytów T z wykorzystaniem symultanicznej akwizycji dwukanałowej. W mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) limfocyty T są najpierw transfektowane plazmidem kodującym ZAP 70 z tagiem GFP, a następnie przygotowywana jest wsparta szklaną podstawką lipidowa warstwa dwuwarstwowa, zawierająca zakotwiczone w lipidach kompleksy MHC z peptydami, cząsteczki adhezyjne oraz cząsteczki kostymulujące.Limfocyty T przetransfekowane białkiem ZAP 70 są dodawane do dwuwarstwy w momencie, gdy receptory limfocytów T są angażowane przez kompleksy peptyd-MHC. Powiązane z receptorem limfocytów T łańcuchy CD3 są fosforylowane przez kinazę LCK z rodziny SARC, co prowadzi do rekrutacji kinazy ZAP 70 z cytoplazmy. Następnie receptor limfocytów T jest znakowany fluorescencyjnie i przeprowadzane jest obrazowanie, podczas którego komórki są zanurzone w medium o niższym współczynniku załamania światła niż szkło nakrywowe i oświetlane wiązką lasera pod kątem powodującym całkowite wewnętrzne odbicie.Powoduje to powstanie fali ewanescentnej na granicy szkło-woda, która zanika wykładniczo w ośrodku, co pozwala na uzyskanie głębokości penetracji od 100 do 200 nanometrów. W związku z tym wzbudzeniu ulegają jedynie fluorofory znajdujące się w błonie plazmatycznej lub w jej bezpośrednim sąsiedztwie. Analiza otrzymanych obrazów wykazuje, że sygnalizacja zachodzi w mikroklastrach receptorów limfocytów T.Główną zaletą mikroskopii TIRF lub konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej jest uzyskanie lepszej rozdzielczości, dzięki której łatwo można zwizualizować klastry sygnałowe lub kompleksy sygnałowe, takie jak mikroklastry TCR. Travis Crites i Chen, obaj postdoktoranci w moim laboratorium, zademonstrują sposób transfekcji pierwotnych limfocytów T myszy przy użyciu technologii Maximi Nucleofector, a następnie ich obrazowanie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkownym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) po stymulacji szklaną warstwą lipidową zawierającą antygen.Metoda ta była szeroko stosowana do badania sygnalizacji w różnych komórkach odpornościowych, w tym limfocytach T, limfocytach B, komórkach NK oraz komórkach tuczowych. Metoda ta ma szerokie zastosowanie i może być wykorzystywana do badania większości układów receptorowych w komórkach ssaków, szczególnie gdy sygnalizacja zachodzi w klastrach. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą początkowo napotkać trudności, ponieważ limfocyty T są bardzo trudne do transfekcji.Ponadto wymagana jest precyzyjna koordynacja, aby żywotność limfocytów T i wydajność transfekcji, jakość bilayera oraz ustawienie mikroskopu spełniały odpowiednie standardy. Pierwszym krokiem tej procedury jest transfekcja naiwnych lub aktywowanych in vitro pierwotnych limfocytów T plazmidami ekspresyjnymi i kodującymi cząsteczkami sygnałowymi znakowanymi GFP przy użyciu zestawu AM maxa mouse T-cell nucleo effector kit. Wszystkie limfocyty T wykorzystane w tej badaniu wykaziły ekspresję A-N-D-T-C-R, który rozpoznaje peptyd MCC znajdujący się w cząsteczce MHC IE myszy K. Procedura transfekcji przedstawiona w niniejszym materiale jest przeprowadzana zgodnie z zaleceniami producenta.Przedstawiono jednak kilka wskazówek, które zwiększają żywotność limfocytów T po transfekcji. Zarówno żywotność, jak i wydajność transfekcji są wyższe w przypadku limfocytów T aktywowanych in vitro niż w przypadku komórek naiwnych, dlatego niniejszy protokół zakłada użycie limfocytów T aktywowanych in vitro przed rozpoczęciem procedury. Dla każdej transfekcji należy przygotować dwa mililitry uzupełnionego medium dla limfocytów T, łącząc w probówce o pojemności dwóch mililitrów 1,9 mililitra medium dostarczonego w zestawie, 20 µL komponentu A, 20 µL komponentu B oraz 100 µL płodowej surowicy bydlęcej.Przenieś dwa mililitry pożywki do każdej studni płytki 12-dołkowej. Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaczem w temperaturze 37 °C na co najmniej godzinę, aby pożywka się ustabilizowała; resuspensja przetransfekowanych komórek w pożywce zimnej lub o pH innym niż 7,2 doprowadzi do śmierci komórek. Aby przygotować mieszaninę do transfekcji, połącz 82 µL roztworu NucleoEffector dla limfocytów T myszy z 18 µL suplementu 2 oraz 5 µg wolnego od endotoksyn plazmidowego DNA o stężeniu nie niższym niż 0,5 µg/µL i wymieszaj dokładnie poprzez delikatne opukiwanie.Przenieś od pięciu do 10 milionów komórek do probówki do wirowania o pojemności 15 mililitrów i wiruj z prędkością 75 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu użyj aspiratora próżniowego, aby usunąć jak największą ilość supernatantu. Resuspenduj pellet komórkowy w mieszaninie do transfekcji, delikatnie i powoli aspirując pellet od trzech do czterech razy, aż do całkowitego usunięcia dużych skupisk komórek. Za pomocą pipety ostrożnie przenieś zawiesinę do certyfikowanego elektropora amaxa vete, upewniając się, że wewnątrz nie ma pęcherzyków powietrza.Wybierz program efektora jądrowego qve X 0 0 1 na urządzeniu do efektorów jądrowych. Włóż vete do uchwytu Q vete i naciśnij przycisk, aby zastosować wybrany program. Następnie niezwłocznie przenieś vete oraz wstępnie wyrównane podłożem pożywkę do dygestorium.Za pomocą dołączonej plastikowej pipety dodaj około 500 µL uprzednio zrównoważonego medium do dołka. Następnie dodaj zawiesinę komórkową do medium w płytce, dozując ją kropla po kropli.Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez cztery godziny, aby umożliwić niski poziom ekspresji białek znakowanych GFP oraz zminimalizować występowanie artefaktów wynikających z nadekspresji. W tej sekcji opisano metodę ustawiania mikroskopu do jednoczesnego obrazowania dwukanałowego przed włączeniem wszystkich komponentów mikroskopu. Uruchom komputer oraz oprogramowanie.Następnie należy upewnić się, że wszystkie komponenty sprzętowe zostały rozpoznane przez oprogramowanie. Ponieważ oprogramowanie uruchomiło się bez żadnych komunikatów o błędach, wszystkie komponenty zostały wykryte. Rozcieńczyć 1 µL roztworu podrozdzielczego.Przenieś fluorescencyjne mikrosfery wielobarwne Flores do 2 ml PBS, aby przygotować standard kolokalizacji. Następnie dodaj 0,25 ml zawiesiny mikrosfer do każdej studni ośmiostudzienkowego systemu szkiełek podstawkowych z komorami firmy Lab Tech. Umieść system szkiełek komorowych na platformie nad obiektywem.Następnie ustaw ostrość na kulek absorbujące przy szybce w podglądzie na żywo. Lewy panel przedstawia kanał, w którym widoczne będą komórki przetransfekowane GFP. Prawy panel będzie wyświetlać znakowany TCR podczas eksperymentów z obrazowaniem żywych komórek.Używając regulacji Y w układzie XY, Z wprowadzenia światłowodu, dostosuj pozycję wiązki laserowej tak, aby wiązka wychodziła z obiektywu i była rzutowana na sufit. Ważne jest, aby wykonać tę czynność, gdy obiektyw znajduje się w pozycji, w której płaszczyzna szkła jest w ogniskowej. Jeśli wiązka na suficie jest rozproszona, oznacza to, że wiązka nie jest skolonimowana.Wyreguluj mikrometr w osi Z, aby uzyskać pełną kolimację dla każdej z linii laserowych używanych w eksperymencie. Następnie, korzystając z miernika mocy lasera, ustaw moc lasera w zakresie od 20 do 30 µW dla każdego kanału. Limfocyty T są niezwykle wrażliwe na promieniowanie laserowe, dlatego całkowita moc oświetlenia jest ograniczona do łącznie 50 µW.W następnym kroku należy ustawić kąt dla darni. Obróć mikrometr wyrównania osi Y w module wprowadzania