Name: Ślina, gruczoły ślinowe i kolekcja hemolimfy od Ixodes scapularis Ticks (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: Naucz się pobierać hemolimfę, gruczoły ślinowe i ślinę od kleszczy Ixodes scapularis. Ta metoda umożliwia badanie patogenów przenoszonych przez kleszcze i ich interakcji z białkami ślinowymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować pracownikom Oddziału Zasobów Zwierzęcych Dywizji Chorób Przenoszonych przez Wektory, a w szczególności Andrea Peterson, Lisa Massoudi, Verna O'Brien i Johnowi Liddellowi za opiekę nad myszami i królikami oraz ich utrzymanie. Chcielibyśmy również podziękować Amy Ullmann, Theresie Russell i Barbarze J. Johnson za ich wkład w przygotowanie niniejszego manuskryptu. Na koniec pragniemy podziękować Alissie Eckert z Biura Zastępczego Dyrektora ds. Komunikacji w CDC za przygotowanie ilustracji graficznych oraz Judy Lavelle za nadzór nad wszystkimi kwestiami prawnymi związanymi z filmowaniem materiału do niniejszego manuskryptu.

1. Pobieranie hemolimfy do przygotowania preparatów
(Film 1)
<ol>
	<li>Ostrożnie usuń aktywnie żerujące kleszcze z organizmu zwierzęcia, umieść je w 3% nadtlenku wodoru do stosowania miejscowego na 5 minut, a następnie w 70% etanolu na 10 minut w celu sterylizacji powierzchniowej.</li>
	<li>Za pomocą pisaka do cytologii (pap pen) narysuj okrąg na szkiełku mikroskopowym powleczonym silanem i umieść kleszcza wewnątrz tego okręgu.
	<ol>
		<li>Szkiełka powleczone silanem stosuje się, aby zapewnić najlepszą adhezję hemolimfy do szkiełka mikroskopowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym (obiektyw 1X, okular 10X, powiększenie 3,5X).</li>
	<li>Delikatnie naciśnij pęsetą na grzbiet kleszcza, aby rozsunąć jego odnóża i unieruchomić zwierzę.</li>
</ol>
Uwaga: Podczas unieruchamiania kleszcza nie należy naciskać zbyt mocno, ponieważ może to doprowadzić do uszkodzenia jelita środkowego lub przebicia kleszcza i zanieczyszczenia hemolimfy.
<ol start="5">
	<li>Amputować nogę lub nogi kleszcza w stawie dystalnym za pomocą jednorazowego skalpela z cienkim ostrzem. Aby określić zakaźność poprzez hemolimfę, wystarczy amputować tylko jedną nogę. W celu pobrania hemolimfy na szkiełko przedmiotowe można amputować kilka nóg.</li>
</ol>
Uwaga: Nie należy odcinać odnóża zbyt blisko ciała, ponieważ może to spowodować zanieczyszczenie hemolimfy treścią z jelita środkowego.
<ol start="6">
	<li>Po odcięciu jednej lub wszystkich nóg należy kontynuować delikatne uciskanie grzbietu kleszcza, aby hemolimfa wydzieliła się z nóg na szkiełko. Delikatnie przesuwać kleszcza po szkiełku, aby rozprowadzić hemolimfę.</li>
</ol>
2. Usunięcie gruczołu ślinowego
(Filmy 2 i 3)
<ol>
	<li>Nanieś kilka kropel PBS (fosforanowego buforu soli) o objętości 25 μl na szkiełko przedmiotowe i umieść kleszcza w jednej z kropli PBS.</li>
	<li>Obejrzyj kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym (obiektyw 1X, okular 10X, powiększenie 3,5X).</li>
	<li>Unieruchom kleszcza za pomocą pęsety z cienkim czubkiem, trzymając go za basis capitulum (aparat gębowy) lub za tylną część ciała.</li>
	<li>Wprowadź pęsetę z cienkim czubkiem w tylną część kleszcza i przetnij grzbiet, aby odsłonić narządy. W razie potrzeby w tym momencie można usunąć jelito środkowe i przenieść je do nowej kropli PBS na szkiełku przedmiotowym lub do probówki do wirówki zawierającej PBS.</li>
	<li>Zlokalizuj parę gruczołów ślinowych (skupiska przypominające winogrona) rozmieszczonych obustronnie wzdłuż odnóży kleszcza. Jeśli gruczoły ślinowe nie są widoczne wśród szczątków kleszcza, przenieś główną część ciała kleszcza, w której wciąż znajdują się gruczoły ślinowe, do nowej kropli PBS, aby ograniczyć zanieczyszczenie i zapobiec utracie gruczołów.</li>
