Name: Rozwój płciowy i wydzielanie askospor u Fusarium graminearum (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Poznaj techniki indukowania rozwoju płciowego i wydzielania askospor u Fusarium graminearum. Metody obejmują krzyżowanie genetyczne, ocenę fenotypów potomstwa oraz skrining mutantów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant z National Science Foundation (MCB-0923794 dla FT).

1. Wytwarzanie peritecji
<ol>
	<li>Zaszczep w centrum podłoża agarowego z marchewką10 w czarce Petriego o średnicy 6,0 cm szczepem produkcyjnym F. graminearum (zalecany PH-1).</li>
	<li>Umieść zaszczepione czalki pod jasnymi lampami fluorescencyjnymi w temperaturze pokojowej (18-24 °C) i pozostaw do wzrostu, aż grzybnia osiągnie zewnętrzną krawędź czalki (3-5 dni). Komercyjne domowe lampy fluorescencyjne są wystarczające do stymulowania formowania i uwalniania owocników.</li>
	<li>Delikatnie usuń grzybnię powietrzną za pomocą sterylnego wykałaczką.</li>
	<li>Rozprowadź 1,0 ml 2,5 % roztworu Tween 60 na powierzchni za pomocą sterylnego szklanego wycieraczki lub zaokrąglonego końca sterylnego pręta szklanego.</li>
	<li>Ponownie wystaw płytki na światło. Nie zabezpieczaj płytek Parafilmem.</li>
	<li>Po 24 h powierzchnia płytek powinna mieć błyszczącą strukturę. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, zeskrob powierzchnię i ponownie nanieś roztwór Tween-60.</li>
	<li>Obserwuj rozwój perytecji w ciągu kolejnego tygodnia. Pośrednie stadia rozwoju perytecium można pozyskać, delikatnie zeskrobując powierzchnię agaru, a następnie zamrozić je gwałtownie w celu ekstrakcji RNA (Rycina 1).</li>
	<li>Dożrzałe zarodniki zgromadzą się na pokrywce płytki do 7. dnia. Początkowo będą one widoczne tylko pod stereomikroskopem, ale do 9. dnia osiągną gęstość wystarczającą, by były widoczne gołym okiem.</li>
</ol>
2. Test uwalniania ascospor
<ol>
	<li>W 6. dniu po aplikacji roztworu Tween, za pomocą świdra do drewna wyciąć z agaru krążek o średnicy 1 cm. Alternatywnie można użyć skalpela do usunięcia fragmentu o podobnej wielkości. Krążek można przekroić na pół, a każdą z połówek umieścić na szklanym szkiełku mikroskopowym.</li>
	<li>Ułożyć fragmenty tak, aby powierzchnia zawierająca ciała owocnikowe była prostopadła do powierzchni szkiełka, a zarodniki były wyrzucane wzdłuż szkiełka.</li>
	<li>Umieścić szkiełko w komorze wilgotnościowej na noc pod oświetleniem. Zarodniki będą gromadzić się na szkiełku i będą widoczne gołym okiem następnego ranka (Rycina 2).</li>
	<li>Nagromadzone zarodniki można spłukać ze szkiełka wodą i w razie potrzeby poddać kwantyfikacji.</li>
	<li>Potencjalne inhibitory wyrzutu ascospór można badać, dodając je na tylną stronę bloku agarowego podczas przygotowywania testu. Tą techniką badano wcześniej niektóre inhibitory kanałów jonowych, które zmniejszają wyrzut zarodników15.</li>
</ol>
3. Generowanie potomstwa rekombinacyjnego
<ol>
	<li>Rozpocznij krzyżowanie poprzez zaszczepienie agaru z marchwią dwoma szczepami F. graminearum (jednym Nit+ i jednym nit-), umieszczając punkty inokulacji po przeciwnych stronach szalki Petriego.</li>
	<li>Gdy strzępki wypełnią powierzchnię, zeskrob część powietrzną i zastosuj roztwór Tween-60 zgodnie z powyższym opisem. Użyj markera, aby zaznaczyć na boku szalki Petriego miejsce, w którym strzępki się stykają.</li>
	<li>Przenieś kultury do światła i inkubuj, aż rozwiną się peritecja i zaczną formować się cyrry z peritecji wzdłuż linii przecięcia obu kultur.</li>
	<li>Pod mikroskopem stereoskopowym ustaw w polu widzenia peritecja wzdłuż przecięcia obu kultur. Używając wysterylizowanej i zanurzonej w sterylnej wodzie szpilki entomologicznej, delikatnie dotknij końcówką szpilki cyrry wzdłuż tej granicy. Wilgoć na szpilce powinna sprawić, że cyrra przyklei się do niej.</li>
	<li>Opłucz końcówkę szpilki z przyczepioną cyrrą w 200 μl sterylnej wody w probówce Eppendorf, aby wypłukać zarodniki.</li>
	<li>Wypal szpilkę w płomieniu, ponownie ją zwilż i pobierz kolejną cyrrę. Pobierz od 10 do 15 cyrr, umieszczając każdą w oddzielnej probówce z wodą.</li>
