Name: Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo zapalenia płuc wywołanego przez robaki pasożytnicze (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Poznaj model zapalenia płuc wywołanego jajami Schistosoma mansoni u myszy. Metoda pozwala badać odpowiedź immunologiczną Th2, rekrutację komórek zapalnych i patologię płuc in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) AI091759 oraz grant badawczy William and Shelby Modell Family Foundation Research Award przyznany przez Crohn's and Colitis Foundation of America (dla MN). Myszy zakażone schistosomami zostały dostarczone przez NIAID Schistosome Resource Center (kontrakt NIAID N01 A130026).

1. Oczyszczanie jaj Schistosoma mansoni
<ol>
 <li>Zakaź myszy Swiss-Webster церkariami schistosomów, które stanowią infekcyjny etap cyklu życiowego Schistosoma 8. Alternatywnie można pozyskać myszy zakażone schistosomami z NIAID Schistosomiasis Resource Center (<a href="http://www.schisto-resource.org/" target="_blank">http://www.schisto-resource.org/</a>). Pozostawić myszy na 6-7 tygodni po zakażeniu; w tym czasie jaja pojawiają się w wątrobie i mogą zostać wyizolowane zgodnie z poniższym opisem (patrz Rys. 1).</li>
 <li>Uśmiercić myszy za pomocą CO2 i zwilżyć 70% etanolem. Położyć mysz na plecach. Za pomocą tępych pęset i nożyc wyciąć skórę oraz leżącą pod nią otrzewną. Wyciąć wątrobę, znajdującą się poniżej klatki piersiowej i przepony.</li>
 <li>Wątroby drobno posiekać i dodać 20 mL na każdą wątrobę mieszaniny do trawienia, składającej się z kolagenazy/dispazy (0,5 mg/mL), penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (100 μg/mL) w PBS. Przenieść mieszaninę do probówki Falcon 50 mL i inkubować przez noc w wytrząsarce w temperaturze 37 °C.</li>
 <li>Odwirować mieszaninę przy 400 x g / 3 min / 20 °C. Delikatnie odlać nadmiar cieczy i napełnić probówkę PBS. Ponownie odwirować i powtórzyć przemywanie PBS. Po ostatnim wirowaniu resuspender osad w 25 mL PBS.</li>
 <li>Przecisnąć resuspenderowany osad przez standardowe metalowe sito kuchenne (używając tłoka strzykawki 50 mL, aby rozgnieść kawałki wątroby i przenieść je do zlewki szklanej), a następnie przepuścić mieszaninę przez gęste sito (używając strzykawki 10 mL, aby przepchnąć mieszaninę przez gęste sito do drugiej zlewki szklanej).</li>
 <li>Przenieść przesianą mieszaninę do probówki Falcon 50 mL. Odwirować przy 400 x g / 5 min / 20 °C. Ostrożnie odlać supernatant, nie tracąc osadu. Resuspender osad w 3 mL PBS.</li>
 <li>Delikatnie nanieść mieszaninę na gradient 20% Percoll o objętości 40 mL, składający się z 8 mL Percoll i 32 mL sacharozy 0,25M (masa cząsteczkowa FW=342,3, zatem 8,56 g sacharozy/100 mL H2O).</li>
 <li>Wirować przez 10 min / 800 x g / 20 °C. Odessać i odrzucić żelowatą górną warstwę komórek wątroby. Pobrać osad z jaj z dna za pomocą pipety transferowej i przenieść do probówki Falcon 15 mL.</li>
 <li>Przemyć osad 3 razy w 10 mL PBS/1 mM EDTA/1 mM EGTA, stosując następujące parametry wirowania: 3 min / 30 x g / 20 °C. Resuspender w 500 μL PBS.</li>
 <li>Nanieść mieszaninę na nowy gradient 25% Percoll o objętości 10 mL (2,5 mL Percoll i 7,5 mL sacharozy 0,25M), stosując następujące parametry wirowania: 10 min / 800 x g / 20 °C.</li>
 <li>Przemyć 3 razy w 10 mL PBS, stosując parametry wirowania: 3 min / 30 x g / 20 °C.</li>
 <li>Podczas ostatniego przemywania w 10 mL pobrać 100 μL w celu policzenia jaj. Jaja szybko opadają na dno, dlatego przed pobraniem próbki probówka Falcon musi zostać dobrze wymieszana. Rozcieńczyć próbkę 100 μL w 900 μL PBS. 100 μL mieszaniny należy policzyć jako kropelki na szkiełku przedmiotowym pod mikroskopem stereotypowym (rozcieńczenie 1:10). Należy używać końcówek do pipet o szerokim otworze.</li>
 <li>Resuspender jaja w PBS do stężenia 50 000 jaj/mL. Jaja mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C i rozmrażane raz lub dwa razy w celu użycia. Przed użyciem sprawdzić pod mikroskopem, czy jaja są nadal nienaruszone (patrz Rys. 1).</li>
</ol>
2. Sensytyzacja domięśniowa jajami S. mansoni: dzień 0
<ol>
 <li>Przygotować jaja w stężeniu 5 000 jaj/100 μL PBS w probówce typu snapcap o pojemności 5 mL. Do iniekcji przygotować o 50% więcej jaj niż jest wymagane.</li>