</ol>
Uwaga: Na wczesnym etapie żerowania gruczoły ślinowe są trudniejsze do zlokalizowania, ponieważ nie są tak rozwinięte jak w późniejszej fazie karmienia.
<ol start="6">
	<li>Usunąć gruczoły ślinowe z kleszcza za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami i umieścić je w nowej kropli PBS.</li>
	<li>Za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami przenieść gruczoły ślinowe do kolejnej czystej kropli 25 μl PBS; powtórzyć ten etap płukania jeszcze 3-4 razy, aby usunąć wszelkie zewnętrzne mikroorganizmy oraz resztki tkanek kleszcza.</li>
</ol>
Uwaga: clusters gruczółów ślinowych należy płukać delikatnie, aby zminimalizować straty i uszkodzenia poszczególnych gruczółów ślinowych.
<ol start="8">
	<li>Umieść gruczoły w czystej kropli PBS na szkiełku pokrytym silanem lub w probówce do wirówki zawierającej PBS.</li>
</ol>
3. Pobieranie śliny
(Film 4)
<ol>
	<li>Tuż przed całkowitym odczepieniem się w pełni nasyconych kleszczy, około 5-7 dni po przymocowaniu, delikatnie usuń dorosłe samice z królika lub innego żywiciela, używając pęsety z cienkimi końcówkami.</li>
	<li>Przytwierdź niemal nasyconego kleszcza do jednego końca szkiełka przedmiotowego za pomocą taśmy klejącej. Taśmę należy umieścić mniej więcej w 3/4 długości grzbietu kleszcza w kierunku głowy, pozostawiając odsłoniętą podstawę kapituluma (części gębowe) kleszcza.</li>
	<li>W miejscu, gdzie taśma styka się z przednią krawędzią powierzchni grzbietowej kleszcza, nanieś pipetą 5 μl 5% roztworu pilokarpiny (w metanolu). Pozostaw pilokarpinę, aby została wchłonięta przez taśmę na grzbiet kleszcza, dbając o to, by pilokarpina nie miała kontaktu z podstawą kapituluma kleszcza.</li>
	<li>Przymocuj kawałek nietoksycznej plasteliny do szkiełka przedmiotowego w odległości około jednej uncji od części gębowych kleszcza.</li>
	<li>Używając pęsety z cienkimi końcówkami, odłam końcówkę dociąganej rurki kapilarnej28 do pożądanej średnicy.</li>
	<li>Obejrzyj podstawę kapituluma kleszcza pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
	<li>Delikatnie wsuń hypostom kleszcza do dociąganej rurki kapilarnej, pozwalając, aby palpy szczękowe pozostały na zewnątrz rurki kapilarnej.</li>
	<li>Wciśnij przeciwległy koniec rurki kapilarnej w plastelinę, aby utrzymać rurkę na miejscu.</li>
	<li>Umieść zamocowanego, śliniącego się kleszcza w ciemnej komorze o wysokiej wilgotności (np. w zamkniętym pudełku styropianowym wyłożonym mokrymi ręcznikami papierowymi). Przechyl szkiełko tak, aby hypostom był skierowany w stronę dna pojemnika, co pozwoli grawitacji wspomóc zbieranie śliny.</li>
	<li>Pozostaw pojemnik w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dokładnie monitoruj śliniące się kleszcze przez pierwszą godzinę i zbieraj ślinę w miarę jej wydzielania, wypychając ją z rurek kapilarnych za pomocą gruszki do pipety Pasteura. Po pierwszej godzinie sprawdzaj ilość nagromadzonej śliny co godzinę przez co najmniej 4 godziny. Kontynuuj zbieranie śliny w miarę jej wydzielania.</li>
</ol>
Uwaga: Pobieranie śliny można przerwać po zebraniu ilości wystarczającej do przeprowadzenia planowanego badania.
<ol start="12">
	<li>Jeśli kleszcze nie ślinią się lub jeśli wymagana jest większa ilość śliny, ślinienie można sporadycznie indukowć, masując hypostom za pomocą rurki kapilarnej.</li>
