Name: Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji transportera ABC MalFGK2 w nanodyskach lipidowych. Protokół obejmuje mieszanie białek szkieletowych z transporterem i lipidami, absorpcję detergentu na kulkach polistyrenowych oraz oczyszczanie chromatografią filtracji żelowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem. CSC zostało sfinansowane ze stypendium podoktorskiego przyznanego przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych. FD jest Tier II Canada Research Chair.

Ogólny proces rekonstytucji
 Proces rekonstytucji rozpoczyna się od zmieszania białka rusztowania błony (MSP) z oczyszczonym kompleksem MalFGK2 w obecności fosfolipidów solubilizowanych detergentem. Następnie następuje powolne usuwanie detergentu za pomocą adsorbentu z polistyrenu, zwanego Bio-Beads lub Amberlite (Rysunek 1). Proces samorzutnego montażu zachodzi najprawdopodobniej w wyniku oddziaływań apolarnych między hydrofobowymi fosfolipidami, kompleksem MalFGK2 a powierzchnią amfipatycznego białka MSP. Produktem końcowym jest cząstka dyskoidalna składająca się z dwóch cząsteczek MSP otaczających kompleks MalFGK2. Cząstki są oddzielane od adduktów i agregatów za pomocą ultrawirowania oraz analitycznej chromatografii wykluczania rozmiarów. Cząstki są charakteryzowane za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła.
 1. Przygotowanie białka rusztowania błonowego, MSP
 <ol>
 <li>MSP z tagiem histydynowym (wersja MSP1D11) jest produkowana z plazmidu pMSP1D1 w szczepie E. coli BL21 (DE3) indukowanym przy OD600~0,5 za pomocą 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu przez 3 h w 37 °C.</li>
 <li>Komórki są zbierane przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C i resuspendowane w buforze TSG10 zawierającym 100 μM fluorku fenylometanosulfonylu.</li>
 <li>Komórki są lizowane w prasie francuskiej (3x) pod ciśnieniem 8 000 psi, a materiał nierozpuszczalny jest usuwany przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C. Frakcja rozpuszczalna zawierająca MSP jest izolowana przez ultrawirowanie przy 125 000 x g przez 45 min.</li>
 <li>MSP jest oczyszczane metodą chromatografii z wykorzystaniem chelatu niklu przy użyciu ~1,5 ml Ni Sepharose HP w buforze TSG10. Zanieczyszczenia są wypłukiwane buforem TSG10 zawierającym 50 mM imidazolu. MSP jest eluowane buforem TSG10 zawierającym 600 mM imidazolu. Oczyszczone białko jest dializowane w buforze TSG10 i przechowywane w -70 °C przy stężeniu białka ~10-15 mg/ml.</li>
 </ol>
 2. Przygotowanie kompleksu MalFGK2
 <ol>
 <li>Kompleks MalFGK2, z tagiem His na C-końcu MalK, jest ekspresowany z plazmidu pBAD22-FGK w E. coli BL21 (DE3) i indukowany przy OD600~0,5 za pomocą 0,2% L-arabinozy przez 3 h w 37 °C.</li>
 <li>Po lizie komórek i wirowaniu zgodnie z krokiem 1.3, osad błonowy zawiesza się w buforze TSG20 do końcowego stężenia 5 mg/ml. Materiał jest solubilizowany przy użyciu 1% w/v n-dodecyl-β-maltopiranozyd (DDM) przez 3 h w 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
 <li>Materiał nierozpuszczalny jest usuwany poprzez ultrawirowanie zgodnie z krokiem 1.3, a supernatant zawierający solubilizowany kompleks MalFGK2 jest zbierany i oczyszczany zgodnie z krokiem 1.4, jednak bez dializy.</li>
 <li>Dalsze oczyszczanie przeprowadza się za pomocą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie Superdex 200 HR 10/300 przy szybkości przepływu 0,5 ml/min.</li>
 </ol>
 3. Przygotowanie fosfolipidów
 <ol>
 <li>Wyekstrahowane całkowite lipidy E. coli rozpuszczone w chloroformie dzieli się na alikwoty po 1 000 nmol w probówkach do mikrocentryfugi z nakrętką. Rozpuszczalnik odparowuje się pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie dodatkowo suszy przez noc w eksykatorze próżniowym.</li>