	<li>Krótko wymieszaj probówki z zawiesinami cyrr na wirówce typu vortex.</li>
	<li>Pobierz pipetą 60 μl zawiesiny zarodników i nanieś na podłoże MMTS1 na szalce Petriego o średnicy 9 cm. Rozprowadź zawiesinę sterylnym rozprowadzaczem typu „hockey stick”. Pozostałą zawiesinę zarodników można przechowywać w temperaturze 4 °C do tygodnia i w razie potrzeby ponownie wysiać na podłoże.</li>
	<li>Inkubuj w temperaturze pokojowej (światło nie jest wymagane) przez 3-5 dni, aż pojawią się bardzo małe kolonie (Rysunek 3). Wśród kolonii wystąpią dwa rodzaje fenotypów. Kolonie nit- będą miały rzadsze strzępki niż kolonie Nit+. Cyrry z rekombinantowych peritecji wykażą oba fenotypy kolonii w przybliżeniu w równych proporcjach. Odrzuć szalki, na których znajdują się kolonie tylko jednego fenotypu. Należy zauważyć, że czasami w wyniku segregacji innych czynników powstaje więcej niż dwa fenotypy.</li>
	<li>Przenieś kolonie na agar V8 lub agar z marchwią w celu przechowywania. Przetestuj kolonie na agarze Czapek's Dox (szczepy nit- nie będą rosły na Czapek's Dox) oraz na PDA z chloranem (0,5 M chloran potasu; szczepy Nit+ nie będą rosły na PDA z chloranem), aby potwierdzić prawidłowy fenotyp. Zbadaj te kolonie pod kątem pożądanych właściwości.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Wytwarzanie peritecji
Celem jest uzyskanie warstwy peritecji bez widocznej grzybni lub zarodników. Powierzchnia hodowli będzie przypominać czarny aksamit (Rycina 1). 24 h po zastosowaniu Tween powierzchni agaru powinien nadać lekki połysk. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, może to oznaczać, że płytka nie została wystarczająco zeskrobana, aby wywołać rozwój peritecji.
Wyrzut askospor
W badaniu zawsze należy zapewnić kilka bloków agaru z szczepem typu dzikiego. Jeśli nie nastąpi wyrzut zarodników, oznacza to, że peritecja są albo zbyt młode, albo zbyt stare. W przypadku zbyt starych peritecji na powierzchni hodowli pojawi się liczne grzybnia, nadając jej białawy odcień. Jeśli tak nie jest, mogą być one zbyt młode i badanie należy powtórzyć za 24 hr. Sporadycznie zdarza się, że hodowle nie wykazują prawidłowego wyrzutu, wówczas eksperyment trzeba powtórzyć. Należy upewnić się, że badanie jest przeprowadzane w odpowiednich warunkach oświetleniowych.
Potomstwo rekombinowane
Rekombinantne peritecja powinny stanowić większość peritecji wzdłuż styku obu szczepów. Zazwyczaj analizujemy 10 cirrhi z jednego skrzyżowania i co najmniej 4-6 z nich powinno być rekombinantami. Bardzo rzadko mutacja uniemożliwia kopulację szczepu. Jeśli jeden z rodziców wykazuje aberracyjny fenotyp wzrostu, wśród kolonii na MMTS może wystąpić więcej niż 2 fenotypy.
<img alt="Analiza wzorca wzrostu bakterii na szalkach Petriego; wynik eksperymentu dotyczącego wzrostu grzybów." src="/files/ftp_upload/3895/3895fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Etapy rozwoju peritecji na agarze marchwiowym. Po lewej, 72 h po zastosowaniu Tween. Zwróć uwagę na czerwony pigment oraz bardzo młode peritecje widoczne jako czarne ziarna na powierzchni. Po prawej, w 144 h, uformowały się dojrzałe peritecie. Zwróć uwagę na niemal całkowity brak grzybni powierzchniowej w obu kulturach.
<img alt="Obserwacja wzrostu grzyba na agarze; eksperyment na szalce Petriego; analiza tworzenia i rozprzestrzeniania się zarodników." src="/files/ftp_upload/3895/3895fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test wyrzutu zarodników. Pomarańczowy krążek agaru z marchewką jest zorientowany tak, aby zarodniki gwałtownie wyrzucane z dojrzałych peritecji na jego powierzchni mogły gromadzić się na powierzchni szkiełka przedmiotowego. Czas akumulacji 15 hr.
<img alt="Schemat stanu równowagi statycznej z klastrami; obraz mikroskopowy do analizy sedymentacji, badanie cząsteczek." src="/files/ftp_upload/3895/3895fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Różnice w wzroście między koloniami Nit+ a nit- na selektywnym podłożu MMTS. Kolonie nit- (groty strzałek) są mniejsze. Kolonie Nit+ (strzałki) wykazują intensywny wzrost. Fotografia wykonana po 7 dniach.