	<li>Do śliny dodać 0,1 objętości koktajlu inhibitorów proteaz i przechowywać w temperaturze -80°C do momentu użycia.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Film 1 demonstruje sposób trzymania częściowo nasyconej nimfy I. scapularis oraz amputacji odnóży w celu zebrania hemolimfy na szkiełko mikroskopowe. Po amputacji odnóża wydzielany jest przezroczysty płyn (rycina 1A i 1B). W przypadku przerwania jelita środkowego hemolimfa wypływająca z amputowanych odnóży jest mętna (rycina 1C i 1D).
Ekstrakcję gruczołów ślinowych po 48 lub 72 godzinach żerowania nimfy przedstawiono w filmach 2 i 3. Po nakłuciu kleszcza zazwyczaj powstaje dużo zanieczyszczeń (składających się z tchawicek, cewek Malpighiego, krwi, tkanki łącznej itp.); aby zapobiec utracie lub uszkodzeniu gruczołów ślinowych, należy przenieść kleszcza do świeżej porcji PBS. Rysunki 2A i 2B pokazują położenie gruczołów ślinowych po rozcięciu nimfy, a rysunek 2C przedstawia wyizolowane skupiska gruczołów ślinowych w PBS.
Przygotowanie do pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis pokazano w filmie 4 i na rysunku 3. Kleszcz wydzielający ślinę do kapilary widoczny jest w filmie 5. Ta metoda pobierania śliny wykorzystuje pilokarpinę w celu stymulacji saliwacji i pozwala na uzyskanie ponad 20 μl śliny z jednej dorosłej samicy kleszcza.
<img alt="Schemat anatomii kleszcza; oznaczone gruczoły ślinowe, hypostom, grzbiet, jelito środkowe; biologia edukacyjna." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1."> 
Rycina 1. Oznaczone struktury nimfy I. scapularis.
Film 1. Ixodes scapularis pobieranie hemolimfy. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie1.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Proces sekcji kleszcza; obraz mikroskopowy; badania biologiczne; metoda badania w parazytologii." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2."> 
Rycina 2. Niezanieczyszczona (A i B) oraz zanieczyszczona (C i D) hemolimfa wypływająca z nogi nimfy.
Film 2. Wyizolowanie gruczołów ślinowych z nimfy I. scapularis karmionej przez 48 godzin.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie2.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
Film 3. Ekstrakcja gruczołów ślinowych z nimfy I. scapularis karmionej przez 72 godziny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie3.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Proces żerowania kleszczy; powiększone obrazy mikroskopowe; etapy przytwierdzania się pasożyta i pobierania posiłku krwi." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3."> 
Rycina 3. Ixodes scapularis gruczoły ślinowe nimfy. (A i B) Przykłady gruczołów ślinowych u nimfy żerującej przez 72 h, przed ekstrakcją. (C) Wyizolowany zespół gruczołów ślinowych.
Film 4. Przygotowanie do pobierania śliny od dorosłej samicy kleszcza I. scapularis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie4.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.
<img alt="Proces przytwierdzania kleszcza, układ eksperymentalny z szkiełkami, narzędzie do usuwania kleszczy, analiza preparatu." src="/files/ftp_upload/3894/3894fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4."> 
Rycina 4. Pobieranie śliny od dorosłych samic kleszczy I. scapularis. (A i B) Kleszcz zamocowany na szkiełku z hypostomem w wyssawanym końcu rurki kapilarnej, przy czym koniec niewyssawany rurki kapilarnej jest unieruchomiony plasteliną. (C i D) Komora nawilżana zawierająca saliwujących dorosłe samice kleszczy I. scapularis.
Film 5. Ixodes scapularis samica kleszcza saliwująca do rurki kapilarnej. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3894/3894movie5.avi">Kliknij tutaj, aby obejrzeć film</a>.

