Name: Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-31T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 25 s
Description: Poznaj metodę rekonstytucji transportera ABC MalFGK2 w nanodyskach lipidowych. Protokół obejmuje mieszanie białek szkieletowych z transporterem i lipidami, absorpcję detergentu na kulkach polistyrenowych oraz oczyszczanie chromatografią filtracji żelowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez Kanadyjski Instytut Badań nad Zdrowiem. CSC zostało sfinansowane ze stypendium podoktorskiego przyznanego przez Kanadyjską Radę ds. Badań Przyrodniczych i Inżynieryjnych. FD jest Tier II Canada Research Chair.

Ogólny proces rekonstytucji
 Proces rekonstytucji rozpoczyna się od zmieszania białka rusztowania błony (MSP) z oczyszczonym kompleksem MalFGK2 w obecności fosfolipidów solubilizowanych detergentem. Następnie następuje powolne usuwanie detergentu za pomocą adsorbentu z polistyrenu, zwanego Bio-Beads lub Amberlite (Rysunek 1). Proces samorzutnego montażu zachodzi najprawdopodobniej w wyniku oddziaływań apolarnych między hydrofobowymi fosfolipidami, kompleksem MalFGK2 a powierzchnią amfipatycznego białka MSP. Produktem końcowym jest cząstka dyskoidalna składająca się z dwóch cząsteczek MSP otaczających kompleks MalFGK2. Cząstki są oddzielane od adduktów i agregatów za pomocą ultrawirowania oraz analitycznej chromatografii wykluczania rozmiarów. Cząstki są charakteryzowane za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła.
 1. Przygotowanie białka rusztowania błonowego, MSP
 <ol>
 <li>MSP z tagiem histydynowym (wersja MSP1D11) jest produkowana z plazmidu pMSP1D1 w szczepie E. coli BL21 (DE3) indukowanym przy OD600~0,5 za pomocą 0,5 mM izopropyl-β-D-1-tiogalaktopiranozydu przez 3 h w 37 °C.</li>
 <li>Komórki są zbierane przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C i resuspendowane w buforze TSG10 zawierającym 100 μM fluorku fenylometanosulfonylu.</li>
 <li>Komórki są lizowane w prasie francuskiej (3x) pod ciśnieniem 8 000 psi, a materiał nierozpuszczalny jest usuwany przez wirowanie przy 5 000 x g przez 10 min w 4 °C. Frakcja rozpuszczalna zawierająca MSP jest izolowana przez ultrawirowanie przy 125 000 x g przez 45 min.</li>
 <li>MSP jest oczyszczane metodą chromatografii z wykorzystaniem chelatu niklu przy użyciu ~1,5 ml Ni Sepharose HP w buforze TSG10. Zanieczyszczenia są wypłukiwane buforem TSG10 zawierającym 50 mM imidazolu. MSP jest eluowane buforem TSG10 zawierającym 600 mM imidazolu. Oczyszczone białko jest dializowane w buforze TSG10 i przechowywane w -70 °C przy stężeniu białka ~10-15 mg/ml.</li>
 </ol>
 2. Przygotowanie kompleksu MalFGK2
 <ol>
 <li>Kompleks MalFGK2, z tagiem His na C-końcu MalK, jest ekspresowany z plazmidu pBAD22-FGK w E. coli BL21 (DE3) i indukowany przy OD600~0,5 za pomocą 0,2% L-arabinozy przez 3 h w 37 °C.</li>
 <li>Po lizie komórek i wirowaniu zgodnie z krokiem 1.3, osad błonowy zawiesza się w buforze TSG20 do końcowego stężenia 5 mg/ml. Materiał jest solubilizowany przy użyciu 1% w/v n-dodecyl-β-maltopiranozyd (DDM) przez 3 h w 4 °C przy łagodnym wytrząsaniu.</li>
 <li>Materiał nierozpuszczalny jest usuwany poprzez ultrawirowanie zgodnie z krokiem 1.3, a supernatant zawierający solubilizowany kompleks MalFGK2 jest zbierany i oczyszczany zgodnie z krokiem 1.4, jednak bez dializy.</li>
 <li>Dalsze oczyszczanie przeprowadza się za pomocą chromatografii żelowej w buforze TSGD na kolumnie Superdex 200 HR 10/300 przy szybkości przepływu 0,5 ml/min.</li>
 </ol>
 3. Przygotowanie fosfolipidów
 <ol>