<ol><li>Bowden, R. L., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+recombination+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Sexual recombination in Gibberella zeae.</a> Phytopathology. 89, 182-188 (1999).</li>
<li>Buller, A. H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuller%2C+AHR+%22Researches+on+Fungi%22">Researches on Fungi</a>. , Longmans, Green and Co. London, England. (1909).</li>
<li>Cavinder, B., Hamam, A., Lew, R. R., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mid1%2C+a+mechanosensitive+calcium+ion+channel%2C+affects+growth%2C+development%2C+and+ascospore+discharge+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">Mid1, a mechanosensitive calcium ion channel, affects growth, development, and ascospore discharge in the filamentous fungus Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 10, 832-841 (2011).</li>
<li>Cuomo, C., Güldener, U., Xu, J. R., Trail, F., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fusarium+graminearum+genome+reveals+a+link+between+localized+polymorphism+and+pathogen+specialization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Fusarium graminearum genome reveals a link between localized polymorphism and pathogen specialization.</a> Science. 317, 1400-1402 (2007).</li>
<li>Desjardins, A. E., Brown, D. W., Yun, S. -H., Proctor, R. H., Lee, T., Plattner, R. D., Lu, S. -W., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+complementation+of+the+mating+type+%28MAT%29+locus+of+the+wheat+head+blight+pathogen+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Deletion and complementation of the mating type (MAT) locus of the wheat head blight pathogen Gibberella zeae.</a> Applied and Environmental Microbiology. 70, 2437-2444 (2004).</li>
<li>Gueldener, U., Seong, K. -Y., Boddu, J., Cho, S., Trail, F., Xu, J. -R., Adam, G., Mewes, H. -W., Muehlbauer, G. J., Kistler, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Fusarium+graminearum+Affymetrix+GeneChip+For+profiling+fungal+gene+expression+in+vitro+and+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Development of a Fusarium graminearum Affymetrix GeneChip For profiling fungal gene expression in vitro and in planta.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 316-325 (2006).</li>
<li>Hallen, H., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+L-Type+calcium+ion+channel+Cch1+affects+ascospore+discharge+and+mycelial+growth+in+the+filamentous+fungus+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">The L-Type calcium ion channel Cch1 affects ascospore discharge and mycelial growth in the filamentous fungus Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Eukaryotic Cell. 7, 415-424 (2008).</li>
<li>Hallen, H., Huebner, M., Shiu, S. -H., Guldener, U., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+shifts+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%2C+with+particular+emphasis+on+ion+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Gene expression shifts during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum), with particular emphasis on ion transport proteins.</a> Fungal Genetics and Biology. 44, 1146-1156 (2007).</li>
<li>Lee, J., Lee, T., Lee, Y. -W., Yun, S. -H., Turgeon, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shifting+fungal+reproductive+mode+by+manipulation+of+mating+type+genes%3A+obligatory+heterothallism+of+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Shifting fungal reproductive mode by manipulation of mating type genes: obligatory heterothallism of Gibberella zeae.</a> Molecular Microbiology. 50, 145-152 (2003).</li>
<li>Klittich, C. J. R., Leslie, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+reduction+mutants+of+Fusarium+moniliforme+%28Gibberella+fujikuoi%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nitrate reduction mutants of Fusarium moniliforme (Gibberella fujikuoi.</a> Genetics. 118, 417-423 (1988).</li>
<li>Min, K., Lee, J., Kim, J. -C., Kim, S. G., Kim, Y. H., Vogel, S., Trail, F., Lee, Y. -W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene%2C+ROA%2C+is+required+for+proper+morphogenesis+and+discharge+of+ascospores+in+Gibberella+zeae%5BTitle%5D)+AND+%22Eukaryotic+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene, ROA, is required for proper morphogenesis and discharge of ascospores in Gibberella zeae.</a> Eukaryotic Cell. 9, 1495-1503 (2010).</li>
<li>Qi, W., Kwon, C., Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+of+transcript+accumulation+during+perithecium+development+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis of transcript accumulation during perithecium development in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum).</a> Molecular Genetics and Genomics. , 276-287 (2006).</li>
<li>Trail, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+cannons%3A+explosive+spore+discharge+in+the+Ascomycota%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Fungal cannons: explosive spore discharge in the Ascomycota.</a> FEMS Microbiol. Lett. 276, 12-18 (2007).</li>
<li>Trail, F., Common, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perithecial+development+by+Gibberella+zeae%3A+a+light+microscopy+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Perithecial development by Gibberella zeae: a light microscopy study.</a> Mycologia. 92, 130-138 (2000).</li>
<li>Trail, F., Xu, H., Loranger, R., Gadoury, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+environmental+aspects+of+ascospore+discharge+in+Gibberella+zeae+%28anamorph+Fusarium+graminearum%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologica%22%5BJournal%5D)">Physiological and environmental aspects of ascospore discharge in Gibberella zeae (anamorph Fusarium graminearum.</a> Mycologica. 94, 181-189 (2002).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