<ol><li>Quach, K. A., Boctor, F. N., Elston, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What%27s+eating+you%3F+Hyalomma+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Cutis%22%5BJournal%5D)">What's eating you? Hyalomma ticks.</a> Cutis. 87, 165-167 (2011).</li>
<li>Graham, J., Stockley, K., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+illnesses%3A+a+CME+update%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr.+Emerg.+Care%22%5BJournal%5D)">Tick-borne illnesses: a CME update.</a> Pediatr. Emerg. Care. 27, 141-147 (2011).</li>
<li>Nuttall, P. A., Paesen, G. C., Lawrie, C. H., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector-host+interactions+in+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Microbiol.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Vector-host interactions in disease transmission.</a> J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2, 381-386 (2000).</li>
<li>Estrada-Pena, A., Jongejan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ticks+feeding+on+humans%3A+a+review+of+records+on+human-biting+Ixodoidea+with+special+reference+to+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Ticks feeding on humans: a review of records on human-biting Ixodoidea with special reference to pathogen transmission.</a> Exp. Appl. Acarol. 23, 685-715 (1999).</li>
<li>Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen-tick-host+interactions%3A+Borrelia+burgdorferi+and+TBE+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Zentralbl+Bakteriol%22%5BJournal%5D)">Pathogen-tick-host interactions: Borrelia burgdorferi and TBE virus.</a> Zentralbl Bakteriol. 289, 492-505 (1999).</li>
<li>Jones, L. D., Hodgson, E., Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+virus+transmission+by+tick+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of virus transmission by tick salivary glands.</a> J. Gen. Virol. 70, 1895-1898 (1989).</li>
<li>Labuda, M., Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-borne+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick-borne viruses.</a> Parasitol. 129, 221-245 (2004).</li>
<li>Socolovschi, C., Mediannikov, O., Raoult, D., Parola, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+tick-borne+bacterial+diseases+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Parasite%22%5BJournal%5D)">Update on tick-borne bacterial diseases in Europe.</a> Parasite. 16, 259-273 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Interactions+that+Enable+Movement+of+the+Lyme+Disease+Agent+from+the+Tick+Gut+into+the+Hemolymph%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Molecular Interactions that Enable Movement of the Lyme Disease Agent from the Tick Gut into the Hemolymph.</a> PLoS Pathog. 7, e1002079(2011).</li>
<li>Piesman, J., Schneider, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+Lyme+disease+spirochetes+during+transmission+by+nymphal+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in Lyme disease spirochetes during transmission by nymphal ticks.</a> Exp. Appl. Acarol. 28, 141-145 (2002).</li>
<li>Brossard, M., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick immunobiology.</a> Parasitol. , Suppl 129. S161-S176 (2004).</li>
<li>Machackova, M., Obornik, M., Kopecky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+salivary+gland+extract+from+Ixodes+ricinus+ticks+on+the+proliferation+of+Borrelia+burgdorferi+sensu+stricto+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Effect of salivary gland extract from Ixodes ricinus ticks on the proliferation of Borrelia burgdorferi sensu stricto in vivo.</a> Folia Parasitol. 53, 153-158 (2006).</li>
<li>Nuttall, P. A., Labuda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host+interactions%3A+saliva-activated+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick-host interactions: saliva-activated transmission.</a> Parasitol. 129, 177-189 (2004).</li>
<li>Anguita, J., Hedrick, M. N., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+Borrelia+burgdorferi+in+the+tick+and+the+mammalian+host%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation of Borrelia burgdorferi in the tick and the mammalian host.</a> FEMS Microbiol. Rev. 27, 493-504 (2003).</li>
<li>Hovius, J. W., van Dam, A. P., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick-host-pathogen+interactions+in+Lyme+borreliosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick-host-pathogen interactions in Lyme borreliosis.</a> Trends Parasitol. 23, 434-438 (2007).</li>
<li>Dunham-Ems, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+reveals+a+biphasic+mode+of+dissemination+of+Borrelia+burgdorferi+within+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks.</a> Journal Clin. Invest. 119, 3652-3665 (2009).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Mather, T. N., Piesman, J., Spielman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+and+salivary+delivery+of+Lyme+disease+spirochetes+in+vector+ticks+%28Acari%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Dissemination and salivary delivery of Lyme disease spirochetes in vector ticks (Acari: Ixodidae).</a> J. Med. Entomol. 24, 201-205 (1987).</li>
<li>Piesman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+Lyme+disease+spirochetes+%28Borrelia+burgdorferi%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Appl.+Acarol%22%5BJournal%5D)">Transmission of Lyme disease spirochetes (Borrelia burgdorferi.</a> Exp. Appl. Acarol. 7, 71-80 (1989).</li>
<li>De Silva, A. M., Fikrig, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+migration+of+Borrelia+burgdorferi+in+Ixodes+ticks+during+blood+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Growth and migration of Borrelia burgdorferi in Ixodes ticks during blood feeding.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 397-404 (1995).</li>
<li>Horka, H., Cerna-Kyckova, K., Skallova, A., Kopecky, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+saliva+affects+both+proliferation+and+distribution+of+Borrelia+burgdorferi+spirochetes+in+mouse+organs+and+increases+transmission+of+spirochetes+to+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Tick saliva affects both proliferation and distribution of Borrelia burgdorferi spirochetes in mouse organs and increases transmission of spirochetes to ticks.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 373-380 (2009).</li>