 <li>Wyekstrahowane całkowite lipidy E. coli rozpuszczone w chloroformie dzieli się na alikwoty po 1 000 nmol w probówkach do mikrocentryfugi z nakrętką. Rozpuszczalnik odparowuje się pod delikatnym strumieniem azotu, a następnie dodatkowo suszy przez noc w eksykatorze próżniowym.</li>
 <li>Film lipidowy rozpuszcza się w buforze TS do końcowego stężenia 5 nM, a następnie intensywnie miesza na wortexie i poddaje sonikacji. Rozpuszczone lipidy będą lekko mętne ze względu na ich ogólną nierozpuszczalność w wodnym buforze TS, jednak powinny pozostać w zawiesinie. Dodaje się DDM do końcowego stężenia 0,5% (~10 mM), po czym roztwór staje się klarowny.</li>
 <li>Mieszaninę lipidową umieszcza się w łaźni wodnej i poddaje sonikacji impulsowej 5 razy po około 5 s. Mieszaninę lipidową przechowuje się w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 1 tydzień.</li>
 </ol>
 4. Przygotowanie Bio-Beads
 <ol>
 <li>Do probówki o pojemności 50 ml wsypuje się około 10-15 ml (objętość sypka) Bio-Beads.</li>
 <li>Kuleczki płucze się kolejno 50 ml 100% metanolu, 95% etanolu, wody milliQ H2O, a na koniec buforem TS (każdym z nich po dwa razy).</li>
 <li>Wypłukane kuleczki przechowuje się w temperaturze 4 °C w ~10 ml buforu TS.</li>
 </ol>
 5. Rekonstytucja nanodysków
 <ol>
 <li>MSP rozcieńcza się w buforze TSGD do końcowego stężenia ~7 mg/ml (~0,3 mM).</li>
 <li>~2 nmol oczyszczonego kompleksu MalFGK2 miesza się w stosunku białko:MSP:lipid 1:3:60 lub 1:3:400 w buforze TSGD. Końcowe stężenia wynoszą 6 μM MalFGK2, 18 μM MSP i 360 μM lipidów (1:3:60) lub 2,4 mM lipidów (1:3:400). Końcowa objętość wynosi 300 μl. Końcowe stężenie DDM wynosi 0,08% (~1,6 mM). Końcowe stężenie glicerolu zależy od ilości dodanych lipidów, ale utrzymuje się na poziomie około 5-10% v/v.</li>
 <li>Do probówki dodaje się ~50 μl zawiesiny Bio-Beads, a mieszaninę inkubuje się przez noc na stole kołyszącym w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Kuleczki osadza się grawitacyjnie, a roztwór odpipetowuje za pomocą wąskiej końcówki, aby uniknąć pobrania jak największej liczby kuleczek Bio-Beads.</li>
 <li>Duże osady usuwa się za pomocą ultrawirowania przy 100 000 x g przez 20 min. Dyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej zgodnie z krokiem 2.4 w buforze TSG10. Frakcje zawierające dyski łączy się, a alikwot należy ponownie wprowadzić na tę samą kolumnę do filtracji żelowej w celu sprawdzenia stabilności preparatu.</li>
 <li>Oczyszczone dyski można przechowywać w temperaturze -70 °C przez dłuższy czas. Po rozmrożeniu na lodzie dyski należy poddać ultrawirowaniu zgodnie z krokiem 5.5 w celu usunięcia potencjalnych osadów. Alikwot należy przeanalizować za pomocą chromatografii filtracyjnej, aby upewnić się, że podczas procesu rozmrażania nie doszło do znacznej agregacji lub precypitacji.</li>
 </ol>
 6. Elektroforeza w żelu natywnym
 <ol>
 <li>Nanodyski o stężeniu 1 μM (~0.2 mg/ml) analizuje się za pomocą natywnego PAGE6, 7 (Tris-HCl pH 8.8, 4-12%), aby ocenić jakość rekonstytucji (Rycina 3A).</li>
 <li>Wiązanie MalE (1 μM) z kompleksem MalFGK2 rekonstytuowanym w nanodyskach jest również oceniane za pomocą natywnego PAGE (Rycina 3A).</li>
 <li>Po elektroforezie żel barwi się błękitem Coomassie przez 10 min, a następnie odbarwia przez ~1 hr.</li>
 </ol>
 7. Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)
 <ol>
 <li>Nanodyski oczyszcza się metodą chromatografii filtracyjnej żelowej, analogicznie do kroku 2.4, w buforze TSG10 przy użyciu kolumny Superdex 200 HR 10/300 i szybkości przepływu 0.1 ml/min. Frakcje zawierające nanodyski są łączone i zagęszczane do stężenia ~10 mg/ml za pomocą wirówkowego filtra Amicon.</li>
