Wsteczne znakowanie fluorescencyjne pozwala na ukierunkowany zewnątrzkomórkowy zapis pojedynczej jednostki ze zidentyfikowanych neuronów in vivo
June 26th, 2013
Wsteczny transport barwnika fluorescencyjnego oznacza subpopulację neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Znakowane aksony mogą być wizualnie celowane in vivo, co pozwala na zewnątrzkomórkowy zapis ze zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację, gdy neurony nie mogą być oznaczone za pomocą manipulacji genetycznej lub są trudne do wyizolowania przy użyciu "ślepych" podejść in vivo.
Ogólnym celem tej procedury jest zarejestrowanie odpowiedzi pojedynczej jednostki in vivo ze zidentyfikowanej populacji neuronów w niegenetycznym systemie modelowym. Osiąga się to poprzez wykonanie najpierw kraniotomii w celu odsłonięcia obszaru mózgu będącego przedmiotem zainteresowania. Drugim krokiem jest użycie drutów wolframowych do umieszczenia barwnika fluorescencyjnego w obszarze, do którego rzutują docelowe neurony.
Następnie barwnik jest transportowany wstecznie, co powoduje selektywne znakowanie neuronów projekcyjnych. Ostatnim krokiem jest nagranie z oznaczonego aksonu pojedynczego neuronu projekcyjnego. Ostatecznie, pojedyncze jednostkowe nagrania zewnątrzkomórkowe są wykorzystywane do pokazania, jak centralne neurony czuciowe w nienaruszonym obwodzie reagują na stymulację sensoryczną w evo.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób obwody nerwowe wykrywają submilisekundowe różnice w czasie sygnałów synaptycznych. Główną przewagą tej techniki nad istniejącymi metodami jest możliwość celowania w pojedyncze neurony, a nawet aksony i systemy niedostępne genetycznie. Co tydzień ryby elektryczne używają sygnałów elektrycznych do komunikacji i nawigacji.
Rozróżniają sygnały od różnych ryb na podstawie submilisekundowych różnic w czasie sygnałów synaptycznych. Zapytaliśmy, w jaki sposób przypuszczalne neurony komparatora czasu w swoim obwodzie elektrosensorycznym są w stanie wykryć tak małe różnice czasowe. Ale technika ta może być również stosowana do innych systemów, takich jak wzrokowe i słuchowe ścieżki sensoryczne.
Szczególnie trudno jest upłynnić się z tych komórek ze względu na mały rozmiar, gęste migonięcie w otaczającej tkance i zakończeniach presynaptycznych, które pokrywają większość brzucha komórki, wstrzyknięcie barwnika wewnątrzkomórkowego podczas zapisu całej komórki. In vitro znakuje pojedynczą komórkę, aby kierować docelowymi zapisami z tego aksonu. Podobnie, transport wsteczny po wstrzyknięciu barwnika zewnątrzkomórkowego zapewnia sposób selektywnego znakowania neuronów projekcyjnych w powierzchownych obszarach mózgu.
Można to wykorzystać do zapewnienia wizualnych wskazówek dla nagrań pojedynczych jednostek in vivo. Aby przygotować igłę z kodem D, najpierw naostrz elektrolitycznie drut wolframowy o średnicy 160 mikrometrów do końcowej średnicy końcówki igły od pięciu do 50 mikrometrów. Następnie, w noc poprzedzającą eksperyment, zakoduj końcówkę igły dwumilimolowym roztworem dekstranu o masie cząsteczkowej 10 000 sprzężonego z barwnikiem podłogowym Alexa w celu wywołania znieczulenia ogólnego.
Umieść rybę w wodzie w zbiorniku z roztworem MS 2 22 w stężeniu 300 miligramów na litr, unieruchomić i elektrycznie wyciszyć rybę, wstrzykując 100 mikrolitrów w ilości trzech miligramów na mililitr w mięśnie grzbietu ciała. Następnie napełnij komorę zapisu wodą ze zbiornika i umieść rybę brzuszną stroną do dołu na platformie pośrodku komory. Następnie dostarczyć napowietrzony roztwór MS 2 22 w stężeniu 100 miligramów na litr w ciągu jednego do dwóch mililitrów na minutę, umieszczając końcówkę pipety w pysku.
