Name: Wsteczne znakowanie fluorescencyjne pozwala na ukierunkowany zewnątrzkomórkowy zapis pojedynczej jednostki ze zidentyfikowanych neuronów in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-26T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Poznaj metodę wstecznego znakowania fluorescencyjnego do nagrywania aktywności pojedynczych neuronów in vivo w układach niegenetycznych. Technika umożliwia selektywne etykietowanie neuronów projekcyjnych w badaniach neurofizjologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie zapewnione przez National Science Foundation (IOS-1050701 dla B.A.C.), National Institutes of Health (NS54174 dla S.M. oraz F30DC0111907 dla A.M.L-W.), Uehara Memorial Foundation oraz Japan Society for the Promotion of Science (G2205 dla T.K.). Dziękujemy Julianowi Meeksowi za wsparcie i wskazówki w zakresie pozakomórkowych rejestracji aksonalnych. Dziękujemy Carlowi Hopkinsowi za udostępnienie prototypu komory rejestracyjnej.

<ol><li>Meeks, J. P., Jiang, X., Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potential+fidelity+during+normal+and+epileptiform+activity+in+paired+soma-axon+recordings+from+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Action potential fidelity during normal and epileptiform activity in paired soma-axon recordings from rat hippocampus.</a> J. Physiol. 566, 425-441 (2005).</li>
<li>Pinault, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+single-cell+staining+procedure+performed+in+vivo+under+electrophysiological+control%3A+morpho-functional+features+of+juxtacellularly+labeled+thalamic+cells+and+other+central+neurons+with+biocytin+or+Neurobiotin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin.</a> J. Neurosci. Methods. 65, 113-136 (1996).</li>
<li>Joshi, S., Hawken, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loose-patch-juxtacellular+recording+in+vivo--a+method+for+functional+characterization+and+labeling+of+neurons+in+macaque+V1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Loose-patch-juxtacellular recording in vivo--a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1.</a> J. Neurosci. Methods. 156, 37-49 (2006).</li>
<li>Margrie, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+whole-cell+recordings+in+the+mammalian+brain+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted whole-cell recordings in the mammalian brain in vivo.</a> Neuron. 39, 911-918 (2003).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromádka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+A+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: A new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4, e6099(2009).</li>
<li>Foust, A., Popovic, M., Zecevic, D., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+potentials+initiate+in+the+axon+initial+segment+and+propagate+through+axon+collaterals+reliably+in+cerebellar+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Action potentials initiate in the axon initial segment and propagate through axon collaterals reliably in cerebellar Purkinje neurons.</a> J. Neurosci. 30, 6891-6902 (2010).</li>
<li>Lehman, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+as+a+transneuronal+tracer%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci.+Biobehav.+Rev%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus as a transneuronal tracer.</a> Neurosci. Biobehav. Rev. 22, 695-708 (1998).</li>
<li>Joris, P. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dogged+pursuit+of+coincidence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">A dogged pursuit of coincidence.</a> J. Neurophysiol. 96, 969-972 (2006).</li>
<li>Heiligenberg, W., Rose, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+amplitude+computations+in+the+midbrain+of+an+electric+fish%3A+Intracellular+studies+of+neurons+participating+in+the+jamming+avoidance+response+of+Eigenmannia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Phase and amplitude computations in the midbrain of an electric fish: Intracellular studies of neurons participating in the jamming avoidance response of Eigenmannia.</a> J. Neurosci. 5, 515-531 (1985).</li>
<li>Morales, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+peri-neuronal+net+to+patch-clamp+neurons+in+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Releasing the peri-neuronal net to patch-clamp neurons in adult CNS.</a> Pflügers Archiv European J. Physiol. 448, 248-258 (2004).</li>
<li>Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+for+species+recognition+in+the+time-coding+electrosensory+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural substrates for species recognition in the time-coding electrosensory pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Neurosci. 18, 1171-1185 (1998).</li>
<li>Hitschfeld, ÉM., Stamper, S. A., Vonderschen, K., Fortune, E. S., Chacron, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+restraint+and+immobilization+on+electrosensory+behaviors+of+weakly+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR.+J%22%5BJournal%5D)">Effects of restraint and immobilization on electrosensory behaviors of weakly electric fish.</a> ILAR. J. 50, 361-372 (2009).</li>
<li>Xu-Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+mechanisms+of+temporal+analysis+in+the+knollenorgan+pathway+of+mormyrid+electric+fish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Central mechanisms of temporal analysis in the knollenorgan pathway of mormyrid electric fish.</a> J. Exp. Biol. 202, 1311-1318 (1999).</li>
<li>Amagai, S., Friedman, M. A., Hopkins, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+coding+in+the+midbrain+of+mormyrid+electric+fish.+I.+Physiology+and+anatomy+of+cells+in+the+nucleus+exterolateralis+pars+anterior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Physiol.+A%3A+Neuroethol+Sens+Neural.+Behav.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Time coding in the midbrain of mormyrid electric fish. I. Physiology and anatomy of cells in the nucleus exterolateralis pars anterior.</a> J. Comp. Physiol. A: Neuroethol Sens Neural. Behav. Physiol. 182, 115-130 (1998).</li>
<li>Brady, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+making+very+fine%2C+durable+dissecting+needles+by+sharpening+tungsten+wire+electrolytically%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically.</a> Bull World Health Organ. 2, 143-144 (1965).</li>
<li>Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal-pattern+recognition+by+single+neurons+in+a+sensory+pathway+devoted+to+social+communication+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal-pattern recognition by single neurons in a sensory pathway devoted to social communication behavior.</a> J. Neurosci. 29, 9417-9428 (2009).</li>
<li>Mugnaini, E., Maler, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytology+and+immunocytochemistry+of+the+nucleus+extrolateralis+anterior+of+the+mormyrid+brain%3A+possible+role+of+GABAergic+synapses+in+temporal+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Cytology and immunocytochemistry of the nucleus extrolateralis anterior of the mormyrid brain: possible role of GABAergic synapses in temporal analysis.</a> Anat Embryol. (Berl). 176, 313-336 (1987).</li>
<li>Kohashi, T., Lyons-Warren, A. M., Mennerick, S., Carlson, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+submillisecond+spike+timing+differences+based+on+delay-line+anticoincidence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Detection of submillisecond spike timing differences based on delay-line anticoincidence detection.</a> J. Neurophysiol. 110, 2295-2311 (2013).</li>
<li>Colin, W., Donoff, R. B., Foote, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+tracer+in+the+peripheral+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde tracer in the peripheral nervous system.</a> Brain Res. 486, 334-339 (1989).</li>
<li>Katz, L. C., Burkhalter, A., Dreyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+latex+microspheres+as+a+retrograde+neuronal+marker+for+in+vivo+and+in+vitro+studies+of+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fluorescent latex microspheres as a retrograde neuronal marker for in vivo and in vitro studies of visual cortex.</a> Nature. 310, 498-500 (1984).</li>
<li>Brown, S. P., Hestrin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracortical+circuits+of+pyramidal+neurons+reflect+their+long-range+axonal+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets.</a> Nature. 457, 1133-1136 (2009).</li>
<li>Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+recording+from+identifiable+neurons+of+the+locomotor+network+in+the+developing+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 88, 1-13 (1999).</li>
<li>Pollak, G. D., Burger, R. M., Klug, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+circuitry+of+the+auditory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dissecting the circuitry of the auditory system.</a> Trends Neurosci. 26, 33-39 (2003).</li>
<li>Wurtz, R. H., Albano, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual-motor+function+of+the+primate+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visual-motor function of the primate superior colliculus.</a> Annu. Rev. Neurosci. 3, 189-226 (1980).</li>
<li>O'Malley, D. M., Zhou, Q., Gahtan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+neural+circuits+in+the+zebrafish%3A+a+suite+of+optical+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Probing neural circuits in the zebrafish: a suite of optical techniques.</a> Methods. 30, 49-63 (2003).</li>
<li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res.+Bull%22%5BJournal%5D)">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res. Bull. 51, 11-28 (2000).</li>
<li>Ohki, K., Chung, S., Ch'ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+imaging+with+cellular+resolution+reveals+precise+micro-architecture+in+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex.</a> Nature. 433, 597-603 (2005).</li>
<li>Gahtan, E., O'Malley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+lesioning+of+large+numbers+of+identified+vertebrate+neurons%3A+applications+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid lesioning of large numbers of identified vertebrate neurons: applications in zebrafish.</a> J. Neurosci. Methods. 108, 97-110 (2001).</li>
<li>Higure, Y., Katayama, Y., Takeuchi, K., Ohtubo, Y., Yoshii, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lucifer+Yellow+slows+voltage-gated+Na%2B+current+inactivation+in+a+light-dependent+manner+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lucifer Yellow slows voltage-gated Na+ current inactivation in a light-dependent manner in mice.</a> J. Physiol. 550, 159-167 (2003).</li>
<li>Mennerick, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+voltage-sensitive+dyes+modulate+GABAA+receptor+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosc%22%5BJournal%5D)">Diverse voltage-sensitive dyes modulate GABAA receptor function.</a> J. Neurosc. 30, 2871-2879 (2010).</li>
<li>Oxford, G. S., Pooler, J. P., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+and+external+application+of+photodynamic+sensitizers+on+squid+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Internal and external application of photodynamic sensitizers on squid giant axons.</a> J. Membr. Biol. 36, 159-173 (1977).</li>
<li>Roberts, T. F., Tschida, K. A., Klein, M. E., Mooney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+spine+stabilization+and+synaptic+enhancement+at+the+onset+of+behavioural+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid spine stabilization and synaptic enhancement at the onset of behavioural learning.</a> Nature. 463, 948-952 (2010).</li>
<li>Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coherent+nonlinear+optical+imaging%3A+beyond+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 62, 507-530 (2011).</li>
<li>Holekamp, T. F., Turaga, D., Holy, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+three-dimensional+fluorescence+imaging+of+activity+in+neural+populations+by+objective-coupled+planar+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Fast three-dimensional fluorescence imaging of activity in neural populations by objective-coupled planar illumination microscopy.</a> Neuron. 57, 661-672 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano konfliktów interesów.