 <li>Napełnić igłę o rozmiarze 23 gauge3/4inch oraz strzykawkę 1 mL ilością 100 μL zawiesiny jaj na jedną mysz. Ze względu na sedymentację jaj, należy napełniać igłę bezpośrednio przed użyciem.</li>
 <li>Przed każdą iniekcją delikatnie potrząsnąć strzykawką w celu wymieszania jaj, a następnie wstrzyknąć dojszywnie 100 μL zawiesiny na każdą mysz.</li>
</ol>
3. Dożylne podanie jaj S. mansoni drogą retroorbitalną: dzień 14.
<ol>
 <li>Przygotować jaja zgodnie z powyższą instrukcją w stężeniu 5 000 jaj/100 μL.</li>
 <li>Zanurzyć myszy w anestezji w specjalnej komorze przy użyciu izofluranu (4%) lub podać wewnątrzbrzusznie ksylazynę (10 mg/kg) i ketaminę (120 mg/kg). Głębokość anestezji należy określić poprzez ściśnięcie poduszeczki stopy i upewnienie się, że nie występuje reakcja fizyczna.</li>
 <li>Po napełnieniu strzykawki o objętości 1 mL z igłą 23G3/4cala zawiesiną jaj, za pomocą pęsety zagiąć igłę pod kątem 90°, tak aby ścięcie było skierowane w dół w stronę kąta zgięcia. Należy upewnić się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Położyć mysz na boku. Odciągnąć skórę tak, aby gałka oczna wystawała, a następnie wstrzyknąć 100 μL do naczyń za gałką oczną pod kątem 45° względem nosa.</li>
 <li>Wyjąć igłę i zastosować lekki ucisk w celu zahamowania krwawienia.</li>
</ol>
Wszystkie te procedury muszą być przeprowadzane z zachowaniem należytej staranności, a myszy należy monitorować do czasu wybudzenia z anestezji. Protokoły te zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Pensylwanii.
4. Pobranie materiału eksperymentalnego: Dzień 22
<ol>
 <li>Uśmiercić myszy za pomocą CO2.</li>
 <li>Zwilżyć mysz 70% etanolem i położyć na grzbiecie.</li>
 <li>Używając tępych pęset, uchwycić brzuch myszy i wykonać niewielkie nacięcie skóry. Ostrożnie usunąć skórę nożyczkami, aby odsłonić klatkę piersiową i otrzewną.</li>
 <li>Rozciąć otrzewną. Przeciąć aortę brzuszną, aby pobrać krew za pomocą pipety Pasteura. Przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Przesunąć wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę. Za pomocą cienkich nożyczek rozciąć przeponę. Ostrożnie rozciąć klatkę piersiową, aby odsłonić tkankę płuc.</li>
 <li>Pobrać pęsetą cienką węzły chłonne przygrasicze drenujące płuca. Znajdują się one pod klatką piersiową, po obu stronach grasicy 9. Przechowywać na lodzie w 1mL sterylnego medium (DMEM uzupełniony o 10% inaktywowanego ciepłem płodowego surowicy cielęcej, 100 U/mL penicyliny, 100 μg/mL streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 50 μM 2-merkaptoetanolu, wszystkie dostępne od Invitrogen).</li>
 <li>W celu pobrania BAL i napowietrzenia płuc do analizy histologicznej należy przeprowadzić intubację wewnątrz tchawicy. Odsłonić tchawicę, przesuwając ślinianki na bok i umieszczając cienką pęsetę pod tchawicą. Za pomocą cienkich nożyczek wyciąć otwór w środkowej części tchawicy i wprowadzić cewnik do płuc. Zabezpieczyć cewnik, zawiązując go nicią chirurgiczną.</li>
 <li>Podłączyć do cewnika strzykawkę 1 mL wypełnioną PBS i napowietrzyć płuca 1 mL PBS. Ostrożnie pobrać płuczynkę BAL za pomocą strzykawki. Przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Podłączyć do cewnika strzykawkę 1 mL wypełnioną 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS i napowietrzyć płuca.</li>
 <li>Usunąć cewnik i mocno zawiązać nić chirurgiczną, aby zapobiec wyciekowi PFA.</li>
 <li>Ostrożnie wypreparować tkankę płuc i umieścić w probówce Falcon 50 mL z 5 mL 4% PFA.</li>
</ol>
5. Przygotowanie odzyskanych tkanek
<ol>
 <li>Surowica: Po przechowywaniu na lodzie od 30 min do 2 h w celu skrzepnięcia krwi, surowicę otrzymuje się z krwi poprzez wirowanie (13000 x g / 10 min / 4 °C). Surowicę przechowuje się w temperaturze -20 °C i można ją wykorzystać do testów ELISA na cytokiny lub testów ELISA na przeciwciała IgG specyficzne dla antygenu jaj S. mansoni 6, 10.</li>
 <li>Węzły chłonne: Przygotowuje się zawiesiny pojedynczych komórek, a liczbę komórek wykorzystuje się do oceny wielkości odpowiedzi immunologicznej. Aby zbadać polaryzację komórek Th2, komórki poddaje się ponownej stymulacji antygenem jaj S. mansoni przez 72 godziny. Barwienie wewnątrzkomórkowe cytokin można badać za pomocą cytometrii przepływowej, a nadnadnadkomórki można odzyskać i przechowywać w temperaturze -20 °C do analizy cytokin Th2 (IL-4, IL-5, IL-13) metodą ELISA 6.</li>
