Rozwój płciowy i wydzielanie askospor u Fusarium graminearum

Ogólnym celem tej procedury jest nauczenie się, jak generować i manipulować rozwojem paratezji oraz prosić o uwolnienie APO w kulturze. Osiąga się to poprzez najpierw indukowanie i aktywne rozwijanie kultury w celu zainicjowania rozwoju seksualnego. Drugim krokiem jest oznaczenie aktywnego wydzielania zarodników, a następnie generowane są rekombinowane paratezy.

Ostatnim krokiem jest ocena potomstwa pod kątem fenotypów, które wskazują, czy nastąpiła rekombinacja, czy nie. Ostatecznie wyniki mogą zostać wykorzystane do badań przesiewowych w kierunku mutantów w rozwoju płciowym lub do wygenerowania wielu mutacji w obrębie jednego szczepu. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ kroki są trudne do opisania i chociaż proste, muszą być wykonane precyzyjnie, aby uzyskać optymalne wydzielanie zarodników i stałą produkcję paratezji.

Zacznij od środkowego zaszczepienia ślimaka marchwi na sześciocentymetrowej szalce Petriego z płodnym szczepem f gramine. Arum inkubuje zaszczepione naczynia pod jasną standardową reklamą. Używaj oświetlenia fluorescencyjnego w temperaturze pokojowej.

Pozwól grzybom rosnąć przez trzy do pięciu dni, aż grzybnia dotrze do zewnętrznej krawędzi naczynia. Na masce. Delikatnie zeskrob powierzchnię kultury sterylną wykałaczką, aby usunąć grzybnię powietrzną.

Następnie nałóż jeden mililitr środka powierzchniowo czynnego na ślimak i wcieraj w powierzchnię wygiętym lub bulwiastym końcem sterylnego szklanego pręta. Bez nakładania perfilu. Umieść talerze z powrotem pod światłami.

Po 24 godzinach powierzchnia płytek powinna mieć błyszczący wygląd. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, zeskrob ją na powierzchnię, ponownie nałóż roztwór tween 60 i zanurz je w świetle przez dodatkowe 24 godziny. Teraz obserwuj rozwój paratezji przez tydzień.

Młode paratezy są widoczne jako czarne ziarna na powierzchni świdra. W porównaniu z dojrzałą paratezją. Grzybni nie powinno być prawie żadna.

Siódmego dnia dojrzałe zarodniki gromadzą się na pokrywie płytki, a w dziewiątym dniu zarodniki są tak gęste, że są widoczne bez powiększenia. Aby zebrać etap pośredni, paratezja delikatnie zeskrobuje powierzchnię ślimaka skalpelem i przenosi paratezję do rurki kriogenicznej. Probówkę można następnie błyskawicznie zamrozić w celu ekstrakcji RNA sześć dni po zastosowaniu środka powierzchniowo czynnego.

Wytnij okrąg o średnicy jednego centymetra ze ślimaka za pomocą drewna, bura lub skalpela. Przekrój okrąg na pół i zamontuj połówki na szklanym szkiełku mikroskopowym, ustaw kawałki tak, aby powierzchnia zawierająca owocniki była prostopadła do powierzchni szkiełka, a zarodniki są wystrzeliwane w dół szkiełka. W tym czasie, jeśli pożądany jest inhibitor zarodników acro, nałóż go na tylną część bloku ślimaka.

Technika ta może być stosowana do badań przesiewowych substancji chemicznych pod kątem inhibitorów wyładowań oraz do badań przesiewowych mutantów genetycznych pod kątem utraty zdolności do wystrzeliwania zarodników, z powodzeniem udało nam się to zrobić. Teraz inkubuj szkiełko przez noc w prostej, oświetlonej, wilgotnej komorze o temperaturze pokojowej. Gdy owocniki wybuchają, zarodniki gromadzą się na szkiełku i będą tam widoczne rano.

Nagromadzone zarodniki można teraz zmyć ze szkiełka, zebrać w czystym naczyniu i określić ilościowo. Zacznij od stworzenia krzyżówki genetycznej między dwoma szczepami f gramine arum, zaszczepiając je po przeciwnych stronach szalki Petriego z marchewką ślimakową. Jak opisano wcześniej, hoduj grzyby, aż łączniki wypełnią powierzchnię.