Po opanowaniu, technika ta pozwoli na celowanie w zidentyfikowane neurony, w tym pojedyncze aksony, w celu rejestracji in vivo w wielu systemach modelowych. Ponadto technika ta umożliwia niezawodną rejestrację aktywności impulsowej neuronów o unikalnych cechach anatomicznych, które sprawiają, że tradycyjne metody rejestracji in vivo są trudne do zastosowania. Wykorzystaliśmy tę technikę do rejestracji z „małych komórek” ELa u ryb mormiryd słabo elektrycznych. Poprzednie próby zbadania właściwości strojenia „małych komórek” zakończyły się niepowodzeniem ze względu na trudne warunki rejestracji11, 14. Podobne cechy anatomiczne stanowią bariery w uzyskaniu rejestracji pojedynczych jednostek z wielu różnych słuchowych i elektrosensorycznych neuronów kręgowców8-10. Aby pokonać te trudności w naszym systemie, wykorzystaliśmy fakt, że „małe komórki” są jedynymi komórkami w ELa, które rzutują do ELp. Zatem transport wsteczny barwnika wprowadzonego do ELp ogranicza znakowanie w ELa do som i aksonów „małych komórek”. Fluorescencyjne znakowanie aksonów umożliwiło precyzyjne umieszczenie elektrody obok znakowanych aksonów, co pozwoliło na rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych komórek pomimo niedostępności som. Próbowaliśmy dokonać rejestracji somatycznej, lecz nie odnieśliśmy sukcesu, prawdopodobnie z powodu otaczających je synaps pochłaniających11,17. Jednakże znakowanie somatyczne było wyraźnie widoczne, co sugeruje, że technika ta mogłaby zostać wykorzystana do celowanej rejestracji somatycznej w innych typach komórek i innych obwodach. Fluorescencyjne znakowanie neuronów poprzez transport wsteczny in vivo było stosowane do prowadzenia celowanych rejestracji in vitro19-21. Podobna technika została wykorzystana do celowanych rejestracji in vivo z neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego22. Nasza praca stanowi nowatorskie rozwinięcie tego podejścia, w którym zarówno znakowanie, jak i rejestracja są przeprowadzane in vivo w obrębie mózgu. Nasza metoda wykazuje, że znakowanie obszarów OUN in vivo za pomocą znacznika wstecznego może zostać rozszerzone na badanie innych nienaruszonych obwodów z podobnie selektywnymi neuronami projekcyjnymi. Na przykład w ssaczym przetwarzaniu słuchowym wzgórze dolne (IC) służy jako ważne centrum przekaźnikowe dla sygnałów z wielu struktur rombencefalicznych23. Iniekcja barwnika do IC selektywnie oznakowałaby komórki projekcyjne z każdego z tych jąder. Wzgórze górne (SC) pełni podobną funkcję w przypadku wzroku24. Preparaty rdzenia kręgowego są szczególnie odpowiednie do tej techniki, ponieważ rdzeń kręgowy jest łatwo dostępny, iniekcja barwnika może odbywać się daleko od miejsca rejestracji, a metodę tę można połączyć z rejestracją wewnątrzkomórkową i wypełnianiem wybranych neuronów w celu uzyskania bardziej szczegółowych informacji anatomicznych25. Wreszcie, śledzenie szlaków (tract-tracing) jest uznaną techniką stosowaną w całym ośrodkowym układzie nerwowym do mapowania złożonych obwodów26. Nasza metoda może zostać wykorzystana do dodania informacji funkcjonalnych do tych badań, tak jak miało to miejsce w przypadku wskaźników wrażliwych na wapń w korze wzrokowej kota27.
 Zabieg chirurgiczny, który jest dobrze ugruntowany, niezawodny i regularnie stosowany do ślepych rejestracji in vivo 16, musi zostać przeprowadzony przy minimalnym krwawieniu i bez uszkodzenia powierzchni mózgu, aby zapewnić przeżycie zwierzęcia i tkanki. Dzięki praktyce operacja i aplikacja barwnika mogą zostać ukończone w ciągu 30-45 minut. Pomyślnie oznakowaliśmy aksony „małych komórek” w 67% preparatów. Większość preparatów posiada tylko 1 lub 2 widoczne oznakowane aksony, ale niektóre mają ich aż 8. Z 119 prób rejestracji oznakowanych jednostek uzyskaliśmy rejestracje pojedynczych jednostek z 26 jednostek rozmieszczonych w 12 preparatach (Tabela 2). Zatem dane zostały zebrane z 41% preparatów z oznakowanymi aksonami, co daje całkowity wskaźnik sukcesu na poziomie 28%.
