Name: Izolacja i pierwotna hodowla komórek wątroby szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-29T12:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Poznaj niezawodny protokół izolacji hepatocytów szczura metodą perfuzji in situ. Technika pozwala uzyskać do 100 milionów żywych komórek o wysokiej witalności, co wspiera badania biochemiczne i metaboliczne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować panu Joshowi Basfordowi oraz dr Xiao-min Li za pomoc techniczną. Praca ta była częściowo wspierana przez granty NIH (DK70992 i DK92779 dla M.L.).

1. Przygotowanie
Wszystkie bufory są przygotowywane na bieżąco z zachowaniem technik sterylnych i sterylizowane za pomocą filtra Corning 0.22 μm.
<ol>
 <li>Przygotować bufor perfuzyjny I, dodając do zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS, bez Ca2+ i Mg2+, patrz Tabela 1): Mg2+ (MgCl2) do stężenia 0,9 mM, EDTA do 0,5 mM oraz HEPES do 25 mM.</li>
 <li>Przygotować bufor perfuzyjny II, dodając do HBSS (z Ca2+ i Mg2+, patrz Tabela 1): HEPES do stężenia 25 mM.</li>
 <li>Przygotować bufor perfuzyjny II z kolagenazą II: Rozpuścić kolagenazę II (1000 U) w 300 ml buforu perfuzyjnego II i utrzymywać roztwór w cieple w kąpieli wodnej przed perfuzją. Roztwór ten należy zużyć w ciągu 30 min, ponieważ aktywność kolagenazy II spada wraz z czasem.</li>
 <li>Przygotować pełne medium Williamsa: Dodać do Medium E Williamsa następujące składniki: L-glutaminę do 2 mM, płodową surowicę bydlęcą (FBS) do 5%, insulinę do 100 nM, deksametazon do 100 nM, penicylinę do 100 IU/ml oraz streptomycynę do 100 mg/ml.</li>
 <li>Bufory te należy ogrzewać przez 30 minut w kąpieli wodnej w temperaturze 42 °C, co jest temperaturą optymalną, odpowiadającą temperaturze wylotowej z kaniuli wynoszącej 37 °C.</li>
</ol>
2. Perfusja szczura w celu izolacji wątroby
<ol>
 <li>System perfuzyjny składa się z pompy, autoklawowalnego wężyka silikonowego oraz łaźni wodnej (patrz Rycina 1). Ustaw natężenie przepływu pompy perystaltycznej na 10 ml/min.</li>
 <li>Z narkozuj dorosłego szczura (masa ciała 300 g) za pomocą ketaminy (87 mg/kg masy ciała) oraz ksylazyny (13 mg/kg) podanych dootrzewnowo (ip). Głębię narkozy należy monitorować za pomocą testu szczypania palca. Gdy szczur przestanie reagować na bodziec bólowy, ogolić włosy z brzucha i przygotować brzuch za pomocą betadyny i etanolu. Wykonać nacięcie w linii pośrodkowej.</li>
 <li>Odsłonić żyłę wrotną wątroby, ostrożnie przesuwając wnętrzności na prawo, poza jamę brzuszną, a następnie wprowadzić kaniulę angiokateter 18G do żyły wrotnej wątroby (patrz Rycina 1).</li>
 <li>Podłączyć wężyk z perfuzatem do igły i rozpocząć infuzję in situ przy niskim natężeniu przepływu (10 ml/min) przy użyciu uprzednio ogrzanego (37 °C) Buforu Perfuzyjnego I.</li>
 <li>W przypadku prawidłowego wykonania wątroba powinna natychmiast zacząć blednąć. Po potwierdzeniu prawidłowej kaniulacji należy przeciąć żyłę główną dolną (IVC), aby umożliwić odpływ (Rycina 1). Dalszy test prawidłowej kaniulacji można przeprowadzić, wywierając lekki nacisk sterylnym tamponem na IVC; wszystkie płaty wątroby powinny szybko zacząć puchnąć.</li>
 <li>Zwiększyć natężenie przepływu do 25 ml/min. Wątroba powinna stać się blada.</li>
 <li>Zmienić roztwór perfuzyjny na Bufor perfuzyjny II z kolagenazą II bez przerywania przepływu przez kolejne 6 minut.</li>
 <li>Okresowo (5-10 razy podczas trawienia) wywierać nacisk tamponem na IVC w 5-sekundowych odstępach. Wątroba będzie puchnąć, co doprowadzi do lepszej dysocjacji komórek wątroby, skracając całkowity czas trawienia i zwiększając końcową wydajność.</li>
 <li>Po perfuzji kolagenazą wątroba powinna stać się miękka/rozmyta. Wyciąć wątrobę, umieścić ją w schłodzonym sterylnym zlewce z 20 ml kompletnego Medium Williamsa, a następnie przenieść do komory z laminarnym przepływem powietrza do hodowli tkanek.</li>
</ol>
3. Izolacja hepatocytów
<ol>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza, używając skrobaka do komórek, delikatnie zdysperguj komórki w pełnej pożywce Williamsa w sterylnym szalce Petriego.</li>
 <li>Przefiltruj zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o rozmiarze porów 100 μm do probówki stożkowej 50 ml, aby usunąć tkankę łączną i niestrawione fragmenty tkanek.</li>
 <li>Zzawieś komórki w 40 ml pełnej pożywki Williamsa i wiruj przy 50 x g przez 3 min w temperaturze 4 °C.</li>
 <li>Odsącz nadosad, a następnie delikatnie resuspenduj komórki w 40 ml zimnej pełnej pożywki Williamsa w celu ich przemycia. Powtórz wirowanie.</li>
 <li>Odsącz nadosad i delikatnie resuspenduj komórki w 25 ml pełnej pożywki Williamsa. Do probówki dodaj 25 ml 90% roztworu Percoll w PBS i delikatnie wymieszaj.</li>
 <li>Wiruj przy 200 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C. Odsącz martwe komórki z górnej części gradientu, ponieważ żywe komórki pozostają na dnie gradientu Percoll.</li>