 <li>Film lipidowy rozpuszcza się w buforze TS do końcowego stężenia 5 nM, a następnie intensywnie miesza na wortexie i poddaje sonikacji. Rozpuszczone lipidy będą lekko mętne ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, jednak powinny pozostać w zawiesinie. Dodaje się DDM do końcowego stężenia 0,5% (~10 mM), po czym roztwór staje się klarowny.</li>
 <li>Mieszaninę lipidową umieszcza się w łaźni wodnej i poddaje sonikacji impulsowej 5 razy po około 5 s. Mieszaninę lipidową przechowuje się w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
 </ol>
 4. Przygotowanie Bio-Beads
 <ol>
 <li>Do probówki o pojemności 50 ml wsypuje się około 10-15 ml (objętość sypka) Bio-Beads.</li>
 <li>Kuleczki płucze się kolejno 50 ml 100% metanolu, 95% etanolu, wody milliQ H2O, a na koniec buforem TS (każdym z nich po dwa razy).</li>
 <li>Wypłukane kuleczki przechowuje się w temperaturze 4 °C w ~10 ml buforu TS.</li>
 </ol>
 5. Rekonstytucja nanodysków
 <ol>
 <li>MSP rozcieńcza się w buforze TSGD do końcowego stężenia ~7 mg/ml (~0,3 mM).</li>
 <li>~2 nmol oczyszczonego kompleksu MalFGK2 miesza się w stosunku białko:MSP:lipid 1:3:60 lub 1:3:400 w buforze TSGD. Końcowe stężenia wynoszą 6 μM MalFGK2, 18 μM MSP i 360 μM lipidów (1:3:60) lub 2,4 mM lipidów (1:3:400). Końcowa objętość wynosi 300 μl. Końcowe stężenie DDM wynosi 0,08% (~1,6 mM). Końcowe stężenie glicerolu zależy od ilości dodanych lipidów, ale utrzymuje się na poziomie około 5-10% v/v.</li>
 <li>Do probówki dodaje się ~50 μl zawiesiny Bio-Beads, a mieszaninę inkubuje się przez noc na stole kołyszącym w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Kuleczki osadza się grawitacyjnie, a roztwór odpipetowuje za pomocą wąskiej końcówki, aby uniknąć pobrania jak największej liczby kuleczek Bio-Beads.</li>
 <li>Duże osady usuwa się za pomocą ultrawirowania przy 100 000 x g przez 20 min. Dyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej zgodnie z krokiem 2.4 w buforze TSG10. Frakcje zawierające dyski łączy się, a alikwot należy ponownie wprowadzić na tę samą kolumnę do filtracji żelowej w celu sprawdzenia stabilności preparatu.</li>
 <li>Oczyszczone dyski można przechowywać w temperaturze -70 °C przez dłuższy czas. Po rozmrożeniu na lodzie dyski należy poddać ultrawirowaniu zgodnie z krokiem 5.5 w celu usunięcia potencjalnych osadów. Alikwot należy przeanalizować za pomocą chromatografii filtracyjnej, aby upewnić się, że podczas procesu rozmrażania nie doszło do znacznej agregacji lub precypitacji.</li>
 </ol>
 6. Elektroforeza w żelu natywnym
 <ol>
 <li>Nanodyski o stężeniu 1 μM (~0.2 mg/ml) analizuje się za pomocą natywnego PAGE6, 7 (Tris-HCl pH 8.8, 4-12%), aby ocenić jakość rekonstytucji (Rycina 3A).</li>
 <li>Wiązanie MalE (1 μM) z kompleksem MalFGK2 rekonstytuowanym w nanodyskach jest również oceniane za pomocą natywnego PAGE (Rycina 3A).</li>
 <li>Po elektroforezie żel barwi się błękitem Coomassie przez 10 min, a następnie odbarwia przez ~1 hr.</li>
 </ol>
 7. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
 <ol>
 <li>Nanodyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej żelowej, analogicznie do kroku 2.4, w buforze TSG10 przy użyciu kolumny Superdex 200 HR 10/300 i szybkości przepływu 0.1 ml/min. Frakcje zawierające nanodyski są łączone i zagęszczane do stężenia ~10 mg/ml za pomocą wirówkowego filtra Amicon.</li>
 <li>Przed analizą metodą DLS próbkę filtruje się dwukrotnie (filtr 0.22 μm), a następnie analizuje za pomocą instrumentu DynaPro nanostar (Wyatt Technology) w kuwecie kwarcowej o objętości wewnętrznej 1 μl. Dane są dopasowywane przy użyciu oprogramowania DYNAMICS (Wyatt Technology) w celu oszacowania średnicy oraz masy cząsteczkowej cząstek.</li>
 </ol>
 8. Pomiary aktywności ATPase
 <ol>