Następnie ustabilizuj rybę za pomocą stałych prętów i wosku po obu stronach ciała. Monitoruj stan zdrowia ryby, sprawdzając ciągły przepływ krwi w naczyniach ocznych i normalny kolor ciała. Następnie obróć platformę wzdłuż osi pionowej.
Wyreguluj jeden koniec platformy tak, aby jedna strona grzbietowej powierzchni głowy ryby była odsłonięta nad wodą, podczas gdy reszta ciała ryby pozostała zanurzona. Umieść mały kawałek chusteczki Kim na dowolnej niezanurzonej części skóry, aby zapobiec wysuszeniu. W tej procedurze nałóż 0,4% lidokainy na odsłoniętą powierzchnię głowy za pomocą patyczka higienicznego.
Następnie użyj ostrza skalpela, aby przeciąć prostokątny kawałek tkanki skórnej o wymiarach około trzech milimetrów na pięć milimetrów dla ryby o długości 6,2 centymetra. Boczna krawędź prostokąta powinna być wyrównana ze środkiem oka. Przednia krawędź prostokąta powinna znajdować się tuż za okiem, a środkowa krawędź prostokąta powinna być tuż boczna do linii środkowej.
Następnie usuń prostokąt za pomocą kleszczy. Wytnij dodatkowe 2,5 milimetra kwadratowego z przodu, aby odsłonić czaszkę. Całkowicie oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki, zeskrobując nadmiar tkanki za pomocą ostrza skalpela.
Następnie całkowicie osusz powierzchnię chusteczką Kim i wymuszonym powietrzem. Następnie przyklej metalowy słupek do przedniego przyśrodkowego odsłoniętego obszaru czaszki za pomocą super kleju. Poczekaj, aż klej całkowicie wyschnie.
Użyj wiertła dentystycznego z końcówką z węglika spiekanego młyna kulowego o średnicy 0,5 milimetra, aby narysować prostokąt o wymiarach około dwóch milimetrów na cztery milimetry na czaszce dla ryby o długości 6,2 centymetra. Następnie przetnij obwód prostokąta skalpelem i kleszczami. Następnie oderwij czaszkę.
Aby odsłonić mózg, wytnij zarówno pigmentowaną oponę twardą, jak i przezroczystą oponę twardą za pomocą nożyczek sprężynowych lub igły. Następnie usuń wycięte części za pomocą kleszczy, aby odsłonić przednie dodatkowe boczne jądro i tylne dodatkowe boczne jądro. Teraz umieść manipulator z przygotowaną wcześniej igłą pokrytą powłoką D nad obszarem docelowym zawierającym interesujące nas aksony.
Jądro tylne pozaboczne w naszym przypadku szybko wprowadza igłę około 25 mikrometrów w głąb tkanki. Po dyfuzji barwnika przez 15 do 30 sekund wycofaj igłę. W razie potrzeby powtórz z dodatkowymi świeżymi igłami.
Umieść każdy z nich w innym miejscu, tak aby barwnik był rozprowadzony w całym regionie docelowym. Następnie spłucz nadmiar barwnika z jamy roztworem Dzwonka Hickmana i odczekaj co najmniej dwie godziny na pobranie i transport barwnika. Aby zobrazować interesujące nas aksony, umieść komorę rejestracyjną z rybami pod obiektywem pionowego mikroskopu fluorescencyjnego epi stage o stałym stopniu.
Zamień roztwór oddechowy na świeżą wodę w zbiorniku i utrzymuj to samo natężenie przepływu. Następnie umieść jeden koniec przewodu uziemiającego w odsłoniętej jamie mózgu i podłącz drugi koniec do masy stopnia głowicy nagrywającej. Następnie umieść parę elektrod rejestrujących obok podstawy ogona.
Następnie podłącz elektrody do wzmacniacza różnicowego i urządzenia rejestrującego. Aby monitorować polecenie wyładowania elektrycznego narządu lub EODC, przygotuj skalowany szkic obszaru mózgu oglądanego w małym powiększeniu, w tym głównych naczyń krwionośnych jako punktów orientacyjnych, aby określić dokładną lokalizację oznaczonych aksonów. Aby najpierw potwierdzić umieszczenie D, view całą tkankę z oświetleniem jasnego pola w celu orientacji.
Następnie obejrzyj go z oświetleniem fluorescencyjnym. Jądro tylne pozaboczne powinno wykazywać rozlane oznakowanie. Następnie, w dużym powiększeniu, zlokalizuj przednie pozaboczne jądro z naczyniami jako punktami orientacyjnymi.