<li>Brossard, M., Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+interactions+between+ticks+and+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Vet.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Immunology of interactions between ticks and hosts.</a> Med. Vet. Entomol. 11, 270-276 (1997).</li>
<li>Wikel, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+modulation+of+host+immunity%3A+an+important+factor+in+pathogen+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Tick modulation of host immunity: an important factor in pathogen transmission.</a> Int. J. Parasitol. 29 (99), 851-859 (1999).</li>
<li>Binnington, K. C., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+tick+salivary+glands+in+feeding+and+disease+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Role of tick salivary glands in feeding and disease transmission.</a> Adv. Parasitol. 18, 315-339 (1980).</li>
<li>Guo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+neutrophil+function+by+two+tick+salivary+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Inhibition of neutrophil function by two tick salivary proteins.</a> Infect. Immun. 77, 2320-2329 (2009).</li>
<li>Montgomery, R. R., Lusitani, D., De Boisfleury Chevance, A., Malawista, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tick+saliva+reduces+adherence+and+area+of+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Tick saliva reduces adherence and area of human neutrophils.</a> Infect. Immun. 72, 2989-2994 (2004).</li>
<li>Lima, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+infectivity+of+the+Lyme+disease+spirochete+Borrelia+burgdorferi+derived+from+Ixodes+scapularis+salivary+glands+and+midgut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Differential infectivity of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi derived from Ixodes scapularis salivary glands and midgut.</a> J. Med. Entomol. 42, 506-510 (2005).</li>
<li>Severinova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-inoculation+of+Borrelia+afzelii+with+tick+salivary+gland+extract+influences+distribution+of+immunocompetent+cells+in+the+skin+and+lymph+nodes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Folia+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Co-inoculation of Borrelia afzelii with tick salivary gland extract influences distribution of immunocompetent cells in the skin and lymph nodes of mice.</a> Folia Microbiol. 50, 457-463 (2005).</li>
<li>How to pull capillary tubes [Internet]. , benchflydotcom. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM">http://www.youtube.com/watch?v=2yKHvKCatmM</a> (2009).</li>
<li>Labuda, M., Jones, L. D., Williams, T., Nuttall, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+tick-borne+encephalitis+virus+transmission+by+tick+salivary+gland+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Vet.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Enhancement of tick-borne encephalitis virus transmission by tick salivary gland extracts.</a> Med. Vet. Entomol. 7, 193-196 (1993).</li>
<li>Kariu, T., Coleman, A. S., Anderson, J. F., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+Rapid+Transfer+and+Localization+of+Lyme+Disease+Pathogens+Within+the+Tick+Gut%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods for Rapid Transfer and Localization of Lyme Disease Pathogens Within the Tick Gut.</a> J. Vis. Exp. (48), e2544(2011).</li>
<li>Edwards, K. T., Goddard, J., Varela-Stokes, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Examination+of+the+internal+morphology+of+the+Ixodid+tick+Amblyomma+maculatum+koch%2C+%28Acari%3AIxodidae%29%3B+a+%22How-to%22+pictorial+dissection+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Midsouth+Entomologist%22%5BJournal%5D)">Examination of the internal morphology of the Ixodid tick Amblyomma maculatum koch, (Acari:Ixodidae); a "How-to" pictorial dissection guide.</a> Midsouth Entomologist. 2, 28-39 (2009).</li>
<li>Ledin, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Borreliacidal+activity+of+saliva+of+the+tick+Amblyomma+americanum%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Vet.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Borreliacidal activity of saliva of the tick Amblyomma americanum.</a> Med. Vet. Entomol. 19, 90-95 (2005).</li>
<li>Ribeiro, J. M., Zeidner, N. S., Ledin, K., Dolan, M. C., Mather, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+much+pilocarpine+contaminates+pilocarpine-induced+tick+saliva%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Med.+Vet.+Entomol%22%5BJournal%5D)">How much pilocarpine contaminates pilocarpine-induced tick saliva?</a> Med. Vet. Entomol. 18, 20-24 (2004).</li>
<li>Barker, R. W., Burris, E., Sauer, J. R., Hair, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+of+tick+oral+secretions+obtained+by+three+different+collection+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Entomol%22%5BJournal%5D)">Composition of tick oral secretions obtained by three different collection methods.</a> J. Med. Entomol. 10, 198-201 (1973).</li>
<li>Burgdorfer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemolymph+test.+A+technique+for+detection+of+rickettsiae+in+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Hemolymph test. A technique for detection of rickettsiae in ticks.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 19, 1010-1014 (1970).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny kleszczy jest istotne w badaniu transmisji, rozpowszechnienia, dysseminacji, proliferacji i przetrwania patogenów przenoszonych przez kleszcze zarówno w organizmie kleszcza, jak i gospodarza 6,11-13,20,23,29. Istnieje kilka metod sekcji kleszcza30,31. Jednak podczas pobierania gruczołów ślinowych kluczowe jest prawidłowe przeprowadzenie sekcji, aby gruczoły te nie zostały przerwane ani zagubione w szczątkach kleszcza. Po usunięciu gruczołów ślinowy...