Kluczowym aspektem aplikacji barwnika jest głębokość znakowania. Płytkie wprowadzenie drutu wolframowego spowoduje wypłukanie barwnika. Jednakże, jeśli penetracja będzie zbyt głęboka, znakowane aksony nie będą widoczne do celowania. Ponadto, aby barwnik został odpowiednio pobrany, musi nastąpić pewne uszkodzenie mechaniczne komórki25, 28. Zbyt duże uszkodzenie doprowadzi jednak do śmierci komórek. Próbowaliśmy znakowania przy użyciu innych barwników i metod (Tabela 2), w tym znakowania anterogradnego poprzez wstrzyknięcie barwnika do ELa wraz z rejestracją z znakowanych aksonów w ELp (Tabela 3). Hipotetyzujemy, że znakowanie anterogradne nie powiodło się, ponieważ znakowanie ograniczyło się do komórek z uszkodzeniami somatycznymi, co uczyniło je nieodpowiednimi. Dodatkowo, terminale presynaptyczne mogły zostać zaburzone. W przeciwieństwie do tego, znakowanie retrogradne minimalizuje oba te problemy. Ilość i miejsce aplikacji barwnika można modyfikować w zależności od badanego obwodu. Maksymalne znakowanie występuje przy najwyższym stężeniu barwnika, co osiągnęliśmy stosując powlekane druty wolframowe. Jednak w przypadku znakowania aksonów o głębokich projekcjach, barwnik może odpadać z igły wolframowej podczas jej wprowadzania. W takich przypadkach bardziej odpowiednie byłoby wstrzykiwanie ciśnieniowe. Pobieranie i transport barwnika są szybkie; w naszej preparacji znakowane aksony były widoczne już 2 godziny po wstrzyknięciu, a dodatkowe znakowane aksony pojawiały się do 6 godzin po wstrzyknięciu. Zatem znakowanie i rejestracja mogą zostać przeprowadzone w ciągu jednego dnia, co eliminuje trudności techniczne związane z operacjami przeżyciowymi. Czas trwania będzie się różnił dla każdej aplikacji w zależności od odległości wymaganej do transportu barwnika.
Kolejnym krytycznym aspektem jest rozmieszczenie elektrod. Ważne jest, aby wprowadzić je do tkanki w pobliżu miejsca znajdującego się znakowanego aksonu, aby zapobiec zapchaniu końcówki. W przypadku tkanek gęstych, takich jak w ELa, długa i cienka trzpienie elektrody rejestrującej minimalizuje nadmierny ruch otaczającej tkanki. Jeśli rejestracja nie powiedzie się przy pierwszej próbie, należy powtórzyć czynność z nowymi elektrodami, aż do uzyskania sygnału lub do momentu, w którym tkanka zostanie uszkodzona w stopniu uniemożliwiającym widoczność aksonu. Należy jednak również szybko umieścić elektrodę obok aksonu, aby zminimalizować czas ekspozycji na fluorescencję, która może powodować fototoksyczność, blaknięcie i wpływać na właściwości fizjologiczne komórki29-31.
Po pomyślnym zassaniu segmentu aksonu do elektrody rejestrującej, pomiary mogą być prowadzone przez kilka godzin. Jeśli jednostki są konsekwentnie tracone w czasie krótszym niż 1 h, należy rozważyć wykonanie mniejszych końcówek elektrod, aby zapobiec wysunięciu się aksonu. Z drugiej strony, zbyt mała końcówka może prowadzić do zapchania, niskiego stosunku sygnału do szumu lub uszkodzenia aksonu. Stały spadek amplitudy potencjału czynnościowego i „powrót” jednostki po zastosowaniu dodatkowego ssania świadczą o tym, że końcówka jest zbyt duża. Zbyt silne ssanie może spowodować nieodwracalne uszkodzenie aksonu. Jednym z rozwiązań jest dopuszczenie niewielkiego wycieku w linii powietrznej, aby ciśnienie powoli wracało do zera. Gwałtowna wyrównanie ciśnienia spowoduje przejściowy względny „wyrzut” na zewnątrz, który może wypchnąć akson.
Choć technika ta stanowi istotną zaletę w uzyskiwaniu ukierunkowanych rejestracji z zidentyfikowanych neuronów projekcyjnych, nie będzie ona użyteczna do rozróżnienia lokalnych interneuronów, ponieważ barwnik zostałby pobrany przez wszystkie typy komórek w miejscu iniekcji. Teoretycznie zastosowanie wielu fluoroforów z oddzielnymi miejscami iniekcji może pozwolić na rozszerzenie tej metody. Na przykład porównanie znakowania pojedynczego i podwójnego mogłoby zostać wykorzystane do rozróżnienia interneuronów od neuronów projekcyjnych po podwójnych iniekcjach w dwóch punktach obwodu32. Podobnie znaczniki retrogradne można łączyć z innymi zaawansowanymi technikami obrazowania, takimi jak obrazowanie dwufotonowe, co zastosowano niedawno w centrum wysokich wokalizacji (HVc) kanarka zebra32. Ponadto obszary rejestracji są ograniczone do tych położonych blisko powierzchni przy użyciu mikroskopów epifluorescencyjnych, ponieważ byliśmy w stanie rozdzielić struktury o wielkości 1 μm jedynie w obrębie pierwszych 30 μm tkanki. Jednak głębokość tę można by zwiększyć poprzez zastosowanie innych technik mikroskopowych, takich jak mikroskopia dwufotonowa33 lub mikroskopia z płaskim oświetleniem sprzężonym z obiektywem34. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta stanowi ważny postęp w badaniu obwodów neuronalnych in vivo, ponieważ może być wykorzystana do rejestracji z pojedynczych neuronów w wielu różnych obwodach w różnorodnych systemach modelowych – w tym w tych, które są stosunkowo niedostępne.