 <li>Aktywność ATPase nanodysków zrekonstytuowanych z MalFGK2 jest określana za pomocą testu kolorymetrycznego8.</li>
 <li>1 μM oczyszczonych dysków i 1 mM ATP miesza się z rosnącymi ilościami MalE i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 20 min. Uwalnianie fosforanu nieorganicznego mierzy się przy 660 nm.</li>
 <li>Ilość uwolnionego fosforanu porównuje się z krzywą wzorcową wygenerowaną przy użyciu roztworu wzorcowego fosforu.</li>
 </ol>
 9. Reprezentatywne wyniki
 Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii filtracyjnej żelowej (Ryc. 2A, lewo). Chromatogram wykazuje, że większość zrekonstytuowanych dysków (linia czarna) eluje jako pojedynczy pik, podczas gdy dyski otrzymane z nadmiarem lipidów (linia czerwona) eluują w objętości martwej oraz jako seria szerokich pików. Jakość nanodysków jest następnie analizowana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Prawidłowo zrekonstytuowane dyski migrują jako ostry prążek w żelu, natomiast te zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów migrują w formie rozmycia (Ryc. 2A, prawo). Analiza DLS wykazuje, że populacja dysków jest jednorodna, ze średnią średnicą 11,4 nm (Ryc. 2B). Zrekonstytuowane dyski mają pozorną masę cząsteczkową 215 kDa na podstawie przybliżenia DLS. Próbki zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów wykazują szeroki rozkład promieni wokół 100 nm, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.
 Jakość kompleksu MalFGK2 jest oceniana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu, a jego aktywność poprzez pomiary aktywności ATPase (Rysunek 3). Białko wiążące maltozę MalE wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MalFGK29, 10. Dzięki zastosowaniu niedenaturującej elektroforezy żelowej możliwe jest wykrycie kompleksu między MalE a MalFGK2 (Rysunek 3A). Stymulacja aktywności ATPase MalK2 przez MalE została przedstawiona na Rysunku 3B.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Proces tworzenia nanodysków z użyciem MSP i MalFGK₂ wraz ze schematem chromatografii filtracyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Typowy schemat blokowy protokołu rekonstytucji.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Wykresy chromatografii wykluczania i dynamicznego rozpraszania światła dla agregatów białkowych i nanodysków." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Kontrola jakości preparatu nanodysków. A. Analiza filtracji żelowej (kolumna Superdex 200 HR 10/300) nanodysków zrekonstytuowanych przy niskim stosunku lipidów (1/3/60; linia czarna) lub wysokim stosunku lipidów (1/3/400; linia czerwona). Natywna elektroforeza w żelu tych samych preparatów dysków. Oznaczono markery masy cząsteczkowej w kDa. B. Analiza dynamicznego rozpraszania światła tych samych preparatów dysków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Schemat elektroforezy przedstawiający kompleks Nd-FGK2 MalE; analiza słupkowa hydrolizy ATP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Analiza cząsteczek MalFGK2-nanodisc. A. Analiza przesunięcia w żelu dla MalE inkubowanego z rosnącymi ilościami cząsteczek MalFGK2-nanodisc. B. Aktywność ATPase cząsteczek MalFGK2-nanodisc w funkcji stężenia MalE.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisujemy prostą procedurę rekonstytucji transportera maltozy do nanodysków. Transporter jest aktywny w ATPazie, a interakcja z rozpuszczalnym partnerem wiążącym MalE może zostać odtworzona (Figura 3). Udana rekonstytucja transportera w nanodyskach otwiera drogę do dodatkowych analiz biofizycznych i biochemicznych. Szczególnie interesująca będzie systematyczna analiza aktywności ATPazy MalK i transportu maltozy w detergentach, liposomach i nanodyskach. Transportery ABC zmieniają konformacje podczas c...