 <li>BAL: Komórki są pelletowane (400 x g / 5 min / 4 °C). Płyn BAL jest odzyskiwany i przechowywany w temperaturze -20 °C do analizy cytokin Th2 metodą ELISA. Liczba komórek BAL służy jako wskaźnik stanu zapalnego dróg oddechowych. Preparaty z cytocentryfugi zawierające 10 000-100 000 komórek (500 rpm / 5 min / 4 °C), a następnie barwienie Diffquik, pozwalają na zliczenie nacieku zapalnego 4, 6. Alternatywnie komórki BAL można badać za pomocą cytometrii przepływowej 6.</li>
 <li>Tkanka płucna: Tkankę płucną przechowuje się przez noc w temperaturze 4 °C. Utrwaloną tkankę zatapia się w parafinie, wykonuje przekroje i osadza na szkiełkach do analizy histologicznej i immunofluorescencyjnej.</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje wszystkie kroki niezbędne do (i) przygotowania oczyszczonych jaj Schistosoma mansoni do zastosowania in vivo (Ryc. 1), (ii) uczulenia i wywołania reakcji u myszy za pomocą tych jaj oraz (iii) pobrania organów w celu zbadania odpowiedzi zapalnej w płucach. Ten model in vivo w sposób powtarzalny indukuje silną odpowiedź zapalną typu Th2 w płucach. Przejawia się to stanem zapalnym dróg oddechowych i eozynofilią, co obrazują wyniki zliczania komórek BAL oraz preparaty z cytocentryfugi (Ryc. 2). Przekroje płuc barwione H&amp;E mogą być badane pod kątem ziarniniaków indukowanych przez jaja (Ryc. 3a), a barwienie immunofluorescencyjne przekrojów płuc pozwala na wizualizację alternatywnie aktywowanych makrofagów oraz genów indukowanych przez cytokiny Th2, takich jak cząsteczka podobna do rezystyny (RELM) α (Ryc. 3b). Antygenowo swoista odpowiedź cytokinowa CD4 Th2 jest badana za pomocą testów ELISA dla IL-5, IL-4 i IL-13 w komórkach węzłów chłonnych przygrasicy stymulowanych antygenem (Ryc. 4).
<img alt="Schemat jaj S. mansoni w wątrobie ziarniniakowej; oś czasu infekcji od wstrzyknięcia do analizy w 22. dniu." src="/files/ftp_upload/3905/3905fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Model wstrzykiwania jaj Schistosoma mansoni. Przedstawiono reprezentatywne zdjęcia wątrób ziarniniakowych, charakterystycznych dla dużego obciążenia jajami S. mansoni, oraz zdjęcia jaj S. mansoni – średni rozmiar (L) 120 μm na (W) 50 μm.
<img alt="Reakcja komórek na jaja Sm; wykres słupkowy, mikroskopia; badanie reakcji odpornościowej z porównaniem typów komórek MAC, LYMPH, EOS." src="/files/ftp_upload/3905/3905fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. S. mansoni wstrzyknięcie jaj indukuje zapalenie dróg oddechowych. A. Liczba komórek BAL (x105) u myszy naiwnych (N) lub po wstrzyknięciu jaj S.mansoni (Sm). *P&lt;0.05. B. Preparat komórek BAL wykonany metodą cytocentryfugacji. Mac, MAKROFAG; Eos, EOZYNOFIL; LYMPH, limfocyt. Pasek, 10 μm.
<img alt="Analiza histologiczna, porównanie barwienia tkanek, obrazy mikroskopowe, struktura komórkowa, wyniki eksperymentu." src="/files/ftp_upload/3905/3905fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Wizualizacja ziarniniaków płucnych i alternatywnie aktywowanych makrofagów otaczających jaja S.mansoni. A. Ziarniniak płucny otaczający jajo Sm (czarna strzałka) zobrazowany w przekrojach płuc barwionych H&amp;E. B. Barwienie immunofluorescencyjne na RELMα (zielony), receptor mannozy (czerwony) i DAPI (niebieski) ujawnia alternatywnie aktywowane makrofagi (biała strzałka) w ziarniniaku otaczającym autofluorescencyjne jajo Sm (czarna strzałka). Pasek skali, 50 μm.
<img alt="Wykres słupkowy ekspresji IL-4, IL-5 i IL-13; porównanie N vs. jaja Sm; wyniki odpowiedzi immunologicznej." src="/files/ftp_upload/3905/3905fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Odpowiedź cytokinowa Th2 specyficzna dla antygenu jaj S.mansoni. Komórki drenażowych węzłów chłonnych przytymusowych od myszy naiwnych (N) lub wstrzykniętych jajami Sm stymulowano antygenem jaj Sm przez 72 godziny, po czym wykonano test ELISA supernatantów pod kątem obecności IL-4, IL-5 i IL-13. Skala, ng/mL.*P&lt;0.05.