<table><tbody><tr><td>Metanosulfonian trikainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>jodopeptyd gallaminy </td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8134</td><td>Flaxedil</td></tr><tr><td>Chlorowodorek lidokainy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5647</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hickman&amp;rsquo;roztwór Ringera </td><td>Brak danych</td><td>Brak danych</td><td>NaCl (6,48 g/l), KCl (0,15 g/l), CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0 (0,29 g/l), MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,12 g/l), NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; (0,084 g/l), NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (0,06 g/l)</td></tr><tr><td>Pompa perystaltyczna</td><td>Gilson lub Rainin</td><td>Minipulse 3 Model 312; RP-1</td><td>10.0 &amp;plusmn; 1,0 obr./min; alternatywnie linia zasilana grawitacyjnie z przepływomierzem</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy </td><td>Nikon</td><td>SM2645</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Klej błyskawiczny</td><td>Super Glue Corporation</td><td>SGH2</td><td>probówka 2 g</td></tr><tr><td>Omni Drill 35</td><td>World Precision Instruments</td><td>503-598</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wiertło węglikowe z głowicą kulistą #1/4</td><td>World Precision Instruments</td><td>501860</td><td>0,19 DIA (średnica wiertła = 0,48 mm) </td></tr><tr><td>Zestaw do kauteryzacji niskotemperaturowej</td><td>World Precision Instruments</td><td>500391</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manualny mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3301R</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Dextran sprzężony z Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen</td><td>D-22912</td><td>stężenie 2 mM; 10 000 MW. Należy dobrać długość fali barwnika tak, aby odpowiadała ustawieniom filtrów mikroskopu</td></tr><tr><td>Mikroskop epifluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>E600 FN</td><td>Akcesorium do zdalnego ustawiania ostrości jest pomocne przy precyzyjnym ustawianiu ostrości filtra TRITC – lub odpowiedniego filtra dopasowanego do płaszczyzn ogniskowych dla różnych długości fal barwników</td></tr><tr><td>Obiektyw małej mocy</td><td>Nikon</td><td>93182</td><td>CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0,1, W.D. 30 mm</td></tr><tr><td>Obiektyw o dużej powiększeniu</td><td>Nikon</td><td>93148</td><td>CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2,0 mm</td></tr><tr><td>Źródło białego światła</td><td>Dolan-Jenner</td><td>Model 190</td><td>Iluminator światłowodowy</td></tr><tr><td>Fluorescencyjne źródło światła </td><td>Lumen Dynamics</td><td>X-Cite 120Q</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Kamera do niskiego poziomu oświetlenia</td><td>Fotometria</td><td>CoolSnap ES</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Manometr cyfrowy</td><td>Omega Engineering</td><td>HHP-201</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany mikromanipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Przedwzmacniacz głowicowy</td><td>Molecular Devices</td><td>CV-7B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Wzmacniacz</td><td>Molecular Devices</td><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>System akwizycji danych</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td></tr><tr><td>Izolowany stymulator impulsowy</td><td>A-M Systems</td><td>2100</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wytciągacz mikrokapilar metodą wypalania (Browna)</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Ustawienia programu dla naszej aplikacji: Grzanie: ramp + 1, Wyciąganie: &amp;rsquo;0&amp;rsquo;, Prędkość: 60, Czas: 90 Pudełko z filamentem</td></tr><tr><td>Pipeta szklana</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Kapilara borokrzemowa z włóknem (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm) </td></tr></tbody></table>

retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Ogólnym celem tej metody jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanej populacji neuronów. Rejestracje elektrofizjologiczne in vivo z pojedynczych neuronów są kluczowe dla zrozumienia funkcjonowania obwodów neuronalnych w warunkach naturalnych. Tradycyjnie rejestracje te były przeprowadzane „na ślepo”, co oznacza, że tożsamość rejestrowanej komórki była nieznana na początku pomiaru. Tożsamość komórkową można określić następnie za pomocą jontoforezy barwnika drogą wewnątrzkomórkową1, przykomórkową (juxtacellular)2 lub za pomocą techniki loose-patch3, jednak rejestracje te nie mogą być celowane w konkretne neurony w obszarach o funkcjonalnie heterogenicznych typach komórek. Białka fluorescencyjne mogą być eksprymowane w sposób specyficzny dla typu komórek, co umożliwia elektrofizjologię pojedynczych komórek kierowaną wizualnie4-6. Istnieje jednak wiele systemów modelowych, dla których narzędzia genetyczne te nie są dostępne. Nawet w genetycznie dostępnych systemach modelowych pożądany promotor może być nieznany, a genetycznie homogeniczne neurony mogą mieć zróżnicowane wzorce projekcji. Podobnie, wektory wirusowe były wykorzystywane do znakowania specyficznych podgrup neuronów projekcyjnych7, lecz zastosowanie tej metody jest ograniczone przez toksyczność i brak specyficzności transsynaptycznej. W związku z tym niezbędne są dodatkowe techniki oferujące specyficzną prewizualizację w celu rejestracji z zidentyfikowanych pojedynczych neuronów in vivo. Prewizualizacja neuronu docelowego jest szczególnie użyteczna w trudnych warunkach rejestracji, w których klasyczne pomiary z pojedynczych komórek są często zbyt trudne do przeprowadzenia8-11. Nowa technika opisana w niniejszej pracy wykorzystuje transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego aplikowanego za pomocą igieł wolframowych do szybkiego i selektywnego znakowania specyficznej podgrupy komórek w konkretnym obszarze mózgu na podstawie ich unikalnych projekcji aksonalnych, zapewniając tym samym wskazówkę wizualną do uzyskania celowanych rejestracji elektrofizjologicznych z zidentyfikowanych neuronów w nienaruszonym obwodzie w obrębie OUN kręgowców.
Najistotniejszym nowatorskim usprawnieniem naszej metody jest zastosowanie znakowania fluorescencyjnego do celowania w konkretne typy komórek w systemie modelowym niedostępnym genetycznie. Słabo elektryczne ryby stanowią doskonały system modelowy do badania obwodów neuronalnych u czuwających, wykazujących naturalne zachowania zwierząt12. Wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania przetwarzania sensorycznego przez „małe komórki” w przednim jądrze boczno-zewnętrznym (ELa) słabo elektrycznych ryb z rzędu mormyrid. Hipoteza zakłada, że „małe komórki” są neuronami komparatorami czasu, które odgrywają ważną rolę w wykrywaniu submilisekundowych różnic w czasie nadejścia impulsów presynaptycznych13. Jednakże cechy anatomiczne, takie jak gęsta mielina, synapsy otaczające oraz małe ciała komórkowe, sprawiły, że rejestracja sygnałów z tych komórek przy użyciu tradycyjnych metod była niezwykle trudna11, 14. W niniejszej pracy wykazujemy, że nasza nowatorska metoda selektywnie znakuje te komórki w 28% preparatów, co umożliwia wiarygodne i stabilne rejestracje oraz charakterystykę odpowiedzi na stymulację elektrosensoryczną.