<table><tbody><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 50K</td><td>Millipore</td><td>UFC805008</td><td>Postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu prawidłowego użycia </td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>E. coli lipidy całkowite</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100500C</td><td>Rozpuszczony w chloroformie, obchodzić się z rozpuszczalnikiem organicznym</td></tr><tr><td>Sefaroza ni żywica HP</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy fosforu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3869</td><td></td></tr><tr><td>pMSP1D1</td><td>Addgene</td><td>20061</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela I. Określone odczynniki.</td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name </td> <td>Kompozycja</td> <td>Komentarze</td> </tr> <tr> <td>DDM stock</td> <td>10% w/v DDM</td> <td>Zawiesić w miliQ wodzie i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td>MalFGK2 stock</td> <td>1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM</td> <td>Przechowywać w temperaturze -70 &; C po oczyszczeniu</td> </tr> <tr> <td>MSP stock</td> <td>10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu</td> <td>Przechowywać w temperaturze -70 &deg; C po oczyszczeniu w < 1 ml podwielokrotności i unikać nadmiernych cykli zamrażania/rozmrażania</td> </tr> <tr> <td>Fosfolipid stock</td> <td>5 nM E. coli total lipids 0,5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 &deg; C przez 1 tydzień</td> </tr> <tr> <td>TS bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Bufor C</td> </tr> <tr> <td>TSG10 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 &; Bufor C</td> </tr> <tr> <td>TSG20 bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glicerol</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td> </tr> <tr> <td>TSGD bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C i dodaj DDM tuż przed użyciem</td> </tr> <tr> <td colspan="3">Tabela II. Przepisy na roztwory.</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

metoda krok po kroku rekonstytucji transportera abc w cząsteczkach lipidowych nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodysk to dyskoidalna cząstka (~ 10-12 nm duża), która więzi białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Nanodysk jest szczególnie atrakcyjną opcją do badania białek błonowych, zwłaszcza w kontekście interakcji ligand-receptor. Metoda zapoczątkowana przez Sligara i współpracowników opiera się na właściwościach amfipatycznych zmodyfikowanego białka rusztowania wysoce a-helisalnego pochodzącego z apolipoproteiny A1. Hydrofobowe powierzchnie białka rusztowania oddziałują z tłuszczowymi acylowymi łańcuchami bocznymi dwuwarstwy lipidowej, podczas gdy obszary polarne są zwrócone w stronę środowiska wodnego. Analizy białek błonowych w nanodyskach mają znaczącą przewagę nad liposomami, ponieważ cząsteczki są małe, jednorodne i rozpuszczalne w wodzie. Ponadto można zastosować metody biochemiczne i biofizyczne zwykle zarezerwowane dla białek rozpuszczalnych i to z obu stron błony. W tym protokole wizualnym przedstawiamy krok po kroku rekonstrukcję dobrze scharakteryzowanego bakteryjnego transportera ABC, kompleksu MalE-MalFGK2. Formowanie się krążka jest procesem samoorganizacji, który zależy od oddziaływań hydrofobowych zachodzących podczas stopniowego usuwania detergentu. Opisujemy podstawowe kroki i podkreślamy znaczenie wyboru prawidłowego stosunku białka do lipidów w celu ograniczenia tworzenia się agregatów i większych polidyspersyjnych cząstek podobnych do liposomów. Proste kontrole jakości, takie jak chromatografia z filtracją żelową, natywna elektroforeza żelowa i spektroskopia dynamicznego rozpraszania światła, zapewniają, że krążki zostały prawidłowo odtworzone.