 <li>Zzawieś osad komórkowy w 30 ml ciepłej pełnej pożywki Williamsa, a następnie powtórz wirowanie i resuspenduj osad komórkowy w 20 ml ciepłej pełnej pożywki Williamsa.</li>
 <li>Policz komórki w zawiesinie za pomocą hemocytometru i określ żywotność komórek poprzez barwienie błękitem trypanu.</li>
</ol>
4. Hodowla hepatocytów
<ol>
 <li>Rozcieńczyć komórki w ocieplonej kompletnej pożywce Williama do pożądanej koncentracji, np. 2,5 x 105 komórek/ml. Wysiać komórki w odpowiedniej objętości na płytki do hodowli komórkowej, np. 5 x 105 komórek / 2 ml / studzienka, 6 studzienek/płytka; lub 2,5 x 105 komórek / 1,5 ml / studzienka, 12 studzienek / płytka. Do hodowli komórek wątrobowych odpowiednie są płytki niepowlekane.</li>
 <li>W typowym przygotowaniu przy żywotności komórek &gt; 85%, gęstość komórek powinna osiągnąć około 60-70% konfluencji, co umożliwia kontakt międzykomórkowy przy zachowaniu wystarczającej przestrzeni, aby hepatocyty mogły osiągnąć pełny rozmiar komórki i uzyskać końcową konfluencję na poziomie 90-95%.</li>
 <li>Aby utworzyć równomierną monowarstwę hepatocytów, innymi słowy, aby zminimalizować tendencję komórek do agregacji w centralnej części studzienki (najprawdopodobniej z powodu przepływu powietrza wewnątrz inkubatora komórkowego), pozostawić płytki w dygestorze przez 30 minut przed umieszczeniem ich w inkubatorze.</li>
 <li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C w uwilgotnionej atmosferze złożonej z 95% powietrza i 5 % CO2. Po 4-godzinnej hodowli komórki mogą pozostać w tej samej pożywce zawierającej serum lub należy wymienić pożywkę na pożywkę bezzsrytkową, np. HepatoZYME-SFM (patrz Tabela 1). Stosowanie pożywki bezzsrytkowej pomaga zachować morfologię komórek bez niekorzystnego wpływu hormonów.</li>
 <li>Pozostawić komórki do regeneracji i wzrostu przez co najmniej jedną noc przed rozpoczęciem eksperymentów. Zaleca się wykorzystanie komórek do testów w ciągu 24 hr, ponieważ może to pomóc w zachowaniu funkcji krytycznych enzymów (np. P450s).</li>
 <li>W razie potrzeby wymieniać pożywkę wzrostową w odstępach 2-dniowych.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Opisane warunki regularnie pozwalają na uzyskanie zbiorów komórek o liczności 1,0 x 108 komórek na jedną preparację z jednej wątroby szczura. Żywotność hepatocytów, zmierzona metodą wykluczania błękitu trypanu, konsekwentnie mieściła się w zakresie 88 ~96%.
Jak przedstawiono na Rysunku 2, hepatocyty agregują i tworzą skupiska po 4 h od wysiania. Większość wyizolowanych komórek spłaszcza się i rozprzestrzenia w typowym wzroście monowarstwowym. Po 24 h krawędzie komórek są wyraźne, powierzchnia komórek jest dosyć gładka, a widoczne są krople lipidów. Komórki posiadają od jednego do trzech jąderek, które są okrągłe, zlokalizowane w centrum komórek, a jądra wykazują spójny rozmiar pomiędzy komórkami (Rysunek 2).
<img alt="Schemat procesu perfuzji wątroby z układem pompy perfuzyjnej, buforów i roztworu kolagenazy." src="/files/ftp_upload/3917/3917fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat perfuzji wątroby. Do żyły wrotnej wątroby wprowadza się kaniulę typu angiocath o rozmiarze 18G, a następnie do igły podłącza się dren perfuzyjny. Po potwierdzeniu prawidłowego zakaniulowania należy przeciąć żyłę główną dolną (IVC), aby umożliwić odpływ.
<img alt="Porównanie wzrostu komórek po 4 h i 24 h; obraz mikroskopowy w eksperymencie z biologii komórki; badanie time-lapse." src="/files/ftp_upload/3917/3917fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Morfologia hodowanych hepatocytów w czasie (od 4 h do 24 h), powiększenie x 200. Po 24 h hodowli komórki rozprzestrzeniły się w typowym wzroście monowarstwowym, a połączenia między komórkami są liniowe.
<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Nazwa odczynnika</td>
 <td>Firma</td>
 <td>Numer katalogowy</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS (bez Ca2+ i Mg2+)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14174</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HBSS (z Ca2+ i Mg2+)</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>14025</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Pożywka Williams's Medium E</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>12551-032</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kolagenaza II</td>
 <td>Worthington</td>
 <td>LS004176</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sito do komórek (100 μm)</td>
 <td>BD</td>
 <td>352360</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>HepatoZYME-SFM</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>17705</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Percoll</td>
 <td>Sigma</td>
 <td>P4937</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kaniula angiokateterowa (18 G)</td>
 <td>BD</td>
 <td>381705</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
Tabela 1.

