Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Ogólnym celem tej procedury jest włączenie transportera A, b, C. W tym przypadku transporter maltozy malf GK dwa do rozpuszczalnych cząstek nano dysku membranowego. Osiąga się to poprzez uprzednie zmieszanie białka rusztowania błonowego MSP z transporterem i odpowiednią ilością lipidów w komórkach detergentu.

Drugim krokiem jest dodanie kulek polistyrenowych i delikatne kołysanie mieszaniną przez noc, detergent jest stopniowo wchłaniany na kulki, co pozwala na tworzenie się cząstek nano dysku. Następnie koraliki są usuwane przez sedymentację. Ostatnim etapem jest oddzielenie prawidłowo uformowanych krążków od agregatów i niepołączonych białek rusztowania za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.

Na koniec jakość krążków ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy żelowej lub spektroskopii rozpraszania światła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak liposomy, jest to, że białka błonowe i krążki są doskonale rozpuszczalne w roztworze wodnym. Ponadto domeny białkowe są teraz dostępne z obu stron.

Ponieważ teraz nie ma już przedziału błonowego Używając białek rusztowania błonowego o różnej długości, udało mi się wychwycić i zbadać różne stany więzadeł białek błonowych. Co najważniejsze, metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki błonowej, takie jak identyfikacja nowych partnerów wiążących transportery a, b i C. W rzeczywistości implikacje tej techniki rozciągają się dalej w kierunku terapii, ponieważ może ona pomóc w odkryciu aktywatorów lub inhibitorów białek błonowych i receptorów.

Chociaż ta metoda wydaje się prosta, należy zachować ostrożność przy wyborze odpowiedniego stosunku lipidów białkowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, mają trudności z obliczeniem prawidłowego współczynnika formy lub przeprowadzeniem prawidłowej kontroli, która zapewnia jakość preparatu. Dlatego wizualna demonstracja tej metody jest bardzo przydatna dla nowego ucznia, aby nauczyć się różnych kroków i potencjalnych trudności.

Aby rozpocząć gro hexa histydyna oznaczona MSP w szczepie E coli BL 21 DE trzy z plazmidu P MSSP 1D jeden indukował produkcję białka, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi około 0,5 przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza, zbierz komórki przez wirowanie w temperaturze 5 000 G przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ponownie zawiesić osad w buforze TSG 10 zawierającym 100 mikromolowych PMSF, trzykrotnie przetrzeć komórki za pomocą prasy francuskiej przy 8 000 PS. Usuwam nierozpuszczalny materiał przez odwirowanie w temperaturze 5 000 g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie wyizolować rozpuszczalną frakcję zawierającą MSP przez ultrawirowanie w temperaturze 125 000 G przez 45 minut.

Oczyść MSP za pomocą chromatografii chelatującej nikiel przy użyciu około 1,5 mililitra surowicy niklowej o wysokiej wydajności w buforze TSG 10. Zmyć zanieczyszczenia buforem T SG 10 zawierającym 50 milimolowy eluowany ILE. MSP z buforem TSG 10 zawierającym 600 milimolowy I midaz po dializie.

Oczyszczone białko w buforze MSP TSG 10 może być przechowywane w temperaturze minus 70 stopni Celsjusza i stężeniu białka około 10 do 15 miligramów na mililitr. Kompleks MALF GK dwa, jego oznakowany na końcu C MAL K, ulega ekspresji z plazmidu. PED 22 FG K wyhodowany w szczepie E coli BL 21 DE trzy indukuje produkcję białka, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi około 0,5 przy 0,2% L Arabów przez trzy godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza po lizie komórek i odwirowaniu.

Tak jak poprzednio, zawieszamy granulat membranowy w buforze TSG 20 do końcowego stężenia pięciu miligramów na mililitr. Następnie rozpuszczaj materiał z 1% masy na objętość GDM przez trzy godziny w czterech stopniach Celsjusza, delikatnie wstrząsając. Usunąć nierozpuszczalny materiał przez ultrawirowanie, jak w przypadku oczyszczania MAL FTK dwa.

Następnie zebrać supernatant zawierający rozpuszczony kompleks mal FTK two i ponownie oczyścić za pomocą chromatografii chelatującej nikiel. Dalej oczyszczać kompleks za pomocą chromatografii żelowej filtracji w buforze TSGD na kolumnie SUEx 200, HR dziesięć trzysta przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę. Aby wytworzyć fosfolipidy, całkowity ekstrakt lipidowy E. coli rozpuszczony w chloroformie rozdziela się na 1000 anomalnych podwielokrotności w zakręcanych probówkach z mikrofiszami, odparowuje rozpuszczalnik pod delikatnym strumieniem azotu i pędzi dalej przez noc w próżni.

Następnie wysuszyć, rozpuścić film lipidowy w buforze TS przy końcowym stężeniu pięciu NMO i energicznie wirować, a następnie pulsować sonikować pięć razy przez około pięć sekund. Rozpuszczone lipidy będą wydawać się lekko nieprzezroczyste ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, ale powinny pozostać w zawiesinie. Dodaj DDM do końcowego stężenia 0,5%W tym momencie roztwór stanie się klarowny, umieść mieszaninę lipidów w łaźni wodnej i pulsuj dźwiękami pięć razy przez około pięć sekund.

Mieszanina lipidów może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez maksymalnie tydzień. Aby przygotować bio kulki, umieść około 10 do 15 mililitrów bio koralików w 50-mililitrowej tubce. Najpierw umyj kulki 50 mililitrami 100% metanolu.