<table><tbody><tr><td>Nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Acros Organics</td><td>61509-5000</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-2205</td><td></td></tr><tr><td>Precyzyjna pęseta Dumont (3C)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9906085</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki mikroskopowe traktowane silanem</td><td>Bioworld</td><td>42763007-1</td><td></td></tr><tr><td>Pisak PAP</td><td>Bioworld</td><td>21750008-1</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki mikroskopowe Super Frost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-18</td><td></td></tr><tr><td>Pilocarpina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6503-5G</td><td></td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowy skalpel #11</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975#11</td><td></td></tr><tr><td>Nietoksyczna glina modelarska</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17307</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary</td><td>Chase Scientific Glass, Inc.</td><td>40A502</td><td></td></tr></tbody></table>

pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy ixodes scapularis

Saliva, Salivary Gland, and Hemolymph Collection from Ixodes scapularis Ticks

Kleszcze występują na całym świecie i zarażają ludzi wieloma chorobami odkleszczowymi. Kleszcze są wektorami patogenów wywołujących boreliozę i nawracającą gorączkę kleszczową (Borrelia spp.), plamistą gorączkę Górskich Skał (Rickettsia rickettsii), ehrlichiozę (Ehrlichia chaffeensis i E. equi), anaplazmozę (Anaplasma phagocytophilum), zapalenie mózgu (wirus kleszczowego zapalenia mózgu), babeszjozę (Babesia spp.), gorączkę kleszczową Kolorado (Coltivirus) oraz tularemię (Francisella tularensis) 1-8. Aby zostać prawidłowo przeniesionymi do gospodarza, czynniki zakaźne te różnicowo regulują ekspresję genów, oddziałują z białkami kleszcza i migrują przez jego organizm 3,9-13. Na przykład czynnik wywołujący boreliozę, Borrelia burgdorferi, adaptuje się poprzez różnicową ekspresję genów do etapów sytości i głodu w cyklu enzootycznym kleszcza 14,15. Ponadto, gdy kleszcz z rodzaju Ixodes spożywa posiłek z krwi, Borrelia namnażają się i migrują z jelita środkowego do hemocelu, skąd przedostają się do gruczołów ślinowych i są przenoszone do gospodarza wraz z wydzielaną śliną 9,16-19.
Kiedy kleszcz żeruje, organizm gospodarza zazwyczaj reaguje silną odpowiedzią hemostatyczną i wrodzoną odpowiedzią immunologiczną 11,13,20-22. Pomimo tych reakcji gospodarza, I. scapularis może żerować przez kilka dni, ponieważ ślina kleszcza zawiera białka o działaniu immunomodulującym, czynniki lityczne, przeciwkrzepliwe oraz fibrinolityczne, które wspomagają żerowanie kleszcza 3,11,20,21,23. Działania immunomodulujące śliny kleszcza lub ekstraktu z gruczołów ślinowych (SGE) ułatwiają transmisję, proliferację i rozprzestrzenianie się licznych patogenów przenoszonych przez kleszcze 3,20,24-27. Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób infekcyjne czynniki przenoszone przez kleszcze wywołują chorobę, niezbędne jest przeprowadzenie sekcji aktywnie żerujących kleszczy i pobranie ich śliny. Niniejszy protokół wideo prezentuje techniki sekcji w celu pobrania hemolimfy i usunięcia gruczołów ślinowych z aktywnie żerujących nimf I. scapularis po 48 i 72 godzinach od umieszczenia na myszy. Prezentujemy również metodę pobierania śliny od dorosłej samicy kleszcza I. scapularis.