<ol><li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> J. Cell Biol. 43, 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Saito, K., Kobayashi, K., Mizuno, Y., Fukuchi, Y., Furihata, T., Chiba, K., Schmidt, M., Schmitz, H. J., Baumgart, A., Guedon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisome+proliferator-activated+receptor+alpha+%28PPARalpha%29+agonists+induce+constitutive+androstane+receptor+%28CAR%29+and+cytochrome+P450+2B+in+rat+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Pharmacokinet%22%5BJournal%5D)">Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARalpha) agonists induce constitutive androstane receptor (CAR) and cytochrome P450 2B in rat primary hepatocytes.</a> Drug Metab. Pharmacokinet. 25, 108-111 (2010).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Donato, M. T., Castell, J. V., Jover, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+hepatocytes+in+primary+culture%3A+the+choice+to+investigate+drug+metabolism+in+man%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Human hepatocytes in primary culture: the choice to investigate drug metabolism in man.</a> Curr. Drug Metab. 5, 443-462 (2004).</li>
<li>Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+isolation+of+murine+hepatocytes+for+in+vitro+malaria+liver+stage+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Malar.+J%22%5BJournal%5D)">Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies.</a> Malar. J. 6, 169(2007).</li>
<li>Bu, S. Y., Mashek, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+long-chain+acyl-CoA+synthetase+5+mediates+fatty+acid+channeling+between+anabolic+and+catabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Hepatic long-chain acyl-CoA synthetase 5 mediates fatty acid channeling between anabolic and catabolic pathways.</a> J. Lipid Res. 51, 3270-3280 (2010).</li>
<li>Aiken, J., Cima, L., Schloo, B., Mooney, D., Johnson, L., Langer, R., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+in+rat+liver+perfusion+for+optimal+harvest+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pediatr.+Surg%22%5BJournal%5D)">Studies in rat liver perfusion for optimal harvest of hepatocytes.</a> J. Pediatr. Surg. 25, 140-144 (1990).</li>
<li>Jauregui, H. O., McMillan, P. N., Hevey, K., Naik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+of+lectin+binding+to+adult+rat+hepatocyte+cell+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis of lectin binding to adult rat hepatocyte cell surfaces.</a> In Vitro Cell. 24, 401-412 (1988).</li>
<li>Klaunig, J. E., Goldblatt, P. J., Hinton, D. E., Lipsky, M. M., Trump, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+liver+cell+culture.+II.+Primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Mouse liver cell culture. II. Primary culture.</a> In Vitro. 17, 926-934 (1981).</li>
<li>Hay, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Operator-induced+contamination+in+cell+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol.+Stand%22%5BJournal%5D)">Operator-induced contamination in cell culture systems.</a> Dev. Biol. Stand. 75, 193-204 (1991).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Pierwotna hodowla hepatocytów jest modelem in vitro powszechnie wykorzystywanym do badania różnych aspektów fizjologii i patologii wątroby. Na przykład pierwotna hodowla jest stosowana do oceny ekspresji i funkcji enzymów metabolizujących leki, w tym cytochromów P450, metabolizmu leków, interakcji lek-lek oraz mechanizmów cytotoksyczności i genotoksyczności 3-7. Protokół opisujący izolację i hodowlę komórek wątroby szczura został opracowany na podstawie wcześniejszych doniesień Aiken et al. <...

izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Isolation and Primary Culture of Rat Hepatic Cells

Kultura pierwotnych hepatocytów jest cennym narzędziem, które było szeroko wykorzystywane w badaniach podstawowych nad funkcjami wątroby, chorobami, patofizjologią, farmakologią oraz innymi pokrewnymi zagadnieniami. Metoda oparta na dwuetapowej perfuzji kolagenazą w celu izolacji nienaruszonych hepatocytów została po raz pierwszy wprowadzona przez Berry’ego i Frienda w 1969 roku 1 i od tego czasu przeszła wiele modyfikacji. Najczęściej stosowaną technikę opisano w pracy Seglenina z 1976 roku 2. W zasadzie hepatocyty są dysocjowane od znieczulonych dorosłych szczurów poprzez niecyrkulacyjną perfuzję kolagenazą przez żyłę wrotną. Izolowane komórki są następnie filtrowane przez nylonowy filtr siatkowy o rozmiarze oczek 100 μm i wysiewane na płytki. Po 4-godzinnej hodowli medium wymienia się na medium z dodatkiem surowicy lub medium bezsurowicze, np. HepatoZYME-SFM, na dalszy czas hodowli. Procedury te wymagają etapów chirurgicznych i sterylnej hodowli, które można lepiej zaprezentować za pomocą wideo niż tekstu. W niniejszej pracy dokumentujemy szczegółowe kroki tych procedur zarówno w formie wideo, jak i protokołu pisemnego, co pozwala na powtarzalne generowanie żywotnych hepatocytów w dużych liczbach.