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Ogólnym celem tej procedury jest wbudowanie transportera ABC, w tym przypadku transportera maltozy malfGK2, w rozpuszczalne nanocząsteczki dyskowe błony (nanodiski). Osiąga się to poprzez wstępne zmieszanie białka rusztowania błony MSP z transporterem i odpowiednią ilością lipidów w micelach detergentu.Drugim krokiem jest dodanie kulek polistyrenowych i delikatne mieszanie zawiesiny przez noc; detergent jest stopniowo absorbowany przez kulki, co umożliwia formowanie się nanocząsteczek dysków. Następnie kulki usuwa się poprzez sedymentację. Ostatnim krokiem jest oddzielenie prawidłowo uformowanych dysków od agregatów i niezespołowanych białek rusztowaniowych za pomocą chromatografii żelowej.Na koniec jakość dysków ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy w żelu lub spektroskopii rozpraszania światła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak liposomy, jest fakt, że białka błonowe i dyski są całkowicie rozpuszczalne w roztworach wodnych. Dodatkowo domeny białkowe są teraz dostępne z obu stron.Ponieważ obecnie nie ma już przedziału membranowego, dzięki zastosowaniu białek rusztowania membranowego o różnych długościach, udało mi się uwięzić i zbadać różne stany wiązań białek błonowych. Co najważniejsze, metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie proteomiki błonowej, takie jak identyfikacja nowych partnerów wiążących transporterów a, b, C. W rzeczywistości zastosowania tej techniki wykraczają dalej w stronę terapii, ponieważ może ona pomóc w odkrywaniu aktywatorów lub inhibitorów białek błonowych i receptorów.Choć metoda ta wydaje się prosta, należy zachować ostrożność przy wyborze odpowiedniego stosunku białek do lipidów. Zazwyczaj osoby początkujące w tej metodzie mają trudności z obliczeniem właściwego stosunku molarnego lub przeprowadzeniem odpowiedniej kontroli zapewniającej jakość preparatu. Dlatego też wizualna demonstracja tej metody jest bardzo przydatna dla studenta chcącego poznać poszczególne etapy oraz potencjalne trudności.Aby rozpocząć, należy hodować MSP z dodatkiem sześciokrotnego znacznika histydynowego w szczepie e coli BL 21 DE3 z plazmidu P MSSP 1D1. Indukcję produkcji białka przeprowadza się, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nanometrach wynosi około 0,5, i kontynuuje przez trzy godziny w temperaturze 37 °C. Komórki należy zebrać poprzez wirowanie przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Osad resuspenduje się w buforze TSG 10 zawierającym 100 µM PMSF. Komórki należy poddać lizie w prasie francuskiej trzykrotnie przy 8 000 PSI. Materiał nierozpuszczalny usuwa się przez wirowanie przy 5 000 ×g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Następnie frakcję rozpuszczalną zawierającą MSP izoluje się poprzez ultrawirowanie przy 125 000 ×g przez 45 minut.Oczyść MSP za pomocą chromatografii z chelatorami niklu, wykorzystując około 1,5 ml żywicy nickel seros high performance w buforze TSG 10. Wypłucz zanieczyszczenia buforem TSG 10 zawierającym 50 mM imidazolu. Eluuj MSP buforem TSG 10 zawierającym 600 mM imidazolu po przeprowadzeniu dializy.Oczyszczone białko w buforze TSG 10 MSP można przechowywać w temperaturze -70 °C przy stężeniu białka wynoszącym około 10 do 15 mg/mL. Kompleks MALF GK 2, z tagiem His na C-końcu MAL K, jest ekspresowany z plazmidu PED 22 FG K w szczepie E. coli BL 21 DE 3; produkcję białka indukuje się, gdy zmierzona gęstość optyczna przy 600 nm wynosi około 0,5, stosując 0,2% L-arabinozy przez trzy godziny w temperaturze 37 °C, a następnie przeprowadza się lizę komórek i wirowanie.Podobnie jak poprzednio, osad błonowy resusppendownujemy w buforze TSG 20 do końcowego stężenia 5 mg/mL. Następnie materiał solubilizujemy za pomocą 1% (m/v) GDM przez trzy godziny w temperaturze 4 °C przy delikatnym wytrząsaniu. Materiał nierozpuszczalny usuwamy poprzez ultrawirowanie, analogicznie do procesu oczyszczania MAL FTK two.Następnie