F. graminearum jest szczególnie odpowiednim obiektem do badania rozwoju ciał owocnikowych ze względu na dostępność dobrze adnotowanego genomu (<a href="http://mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/">mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB/</a> ;4) oraz dostępność mikromacierzy opartej na technologii Affymetrix6. Ułatwiło to identyfikację genów istotnych dla wyrzutu askospor7,11,3. Przedstawione tutaj metody pozwolą badaczowi skupić się na konkretnym zestawie etapów rozwoju i funkcji podczas analizy genetycznej ciał owocnikowych F. graminearum. Metody te można również łatwo dostosować do pokrewnych grzybów, które mogą owocnikować w kulturze, a mogą one służyć jako standard badania rozwoju dla wielu innych typów ciał owocnikowych grzybów.
Zdolność do oceny fenotypu wyrzutu zarodników może być utrudniona u gatunków, w których zarodniki są małe i trudne do dostrzeżenia, takich jak F. graminearum. Zbieranie zarodników na czystym szkiełku ułatwia zarówno ocenę wizualną, jak i ilościową, ponieważ zarodniki można spłukać ze szkiełka i poddać kwantyfikacji. Niektóre gatunki grzybów wytwarzają śluz otaczający zarodniki, co sprawia, że nie można ich spłukać, lecz należy policzyć je mikroskopowo, gdy pozostają na szkiełku. Stwierdziliśmy, że dotyczy to gatunku Sclerotinia sclerotiorum.