światłowodowego, aby przesunąć wiązkę w dół od sufitu, aż jej kąt w stosunku do osi optycznej obiektywów zbliży się do 90 stopni.Po osiągnięciu kąta krytycznego dla całkowitego wewnętrznego odbicia światło lasera przestanie opuszczać obiektyw. Aby ocenić, czy uzyskano odpowiednie ustawienie tzw. dywanu (turf alignment), należy przesuwać ostrość w górę i w dół przez płaszczyznę szkiełka nakrywowego. Zauważmy tutaj, że gdy kulek zaabsorbowanych na powierzchni brakuje w płaszczyźnie ostrości, wiele kulek można dostrzec dryfujących w roztworze. Aby uzyskać prawidłowe ustawienie dywanu, konieczne jest zwiększenie kąta wiązki względem obiektywu.Wraz ze zwiększaniem kąta wiązki, kuleczki pływające w pobliżu powierzchni zaczynają znikać, a intensywność kuleczek zaabsorbowanych na granicy faz wzrasta. Obecnie, gdy kuleczki zaabsorbowane na granicy faz zostaną wyprowadzone poza obszar ostrości, żadne kuleczki pływające w roztworze nie pozostają widoczne. W tym momencie układ jest prawidłowo wyrównany, ponieważ jedynie kuleczki zaabsorbowane na szkiełku nakrywce mogą znajdować się w ostrości.Następnie, aby dopasować do siebie czerwony i zielony kanał fluorescencji, ustaw ostrość na kuleczki i porównaj położenie charakterystycznych elementów na obrazach uzyskanych w obu kanałach. Za pomocą mikrometrycznych śrub X i Y na jednym ze statywów kamer przesuń kuleczki tak, aby ich względne położenie było jak najbliższe. Zwróć uwagę na jasną kuleczkę w lewym dolnym kwadrancie obu obrazów, aby zapewnić wyrównanie przestrzenne między dwoma kanałami.Tę strukturę ustawia się w tej samej pozycji względnej na obu obrazach. Należy zarejestrować i zapisać obrazy z obu kanałów. Obrazy te posłużą jako standard kolokalizacji do wyrównania obu kanałów.Przykład takiego dopasowania przedstawiono tutaj przed wykonaniem wyrównania. Jeden z kanałów jest obrócony względem drugiego, co widać na tym obrazie, na którym nałożono na siebie obrazy z dwóch kanałów kulek o rozdzielczości poniżej limitu dyfrakcyjnego. Po wprowadzeniu korekt obrazy są wyrównane, jak pokazano tutaj.Jakość dopasowania można dodatkowo zweryfikować, porównując obrazy żywych komórek przetransfekowanych GFP. Zwróć uwagę, że podium Laila z obu kanałów jest idealnie wyrównane. Następuje to po dopasowaniu dwóch obrazów przy użyciu kalibracji ustanowionej za pomocą fluorescencyjnych mikrokulek.Po przygotowaniu mikroskopu przygotowuje się komory przepływowe zawierające wsparte na szkle dwuwarstwy lipidowe prezentujące antygen, a następnie wykonuje się turf M, aby w pierwszej kolejności zwizualizować wchodzące w interakcję z podłożem transfektowane limfocyty T. Zgodnie z protokołem opisanym przez Anę i Dustina, montuje się komorę przepływową z płaskimi dwuwarstwami lipidowymi utworzonymi na szklanym nakryciu zawierającym lipidy NI NTA, cząsteczkę adhezyjną ICAM-1 oraz kompleksy peptydowo-MHC. IEFK obciążone MCC są włączane do dwuwarstwy za pomocą znaczników histydynowych.Wprowadzono cząsteczkę kostymulującą CD 80. Wykorzystując kotwicę GPI, umieść komorkę przepływową na stoliku mikroskopu i ustabilizuj ją, mocując komorę do płyty adapterowej na stoliku mikroskopu za pomocą pręta napinającego w celu jej unieruchomienia. Następnie zamocuj dostarczony przez producenta element grzejny do komorki przepływowej, aby kontrolować jej temperaturę.Ustaw obiektyw nad warstwą lipidową (bilayer) i wyostrz obraz płaszczyzny tej warstwy, aby umożliwić ogrzewanie obiektywu oraz komory przepływowej; włącz grzałki komory przepływowej i obiektywu, aby doprowadzić temperaturę w komorze do 37 °C. Po czterech godzinach inkubacji przenieś przetransfekowane limfocyty T do probówki o pojemności 15 ml i odwirowuj z prędkością 80 ×g. Resuspenduj komórki