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Ogólnym celem tej metody jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanej populacji neuronów. Rejestracje elektrofizjologiczne in vivo z ...

Ogólnym celem tej procedury jest rejestracja odpowiedzi pojedynczych jednostek in vivo z zidentyfikowanej populacji neuronów w niegenetycznym modelu systemowym. Zostaje to osiągnięte poprzez wykonanie w pierwszej kolejności kraniotomii w celu odsłonięcia interesującego obszaru mózgu. W drugim kroku wykorzystuje się druty wolframowe do wprowadzenia barwnika fluorescencyjnego do obszaru, do którego rzutują docelowe neurony.Następnie barwnik jest transportowany w sposób retrogradowy, co prowadzi do selektywnego znakowania neuronów projekcyjnych. Ostatnim krokiem jest rejestracja sygnałów z oznakowanego aksonu pojedynczego neuronu projekcyjnego. W końcowym etapie wykorzystuje się pozakomórkowe rejestracje pojedynczych jednostek, aby wykazać, w jaki sposób centralne neurony sensoryczne w nienaruszonym obwodzie reagują na stymulację sensoryczną in vivo.Ta metoda może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób obwody neuronalne wykrywają submilisekundowe różnice w czasie impulsów synaptycznych. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami jest możliwość celowania w pojedyncze neurony, a nawet aksony, oraz w systemy niedostępne genetycznie. Słaboelektryczne ryby wykorzystują sygnały elektryczne do komunikacji i nawigacji.Sygnały pochodzące od różnych ryb są rozróżniane dzięki różnicom w czasie wejść synaptycznych wynoszącym poniżej milisekundy. Postawiliśmy pytanie, w jaki sposób domniemane neurony komparatora czasu w ich obwodzie elektrosensorycznym są w stanie wykryć tak niewielkie różnice czasowe. Technikę tę można jednak zastosować również do innych układów, takich jak szlaki sensoryczne wzrokowe i słuchowe.Wyodrębnienie tych komórek jest szczególnie trudne ze względu na ich niewielki rozmiar, gęste upakowanie w otaczającej tkance oraz zakończenia presynaptyczne, które pokrywają większą część ciała komórki. Wewnątrzkomórkowa iniekcja barwnika podczas rejestracji typu whole-cell in vitro pozwala na oznakowanie pojedynczej komórki w celu przeprowadzenia ukierunkowanych pomiarów z danego aksonu. Podobnie, transport retrogradowy po zewnątrzkomórkowej iniekcji barwnika umożliwia selektywne oznakowanie neuronów projekcyjnych w powierzchownych obszarach mózgu.Można tego użyć do zapewnienia wizualnego prowadzenia podczas rejestracji pojedynczych jednostek in vivo. Aby przygotować igłę kodowaną barwnikiem D, należy najpierw zaostrzyć elektrolitycznie drut wolframowy o średnicy 160 µm do końcowej średnicy czubka igły wynoszącej od 5 do 50 µm. Następnie, w noc poprzedzającą eksperyment, należy zakodować czubek igły za pomocą 2 mM roztworu barwnika Alexa Fluor sprzężonego z dekstranem o masie cząsteczkowej 10 000 Da w celu indukowania znieczulenia ogólnego.Umieść rybę w wodzie z akwarium z roztworem MS 2 22 w stężeniu 300 mg/L; unieruchom i wycisz elektrycznie rybę, wstrzykując 100 µL flail w stężeniu 3 mg/mL do mięśni grzbietowych ciała. Następnie napełnij komorę rejestracyjną wodą z akwarium i ułóż rybę stroną brzuszną do dołu na platformie w centrum komory. Następnie podawaj napowietrzony roztwór MS 2 22 w stężeniu 100 mg/L w tempie od 1 do 2 mL/min, umieszczając końcówkę pipety w pysku ryby.Następnie ustabilizuj rybę za pomocą przymocowanych prętów i wosku po obu stronach ciała. Monitoruj stan zdrowia ryby, sprawdzając ciągłość przepływu krwi w naczyniach ocznych oraz prawidłowy kolor ciała. Następnie obróć platformę wokół osi pionowej.Ustaw jeden koniec platformy tak, aby jedna strona powierzchni grzbietowej głowy ryby znajdowała się nad powierzchnią wody, podczas gdy reszta ciała ryby pozostawała zanurzona. Umieść niewielki kawałek chusteczki Kimwipe na każdej niezanurzonej części skóry, aby zapobiec jej wysychaniu. W tej procedurze nanieś 0,4% lidokainy na odsłoniętą powierzchnię głowy za pomocą patyczka higienicznego.Następnie za pomocą ostrza skalpela wyciąć prostokątny fragment tkanki skórnej o wymiarach około trzech milimetrów na pięć milimetrów dla ryby o długości 6,2 centymetra. Boczna krawędź prostokąta powinna znajdować się na wysokości środka oka. Przednia krawędź prostokąta powinna znajdować się tuż za okiem, a krawędź przyśrodkowa tuż bocznie od linii środkowej.Następnie usuń prostokąt za pomocą pęsety. Wytnij dodatkowy kwadrat o boku 2,5 milimetra przedniej strony, aby odsłonić czaszkę. Całkowicie oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki, zeskrobując nadmiar tkanki ostrzem skalpela.Następnie całkowicie osusz powierzchnię za pomocą chusteczki Kim wipe i strumienia powietrza. Dalej, za pomocą superkleju przyklej metalowy trzpień do przednio-przyśrodkowego odsłoniętego obszaru czaszki. Odczekaj do całkowitego wyschnięcia kleju.Używając wiertarki stomatologicznej z karbidową końcówką kulistą o średnicy 0,5 mm, wyznacz na czaszce ryby o długości 6,2 cm prostokąt o wymiarach około dwóch na cztery milimetry. Następnie wytnij obrys prostokąta za pomocą skalpela i pęsety. Po tym odwarstw czaszkę.Aby odsłonić mózg, należy przeciąć pigmentowaną oponę twardą oraz przezroczystą oponę miękką za pomocą nożyczek sprężynowych lub