Pierwotne hepatocyty stanowią cenne narzędzie do oceny funkcji biochemicznych, molekularnych i metabolicznych w fizjologicznie istotnym systemie eksperymentalnym. Opisujemy niezawodny protokół perfuzji wątroby szczura in situ, który pozwala na konsekwentne uzyskiwanie żywotnych hepatocytów w ilości do 1,0 × 108 komórek na preparat, przy żywotności komórek w zakresie 88 ~ 96%.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Hodowla pierwotnych hepatocytów jest cennym narzędziem, które znajduje szerokie zastosowanie w badaniach podstawowych nad funkcjami wątroby, chorobami, patofizjologią, farmakologią...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zaprezentowanie niezawodnego protokołu generowania dużych ilości żywych hepatocytów. Osiąga się to poprzez perfuzję roztworu kolagenazy przez żyłę wrotną szczura. Następnie zdysocjowane komórki są izolowane i oczyszczane przy użyciu nylonowego filtra siatkowego, a komórki martwe są oddzielane od żywych za pomocą roztworu Percoll.Ostatnim krokiem jest hodowla hepatocytów w inkubatorze. W rezultacie protokół ten pozwala na uzyskanie do 100 milionów komórek na jedną preparację przy 90% żywotności komórek. Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ procedura ta wymaga kroków chirurgicznych i hodowlanych, które są łatwiejsze do zrozumienia na podstawie nagrania wideo niż tekstu; procedurę zaprezentuje technik z mojego laboratorium. Wszystkie wymagane bufory perfuzyjne oraz kompletne medium Williamsa powinny zostać przygotowane dzień wcześniej z zachowaniem zasad sterylności przed ich użyciem.Bufor należy ogrzewać przez 30 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 42°C. Odpowiada to optymalnej temperaturze wylotowej na kaniuli wynoszącej 37°C. System perfuzyjny składa się z pompy, autoklawowalnych przewodów elastycznych oraz kąpieli wodnej

isolation-and-primary-culture-of-rat-hepatic-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Izolacja i pierwotne hodowle komórek wątroby szczura

Opisano nową metodę pozyskiwania makrofagów z hodowli pierwotnej komórek wątroby szczura. Metoda ta wykorzystuje proliferację makrofagów w hodowli, a następnie wstrząsanie kolb z kulturą i oczyszczanie poprzez selektywną adhezję do plastikowych naczyń. Technika ta pozwala na wydajne pozyskanie makrofagów wątrobowych bez konieczności stosowania złożonego sprzętu i specjalistycznych umiejętności.

Prosta i wydajna metoda izolacji makrofagów z mieszanych kultur pierwotnych komórek wątroby dorosłych osobników

Opisano technikę izolacji fibroblastów wrotnych z wątroby szczura. Wątroby poddano perfuzji oraz trawieniu in situ kolagenazą, a następnie trawieniu ex vivo zawiesiny wątrobowej i selekcji komórek pod względem wielkości. Metoda ta pozwala na uzyskanie czystej populacji fibroblastów wrotnych bez konieczności pasażowania w hodowli.

Izolacja fibroblastów wrotnych szczura poprzez perfuzję wątroby in situ

Opisana jest zmodyfikowana dwuetapowa procedura perfuzji kolagenazy do izolacji ludzkich hepatocytów. Metodę tę można również zastosować do wątroby innych ssaków. Wyizolowane hepatocyty są dostępne w wysokiej wydajności i żywotności, co czyni je odpowiednim modelem do badań naukowych w takich dziedzinach jak regeneracja wątroby, farmakokinetyka i toksykologia.