<table><tbody><tr><td>Szczep Fusarium graminearum PH-1</td><td>Fungal Genetics Stock Center</td><td>FGSC 9075</td><td></td></tr><tr><td>Tween 60</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1629</td><td></td></tr><tr><td>Agar Czapek&amp;rsquo;s Dox</td><td>Difco Laboratories</td><td>233810</td><td></td></tr><tr><td>Chloran potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255572</td><td></td></tr></tbody></table>

rozwój płciowy i wyrzut ascospor u fusarium graminearum

Sexual Development and Ascospore Discharge in Fusarium graminearum

Fusarium graminearum stało się systemem modelowym do badań nad rozwojem i patogennością grzybów nitkowatych. F. graminearum najłatwiej wytwarza owocniki, zwane peritecjami, na agarze marchwiowym. Peritecja zawierają liczne typy tkanek, powstające w określonych stadiach rozwoju peritecji. Obejmują one (w kolejności pojawiania się) formowanie się inicjałów peritecji (z których powstają strzępki askogenne), ścianę zewnętrzną, parafizy (sterylne grzybnie zajmujące centrum peritecji do czasu rozwoju worków), worki oraz askospory wewnątrz worków14. Rozwój każdej z tych tkanek jest oddzielony od siebie o około 24 godziny i stanowił podstawę badań transkryptomicznych podczas rozwoju płciowego12,8. Bardziej szczegółowy opis rozwoju, zawierający fotografie każdego etapu, znajduje się w pracy Hallen et al. (2007). W niniejszej pracy przedstawiamy metody generowania i zbioru synchronicznie rozwijających się trawników peritecji do badań czasowych regulacji genów, rozwoju i procesów fizjologicznych. Chociaż metody te zostały opracowane konkretnie z myślą o F. graminearum, techniki te mogą być stosowane w przypadku wielu innych grzybów, pod warunkiem że owocowanie może zostać indukowane w kulturze i występuje pewna synchronizacja rozwoju. Niedawno dostosowaliśmy ten protokół do badania rozwoju płciowego F. verticillioides. Chociaż u tego gatunku poszczególne peritecja muszą być zbierane ręcznie, ponieważ nie udało się zindukować powstania trawnika rozwijających się peritecji, proces ten sprawdził się w badaniu rozwoju (Sikhakolli i Trail, niepublikowane).
Najważniejszą funkcją owocników grzybów jest rozprzestrzenianie zarodników. U wielu gatunków Ascomycota (grzybów workowych), zarodniki są wystrzeliwane z worka w wyniku generowania ciśnienia turgorowego wewnątrz worka, co powoduje wyrzut zarodników (oraz płynu epiplazmatycznego) przez otwór w wierzchołku worka2,7. Nasze badania nad wymuszonym wyrzutem ascospor doprowadziły do opracowania „testu wyrzutu zarodników”, którego używamy do przesiewania mutacji w tym procesie. W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły tego testu.
F. graminearum jest homotaliczny, a zatem może tworzyć ciała owocnikowe wobec braku kompatybilnego partnera. Przewagą homotalizmu jest brak konieczności krzyżowania w celu uzyskania potomstwa homozygotycznego pod względem konkretnej cechy, co ułatwiło badanie rozwoju seksualnego u tego gatunku14,7. Niemniej jednak wygenerowano szczepy heterotaliczne, które mogą być wykorzystywane do krzyżowania5,9. Możliwe jest również krzyżowanie szczepów homotalicznych w celu uzyskania mutantów dla kilku genów w jednym szczepie1. Odbywa się to poprzez wspólne inokulowanie jednej szalki Petriego dwoma szczepami. W miejscu ich styku większość peritecji będzie rekombinantami (pod warunkiem, że mutacja w jednym ze szczepów rodzicielskich nie hamuje krzyżowania). Wraz z wiekiem peritecie przestają gwałtownie wyrzucać ascospory, a zaczynają wydzielać je masowo. Powstały wysięk zarodników (zwany cirrhusem) gromadzi się na wierzchołku peritecium i może zostać łatwo usunięty w celu odzyskania pojedynczych zarodników. W niniejszej pracy przedstawiamy protokół ułatwiający identyfikację peritecji rekombinantnych oraz odzyskiwanie rekombinantnego potomstwa.