<ol><li>World Health Organization. Prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis: report of a WHO expert committee. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+Technical+Report+Series+912%22">WHO Technical Report Series 912</a>. , Geneva. (2002).</li>
<li>Pearce, E. J., MacDonald, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of schistosomiasis.</a> Nat. Rev. Immunol. 2, 499-511 (2002).</li>
<li>Sandler, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+gene+expression+profiles+during+acute+pathogen-induced+pulmonary+inflammation+reveal+divergent+roles+for+Th1+and+th2+responses+in+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Global gene expression profiles during acute pathogen-induced pulmonary inflammation reveal divergent roles for Th1 and th2 responses in tissue repair.</a> J. Immunol. 171, 3655-3667 (2003).</li>
<li>Perrigoue, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-31-IL-31R+interactions+negatively+regulate+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">IL-31-IL-31R interactions negatively regulate type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 204, 481-487 (2007).</li>
<li>Sandor, M., Weinstock, J. V., Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulomas+in+schistosome+and+mycobacterial+infections%3A+a+model+of+local+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Granulomas in schistosome and mycobacterial infections: a model of local immune responses.</a> Trends Immunol. 24, 44-52 (2003).</li>
<li>Nair, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatively+activated+macrophage-derived+RELM-%7Balpha%7D+is+a+negative+regulator+of+type+2+inflammation+in+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Alternatively activated macrophage-derived RELM-{alpha} is a negative regulator of type 2 inflammation in the lung.</a> J. Exp. Med. 206, 937-952 (2009).</li>
<li>Dalton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+schistosome+eggs+and+miracidia+free+of+contaminating+host+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Parasitology%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of schistosome eggs and miracidia free of contaminating host tissues.</a> Parasitology. 115, 29-32 (1997).</li>
<li>Lewis, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+laboratory+maintenance+of+Schistosoma+mansoni%2C+with+observations+on+three+schistosome%2Fsnail+host+combinations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Parasitol%22%5BJournal%5D)">Large-scale laboratory maintenance of Schistosoma mansoni, with observations on three schistosome/snail host combinations.</a> J. Parasitol. 72, 813-829 (1986).</li>
<li>Tilney, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+in+the+adult+laboratory+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat.</a> J. Anat. 109 (Pt. 3), 369-383 (1971).</li>
<li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schistosomiasis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Schistosomiasis.</a> Current protocols in immunology. Coligan, J. E. Chapter 19, Unit 19(2001).</li>
<li>Kaplan, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+cells+are+required+for+the+Schistosoma+mansoni+egg-induced+granulomatous+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th2 cells are required for the Schistosoma mansoni egg-induced granulomatous response.</a> J. Immunol. 160, 1850-1856 (1998).</li>
<li>Wynn, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrotic+disease+and+the+T%28H%291%2FT%28H%292+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Fibrotic disease and the T(H)1/T(H)2 paradigm.</a> Nat. Rev. Immunol. 4, 583-594 (2004).</li>
<li>Cheever, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+hepatic+fibrosis+and+granuloma+size+among+mouse+strains+infected+with+Schistosoma+mansoni%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Variation of hepatic fibrosis and granuloma size among mouse strains infected with Schistosoma mansoni.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 37, 85-97 (1987).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