Izolacja ludzkich hepatocytów za pomocą dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy

Opisano technikę izolowania ludzkich hepatocytów i niemiąższowych komórek wątroby od tego samego dawcy. Różne typy komórek wątroby stanowią podstawę funkcjonalnych modeli wątroby i inżynierii tkankowej. Ta nowa metoda ma na celu wyizolowanie komórek wątroby w celu uzyskania wysokiej wydajności i żywotności.

Protokół izolacji pierwotnych ludzkich hepatocytów i odpowiadających im głównych populacji niemiąższowych komórek wątroby

Tutaj pokazujemy enzymatyczne podejście do izolacji pierwotnych hepatocytów od dorosłych myszy i opisujemy kwantyfikację odpowiedzi zapalnej za pomocą ELISA i PCR w czasie rzeczywistym.

Indukcja odpowiedzi zapalnej w pierwotnych kulturach hepatocytów od myszy

Tutaj prezentujemy protokół izolacji zdrowych i funkcjonalnych pierwotnych hepatocytów myszy. Opracowano instrukcje dotyczące wykrywania powstającej syntezy białek wątrobowych za pomocą nieradioaktywnego substratu znakującego, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów leżących u podstaw syntezy białek w kontekście homeostazy metabolizmu energetycznego w wątrobie.

Izolacja pierwotnych hepatocytów myszy do analizy powstającej syntezy białek metodą znakowania nieradioaktywnej L-azydohomoalaniny

Prezentowany tutaj jest protokół izolacji hepatocytów myszy z wątroby dorosłych myszy przy użyciu zmodyfikowanej techniki perfuzji kolagenazy. Opisano również długoterminową hodowlę hepatocytów w warstwie kolagenowej 3D, a także znakowanie immunologiczne składników cytoszkieletu w celu zbadania tworzenia kanałów żółciowych i ich odpowiedzi na leczenie.

Izolacja i hodowla kanapkowa kolagenu 3D pierwotnych hepatocytów myszy w celu zbadania roli cytoszkieletu w tworzeniu kanałów żółciowych in vitro

Pierwotne hepatocyty są cennym narzędziem do badania reakcji wątroby i metabolizmu in vitro. Wykorzystując dostępne na rynku odczynniki, opracowano ulepszony, efektywny czasowo i pracochłonnie protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy.

Ulepszony protokół izolacji pierwotnych hepatocytów myszy pod względem czasu i pracy

Ten protokół szczegółowo opisuje użycie specjalnego cewnika dożylnego, standaryzowanego sterylnego jednorazowego wężyka, kontroli temperatury uzupełnionej monitorowaniem w czasie rzeczywistym, oraz systemu alarmowego dla dwuetapowej procedury perfuzji kolagenazy w celu poprawy spójności żywotności, wydajności i funkcjonalności izolowanych pierwotnych hepatocytów szczurów.

Izolacja pierwotnych hepatocytów szczura z wieloparametrową kontrolą perfuzji

Ten protokół przedstawia zoptymalizowaną dwuetapową technikę perfuzji wątroby kolagenazy w modelu szczurzym i pokazuje użycie izolowanych hepatocytów do długoterminowej hodowli organoidów 3D in vitro.

Perfuzja wątroby szczura i izolacja pierwotnych hepatocytów: stara procedura kluczowa dla najnowocześniejszej hodowli organoidów 3D

Poznaj niezawodny protokół izolacji hepatocytów szczura metodą perfuzji in situ. Technika pozwala uzyskać do 100 milionów żywych komórek o wysokiej witalności, co wspiera badania biochemiczne i metaboliczne.

Izolacja i hodowla pierwotna komórek wątroby szczura

Przeglądaj więcej filmów