 <li>Przed analizą metodą DLS próbkę filtruje się dwukrotnie (filtr 0.22 μm), a następnie analizuje za pomocą instrumentu DynaPro nanostar (Wyatt Technology) w kuwecie kwarcowej o objętości wewnętrznej 1 μl. Dane są dopasowywane przy użyciu oprogramowania DYNAMICS (Wyatt Technology) w celu oszacowania średnicy oraz masy cząsteczkowej cząstek.</li>
 </ol>
 8. Pomiary aktywności ATPase
 <ol>
 <li>Aktywność ATPase nanodysków zrekonstytuowanych z MalFGK2 jest określana za pomocą testu kolorymetrycznego8.</li>
 <li>1 μM oczyszczonych dysków i 1 mM ATP miesza się z rosnącymi ilościami MalE i inkubuje w temperaturze 37 °C przez 20 min. Uwalnianie fosforanu nieorganicznego mierzy się przy 660 nm.</li>
 <li>Ilość uwolnionego fosforanu porównuje się z krzywą wzorcową wygenerowaną przy użyciu roztworu wzorcowego fosforu.</li>
 </ol>
 9. Reprezentatywne wyniki
 Nanodyski są oczyszczane za pomocą chromatografii filtracyjnej żelowej (Ryc. 2A, lewo). Chromatogram wykazuje, że większość zrekonstytuowanych dysków (linia czarna) eluje jako pojedynczy pik, podczas gdy dyski otrzymane z nadmiarem lipidów (linia czerwona) eluują w objętości martwej oraz jako seria szerokich pików. Jakość nanodysków jest następnie analizowana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu oraz spektroskopii dynamicznego rozpraszania światła (DLS). Prawidłowo zrekonstytuowane dyski migrują jako ostry prążek w żelu, natomiast te zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów migrują w formie rozmycia (Ryc. 2A, prawo). Analiza DLS wykazuje, że populacja dysków jest jednorodna, ze średnią średnicą 11,4 nm (Ryc. 2B). Zrekonstytuowane dyski mają pozorną masę cząsteczkową 215 kDa na podstawie przybliżenia DLS. Próbki zrekonstytuowane w obecności nadmiaru lipidów wykazują szeroki rozkład promieni wokół 100 nm, co jest typowe dla próbek niejednorodnych.
 Jakość kompleksu MalFGK2 jest oceniana za pomocą natywnej elektroforezy w żelu, a jego aktywność poprzez pomiary aktywności ATPase (Rysunek 3). Białko wiążące maltozę MalE wiąże się z wysokim powinowactwem do transportera MalFGK29, 10. Dzięki zastosowaniu niedenaturującej elektroforezy żelowej możliwe jest wykrycie kompleksu między MalE a MalFGK2 (Rysunek 3A). Stymulacja aktywności ATPase MalK2 przez MalE została przedstawiona na Rysunku 3B.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig1.jpg" alt="Proces tworzenia nanodysków z użyciem MSP i MalFGK₂ wraz ze schematem chromatografii filtracyjnej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Typowy schemat blokowy protokołu rekonstytucji.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig2.jpg" alt="Wykresy chromatografii wykluczania i dynamicznego rozpraszania światła dla agregatów białkowych i nanodysków." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rycina 2. Kontrola jakości preparatu nanodysków. A. Analiza filtracji żelowej (kolumna Superdex 200 HR 10/300) nanodysków zrekonstytuowanych przy niskim stosunku lipidów (1/3/60; linia czarna) lub wysokim stosunku lipidów (1/3/400; linia czerwona). Natywna elektroforeza w żelu tych samych preparatów dysków. Oznaczono markery masy cząsteczkowej w kDa. B. Analiza dynamicznego rozpraszania światła tych samych preparatów dysków. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3910/3910fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną rycinę</a>.
 <img src="/files/ftp_upload/3910/3910fig3.jpg" alt="Schemat elektroforezy przedstawiający kompleks Nd-FGK2 MalE; analiza słupkowa hydrolizy ATP." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Analiza cząsteczek MalFGK2-nanodisc. A. Analiza przesunięcia w żelu dla MalE inkubowanego z rosnącymi ilościami cząsteczek MalFGK2-nanodisc. B. Aktywność ATPase cząsteczek MalFGK2-nanodisc w funkcji stężenia MalE.