Oświetl go światłem fluorescencyjnym, szukając oznaczonego aksonu w pobliżu powierzchni, używając średnicy zewnętrznej jednego milimetra i 0,58 milimetra średnicy wewnętrznej. Szkło kapilarne krzemianowe Bo z żarnikiem. Wyciągnij elektrodę rejestrującą z wąskim trzpieniem o długości pięciu milimetrów i średnicy końcówki od około jednego do 2,4 mikrometra.
Napełnij elektrodę przefiltrowanym roztworem dzwonka Hickmana. Końcowa rezystancja końcówki powinna mieścić się w zakresie od 16 do 155 mega omów. Umieść elektrodę w uchwycie elektrody z portem ciśnieniowym.
Podłącz go do stopnia czołowego zamontowanego na manipulatorze. Następnie podłącz stopień główny do amplifier. Analogowo-cyfrowe urządzenie akwizycyjne, które nie zostało pokazane, łączy amplifier z komputerem.
Następnie przyłóż nadciśnienie 30 milibarów do linii elektrod. Powoli przesuwaj elektrodę w kierunku aksonu od powierzchni tkanki. Ponieważ elektroda znajduje się blisko aksonu, nadciśnienie powinno powodować niewielki, ale zauważalny ruch aksonu, gdy elektroda znajduje się obok aksonu.
Rejestruj aktywność podczas prezentacji bodźców testowych. Chociaż artefakt elektryczny potwierdza prawidłowe nagrywanie i stymulację, nie powinno być żadnych potencjałów czynnościowych. Zwolnij ciśnienie zewnętrzne w elektrodzie i powtórz stymulację i rejestrację.
Następnie zastosuj lekkie ssanie, powodując przemieszczenie się aksonu do elektrody. Powtórz stymulację i nagrywanie ponownie. Teraz powinieneś zobaczyć pewne potencjały czynnościowe w odpowiedzi na stymulacje.
Gdy potencjały czynnościowe są widoczne, zamknij przewód ciśnieniowy. Po zakończeniu wszystkich żądanych zapisów zmień wodę w zbiorniku z powrotem na roztwór oddechowy z MS 2 22 w ilości stu miligramów na litr, aby upewnić się, że ryba jest całkowicie znieczulona. Przez co najmniej 10 minut przed eutanazją ryb nie powinno być wykrywane żadne EODC.
Oto pięć przykładowych śladów pokazujących potencjały czynnościowe wywołane przez 0,1 milisekundy sześciomiliwoltowego na centymetr, jednofazowy kontralateralny dodatni impuls poprzeczny impuls kwadratowy, a oto wykres rastrowy pokazujący czasy skoków podczas 20 powtórzeń 75-milisekundowego okna nagrywania dla tej samej jednostki stymulowanej w czasach zero bodźcami sześciomiliwoltami na centymetr. Zakres czasu trwania jest podany po prawej stronie. Pokazano tutaj krzywą dostrajania czasu trwania bodźca, która określa ilościowo reakcje jako skoki na powtórzenie bodźca.
Po opanowaniu, operacja i wstrzyknięcie barwnika pokazane w tej technice mogą być wykonane w ciągu jednej godziny, jeśli są wykonane prawidłowo, a zapisy można rozpocząć dwie do trzech godzin po wstrzyknięciu barwnika. Podczas próby wykonania tej procedury należy pamiętać o uważnym monitorowaniu stanu zdrowia zwierzęcia doświadczalnego Zgodnie z tą procedurą. Inne metody, takie jak obrazowanie dwufotonowe, mogą być wykonywane w celu rejestrowania z neuronów w jeszcze głębszych strukturach mózgu.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oznaczać i rejestrować odpowiedzi pojedynczych jednostek ze zidentyfikowanej populacji neuronów.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia metodę rejestracji pojedynczych reakcji jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo za pomocą wstecznego transportu fluorescencyjnego barwnika. Ta technika pozwala na selektywne znaczenie neuronów projekcyjnych, ułatwiając ukierunkowane rejestracje pozakomórkowe w niegenetycznych systemach modelowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Elektrofizjologia
- Obwody neuronalne
Tło
- Rejestrowanie z określonych neuronów jest kluczowe dla zrozumienia obwodów neuronowych.
- Tradycyjne metody mogą nie efektywnie znaczyć neuronów w niegenetycznych systemach.