w 300 µL buforu H-B-S-B-S-A. Następnie dodaj przeciwciało H 57 FAB lub fragment zmienny pojedynczego łańcucha H 57 w celu znakowania TCR do stężenia końcowego 10 µg/ml dla fab lub 20 µg/ml dla fragmentu zmiennego pojedynczego łańcucha.Przenieś komórki do probówki typu Falcon o pojemności pięciu mililitrów. Następnie, używając strzykawki z końcówką 1 ml, wstrzyknij komórki do komory przepływowej poprzez zawór trójdrożny. Skonfiguruj warunki obrazowania tak, aby dwukanałowa akwizycja na żywo wyświetlała podgląd kanałów TCR i GFP, a następnie znajdź pole z komórkami transfekowanymi.Ze względu na różnice w intensywności sygnałów TCR i GFP, skalowanie obrazów może wymagać korekty w czasie rzeczywistym, aby umożliwić wizualizację komórek w obu kanałach. Podobnie jak w tym przypadku, potwierdź oświetlenie powierzchniowe (turf illumination), przesuwając płaszczyznę szklaną w górę w celu wykrycia ewentualnego barwienia bocznych błon. Jeśli boczne błony nie wchodzą w ognisko, oznacza to, że ustawienie powierzchniowe jest prawidłowe.W tym podglądzie na żywo barwienie błony bocznej jest widoczne zarówno w płaszczyźnie szkiełka nakrywki, jak i w momencie, gdy szkiełko nakrywki zostaje przesunięte poza obszar ostrości, aby uzyskać właściwe ustawienie mikroskopu w trybie turf. Kąt lasera względem obiektywu zostaje zwiększony, a błona boczna traci ostrość. Rozpocznij przechwytywanie pojedynczych obrazów oraz sekwencji poklatkowych z interwałem 10 s.Przez pięć minut komórki inkubowano na dwuwarstwach szklanych i INTA zawierających sześć cząsteczek na mikrometr kwadratowy peptydu z tagiem His IEFK, 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy ICAM-1 z tagiem His sprzężonego z Alexa 647 oraz 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy CD80 zakotwiczonego w GPI. Przeprowadzono jednoczesną akwizycję obrazów dwukanałowych za pomocą mikroskopii TURF w stałej obecności fragmentu FAB H57 sprzężonego z Alexa 546.Aby zabarwić TCR, komórki obrazowano do jednej godziny po pierwszym kontakcie z warstwą dwuskładnikową. Liczbę skupisk ZAP 70 na komórkę analizowano przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania do liczenia skupisk. W każdym przypadku przeanalizowano co najmniej 40 komórek.Załadowane peptydy są wskazane na wstawce. ICAM 1 odnosi się do komórek na dwuwarstwach zawierających 100 cząsteczek na mikrometr kwadratowy sprzężonego Alexa 647 z His-tagiem ICAM 1, jak pokazano na rycinie. Sygnalizacja zależna od Zap 70 zachodzi w mikroskupiskach TCR i tylko w odpowiedzi na ligandy agonistyczne, co można zaobserwować w tym filmie, zarejestrowanym w tempie 10 sekund na klatkę.Sygnalizacja TCR w odpowiedzi na peptydy agonistyczne jest podtrzymywana przez ciągłe tworzenie mikroklastrów TCR na obrzeżach obszaru kontaktu, które rekrutują ZAP 70. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak transfekować pierwotne limfocyty T przy użyciu technologii maxa nuclear affection oraz jak prawidłowo obrazować rekrutację cząsteczek sygnałowych GFPT do mikroklastrów TCR za pomocą mikroskopii turf. Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć siedem godzin.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby obchodzić się z komórkami pierwotnymi bardzo delikatnie. Im zdrowsze będą komórki na każdym etapie eksperymentu, tym wyższa będzie wydajność transfekcji i tym więcej komórek uda się uchwycić podczas obrazowania. Limfocyty T są bardzo ruchliwe, w efekcie czego sekwencyjne obrazowanie kanału TCR i GFP powoduje, że dwa obrazy nie pokrywają się idealnie ze względu na przemieszczanie się mikroklastrów TCR i samych komórek.Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy dwukanałowy mikroskop turf do jednoczesnej akwizycji obrazu.