<ol><li>Denisov, I. G., Ginkova, Y. V., Lazarides, A. A., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+self-assembly+of+monodisperse+phospholipid+bilayer+Nanodiscs+with+controlled+size%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Directed self-assembly of monodisperse phospholipid bilayer Nanodiscs with controlled size.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 3477-3487 (2004).</li>
<li>Boldog, T., Grimme, S., Li, M., Sligar, S. G., Hazelbauer, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+separate+chemoreceptor+oligomeric+states+and+reveal+their+signaling+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs separate chemoreceptor oligomeric states and reveal their signaling properties.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 11509-11514 (2006).</li>
<li>Bass, B. J., Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homotropic+cooperativity+of+monomeric+cytochrome+P450+3A4+in+a+nanoscale+native+bilayer+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Homotropic cooperativity of monomeric cytochrome P450 3A4 in a nanoscale native bilayer environment.</a> J. Biol. Chem. 282, 7066-7076 (2007).</li>
<li>Alami, M., Dalal, K., Lelj-Garolla, B., Sligar, S. G., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+unravel+the+interaction+between+the+SecYEG+channel+and+its+cytosolic+partner+SecA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs unravel the interaction between the SecYEG channel and its cytosolic partner SecA.</a> EMBO J. 26, 1995-2004 (2007).</li>
<li>Mi, L. -Z., Grey, M. J., Nishida, N., Walz, T., Lu, C., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+stability+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+in+detergent+micelles+and+phospholipid+nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural stability of the epidermal growth factor receptor in detergent micelles and phospholipid nanodiscs.</a> Biochemistry. 47, 10314-10323 (2008).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217, 220-230 (1994).</li>
<li>Dalal, K., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+the+SecY+translocon+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of the SecY translocon in Nanodiscs.</a> Methods Mol. Biol. 619, 145-156 (2010).</li>
<li>Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+assay+for+nanomole+amounts+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate.</a> Anal. Biochem. 100, 95-97 (1979).</li>
<li>Davidson, A. L., Dassa, E., Orelle, C., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+bacterial+ATP-binding+cassette+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol.+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of bacterial ATP-binding cassette systems.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364 (2008).</li>
<li>Bordignon, E., Grote, M., Schneider, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+maltose+ATP-binding+cassette+transporter+in+the+21st+century-towards+a+structural+dynamic+perspective+on+its+mode+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The maltose ATP-binding cassette transporter in the 21st century-towards a structural dynamic perspective on its mode of action.</a> Mol. Microbiol. 77, 1354-1366 (2010).</li>
<li>Alvarez, F. J., Orelle, C., Davidson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+reconstitution+of+an+ABC+transporter+for+use+in+electron+paramagnetic+resonance+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional reconstitution of an ABC transporter for use in electron paramagnetic resonance spectroscopy.</a> J. Am. Chem. Soc. 132, 9513-9515 (2010).</li>
<li>Ritchie, T. K., Grinkova, Y. V., Bayburt, T. H., Denisov, I. G., Zolnerciks, J. K., Atkins, W. M., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins in phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 464, 211-231 (2009).</li>
<li>Glück, J. M., Koenig, B. W., Willbold, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+allow+the+use+of+integral+membrane+proteins+as+analytes+in+surface+plasmon+resonance+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs allow the use of integral membrane proteins as analytes in surface plasmon resonance studies.</a> Anal. Biochem. 408, 46-52 (2011).</li>
<li>Wan, C. -P. L., Chiu, M. H., Wu, X., Lee, S. K., Prenner, E. J., Weers, P. M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein-induced+conversion+of+phosphatidylcholine+bilayer+vesicles+into+nanodisks%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta+%28BBA%29%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein-induced conversion of phosphatidylcholine bilayer vesicles into nanodisks.</a> Biochim. Biophys. Acta (BBA). 1808, 606-613 (2011).</li>
<li>Nath, A., Trexler, A. J., Koo, P. K., Miranker, A. D., Atkins, W. M., Rhoades, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+spectroscopy+using+phospholipid+bilayer+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence spectroscopy using phospholipid bilayer Nanodiscs.</a> Methods Enzymol. 472, 89-117 (2010).</li>
<li>Denisov, I. G., Sligar, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochromes+P450+in+Nanodiscs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cytochromes P450 in Nanodiscs.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1814, 223-229 (2011).</li>
<li>Zhang, X. X., Chan, C. S., Bao, H., Fang, Y., Foster, L. J., Duong, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodiscs+and+SILAC-based+mass+spectrometry+to+identify+a+membrane+protein+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Nanodiscs and SILAC-based mass spectrometry to identify a membrane protein interactome.</a> J. Proteome Res. , Forthcoming (2011).</li>
</ol>