igły. Następnie usunięte fragmenty należy zebrać pęsetą, aby odsłonić przednie oraz tylne jądro dodatkowe boczne. Teraz należy ustawić manipulator z przygotowaną wcześniej igłą pokrytą substancją D nad regionem docelowym zawierającym analizowane aksony.W naszym przypadku do tylnego jądra bocznego zewnętrznego należy szybko wprowadzić igłę na głębokość około 25 micrometers w tkankę. Po dyfuzji barwnika przez 15 do 30 sekund należy wycofać igłę. W razie potrzeby powtórzyć czynność, używając kolejnych nowych igieł.Umieść każdą z nich w innym miejscu, tak aby barwnik rozprzestrzenił się w całym obszarze docelowym. Następnie wypłucz nadmiar barwnika z jamki za pomocą roztworu Ringera Hickmana i odczekaj co najmniej dwie godziny do czasu wchłonięcia i transportu barwnika. Aby zwizualizować interesujące aksony, umieść komorę rejestracyjną z rybą pod obiektywem odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego z epifluorescencją i nieruchomym stolikiem.Zmień roztwór oddechowy na świeżą wodę z akwarium, utrzymując taką samą prędkość przepływu. Następnie umieść jeden koniec przewodu uziemiającego w odsłoniętej jamie mózgowej, a drugi koniec podłącz do uziemienia głowicy rejestrującej. Następnie umieść parę elektrod rejestrujących obok podstawy ogona.Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza różnicowego i urządzenia rejestrującego. Aby monitorować sygnał sterujący wyładowaniem organu elektrycznego (EODC), przygotuj skalowany szkic obszaru mózgu oglądanego przy małym powiększeniu, uwzględniając główne naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne do zidentyfikowania dokładnej lokalizacji oznakowanych aksonów. W celu potwierdzenia rozmieszczenia elektrody D, najpierw obejrzyj całą tkankę przy użyciu oświetlenia w polu jasnym w celu orientacji.Następnie należy obejrzeć preparat przy użyciu oświetlenia fluorescencyjnego. Tylne jądro pozaboczne powinno wykazywać rozproszone znakowanie. Po tym etapie, przy dużym powiększeniu, należy zlokalizować przednie jądro pozaboczne, wykorzystując naczynia krwionośne jako punkty orientacyjne.Oświetl próbkę światłem fluorescencyjnym, poszukując znakowanego aksonu w pobliżu powierzchni, używając szklanej kapilary borokrzemianowej o średnicy zewnętrznej 1 mm i średnicy wewnętrznej 0,58 mm z filamentem. Wytnij elektrodę rejestrującą z wąskim, 5 mm długim trzonem i średnicą końcówki wynoszącą od około 1 do 2,4 µm.Napełnij elektrodę przefiltrowanym roztworem Ringera Hickmana. Końcowa rezystancja końcówki powinna mieścić się w zakresie od 16 do 155 mega omów. Umieść elektrodę w uchwycie do elektrod z portem ciśnieniowym.Podłącz go do modułu głowicy zamontowanego na manipulatorze. Następnie podłącz moduł głowicy do wzmacniacza. Urządzenie do akwizycji sygnałów analogowo-cyfrowych, niewykazane na schemacie, łączy wzmacniacz z komputerem.Następnie przyłóż dodatnie ciśnienie 30 millibar do linii elektrody. Powoli przesuwaj elektrodę od powierzchni tkanki w kierunku aksonu. Gdy elektroda znajdzie się blisko aksonu, dodatnie ciśnienie powinno spowodować niewielki, lecz zauważalny ruch aksonu w momencie, gdy elektroda znajduje się obok niego.Zarejestruj aktywność podczas prezentacji bodźców testowych. Chociaż artefakt elektryczny potwierdza prawidłowy zapis i stymulację, nie powinny wystąpić potencjały czynnościowe. Zwolnij nacisk zewnętrzny na elektrodę, a następnie powtórz stymulację i rejestrację.Następnie zastosuj lekkie podciśnienie, aby akson przesunął się do wnętrza elektrody. Powtórz stymulację i rejestrację. Teraz powinny pojawić się potencjały czynnościowe w odpowiedzi na stymulację.Gdy potencjały czynnościowe staną się widoczne, zamknij linię ciśnienia. Po zakończeniu wszystkich wymaganych pomiarów, przełącz wodę w zbiorniku z powrotem na roztwór oddechowy z MS 222 w stężeniu 100 mg/l, aby upewnić się, że ryba jest całkowicie znieczulona. Przed eutanazją ryby przez co najmniej 10 minut nie powinno być wykrywane żadne EODC.Oto pięć przykładowych zapisów obrazujących potencjały czynnościowe wywołane jednofazowym, przeciwstawnym, pozytywnym poprzecznym impulsem prostokątnym o czasie trwania 0,1 ms i natężeniu 6 mV/cm, a tutaj znajduje się wykres rastrowy pokazujący czasy wystąpienia impulsów podczas 20 powtórzeń 75 ms okna rejestracji dla tej samej jednostki stymulowanej w czasie zero bodźcami o natężeniu 6 mV/cm. Zakres czasów trwania jest wyszczególniony po prawej stronie. Przedstawiono tutaj krzywą dostrojenia do czasu trwania bodźca, która określa odpowiedzi jako liczbę impulsów na powtórzenie bodźca.Po opanowaniu techniki, zabieg chirurgiczny i wstrzykiwanie barwnika przedstawione w niniejszej procedurze mogą zająć jedną godzinę przy prawidłowym wykonaniu, a rejestrację można rozpocząć od dwóch do trzech godzin po wstrzyknięciu barwnika. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby uważnie monitorować stan zdrowia zwierzęcia doświadczalnego po zakończeniu zabiegu. W celu rejestracji aktywności neuronów w jeszcze głębszych strukturach mózgu można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie dwufotonowe.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dogłębną wiedzę na temat tego, jak znakować i rejestrować odpowiedzi pojedynczych jednostek z zidentyfikowanej populacji neuronów.