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

*Fusarium graminearum* stało się systemem modelowym w badaniach nad rozwojem i patogennością grzybów nitkowatych. *F. graminearum* najłatwiej produkuje...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest nauka generowania i manipulowania rozwojem paratezji oraz badania wyrzutu APO w hodowli. Jest to osiągane poprzez najpierw indukcję i aktywny wzrost hodowli w celu zainicjowania rozwoju płciowego. Drugim krokiem jest analiza aktywnego wyrzutu zarodników, a następnie generowanie rekombinowanych paratezji.Ostatnim krokiem jest ocena potomstwa pod kątem fenotypów wskazujących na to, czy doszło do rekombinacji. Ostatecznie wyniki te mogą zostać wykorzystane do przesiewania mutantów w rozwoju płciowym lub do generowania wielu mutacji w obrębie jednego szczepu. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki te są trudne do opisania i choć są proste, muszą być wykonane precyzyjnie, aby uzyskać optymalny wyrzut zarodników i spójną produkcję paratezji.Zacznij od inokulacji centralnej rdzenia marchewki w szalce Petriego o średnicy sześciu centymetrów przy użyciu fertylnego szczepu f gramine. Inkubuj inokulowane szalki pod jasnym, standardowym komercyjnym oświetleniem fluorescencyjnym w temperaturze pokojowej.Pozostaw grzyby do wzrostu przez trzy do pięciu dni, aż grzybnia osiągnie zewnętrzną krawędź szalki. W komorze z laminarnym przepływem powietrza delikatnie zeskrob powierzchnię hodowli za pomocą sterylnego wykałaczką, aby usunąć grzybnię napowietrzną.Następnie nanieś jeden mililitr surfaktantu na świder i wetrzyj go w powierzchnię zagiętym lub kulistym końcem sterylnego szklanego pręta. Nie nakładaj perfilu. Umieść płytki ponownie pod lampami.Po 24 godzinach powierzchnia płytek powinna mieć błyszczący wygląd. Jeśli grzybnia pojawi się ponownie, należy zeskrobać powierzchnię, ponownie zastosować roztwór Tween 60 i naświetlać płytki przez kolejne 24 godziny. Następnie obserwuj rozwój parathezji przez tydzień.Młode paratezje są widoczne jako czarne ziarna na powierzchni świdra. W porównaniu do dojrzałych paratezji, grzybnia powierzchniowa praktycznie nie powinna występować.Do siódmego dnia na pokrywce szalki gromadzą się dojrzałe zarodniki, a do dziewiątego dnia są one tak gęste, że są widoczne bez powiększenia. Aby zebrać stadium pośrednie, parathesia należy delikatnie zeskrobać z powierzchni świdra za pomocą skalpela i przenieść do probówki kriogenicznej. Probówkę można następnie zamrozić w technice flash-freezing w celu ekstrakcji RNA sześć dni po zastosowaniu surfaktantu.Wytnij z bloku agarowego krążek o średnicy jednego centymetra, używając do tego świdra do drewna, wiertła lub skalpela. Przeciąć krążek na pół i zamocować obie połowy na szklanym przedmiocie mikroskopowym; ułożyć fragmenty tak, aby powierzchnia zawierająca owocniki była prostopadła do powierzchni szkiełka, a zarodniki były skierowane wzdłuż przedmiotu. W tym momencie, jeśli wymagane jest zastosowanie inhibitora zarodników, należy nanieść go na tył bloku agarowego.Technikę tę można wykorzystać do przesiewania substancji chemicznych w poszukiwaniu inhibitorów wyrzutu oraz do przesiewania mutantów genetycznych pod kątem utraty zdolności do wyrzutu zarodników; z sukcesem przeprowadziliśmy obie te procedury. Następnie inkubuj preparat przez noc w prostej, oświetlonej komorze nawilżającej w temperaturze pokojowej. W miarę wyrastania ciałnasiennych, zarodniki będą gromadzić się na szkiełku i będą widoczne następnego ranka.Zgromadzone zarodniki można teraz spłukać z szkiełka do czystego naczynia i poddać kwantyfikacji. Rozpocznij od przeprowadzenia krzyżowania genetycznego dwóch szczepów f gramine arum poprzez zaszczepienie ich po przeciwnych stronach