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Opisujemy prostą procedurę rekonstytucji transportera maltozy do nanodysków. Transporter jest aktywny w ATPazie, a interakcja z rozpuszczalnym partnerem wiążącym MalE może zostać odtworzona (Figura 3). Udana rekonstytucja transportera w nanodyskach otwiera drogę do dodatkowych analiz biofizycznych i biochemicznych. Szczególnie interesująca będzie systematyczna analiza aktywności ATPazy MalK i transportu maltozy w detergentach, liposomach i nanodyskach. Transportery ABC zmieniają konformacje podczas c...

<table><tbody><tr><td>Filtr odśrodkowy Amicon Ultra-4 50K</td><td>Millipore</td><td>UFC805008</td><td>Postępuj zgodnie z protokołem producenta w celu prawidłowego użycia </td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 Adsorbent</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>E. coli lipidy całkowite</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100500C</td><td>Rozpuszczony w chloroformie, obchodzić się z rozpuszczalnikiem organicznym</td></tr><tr><td>Sefaroza ni żywica HP</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór wzorcowy fosforu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3869</td><td></td></tr><tr><td>pMSP1D1</td><td>Addgene</td><td>20061</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 HR 10/300</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabela I. Określone odczynniki.</td></tr><tr><td colspan="4"> <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name </td> <td>Kompozycja</td> <td>Komentarze</td> </tr> <tr> <td>DDM stock</td> <td>10% w/v DDM</td> <td>Zawiesić w miliQ wodzie i przechowywać w temperaturze -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td>MalFGK2 stock</td> <td>1-2 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM</td> <td>Przechowywać w temperaturze -70 &; C po oczyszczeniu</td> </tr> <tr> <td>MSP stock</td> <td>10-15 mg/ml 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu</td> <td>Przechowywać w temperaturze -70 &deg; C po oczyszczeniu w < 1 ml podwielokrotności i unikać nadmiernych cykli zamrażania/rozmrażania</td> </tr> <tr> <td>Fosfolipid stock</td> <td>5 nM E. coli total lipids 0,5% w/v (10 mM) DDM 50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 &deg; C przez 1 tydzień</td> </tr> <tr> <td>TS bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7,9 50 mM NaCl</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; Bufor C</td> </tr> <tr> <td>TSG10 buffer</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH 7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerolu</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 &; Bufor C</td> </tr> <tr> <td>TSG20 bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH8 100 mM NaCl 20% v/v glicerol</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C</td> </tr> <tr> <td>TSGD bufor</td> <td>50 mM Tris-HCl, pH7,9 100 mM NaCl 10% v/v glicerol 0,03% w/v DDM</td> <td>Przechowywać w temperaturze 4 stopni; C i dodaj DDM tuż przed użyciem</td> </tr> <tr> <td colspan="3">Tabela II. Przepisy na roztwory.</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

metoda krok po kroku rekonstytucji transportera abc w cząsteczkach lipidowych nanodisc

A Step-by-step Method for the Reconstitution of an ABC Transporter into Nanodisc Lipid Particles