retrograde-fluorescent-labeling-allows-for-targeted-extracellular

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Retrogradowe fluorescencyjne znakowanie umożliwia ukierunkowane zewnątrzkomórkowe pojedyncze nagrywanie jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Prezentujemy protokół elektroporacji in vivo do transfekcji pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek zwojowych siatkówki (RGCs) oraz innych typów komórek siatkówki u myszy postnatalnych w szerokim zakresie wieku. Zdolność do znakowania i genetycznej manipulacji postnatalnymi RGCs in vivo stanowi potężne narzędzie w badaniach nad rozwojem.

Transfekcja komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Niniejszy artykuł przedstawia rejestrację sygnałów z pojedynczych komórek pochodzących z fluorescencyjnie znakowanych populacji neuronów w nienaruszonej siatkówce myszy. Dzięki zastosowaniu dwufotonowego wzbudzenia w podczerwieni, transgenicznie znakowane komórki zostały wytypowane do rejestracji metodą patch-clamp w celu zbadania ich reakcji na światło, właściwości pól recepcyjnych oraz morfologii.

Charakterystyka elektrofizjologiczna populacji komórek wykazujących ekspresję GFP w nienaruszonej siatkówce

Opisujemy prostą i niskokosztową technikę wprowadzania wysokich stężeń barwników fluorescencyjnych i czułych na wapń do neuronów lub dowolnego szlaku neuronalnego z wykorzystaniem polietylenowej pipety ssącej.

Retrogradne znakowanie nerwów, szlaków i korzeni rdzeniowych barwnikami fluorescencyjnymi

Źródło: Inal, M. A. et. al., wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila przy użyciu lipofilowych barwników fluorescencyjnych. J. Vis. Exp. (2020)Ten film pokazuje metodę wstecznego znakowania neuronów ruchowych Drosophila za pomocą barwników lipofilowych. Barwnik dostaje się do aksonu, przemieszcza się wstecz i oznacza neurony na zielono, umożliwiając szczegółową wizualizację ich morfologii i projekcji pod mikroskopem konfokalnym.

Wsteczne znakowanie neuronów ruchowych Drosophila za pomocą fluorescencyjnych barwników lipofilowych

Opisano metodę znakowania neuronów barwnikami fluorescencyjnymi w określonych funkcjonalnych mikrodomenach kory nowej. Po pierwsze, obrazowanie optyczne sygnału wewnętrznego służy do uzyskania mapy funkcjonalnej. Następnie mikroskopia dwufotonowa jest używana do oznaczania i obrazowania neuronów w mikrodomenie mapy.

Celowane znakowanie neuronów w specyficznej funkcjonalnej mikrodomenie kory nowej poprzez połączenie sygnału wewnętrznego i obrazowania dwufotonowego

Ten protokół opisuje projektowanie i chirurgiczne wszczepienie mechanizmu krępującego głowę do monitorowania aktywności neuronalnej w podkorowych strukturach mózgu u szczurów czujnych.  Wyznacza procedury izolowania pojedynczych neuronów w konfiguracji przyściennej i skutecznego identyfikowania ich lokalizacji anatomicznych.

Monitorowanie i lokalizacja pojedynczych neuronów w podkorowych strukturach mózgu czujnych, skrępowanych głową szczurów

Opisujemy technikę oznaczania neuronów i ich procesów poprzez iniekcje śladowe do jąder mózgowych za pomocą preparatu in vitro. Zmodyfikowaliśmy istniejącą metodę elektroporacji znaczników invitro, wykorzystując znakowane fluorescencyjnie mutanty myszy i podstawowy sprzęt optyczny w celu zwiększenia dokładności znakowania.

Laserowe śledzenie neuronów w eksplantatach mózgu

Ten film pokazuje procedurę kraniotomii, która umożliwia przewlekłe obrazowanie neuronów w korze zaśledziony myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo w linii transgenicznej Thy1-GFP. Podejście to łączy się z wstrzyknięciem do grzbietowego hipokampa wirusa związanego z ekspresją mCherry. Techniki te pozwalają na długoterminowe monitorowanie plastyczności strukturalnej zależnej od doświadczenia w RSC.

Jednoczesne dwufotonowe obrazowanie in vivo wejść synaptycznych i celów postsynaptycznych w korze zaśledzinowej myszy

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy metodę badania morfogenezy neurytów w pourodzeniowych eksplantatach siatkówki myszy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej. Opisujemy podejście do rzadkiego znakowania i pozyskiwania typów komórek siatkówki i ich drobnych procesów przy użyciu rekombinowanych wektorów wirusowych związanych z adeno, które wyrażają białka fluorescencyjne ukierunkowane na błonę w sposób zależny od Cre.

Obrazowanie poklatkowe arboryzacji neuronów przy użyciu rzadkiego znakowania wirusem związanym z adenowirusem genetycznie ukierunkowanych populacji komórek siatkówki

Tutaj prezentujemy protokół opisujący transdukcję wirusa w dyskretnych obszarach mózgu za pomocą konstruktów optogenetycznych, które umożliwiają specyficzną dla synaps charakterystykę elektrofizjologiczną w ostrych wycinkach mózgu gryzoni.

Ex vivo Badanie optogenetyczne transmisji synaptycznej dalekiego zasięgu i plastyczności od przyśrodkowej kory przedczołowej do bocznej kory śródwęchowej

Poznaj metodę wstecznego znakowania fluorescencyjnego do nagrywania aktywności pojedynczych neuronów in vivo w układach niegenetycznych. Technika umożliwia selektywne etykietowanie neuronów projekcyjnych w badaniach neurofizjologicznych.

Wsteczne znakowanie fluorescencyjne pozwala na ukierunkowany zewnątrzkomórkowy zapis pojedynczej jednostki ze zidentyfikowanych neuronów in vivo (Wideo) | JoVE Journal

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

Przeglądaj więcej filmów