Pozwól, aby kulki osiadły grawitacyjnie, a następnie delikatnie wylej roztwór. Powtórz proces raz dla metanolu, a następnie dwa razy dla 95% etanolu mili Q wody i na koniec buforu TS. Rozpocznij nano dyskretną konstytucję od rozcieńczenia MSP w buforze TSGD do końcowego stężenia około siedmiu miligramów na mililitr lub 0,3 milimola.

Aby zapewnić udany eksperyment, ważne jest, aby wybrać odpowiednie proporcje lipidów i białek, które mają być ze sobą zmieszane. Wymieszać około dwóch M oczyszczonego kompleksu malf GK dwa w stosunku białka do MS P do lipidów od jednego do trzech do 60 w buforze TSGD dla końcowej objętości 300 mikrolitrów tutaj, próbkę nadmiaru lipidu w stosunku jeden do trzech do 400 przygotowuje się również jako kontrolę ujemną w 50 mikrolitrach zawiesiny biokulek do probówki i inkubuje mieszaninę przez noc na kołysząc stół w temperaturze czterech stopni Celsjusza następnego dnia, osadzaj koraliki grawitacyjnie. Gdy kulki osiądą na roztworze, przepuść rurę przez wąską końcówkę, aby uniknąć jak największej ilości kulek bio.

Usunąć duże osady przez ultrawirowanie w temperaturze 100 000 GS przez 20 minut. Przystąpić do oczyszczania krążków za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej, jak to miało miejsce wcześniej w buforze TSG 10. Następnie wstrzyknąć Eloqua na tę samą żelową kolumnę filtracyjną w celu przetestowania stabilności preparatu.

Następnie połącz frakcje zawierające krążki. Jakość preparatu ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy żelowej. Przeanalizować jeden mikromol nanokrążków, aby ocenić jakość rekonstytucji.

Oceń również wiązanie mal E z mal ftk dwa kompleksy odtworzone w nanodyskach. Po elektroforezie zabarwić żel błękitem kumasi przez 10 minut i odstawić na około godzinę. Aby przeprowadzić dynamiczne rozpraszanie światła lub DLS, najpierw oczyść nanodyski za pomocą chromatografii z filtracją żelową, tak jak poprzednio, przy użyciu kolumny SUEx 200 HR dziesięć trzysta przy natężeniu przepływu 0,1 mililitra na minutę.

Puluj frakcje zawierające nano dyski i skoncentruj do około 10 miligramów na mililitr za pomocą filtra odśrodkowego AmCon. Następnie przefiltruj próbkę dwukrotnie. Wykonuj analizę za pomocą DLS przy użyciu instrumentu dynapro nano star w danych o objętości wewnętrznej jednego mikrolitra i dopasowaniu kwarcowym.

Korzystając z oprogramowania dynamicznego do oszacowania średnicy i masy cząsteczkowej cząstek, określ aktywność A TPA mal FTK dwóch odtworzonych nanodysków za pomocą testu metrycznego chole. Najpierw zmieszaj jeden mikromol oczyszczonych krążków i jeden milimol TP z rosnącą ilością mal e. Próbki należy inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 20 minut.

Następnie zmierz uwalnianie nieorganicznego fosforanu na głębokości 660 nanometrów. Porównaj ilość uwolnionego fosforanu z krzywą wzorcową otrzymaną za pomocą roztworu wzorcowego fosforu. Nanodyski są oczyszczane za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej.

Chromatogram pokazuje, że większość odtworzonych krążków wymywa się jako pojedynczy pik, podczas gdy krążki wykonane z nadmiaru lipidów eluują w pustej objętości i jako seria szerokich pików, jakość przygotowania krążka jest dalej analizowana przez natywne krążki elektroforezy żelowej odtworzone z ograniczoną ilością lipidów migrują jako ostre pasmo na natywnym żelu, podczas gdy te odtworzone w obecności nadmiaru lipidów migrują w postaci rozmazów. Analiza przeprowadzona przez DLS pokazuje, że populacja dysku jest jednorodna o średnim promieniu 5,0 nanometrów. Na podstawie aproksymacji DLS, odtworzone krążki mają pozorną masę cząsteczkową 215 kilodaltonów, próbki odtworzone w obecności nadmiaru lipidów mają szeroko rozprowadzone promienie około 100 nanometrów, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.

Aktywność kompleksu MAL FTK two ocenia się, mierząc szybkość hydrolizy TP i powinowactwo do oddziałujących partnerów, takich jak białko wiążące maltozę, MAL E, białko wiążące maltozę. MAL E wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MAL FTK two za pomocą niedenaturującej elektroforezy żelowej. Możliwe jest wykrycie kompleksu między MAL E i MAL ftk dwa, stymulacja aktywności MAL KA TPA przez MAL E jest tutaj pokazana jako funkcja stężenia MAL e.

Wytwarzanie nanodysku jest stosunkowo proste, jednak niewielkie odchylenia od optymalnych warunków mogą prowadzić do nieodwracalnej agregacji białek Po opanowaniu tej techniki można to zrobić w mniej niż dwa dni. Próbując tej procedury, należy pamiętać o tym, jak ważny jest wybór prawidłowego stosunku lipidów białkowych, ponieważ nadmierna ilość lipidów doprowadzi do produkcji dużych cząstek podobnych do liposomów polidyspersyjnych. Kluczowe znaczenie ma dokładna analiza jakości odtworzonego materiału przy użyciu technik innych niż filtracja żelowa, takich jak spektroskopia rozpraszania światła, analityczne ultrawirowanie lub prościej natywna elektroforeza żelowa.

Należy pamiętać, że rodzaj fosfolipidu obejmującego krążek, jak również białko rusztowania błonowego, może przyczynić się do skuteczności rekonstytucji. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu dobrze zrozumiałeś, jak generować rozpuszczalne i jednorodne nanodyski zawierające wybrane przez Ciebie białko błonowe. Powodzenia w eksperymentach.