Nanodysk to dyskoidalna cząstka (~ 10-12 nm duża), która więzi białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Nanodysk jest szczególnie atrakcyjną opcją do badania białek błonowych, zwłaszcza w kontekście interakcji ligand-receptor. Metoda zapoczątkowana przez Sligara i współpracowników opiera się na właściwościach amfipatycznych zmodyfikowanego białka rusztowania wysoce a-helisalnego pochodzącego z apolipoproteiny A1. Hydrofobowe powierzchnie białka rusztowania oddziałują z tłuszczowymi acylowymi łańcuchami bocznymi dwuwarstwy lipidowej, podczas gdy obszary polarne są zwrócone w stronę środowiska wodnego. Analizy białek błonowych w nanodyskach mają znaczącą przewagę nad liposomami, ponieważ cząsteczki są małe, jednorodne i rozpuszczalne w wodzie. Ponadto można zastosować metody biochemiczne i biofizyczne zwykle zarezerwowane dla białek rozpuszczalnych i to z obu stron błony. W tym protokole wizualnym przedstawiamy krok po kroku rekonstrukcję dobrze scharakteryzowanego bakteryjnego transportera ABC, kompleksu MalE-MalFGK2. Formowanie się krążka jest procesem samoorganizacji, który zależy od oddziaływań hydrofobowych zachodzących podczas stopniowego usuwania detergentu. Opisujemy podstawowe kroki i podkreślamy znaczenie wyboru prawidłowego stosunku białka do lipidów w celu ograniczenia tworzenia się agregatów i większych polidyspersyjnych cząstek podobnych do liposomów. Proste kontrole jakości, takie jak chromatografia z filtracją żelową, natywna elektroforeza żelowa i spektroskopia dynamicznego rozpraszania światła, zapewniają, że krążki zostały prawidłowo odtworzone.

Nanodyski to małe dyskoidalne cząstki, które zawierają białka błonowe w małym fragmencie dwuwarstwy fosfolipidowej. Udostępniamy protokół wizualny, który pokazuje krok po kroku wbudowywanie transportera MalFGK2 w dysk.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

The nanodisc is a discoidal particle (~ 10-12 nm large) that trap membrane proteins into a small patch of phospholipid bilayer. The nanodisc is a ...

Ogólnym celem tej procedury jest wbudowanie transportera ABC, w tym przypadku transportera maltozy malfGK2, w rozpuszczalne nanocząsteczki dyskowe błony (nanodiski). Osiąga się to poprzez wstępne zmieszanie białka rusztowania błony MSP z transporterem i odpowiednią ilością lipidów w micelach detergentu.Drugim krokiem jest dodanie kulek polistyrenowych i delikatne mieszanie zawiesiny przez noc; detergent jest stopniowo absorbowany przez kulki, co umożliwia formowanie się nanocząsteczek dysków. Następnie kulki usuwa się poprzez sedymentację. Ostatnim krokiem jest oddzielenie prawidłowo uformowanych dysków od agregatów i niezespołowanych białek rusztowaniowych za pomocą chromatografii żelowej.Na koniec jakość dysków ocenia się za pomocą natywnej elektroforezy w żelu lub spektroskopii rozpraszania światła. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z innymi metodami, takimi jak liposomy, jest fakt, że białka błonowe i dyski są całkowicie rozpuszczalne w roztworach wodnych. Dodatkowo domeny białkowe są teraz dostępne z obu stron.Ponieważ obecnie nie ma już przedziału membranowego, dzięki zastosowaniu białek rusztowania membranowego o różnych długościach, udało mi się uwięzić i zbadać różne

a-step-step-method-for-reconstitution-an-abc-transporter-into

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Krok po kroku metoda wytwarzania transportera ABC w cząstkach lipidowych nanodysków

Opisano procedury całkowitego odtworzenia prototypu kanału potasowego bramkowanego napięciem do błon lipidowych. Odtworzone kanały nadają się do testów biochemicznych, zapisów elektrycznych, badań przesiewowych ligandów i badań krystalograficznych elektronów. Metody te mogą mieć ogólne zastosowanie w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych innych białek błonowych.

Rekonstytucja kanału Kv do błon lipidowych w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych

Obsługiwane dwuwarstwy lipidowe i naturalne cząsteczki błony to wygodne systemy, które mogą przybliżać właściwości błon komórkowych i być włączane do różnych strategii analitycznych. W tym miejscu demonstrujemy metodę przygotowania mikromacierzy złożonych z podpartych dwuwarstwowych kulek SiO2 pokrytych dwuwarstwą lipidową, pęcherzyków fosfolipidowych lub naturalnych cząstek błonowych.