należy zebrać nadsącz zawierający zsolubilizowany kompleks mal FTK two i ponownie go oczyścić za pomocą chromatografii z chelatorami niklu. Dalsze oczyszczanie kompleksu przeprowadza się metodą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie SUEx 200, HR ten trzy hundred przy szybkości przepływu 0,5 milliliters per minute. Aby przygotować fosfolipidy, całkowity ekstrakt lipidowy z e coli rozpuszczony w chloroformie rozdziela się na 1000 anomal aliquots w probówkach typu microfiche z nakrętką; rozpuszczalnik odparowuje się pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie suszy przez noc w próżni.Następnie wysuszyć, rozpuścić błonę lipidową w buforze TS przy końcowym stężeniu NMO wynoszącym 5 i energicznie wymieszać w wiertleksie, a następnie poddać sonikacji impulsowej pięć razy przez około pięć sekund. Rozpuszczone lipidy będą wydawać się lekko mętne ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, lecz powinny pozostać w zawiesinie. Dodać DDM do końcowego stężenia 0,5%. W tym momencie roztwór stanie się klarowny; umieścić mieszaninę lipidów w łaźni wodnej i poddać sonikacji impulsowej pięć razy przez około pięć sekund.Mieszaninę lipidową można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie jeden tydzień. Aby przygotować bio-beads, należy umieścić około 10 do 15 ml bio-beads w probówce o pojemności 50 ml. Następnie należy przemyć kuleczki 50 ml 100% metanolu.Pozostaw kuleczki do opadnięcia pod wpływem grawitacji, a następnie ostrożnie odlej roztwór. Powtórz ten proces raz dla metanolu, następnie dwukrotnie dla 95% etanolu, wody Milli-Q, a na koniec dla buforu TS. Rozpocznij konstytuowanie nano-dyskretne poprzez rozcieńczenie MSP w buforze TSGD do końcowego stężenia wynoszącego około 7 mg/mL lub 0,3 mM.Aby zapewnić sukces eksperymentu, ważne jest wybranie odpowiednich proporcji lipidów i białek do zmieszania. Wymieszać około 2 µM oczyszczonego kompleksu malf GK dwa w stosunku białka do MS P i lipidów wynoszącym 1:3:60 w buforze TSGD, aby uzyskać objętość końcową 300 µL. Tutaj przygotowano również próbkę z nadmiarem lipidów w stosunku 1:3:400 jako kontrolę negatywną. Dodać do probówki 50 µL zawiesiny bio-beads i inkubować mieszaninę przez noc na stole kołyszącym w temperaturze 4 °C. Następnego dnia odwirować kuleczki grawitacyjnie. Po osadzeniu się kuleczek pobrać roztwór za pomocą wąskiej końcówki, aby uniknąć pobrania jak największej liczby bio-beads.Usuń duże osady poprzez ultrawirowanie przy 100 000 xg przez 20 minut. Następnie przeprowadź oczyszczanie dysków za pomocą chromatografii żelowej, zgodnie z wcześniejszą procedurą, w buforze TSG 10. W dalszej kolejności wprowadź Eloqua na tę samą kolumnę do chromatografii żelowej, aby przetestować stabilność preparatu.Następnie połącz frakcje zawierające nanodyski. Jakość preparatu ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy w żelu. Przeanalizuj jeden mikromol nanodysków, aby ocenić jakość rekonstytucji.Należy również ocenić wiązanie mal E z kompleksem mal ftk two zrekonstytuowanym w nanodyskach. Po elektroforezie żel należy barwić błękitem Coomassie przez 10 minut, a następnie odbarwiać przez około jedną godzinę. Aby przeprowadzić dynamiczne rozpraszanie światła (DLS), najpierw należy oczyścić nanodyski za pomocą chromatografii filtracyjnej, jak wcześniej, używając kolumny Superdex 200 10/300 przy szybkości przepływu 0,1 ml/min.Połączyć frakcje zawierające nanodyski i zagęścić do stężenia około 10 mg/ml za pomocą wirówki z filtrem AmCon. Następnie przefiltrować próbkę dwukrotnie. Przeprowadzić analizę metodą DLS przy użyciu urządzenia dynapro nano star w kwarcowej kuwecie o objętości wewnętrznej 1 µl.Wykorzystując oprogramowanie dynamiczne do oszacowania średnicy i masy cząsteczkowej cząsteczek, określ aktywność ATPase dla dwóch zrekonstytuowanych nanodysków mal FTK za pomocą testu kolorymetrycznego. Najpierw zmieszaj 1 µM oczyszczonych dysków oraz 1 mM ATP z rosnącymi ilościami mal e. Inkubuj próbki w temperaturze 37 °C przez 20 minut.Następnie zmierz uwalnianie fosforanu nieorganicznego przy 660 nanometrach. Porównaj ilość uwolnionego fosforanu z krzywą wzorcową wyznaczoną za pomocą roztworu wzorcowego fosforu. Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii filtracyjnej żelowej.Chromatogram pokazuje, że większość zrekonstytuowanych dysków eluuje jako pojedynczy pik, podczas gdy dyski przygotowane z nadmiarem lipidów eluują w objętości martwej oraz jako seria szerokich pików; jakość preparacji dysków analizowano dodatkowo za pomocą natywnej elektroforezy w żelu. Dyski zrekonstytuowane z ograniczoną ilością lipidów migrują jako wąski prążek na żelu natywnym, natomiast te zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów migrują jako rozmazy. Analiza metodą DLS wykazuje, że populacja dysków jest jednorodna ze średnim promieniem 5,0 nanometrów. Na podstawie przybliżenia DLS zrekonstytuowane dyski mają pozorną masę cząsteczkową 215 kilodaltonów; próbki zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów wykazują szeroki rozkład promieni wokół 100 nanometrów, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.Aktywność kompleksu MAL FTK 2 ocenia się poprzez pomiar szybkości hydrolizy TP oraz powinowactwa do partnerów oddziaływania, takich jak białko wiążące maltozę, MAL E. MAL E wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MAL FTK 2 w metodzie nieodtwarzającej elektroforezy żelowej. Możliwe jest wykrycie kompleksu między MAL E a MAL FTK 2; tutaj przedstawiono stymulację aktywności MAL KA TPA przez MAL E jako funkcję stężenia MAL E.Tworzenie nanodysków jest stosunkowo proste, jednak niewielkie odchylenia od optymalnych warunków mogą prowadzić do nieodwracalnej agregacji białek; po opanowaniu ta technika może zostać zrealizowana w mniej niż dwa dni. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o kluczowej roli wyboru odpowiedniego stosunku białka do lipidów, ponieważ nadmiar lipidów doprowadzi do powstania dużych, polidyspersyjnych cząstek przypominających liposomy. Jest niezwykle istotne, aby dokładnie analizować jakość zrekonstytuowanego materiału, stosując techniki inne niż filtracja żelowa, takie jak spektroskopia rozpraszania światła, analityczna ultrawirówka lub w prostszy sposób elektroforeza w żelu w warunkach natywnych.Należy pamiętać, że rodzaj fosfolipidu wbudowanego w dysk, a także rodzaj białka rusztowania błony mogą wpływać na wydajność rekonstytucji. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu zdobyli Państwo rzetelną wiedzę na temat tego, jak generować rozpuszczalne i homogeniczne nanodyski zawierające wybrany przez Państwa białka błonowe. Życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krok po kroku metoda wytwarzania transportera ABC w cząstkach lipidowych nanodysków

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Kotranslacyjna insercja do wstępnie uformowanych nanodysków umożliwia badanie bezkomórkowych syntetyzowanych białek błonowych w określonych środowiskach lipidowych bez kontaktu z detergentami. Protokół ten opisuje przygotowanie podstawowych komponentów systemu oraz parametry krytyczne dla poprawy wydajności odciągania i jakości próbki.

Kotranslacyjna insercja białek błonowych do wstępnie uformowanych nanodysków

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Tutaj opisujemy produkcję i charakterystykę czynników bioaktywnych zawierających nanodyski. Nanodyski amfoterycyny B są traktowane jako przykład, aby opisać protokół w sposób krokowy.

Formulacja i charakterystyka czynnika bioaktywnego zawierającego nanodyski

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Poznaj metodę rekonstytucji transportera ABC MalFGK2 w nanodyskach lipidowych. Protokół obejmuje mieszanie białek szkieletowych z transporterem i lipidami, absorpcję detergentu na kulkach polistyrenowych oraz oczyszczanie chromatografią filtracji żelowej.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Przeglądaj więcej filmów