Pozyskiwanie hemolimfy, gruczołów ślinowych i śliny z zakażonych kleszczy jest istotne dla badania mechanizmów wywoływania chorób przez patogeny przenoszone przez kleszcze. W niniejszym protokole demonstrujemy sposób pobierania hemolimfy i gruczołów ślinowych z żerujących nimf Ixodes scapularis. Przedstawiamy również metodę pobierania śliny od dorosłych samic I. scapularis.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Kleszcze występują na całym świecie i są przyczyną wielu chorób przenoszonych przez kleszcze u ludzi. Kleszcze są wektorami patogenów wywołujących boreliozę oraz kleszczowe...

Ogólnym celem tej procedury jest pobranie kleszczy, hemolimfy oraz gruczołów ślinowych wraz ze śliną z aktywnie żerujących kleszczy ex ODI scapularis. Osiąga się to najpierw poprzez amputację nogi kleszcza w stawie dystalnym w celu usunięcia hemolimfy. Następnie pobiera się gruczoły ślinowe poprzez sekcję kleszcza w roztworze soli fosforanowej (PBS), zlokalizowanie gruczołów ślinowych i przeniesienie ich do czystej porcji PBS.Ślinę pobiera się poprzez naniesienie pilokarpiny na grzbiet kleszcza za pomocą mikropipety, wprowadzenie gęby kleszcza do wspólnej rurki kapilarnej i umożliwienie kleszczowi wydzielenia śliny do rurki. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące obecność mikroorganizmów w hemolimfie lub gruczołach ślinowych za pomocą immunofluorescencji lub analizy białek. Wśród innych wyników analizowane są interakcje białek z białkami śliny.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z pobieraniem hemolimfy napotykają trudności, ponieważ unieruchomienie kleszcza bez przerwania jelita środkowego, co prowadziłoby do zanieczyszczenia hemolimfy, jest zadaniem trudnym. Podobnie może być z pobieraniem śliny, ponieważ nie wszystkie kleszcze ją wydzielają. Dlatego ważne jest, aby próbowa

saliva-salivary-gland-hemolymph-collection-from-ixodes-scapularis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ślina, gruczoły ślinowe i pobieranie hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Produkcja zdrowych kleszczy hodowanych w laboratorium jest niezbędna do badań nad biologią kleszczy i interakcjami kleszcz-patogen. Tutaj pokazujemy prosty protokół karmienia niedojrzałych kleszczy, który jest opłacalny i mniej stresujący dla myszy.

Hodowla Ixodes scapularis, kleszcza czarnonogiego: karmienie niedojrzałych stadiów na myszach

Tutaj prezentujemy protokół do przestrzennej i czasowej oceny obecności żywotnej mikroflory w jelitach kleszczy przy użyciu zmodyfikowanego podejścia do hybrydyzacji in situ.