a-tirf-microscopy-technique-for-real-time-simultaneous-imaging-tcr

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Technika mikroskopii TIRF do obrazowania w czasie rzeczywistym i jednoczesnego przedstawienia TCR oraz powiązanych białek sygnałowych

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to potężna metoda obserwacji struktur znajdujących się blisko powierzchni komórki przy wysokim kontraście i rozdzielczości czasowej. Demonstrujemy, w jaki sposób TIRF może być wykorzystany do badania dynamiki białek w korze bakterii i grzybów otoczonych ścianą komórkową.

Wizualizacja organizacji i dynamiki kory mikroorganizmów z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Opisujemy metodę obrazowania żywych komórek, która dostarcza wglądu w dynamikę białek podczas procesu aktywacji limfocytów T. Demonstrujemy połączone zastosowanie testu rozprzestrzeniania się komórek T, mikroskopii konfokalnej i analizy obrazowania w celu uzyskania wyników ilościowych w celu śledzenia tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego podczas aktywacji komórek T.

Obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym tworzenia kompleksu sygnalizacyjnego limfocytów T

Ten protokół opisuje, jak używać mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia do wizualizacji i śledzenia pojedynczych receptorów na powierzchni żywych komórek, a tym samym do analizy bocznej ruchliwości receptora, wielkości kompleksów receptorowych, a także do wizualizacji przejściowych interakcji receptor-receptor. Protokół ten można rozszerzyć na inne białka błonowe.

Wysokorozdzielcza czasoprzestrzenna analiza dynamiki receptorów za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ten manuskrypt opisuje, jak przeprowadzić (pojedyncze cząsteczki) testy oparte na transferze energii rezonansu Förstera (FRET) w celu zmierzenia dynamiki wiązania między receptorem antygenu limfocytów T (TCR) a cząsteczkami MHC naładowanymi peptydami antygenowymi, które występują w synapsie immunologicznej limfocytu T w kontakcie z funkcjonalizowaną dwuwarstwą lipidową podpartą planarnie.

Pomiar wiązania TCR-pMHC in situ za pomocą testu mikroskopowego opartego na FRET

Znakowanie domeny zewnątrzkomórkowej białka błonowego za pomocą wrażliwego na pH fluoroforu, superekliptycznej pHluoryny (SEP), pozwala na określenie subkomórkowej lokalizacji, ekspresji i transportu. Obrazowanie białek znakowanych SEP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) umożliwia ilościowe określenie poziomów białek w obwodowej ER i błonie plazmatycznej.

Wykorzystanie receptorów znakowanych pHluoryną do monitorowania lokalizacji subkomórkowej i transportu

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Przedstawiamy protokół do implementacji mikroskopii interferencyjno-refleksyjnej i mikroskopii totalno-wewnętrznej-refleksyjno-fluorescencyjnej do jednoczesnego obrazowania dynamicznych mikrotubul i fluorescencyjnie znakowanych białek związanych z mikrotubulami.

Mikroskopia fluorescencyjna z jednoczesnym odbiciem interferencyjnym i całkowitym odbiciem wewnętrznym do obrazowania dynamicznych mikrotubul i powiązanych białek

Ten protokół jest przewodnikiem do wizualizacji dynamicznych aktyny i mikrotubul za pomocą testu in vitro total internal fluorescence (TIRF)  mikroskopowego.

Wizualizacja dynamiki sprzężeń aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF)

Poznaj technikę mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania receptora TCR i białek sygnałowych w komórkach T. Ta metoda umożliwia badanie dynamiki sygnalizacji immunologicznej w czasie rzeczywistym.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Przeglądaj więcej filmów