Zeskrob nadziemne części i nałóż T między 60 roztworem. W tym scenariuszu zaznacz tabliczkę, na której spotykają się łączniki. Przywróć kultury do światła i wysiaduj je przez około siedem dni, kiedy paratezja się rozwinie, a Siri zacznie formować się z paratezji wzdłuż skrzyżowania kultur.

Technika ta może być wykorzystana do łączenia wielu mutacji w jeden szczep. Warto również zauważyć, że można wybrać zarówno dzianinę plus, jak i dzianinę minus, dzięki czemu jest to bardzo przydatny marker do wyboru. Pod mikroskopem preparacyjnym pokaż paratezje wzdłuż przecięcia dwóch kultur.

Następnie znajdź oko do przypalania. Teraz zanurz wysterylizowaną szpilkę do owadów w sterylnej wodzie i dotknij szpilki do surowicy utworzonej na granicy między kulturami. SRI powinny przylegać do wilgoci szpilki.

Następnie przepłucz końcówkę szpilki w 200 mikrolitrach sterylnej wody zawartej w 1,5 mililitrowej mikroprobówce wirówkowej. Podpal szpilkę, ponownie ją zwilż i wybierz inny sru. Wybierz od trzech do pięciu Siri i przenieś je wszystkie do własnej tuby.

Teraz na krótko wir. Każda tuba zawiera zawieszone Siri dla każdej tuby. Rozprowadź 60 mikrolitrów zawiesiny zarodników na dziewięciomilimetrowej szalce Petriego.

Z pożywką MMTS inkubować płytki w temperaturze pokojowej ze światłem lub bez, a pozostałą zawiesinę zarodników przechowywać w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do tygodnia. Po trzech do pięciu dniach na talerzu pojawiają się bardzo małe kolonie. Jeden fenotyp można ocenić pod mikroskopem.

Dzianinowe kolonie ujemne będą miały rzadsze hyphy niż kolonie dzianinowe dodatnie. Wyrzuć te płytki tylko z jednym z fenotypów. Siri z rekombinowanych paratezji mają oba fenotypy kolonii w przybliżeniu w równych proporcjach.

Zachowaj te talerze. Czasami inne fenotypy wynikają z segregacji innych czynników, takich jak kolonie, które są pośrednie między dzianiną dodatnią a dzianinową ujemną do celów przechowywania, przenieś kolonie z rekombinowanych płytek na płytkę V ósemkową lub marchewkową, aby kontynuować badanie, badając inne fenotypy, umieść kolonie na ślimaku doku Chap X i na płytkach z PDA zawierającym chloran. Paratezy były uprawiane na czarnym aksamitnym trawniku bez grzybni i zarodników.

Po 24 godzinach od nałożenia tween, powierzchnia ślimaka miała lekki połysk. Gdyby grzybnia pojawiła się ponownie, płytka mogłaby nie zostać zeskrobana na tyle, aby wywołać rozwój paratezji. Kilka bloków świdra z owocnikami z dzikiego szczepu zostało ustawionych, aby wystrzelić swoje zarodniki na szklanych szkiełkach w celu obserwacji.

Przygotowano odpowiednie odpalenie oświetlenia. Paratezy, które były zbyt młode lub zbyt stare, często nie strzelały. Gdy jest zbyt stary, na powierzchni kultury pojawiają się liczne hyphy, nadając jej białawy odcień.

Gdy owocniki były zbyt młode, nie wystrzeliwały i eksperyment powtórzono. 24 godziny później, gdy 10 Siri zostało zebranych z krzyżówki, co najmniej sześć było typowo rekombinowanych, co zostało ocenionych przez mieszankę fenotypów ujemnych i dodatnich. Bardzo rzadko mutacja uniemożliwiała rozmnażanie się szczepu.

Jeśli jedno z rodziców miało wyraźny fenotyp wzrostu, to więcej niż dwa fenotypy były obecne wśród kolonii na MMTS. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby zacząć od kultury, która była dobrze utrzymana i nie była sekwencyjnie przenoszona w czasie. Zawsze zaczynaj od kultury, która została wyhodowana ze stabilnego materiału w zamrażarce.