- Fluorescencyjny barwnik może być używany do znaczenia neuronów na podstawie ich anatomicznych projekcji.
- To podejście jest szczególnie przydatne do badania sensorycznych neuronów u ryb elektrycznych.
Cel badania
- Opracowanie techniki do rejestracji in vivo z zidentyfikowanych neuronów.
- Zbadanie, jak sensoryczne neurony reagują na bodźce.
- Poprawa zdolności do ukierunkowania na pojedyncze neurony w złożonych tkankach.
Zastosowanie metod
- Kraniotomia w celu ekspozycji regionu mózgu o zainteresowaniu.
- Wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika do obszarów docelowych w celu znaczenia neuronów projekcyjnych.
- Zastosowanie drutów wolframowych dla precyzyjnego umieszczenia barwnika.
- Rejestrowanie pozakomórkowe z znaczonych aksonów w celu oceny reakcji neuronowych.
Główne wyniki
- Skuteczne znaczenie neuronów projekcyjnych za pomocą wstecznego transportu barwnika.
- Zdolność do rejestracji pojedynczych reakcji jednostek z zidentyfikowanych neuronów.
- Wykazanie zastosowania techniki do badania różnic czasowych w obwodach sensorycznych.
- Dostarczenie wizualnego przewodnika dla ukierunkowanych rejestracji in vivo.
Wnioski
- Metoda pozwala na ukierunkowane rejestrowanie z określonych neuronów w niegenetycznych systemach.
- To podejście może być zastosowane do różnych ścieżek sensorycznych poza rybami elektrycznymi.
- Oferuje znaczącą przewagę nad tradycyjnymi metodami w złożonych środowiskach tkankowych.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables targeted single-unit recordings from identified neurons in non-genetic model systems, addressing a key challenge in neuroscience research where genetic tools are unavailable. By using retrograde fluorescent labeling based on axonal projections, researchers can pre-visualize and selectively record from specific neuronal populations, improving the reliability and interpretability of electrophysiological data. This capability supports mechanistic de-risking in target validation by linking neuronal identity to function in intact circuits, which is valuable for preclinical neuroscience and translational biomarker discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking neuronal identity to electrophysiological function in vivo.
- Operational Value: Provides a visual cue for targeted recordings, reducing blind sampling and increasing data quality in heterogeneous tissues.
- Predictive Confidence: Supports biological de-risking by confirming that recorded signals originate from anatomically defined projection neurons.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Creates a standardized, reproducible system for preparing labeled neurons for downstream electrophysiological assessment.
- Quantitative Output: Enables measurement of single-unit responses to sensory stimuli, providing actionable data for compound screening.
- Platform Reuse: The retrograde labeling approach can be adapted across brain regions and model systems, supporting scalable use in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Disease-Relevant System: Applicable to sensory processing circuits, offering insight into neural mechanisms of stimulus detection and timing discrimination.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical work by enabling consistent identification of neuronal targets across experimental sessions.
- Risk-Adjusted Advancement: Reduces false positives in target validation by ensuring recordings are obtained from the intended neuronal population.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis-driven interrogation of neural circuits before moving to lead identification and preclinical validation stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by allowing researchers to record from neurons defined by their projection patterns, clarifying functional roles in sensory processing.
- Screening: Generates reproducible, quantifiable electrophysiological readouts that can be used to assess neuronal responses under controlled conditions.
- Analytics: Produces spike timing and duration tuning curves that enable quantitative comparison of neuronal responses across stimuli or conditions.
- Translational Research: Supports continuity from circuit-level discovery to preclinical models by providing a reliable method to identify and re-target specific neurons.
- Enterprise Reuse: The core technique of retrograde dye labeling is adaptable to various brain regions and species, making it a reusable capability across neuroscience discovery programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through anatomically precise targeting.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of single-unit recordings via pre-visualization of target neurons.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in early discovery by increasing the likelihood that observed phenotypes are linked to the intended neuronal target.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated neuronal identity and function in intact circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroanatomy, microsurgery, and in vivo electrophysiology.
- Depends on access to fluorescence microscopy, micromanipulators, and extracellular recording equipment.
- Necessitates standardization of dye injection parameters and transport times across users and labs.
- Must account for variability in axonal projection patterns when applying the method to new model systems or brain regions.
- Practical limitations include dependence on successful retrograde transport, which may vary by tissue health and dye properties.