W niniejszym opracowaniu opisano model z wykorzystaniem jaj Schistosoma mansoni do indukowania stanu zapalnego płuc typu 2. Charakterystyczne cechy tego modelu obejmują silną odpowiedź immunologiczną Th2, zapalenie dróg oddechowych oraz tworzenie ziarniniaków płucnych. Ponieważ parametry te są zależne od odpowiedzi komórek CD4 Th2 11, jest to użyteczny model do badania wpływu delecji specyficznych dla białka lub linii komórkowej na odpowiedzi komórek Th2. W tym przypadku odczyty obejmowałyby ilościowe...

<table><tbody><tr><td>Kolagenaza/Dyspaza</td><td></td><td>Roche Applied Science</td><td>11 097 113 001 (500 mg)</td></tr><tr><td>Zestaw barwiący Diff Quik Hema 3</td><td>Zestaw</td><td>Fisher Scientific Co. LLC</td><td>122-911</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ciecz</td><td>Gibco</td><td>11965</td></tr><tr><td>Probówka Falcon 50 ml</td><td>Opakowanie</td><td>Sokół</td><td>352070</td></tr><tr><td>Przewody PE Intramedic</td><td></td><td>Becton Dickinson and Co.</td><td>427410 (0,58 mm)</td></tr><tr><td>Izofluran</td><td></td><td>Abbot Animal Health</td><td>52600405 (250 ml)</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td></td><td>Fort Dodge, Animal Health</td><td>100 mg/ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko receptorowi mannozy</td><td>Biotyna</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA2235B</td></tr><tr><td>Sito metalowe</td><td>Standardowe sito kuchenne</td><td>Cel</td><td>Laurentiis</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td></td><td>Electron Microsc. Sciences</td><td>15710 (16%)</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td></td><td>Gibco</td><td>15070 (100x)</td></tr><tr><td>Percoll</td><td></td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>17 0891 01 (1 litr)</td></tr><tr><td>RELM&amp;alpha; przeciwciało</td><td></td><td>Peprotech</td><td>500-P214 (50&amp;#x03BC;g)</td></tr><tr><td>Nici chirurgiczne</td><td></td><td>Surgical Specialties Corp.</td><td>SP118 (2,0 USP 100 jardów)</td></tr><tr><td>Igła do strzykawki</td><td></td><td>BD Vacutainer Lab. Med.</td><td>305143 (23g, 3/4 cala)</td></tr><tr><td>Sito testowe wg standardu USA</td><td></td><td>W.S. Tyler, Inc.</td><td>150&amp;#x03BC;m, 0,0059&quot;&lt;br/&gt;
ASTME-11, Spec. nr 100</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td></td><td>Butler</td><td>20 mg/ml</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie jaj schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma to przywry krwi, które zakażają szacunkowo 200 milionów ludzi na całym świecie 1. W przebiegu przewlekłej infekcji Schistosoma ciężka patologia, obejmująca włóknienie wątroby i splenomegalię, jest wywoływana przez odpowiedź immunologiczną na jaja pasożyta, a nie przez samego pasożyta 2. Jaja pasożyta indukują odpowiedź Th2 charakteryzującą się produkcją IL-4, IL-5 i IL-13, alternatywną aktywacją makrofagów oraz rekrutacją eozynofilów. W niniejszej pracy opisujemy wstrzykiwanie jaj Schistosoma mansoni jako model do badania specyficznych dla pasożyta odpowiedzi cytokinowych Th2 w płucach i drenujących węzłach chłonnych, tworzenia ziarniniaków płucnych otaczających jajo oraz stanu zapalnego dróg oddechowych. 
Po sensytyzacji domięśniowej i wyzwaniu dożylnym, jaja S. mansoni są transportowane do płuc poprzez tętnice płucne, gdzie zostają uwięzione w miąższu płuc w obrębie ziarniniaków składających się z limfocytów, eozynofili oraz alternatywnie aktywowanych makrofagów 3-6. Z tworzeniem ziarniniaków wiąże się obserwowany stan zapalny w przestrzeniach pęcherzykowo-oskrzelowych, powiększenie drenujących węzłów chłonnych oraz aktywacja limfocytów T CD4. W niniejszym materiale szczegółowo opisujemy protokół izolacji jaj Schistosoma mansoni z zakażonych wątrób (zmodyfikowany na podstawie 7), sensytyzacji i wyzwania myszy, a także pobierania organów (płukanie pęcherzykowo-oskrzelowe (BAL), płuca i drenujące węzły chłonne) do analizy. Przedstawiamy również reprezentatywne dane histologiczne i immunologiczne oraz sugestie dotyczące dodatkowych analiz immunologicznych.
Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta dostarcza modelu in vivo do badania odpowiedzi immunologicznych indukowanych przez helmintów w płucach, który znajduje szerokie zastosowanie w badaniach nad chorobami zapalnymi typu Th2, w tym nad zakażeniami helmintami, chorobami włóknistymi, zapaleniami alergicznymi oraz astmą. Zalety tego modelu w badaniu zapalenia typu 2 w płucach obejmują powtarzalność silnej odpowiedzi zapalnej Th2 w płucach i drenujących węzłach chłonnych, łatwość oceny stanu zapalnego poprzez badanie histologiczne ziarniniaków otaczających jaja oraz możliwość długoterminowego przechowywania jaj pasożyta.

Schistosoma mansoni jaja są silnymi stymulatorami odpowiedzi immunologicznej typu Th2 (T helper type 2), charakterystycznej dla infekcji pasożytniczych, astmy i zapalenia alergicznego. Niniejszy protokół wykorzystuje wstrzykiwanie jaj S. mansoni w celu wywołania indukowanej cytokinami CD4 Th2 odpowiedzi zapalnej w płucach, charakteryzującej się tworzeniem ziarniaków wokół jaj, eozynofilią oraz alternatywną aktywacją makrofagów.

Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

pasożyty z rodzaju Schistosoma to przywry krwi, które infekują szacunkowo 200 milionów ludzi na całym świecie 1. W przypadku przewlekłej infekcji Schistosoma ciężkie ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest zbadanie stanu zapalnego płuc oraz odpowiedzi komórek odpornościowych. Zostaje to osiągnięte poprzez oczyszczanie jaj helmintów z wątrób zakażonych shta. W drugim kroku myszy są immunizowane i poddawane działaniu oczyszczonych jaj, co wywołuje silną odpowiedź zapalną w płucach.Następnie izoluje się płuca oraz drenujące organy limfatyczne myszy w celu oceny nasilenia odpowiedzi zapalnej na helminty. Uzyskane wyniki wykazują silny stan zapalny płuc wywołany przez helminty, oparty na rekrutacji komórek zapalnych do płuc oraz obserwacji patologii płuc wywołanej przez jaja. Zazwyczaj osoby rozpoczynające naukę tej techniki mogą napotkać pewne trudności, ponieważ precyzja i ostrożność są niezbędne podczas sekcji płuc i węzłów chłonnych, a także przy wstrzykiwaniu jaj.Jednakże dopracowanie tej techniki jest opłacalne, ponieważ pozwala na wizualizację silnej odpowiedzi zapalnej płuc na jaja helmintów. Technikę tę demonstrują Karen i technicy z laboratorium Nyer i Greenberga. Położyć uśpioną mysz zakażoną Schistosoma circ na grzbiecie i wykonać nacięcie skóry w celu odsłonięcia otrzewnej, wyciąć wątrobę znajdującą się poniżej klatki piersiowej i przepony, drobno posiekać wątroby i dodać 20 milliliters na wątrobę mieszaniny trawiennej, składającej się z kolagenazy, dysbase, penicyliny i streptomycyny w PBS. Przenieść tę mieszaninę do probówki Falcon o pojemności 50 milliliter i inkubować przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 degrees Celsius.Następnego dnia. Odwiruj mieszaninę w wirówce. Odlej nadmiar cieczy, napełnij probówkę PBS i ponownie odwiruj, powtarzając przemywanie PBS po ostatnim wirowaniu.Resuspenduj osad w 25 mililitrach PBS. Następnie przecedź resuspendowany osad przez metalowe sito, a potem przez sito laboratoryjne. Przenieś tak przefiltrowaną mieszaninę do probówki Falcon o pojemności 50 mililitrów i odwiruj w wirówce.Odlać nadsącz i zawiesić osad w trzech mililitrach PBS. Mieszaninę ostrożnie nałożyć na gradient 40 ml, składający się z ośmiu ml na probówkę oraz 32 ml 0,25 M sacharozy, a następnie wirować przez 10 minut przy 800 $\times$g w temperaturze 20 °C.Następnie usuń górną warstwę komórek wątroby za pomocą pipety transferowej. Pobierz osad jajowy z dna i umieść go w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml. Przemyj osad trzykrotnie w 10 ml PBS zawierającego EDTA i EGTA, a następnie odwiruj.Osad zawiesić ponownie w 500 µL PBS. Mieszaninę tę nałożyć na nowy gradient 10 mL zawierający 2,5 mL Percoll oraz 7,5 mL 0,25 M sacharozy i odwirować. Osad wyprać trzykrotnie w 10 mL.PBS i wirówka. Upewnij się, że zawartość probówki Falcon została dobrze wymieszana, a następnie pobierz 50 µL z ostatniego przemycia. Aby policzyć jaja, rozcieńcz pobrane 50 µL.Wymieszać z 450 µL PBS i nanieść 100 µL tej mieszaniny na szkiełko przedmiotowe umieszczone na stole mikroskopu stereoskopowego w celu policzenia kropli; resuspender jaja w PBS do stężenia 50 000 jaj/mL. Jaja można przechowywać przez kilka miesięcy w temperaturze -80 °C i rozmrażać raz lub dwa razy w celu użycia. Przed użyciem sprawdzić jaja pod mikroskopem w probówce z zakrętką typu snap o pojemności 5 mL, aby upewnić się, że są nadal nieuszkodzone.Przygotować jaja w stężeniu 5 000 jaj na 100 µL PBS do iniekcji. Odmierzyć o 50% więcej jaj niż jest wymagane. Napełnić igłę 23G o długości 5/8 cala i strzykawkę o pojemności 1 mL zawiesiną jaj w ilości 100 µL na mysz.Kołysz strzykawką w przód i w tył, aby wymieszać jaja przed każdym wstrzyknięciem, a następnie wstrzykaj 100 µL zawiesiny do jamy otrzewnowej każdej myszy 14 dni po sensytyzacji. Przygotuj jaja w taki sam sposób jak wcześniej w stężeniu 5 000 jaj na 100 µL i napełnij strzykawkę