szalki Petriego z podłożem z marchwi. Zgodnie z wcześniejszym opisem, hoduj grzyby do momentu, aż strzępki wypełnią całą powierzchnię.Zeskrob części nadziemne i nanieś roztwór T 60. W tym przypadku zaznacz na płytce miejsce, w którym stykają się strzępki. Przenieś kultury z powrotem pod światło i inkubuj przez około siedem dni, aż rozwiną się paratezy i zaczną formować się z nich sori wzdłuż linii styku kultur.Tę technikę można wykorzystać do wprowadzenia wielu mutacji do jednego szczepu. Warto również zauważyć, że zarówno knit plus, jak i knit minus mogą zostać wyselekcjonowane, co czyni ten marker bardzo użytecznym markerem selekcyjnym. Pod mikroskopem stereoscopicznym ustaw w polu widzenia parathezję wzdłuż styku dwóch kultur.Następnie zlokalizuj oko. Teraz zanurz sterylną szpilkę entomologiczną w sterylnej wodzie i dotknij szpilką surowicy utworzonej na granicy kultur. SRI powinny przykleić się do wilgoci na szpilce.Następnie wypłucz końcówkę igły w 200 µL sterylnej wody zawartej w probówce mikrocentryfużowej o pojemności 1,5 ml. Wypal igłę w płomieniu, ponownie ją zwilż i pobierz kolejną sru. Pobierz od trzech do pięciu Siri i przenieś je wszystkie do osobnej probówki.Następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex. Dla każdej probówki zawierającej zawiesinę Siri, roznieś 60 µL zawiesiny zarodników na płytce Petriego o średnicy 9 mm.Używając pożywki MMTS, inkubuj płytki w temperaturze pokojowej z włączonym lub wyłączonym oświetleniem, a pozostałą zawiesinę zarodników przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie tydzień. Po trzech do pięciu dniach na płytce pojawią się bardzo małe kolonie. Jeden fenotyp można ocenić pod mikroskopem.Kolonie knit-ujemne będą miały rzadsze strzępki niż kolonie knit-dodatnie. Należy odrzucić płytki zawierające tylko jeden z tych fenotypów. Siri z rekombinowanej parathesii wykazują oba fenotypy kolonii w niemal równych proporcjach.Zachowaj te płytki. Czasami w wyniku segregacji innych czynników pojawiają się inne fenotypy, takie jak kolonie o cechach pośrednich między knit dodatnimi a knit ujemnymi; w celach przechowywania przenieś kolonie z płytek z rekombinantami na płytkę z agarem V8 lub marchewkowym, aby kontynuować badanie poprzez analizę innych fenotypów; wysej kolonie na agar Chap X dock oraz na płytki z PDA zawierającym chlorat. Parathesia rozrastały się w formie czarnego, aksamitnego trawnika, bez widocznej grzybni ani zarodników.24 godziny po zastosowaniu tweenu powierzchnia świdra miała lekki połysk. Jeśli grzybnia pojawiła się ponownie, płytka mogła nie zostać wystarczająco zeskrobana, aby wywołać rozwój paratezji. Przygotowano kilka bloków świdra z ciałami owocnikowymi szczepu typu dzikiego, aby umożliwić wyrzut zarodników na szkiełka przedmiotowe w celu obserwacji.Przygotowano odpowiednie oświetlenie do wyzwalania. Paratezie, które były zbyt młode lub zbyt stare, często nie reagowały. W przypadku zbyt starych kultur na ich powierzchni pojawiało się liczne strzępki, nadając im białawy odcień.W przypadku zbyt młodych owocników nie doszło do ich wykwitnięcia, w związku z czym eksperyment powtórzono. Po 24 godzinach, po zebraniu 10 Siri z krzyżówki, co najmniej sześć z nich było zazwyczaj rekombinantami, co oceniono na podstawie mieszanki fenotypów knit negative i knit positive. Bardzo sporadycznie mutacja uniemożliwiała szczepowi kojenie.Jeśli jeden z rodziców wykazywał wyraźny fenotyp wzrostu, wówczas wśród kolonii na MMTS wystąpiło więcej niż dwa fenotypy. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby rozpocząć od kultury, która była dobrze utrzymywana i nie była przenoszona seryjnie przez dłuższy czas. Zawsze należy zaczynać od kultury wyhodowanej ze stabilnego materiału zamrożonego.