Tworzenie mikromacierzy biomembranowych metodą montażu opartą na ściągaczce

Wiele białek spełnia swoją funkcję, gdy są przyczepione do powierzchni błony. Wiązanie białek zewnętrznych na błonach nanodysków można pośrednio zobrazować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Pokazujemy, że charakterystyczne układanie (rouleau) nanodysków indukowane przez fosforungmian sodu o ujemnym barwieniu jest zapobiegane przez wiązanie białka zewnętrznego.

Metoda wizualizacji i analizy białek oddziałujących z błoną za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Dwuwarstwowe membrany fosfolipidowe (DLBM) z solidnym wsparciem, wolne od białek, mogą być przekształcane w złożone i dynamiczne sieci nanorurek lipidowych i mogą służyć jako oddolne modele 2D retikulum endoplazmatycznego.

Spontaniczne powstawanie i rearanżacja sztucznych sieci nanorurek lipidowych jako model oddolny retikulum endoplazmatycznego

Fuzja mitochondriów jest ważną reakcją homeostatyczną leżącą u podstaw dynamiki mitochondriów. Opisano tutaj system rekonstytucji in vitro do badania fuzji mitochondrialnej błony wewnętrznej, która może rozwiązać problem wiązania błony, dokowania, heminacji i otwierania porów. Omówiono wszechstronność tego podejścia w badaniu systemów błon komórkowych.

Modelowa platforma membranowa do odtwarzania dynamiki błon mitochondrialnych

Ten protokół opisuje tworzenie wspieranych dwuwarstw lipidowych oraz dodawanie włókien cytoszkieletu i białek motorycznych w celu zbadania dynamiki odtworzonych, połączonych błoną sieci cytoszkieletu za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Rekonstytucja minimalnych kory aktynowych połączonych błoną na podpartych dwuwarstwach lipidowych

W tym manuskrypcie demonstrujemy eksperymentalne techniki hermetyzacji cytoszkieletu F-aktyny w gigantyczne jednowarstwowe pęcherzyki lipidowe (zwane również liposomami) oraz metodę tworzenia warstwy F-aktyny naśladującej korę mózgową na wewnętrznej wlotce błony liposomowej.

In vitro Rekonstrukcja cytoszkieletu aktynowego w gigantycznych pęcherzykach jednowarstwowych

Rekonstytucja bez komórek była kluczowym narzędziem do zrozumienia montażu cytoszkieletu, a prace w ostatniej dekadzie ustaliły podejścia do badania dynamiki septyny w systemach minimalnych. Przedstawiono tutaj trzy uzupełniające się metody obserwacji montażu septyny w różnych kontekstach membranowych: dwuwarstwy płaskie, podpory sferyczne i podpory prętowe.

Rekonstrukcja zespołu septyny na błonach w celu zbadania właściwości i funkcji biofizycznych

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

Przedstawiamy protokół do odtwarzania białek błonowych i enkapsulacji enzymów oraz innych rozpuszczalnych w wodzie składników w pęcherzykach lipidowych o rozmiarach sub-mikrometrowych i mikrometrowych.

Budowa nierównowagowych sieci metabolicznych w pęcherzykach o rozmiarach nano- i mikrometrowych

Niniejsze badanie opisuje procedurę rekonstrukcji błonowego białka TWIK, kanału K+ wrażliwego na kwasy 2 (Zadanie 2) w nanodyski. Pomyślny montaż potwierdzono za pomocą mikroskopii krio-elektronowej z pojedynczą cząstką, która dała dobrze określone dwuwymiarowe średnie klasowe.

Technika stabilizacji białek błonowych w nanodyskach

Poznaj metodę rekonstytucji transportera ABC MalFGK2 w nanodyskach lipidowych. Protokół obejmuje mieszanie białek szkieletowych z transporterem i lipidami, absorpcję detergentu na kulkach polistyrenowych oraz oczyszczanie chromatografią filtracji żelowej.

Metoda krok po kroku rekonstytucji transportera ABC w cząsteczkach lipidowych Nanodisc

Przeglądaj więcej filmów