o pojemności 1 ml z igłą 23 G. Używając pęsety, zegnij igłę pod kątem 90 stopni i upewnij się, że w strzykawce nie ma pęcherzyków powietrza.Zanurzyć mysz w narkozie i ułożyć ją na boku. Wstrzyknąć 100 µL zawiesiny do naczyń krwionośnych za gałką oczną pod kątem 45 stopni względem nosa. Osiem dni po podaniu dożylnym uśmiercić mysz i wykonać niewielkie nacięcie skóry brzucha.Przetnij otrzewną i zlokalizuj aortę brzuszną. Przetnij aortę, aby pobrać krew za pomocą pipety Pasteura, a następnie przechowuj ją w lodzie. Przesuń wątrobę w dół, aby odsłonić przeponę.Za pomocą precyzyjnych nożyczek przetnij przeponę, robiąc to ostrożnie. Otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić tkankę płucną. Węzły chłonne paratymusowe znajdują się pod klatką piersiową, powyżej płuc i po obu stronach grasicy.Wydobądź węzły chłonne za pomocą precyzyjnej pęsety i przechowuj je w lodzie w 1 ml sterylnego medium. Aby rozpocząć procedurę intubacji, odsuń gruczoły ślinowe na bok, aby odsłonić tchawicę. Umieść precyzyjną pęsetę pod tchawicą i użyj precyzyjnych nożyczek.Wytnij otwór w środkowej części tchawicy i wprowadź rurkę do płuc. Zabezpiecz rurkę, zawiązując ją nicią chirurgiczną. Następnie podłącz do rurki strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną PBS i napompuj płuca 1 ml PBS.Ostrożnie pobierz płyn z przemywania BAL za pomocą strzykawki i przechowuj go w lodzie. Następnie podłącz do rurki strzykawkę o pojemności jednego mililitra wypełnioną 4% paraformaldehydem w PBS i napompuj płuca. Następnie usuń rurkę i zaciśnij nić chirurgiczną, aby zapobiec wyciekowi PFA.Na koniec ostrożnie wypreparuj tkankę płuc i umieść ją w probówce typu Falcon o pojemności 50 ml zawierającej 5 ml 4% PFA w PBS. Po inkubacji na lodzie przez 0,5 do 2 godzin odwiruj pobraną krew, aby oddzielić warstwę surowicy; surowica może być wykorzystana do analizy IgG specyficznej dla antygenu jaj *S. mansoni* za pomocą testu ELISA. Wycięte węzły chłonne przywątrobowe można ponownie stymulować antygenem jaj *S. mansoni* w celu analizy cytokin Th2 specyficznych dla antygenu. Po wirowaniu i pelletowaniu komórek odzyskaj płyn BAL do analizy cytokin Th2 metodą ELISA. Komórki BAL są odzyskiwane do przygotowania cytocentryfużowego.Przez noc utrwalona tkanka płuc do badań histologicznych i immunofluorescencyjnych; przedstawione tutaj obrazy ukazują wątroby ziarniniakowe, które są charakterystyczne dla wysokiego obciążenia jajami esman. Na zdjęciach widoczne są również jaja esman. Rysunek ten przedstawia zapalenie dróg oddechowych wywołane wstrzyknięciem jaj essman sooni.Wykres po lewej stronie pokazuje, że liczba komórek w BAL jest znacznie wyższa u myszy, którym wstrzyknięto jaja s mansoni, w porównaniu z myszami naiwnymi. Obrazy po lewej stronie przedstawiają reprezentatywne preparaty z cyto-wirowania. Można na nich wyraźnie zwizualizować komórki BAL oraz naciek zapalny składający się z makrofagów, eozynofili i limfocytów.Na przekroju płuca barwionym H&amp;E widoczny jest ziarniniak płucny otaczający jajo esson. Obraz przedstawia barwienie immunofluorescencyjne dla realm alpha w kolorze zielonym. Receptor mano w kolorze czerwonym oraz barwnik DPI w kolorze niebieskim ujawniają alternatywnie aktywowane makrofagi, wskazane białą strzałką.Przedstawiono tutaj odpowiedź cytokinową TH2 swoistą dla antygenu jaj S. mansoni w węzłach chłonnych obszaru krezkowego u myszy naiwnych oraz myszy wstrzykniętych S. mansoni. Komórki węzłów chłonnych z każdej grupy stymulowano antygenem jaj S. mansoni przez 72 godziny. Następnie w supernatancie wykonano test ELISA w celu oznaczenia IL-4, IL-5 oraz IL-13.Stężenia wszystkich trzech cytokin zapalnych były znacznie wyższe u myszy po wstrzyknięciu esmanu, po jego rozwoju. Technika ta stanowi łatwy sposób dla badaczy z dziedziny alergii i infekcji helmintami na badanie komórek odpornościowych rekrutowanych w odpowiedzi na zakażenie pasożytniczymi helmintami oraz alergię w organizmie modelowym myszy.