Wizualizacja mikrobioty w jelitach kleszczy poprzez hybrydyzację in situ w całości

Analiza hemolimfy kleszczowej stanowi ważne źródło informacji o tym, jak niektóre patogeny wywołują choroby i jak kleszcze reagują immunologicznie na tę infekcję. Niniejsze badanie pokazuje, jak zaszczepić propagule grzybów i zebrać hemolimfę od nabrzmiałych samic Rhipicephalus microplus.

Ujawnienie zbierania hemolimfy i inokulacji blastospor Metarhizium do kleszczy Rhipicephalus microplus w kierunku badań patologii bezkręgowców

W tym badaniu, system żywienia dla nimfalnych i larwalnych stadiów kleszcza twardego został opracowany za pomocą kapsułki dołączonej do myszy laboratoryjnej. Kapsuła do karmienia jest wykonana z elastycznych materiałów i pozostaje mocno przymocowana do myszy przez co najmniej tydzień i umożliwia wygodne monitorowanie żerowania kleszczy.

Oparty na kapsułkach model do infestacji niedojrzałych stadiów kleszczy twardych na myszach laboratoryjnych

Obecny protokół opisuje izolację mikroRNA z gruczołów ślinowych kleszczy i oczyszczonych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. Jest to uniwersalna procedura, która łączy w sobie powszechnie używane odczynniki i materiały eksploatacyjne. Metoda pozwala również na użycie niewielkiej liczby kleszczy, co skutkuje wysokiej jakości mikroRNA, które można łatwo zsekwencjonować.

Izolacja mikroRNA z kultur gruczołów ślinowych ex vivo kleszczy i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych

Przedstawiona tutaj jest metoda nawożenia kleszczy krwią in vitro za pomocą systemu sztucznej błony, aby umożliwić częściowe lub pełne zagęszczenie różnych etapów życia kleszcza.

Karmienie sztuczną membraną kleszcza dla Ixodes scapularis

Opisujemy metodę skutecznego zbierania mierzalnych hemolimfów od małych stawonogów do późniejszej analizy.

Precyzyjna i wymierna metoda zbierania hemolimfy z małych stawonogów

Ten artykuł przedstawia metodologię wystawiania ludzi na działanie larw Ixodes scapularis do badań klinicznych. Technika jest stosunkowo prosta, tolerowana przez ochotników biorących udział w badaniu i może być modyfikowana w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Takie badania z udziałem ludzi muszą być prowadzone zgodnie z protokołami badań klinicznych zatwierdzonymi przez właściwe organy regulacyjne.

Model eksperymentalnego narażenia ludzi na larwy kleszczy Ixodes scapularis

Przedstawiamy protokół polegający na zbieraniu śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych oraz śródjelita po sekcji pojedynczego karmionego kleszcza, aby badać specyficzną lokalizację patogenów przenoszonych przez kleszcze w tkankach i pogłębić zrozumienie kompetencji wektorów oraz interakcji patogen-mikrobiom.

Ekstrakcja śliny, hemolimfy, gruczołów ślinowych i jelita środkowego od pojedynczych kleszczy (Acari: Ixodidae)

Metoda ta opisuje opracowanie systemu żywienia krwią kleszczy in vitro , wykorzystującego komorę drukowaną w 3D oraz laboratoryjnie wykonaną membranę silikonową. System umożliwia sztuczne karmienie kleszczy, umożliwiając łatwe pobieranie próbek na różnych etapach karmienia oraz wykorzystując niewielkie ilości krwi, stanowiąc nieocenione narzędzie do badania kleszczy ixoidied.

Krew kleszczy karmiąca przez sztuczną błonę w komorze wydrukowanej 3D w badaniach nad kleszczami Ixoidida

Naucz się pobierać hemolimfę, gruczoły ślinowe i ślinę od kleszczy Ixodes scapularis. Ta metoda umożliwia badanie patogenów przenoszonych przez kleszcze i ich interakcji z białkami ślinowymi.

Pozyskiwanie śliny, wydzieliny gruczołów ślinowych oraz hemolimfy z kleszczy Ixodes scapularis

Przeglądaj więcej filmów