sexual-development-and-ascospore-discharge-in-fusarium-graminearum

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Rozwój seksualny i uwalnianie askospor w Fusarium graminearum

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Szkodliwość grzybów infekujących nasiona w uprawach zbóż skłoniła do licznych wysiłków badawczych mających na celu lepsze zrozumienie interakcji między rośliną a patogenem. Aby badać interakcje nasion z grzybami w warunkach laboratoryjnych, opracowaliśmy niezawodną metodę ilościowego określania reprodukcji grzybów, biomasy oraz skażenia mikotoksynami przy użyciu bioassayów na ziarnach.

Ilościowe określanie kolonizacji grzybowej, sporogenezy i produkcji mikotoksyn z wykorzystaniem biotestów na ziarnach kukurydzy

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Problemy w przetwarzaniu próbek biologicznych do obserwacji skaningowej mikroskopii elektronowej obejmują zapadanie się komórek, traktowanie próbek z wilgotnych mikrośrodowisk i niszczenie komórek. Niedrogie i stosunkowo szybkie protokoły odpowiednie do przygotowania trudnych próbek, takich jak merystemy kwiatowe, cysty lęgniowców i grzyby (Agaricales) są kompilowane i szczegółowo opisywane tutaj.

Protokoły skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM) dla problematycznych próbek roślin, lęgniowców i grzybów

Tutaj prezentujemy protokół oparty na systemie przynęty na mącznika mącznika (Tenebrio molitor), który był używany do izolowania i selekcji grzybów entomopatogenicznych (EPF) z próbek gleby. Skuteczna formuła liczby konidiów (ECN) jest stosowana do wyboru EPF o wysokiej tolerancji na stres w oparciu o cechy fizjologiczne do zwalczania mikrobiologicznego szkodników na polu.

Izolacja i selekcja grzybów entomopatogenicznych z próbek glebowych oraz ocena zjadliwości grzybów wobec szkodników owadzich

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje zoptymalizowany protokół inokulacji, który wykorzystuje oderwane osłonki liści kukurydzy do powtarzalnych badań cytologicznych, fizjologicznych i molekularnych interakcji kukurydzy z patogenami grzybów roślinnych. Pochwy liściowe ułatwiają obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórkowych między żywą rośliną a grzybem w nieutrwalonych tkankach.

Oderwane osłonki kukurydzy do obrazowania żywych komórek zakażenia patogenami grzybów kukurydzy dolistnej

Tutaj prezentujemy podstawowy protokół indukcji krycia P. blakesleeanus.

Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

Przedstawiono technikę niezbędną do wizualizacji bijącego serca w larwalnym i dorosłym stadium rozwoju Drosophila. Każdy etap cyklu życiowego wymaga zastosowania odmiennej metodologii.

Wizualizacja bijącego serca u Drosophila

Poznaj techniki indukowania rozwoju płciowego i wydzielania askospor u Fusarium graminearum. Metody obejmują krzyżowanie genetyczne, ocenę fenotypów potomstwa oraz skrining mutantów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Przeglądaj więcej filmów