using-eggs-from-schistosoma-mansoni-as-an-vivo-model-helminth-induced

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Korzystanie z jajek z Schistosoma mansoni jako modelu in vivo zapalenia płuc wywołanego pasożytami

Zakażenie *Trichuris muris* jest jelitowym modelem odporności Th2, w którym myszy oporne generują ochronną odpowiedź Th2, natomiast myszy podatne generują patologiczną odpowiedź Th1.

Infekcja Trichuris muris: Model odporności typu 2 i stanu zapalnego w jelitach

Opisujemy metodę in vitro hodowli schistosomul pasożytniczego płazińca Schistosoma mansoni, polegającą na pozyskiwaniu i transformacji zakaźnych cerkariów z pośredniego żywiciela – słodkowodnego ślimaka Biomphalaria glabrata.

Transformacja cerkarii i hodowla in vitro schistosomul Schistosoma mansoni

Heligmosomoides polygyrus to mysi nicień o potężnych zdolnościach immunomodulacyjnych, które są bardzo podobne do tych z bardzo rozpowszechnionej infekcji ludzkim robakiem pasożytniczym. W tym miejscu opisujemy protokół długoterminowego utrzymania cyklu życiowego H. polygyrus.

Hodowla Heligmosomoides polygyrus: immunomodulującego pasożyta nicieni i wydzielanych przez niego produktów

Ten artykuł opisuje protokół na dużą skalę izolacji aksenicznej i zbierania swobodnie pływających miracidii ludzkiej krwi przywry Schistosoma mansoni oraz ich późniejszego przetwarzania w celu wprowadzenia do hodowli in vitro.

Masowa izolacja i hodowla in vitro wewnątrzmięczakowych stadiów ludzkiej krwi Fluke Schistosoma mansoni

Tutaj prezentujemy protokół wstrzykiwania jaj świerszczy, technikę, która służy jako podstawowa metoda w wielu eksperymentach na świerszczu, w tym, ale nie tylko, interferencji RNA i manipulacji genomem.

Wstrzykiwanie jaj Gryllus bimaculatus

Tutaj dostarczyliśmy metodę osiągnięcia stabilnej transfekcji pasożytów Eimeria kurczaka poprzez nukleofektyczne sporozoity lub merozoity drugiej generacji. Genetycznie zmodyfikowane pasożyty eimeriańskie wykazujące ekspresję heterologicznych genów antygenowych mogą być wykorzystywane jako nośniki szczepionek.

Nukleofekcja i rozmnażanie in vivo pasożytów Eimeria kurczaka

Zakażenie Caenorhabditis elegans pasożytem mikrosporydów Nematocida parisii umożliwia robakom wytwarzanie potomstwa, które jest wysoce odporne na ten sam patogen. Jest to przykład odporności dziedzicznej, słabo poznanego zjawiska epigenetycznego. Niniejszy protokół opisuje badanie odporności dziedzicznej w genetycznie podatnym modelu robaka.

Badanie odporności dziedzicznej w modelu zakażenia mikrosporydiami Caenorhabditis elegans

Limfocyty T i ILC2 wykazujące ekspresję IL-9 są indukowane podczas infekcji N. brasiliensis, jednak ich charakterystyka została w dużej mierze przeoczona w zakażonym jelicie ze względu na ich niską częstotliwość i różnicową kinetykę. Protokół ten opisuje izolację tych komórek z różnych narządów docelowych i potwierdzenie ich tożsamości za pomocą cytometrii przepływowej na różnych etapach infekcji.

Strategia badania komórek limfoidalnych wytwarzających IL-9 w modelu zakażenia Nippostrongylus brasiliensis

Strongyloides ratti to pasożytniczy nicień, który powoduje przejściowe infekcje u myszy laboratoryjnych, wykazując migrację tkanek i etapy życia jelitowego. W tym miejscu przedstawiamy protokół utrzymania cyklu pasożytniczego u szczurów i eksperymentalnego zakażenia myszy, w tym kwantyfikację pasożytów w głowie, płucach i jelicie.

Eksperymentalne zakażenie myszy pasożytniczym nicieniem Strongyloides ratti

Tutaj opisujemy warunki hodowli in vitro, izolację i zwiększoną generację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z Echinococcus granulosus. Małe pojazdy elektryczne charakteryzowały się dynamicznym rozpraszaniem światła i transmisyjną mikroskopią elektronową. Wychwyt przez komórki dendrytyczne pochodzące ze szpiku kostnego i ich modulację fenotypową badano za pomocą mikroskopii konfokalnej i cytometrii przepływowej.

Izolacja i wychwyt komórek dendrytycznych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Echinococcus granulosus

Badanie to oceniało aktywność biologiczną ekstraktów z Tithonia diversifolia przy użyciu metod opartych na rodnikach oraz testu in vitro wylęgu jaj (EHA), aby ocenić ich wpływ na nicienie pokarmowe u małych przeżuwaczy. Opisano metodologię i kluczowe ustalenia, podkreślając potencjał tych ekstraktów do zwalczania pasożytów.

Ocena właściwości antyoksydacyjnych i anthelmintycznych ekstraktów Tithonia diversifolia przeciwko jajeczom nicieni pokarmowych z wykorzystaniem testów in vitro

Poznaj model zapalenia płuc wywołanego jajami Schistosoma mansoni u myszy. Metoda pozwala badać odpowiedź immunologiczną Th2, rekrutację komórek zapalnych i patologię płuc in vivo.

Wykorzystanie jaj Schistosoma mansoni jako modelu in vivo stanu zapalnego płuc wywołanego przez helminty

Przeglądaj więcej filmów