Name: Filtry z waty szklanej do koncentracji wirusów przenoszonych przez wodę i rolniczych patogenów odzwierzęcych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Naucz się konstruować filtry z waty szklanej do koncentracji wirusów, bakterii i pierwotniaków z dużych objętości wody. Ta ekonomiczna metoda umożliwia skuteczną detekcję patogenów przenoszonych drogą wodną w badaniach mikrobiologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Williamowi T. Eckertowi za narrację w filmie. Opracowanie protokołu z użyciem wełny szklanej było częścią badania Wisconsin Water And Health Trial for Enteric Risks (badanie WAHTER), finansowanego z grantu US EPA STAR R831630. Próbki z Alaski zostały pobrane przez A. Reeves, A. Ramey oraz B. Meixella przy wsparciu finansowym USGS. Wszelkie użycie nazw handlowych, produktów lub firm służy wyłącznie celom opisowym i nie oznacza poparcia przez rząd USA.

1. Przygotowanie wełny szklanej
<ol>
 <li> Przed przygotowaniem i po każdej partii filtrów należy wysterylizować obszar roboczy 10% roztworem wybielacza. </li>
 <li> Założyć rękawiczki i fartuch. Wysterylizować wiadro w autoklawie w temperaturze 121°C i pod ciśnieniem 15 psi przez co najmniej 20 minut. Umieścić wełnę szklaną w sterylnym wiadrze. </li>
 <li> Nasycić wełnę szklaną wodą z odwróconej osmozy i pozostawić do namoczenia na 15 minut. </li>
 <li> Odlać wodę z odwróconej osmozy z wiadra.</li>
 <li> Nasycić wełnę szklaną 1 M HCl i pozostawić do namoczenia na 15 minut. </li>
 <li> Odlać 1 M HCl z wiadra.</li>
 <li> Przepłukać wełnę szklaną wodą z odwróconej osmozy. </li>
 <li> Dokładnie wymieszać. </li>
 <li> Sprawdzić pH za pomocą papierka wskaźnikowego i powtarzać płukanie wodą z odwróconej osmozy aż do uzyskania neutralnego pH. </li>
 <li> Odlać wodę z płukania. </li>
 <li> Nasycić wełnę szklaną 1 M NaOH i pozostawić do namoczenia na 15 minut. </li>
 <li> Odlać 1 M NaOH z wiadra. </li>
 <li> Powtarzać płukanie wodą z odwróconej osmozy aż do uzyskania neutralnego pH. </li>
 <li> Odlać wodę z płukania. </li>
 <li> Zamiast wiadra można skonstruować myjkę do wełny szklanej, której budowa jest zbliżona do myjki do pipet szklanych (Rysunek 1). </li>
 <li> Całkowicie przykryć wełnę szklaną sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanem (PBS) o pH 6,8. </li>
 <li> Przygotowaną wełnę szklaną należy zużyć niezwłocznie lub przechowywać w temperaturze 4°C. Może być ona przechowywana do dwóch tygodni. Przed użyciem należy upewnić się, że pH jest neutralne, ponieważ z czasem ulegnie ono zwiększeniu. Jeśli pH nie jest neutralne, należy ponownie przepłukać wełnę sterylnym solnym roztworem buforowanym fosforanem (pH 6,8). </li>
</ol>

2. Montaż filtra z wełny szklanej
<ol>
 <li> Wywierć otwór o średnicy 11/16 cala w nasadkach z PVC i nacinaj gwinty, aby możliwe było wkręcenie nylonowych złączek z adapterem męskim w nasadki. Krok ten jest konieczny tylko przy pierwszym montażu. Następnie nasadki mogą być używane przez lata. Nałóż taśmę teflonową na gwinty złączek nylonowych i wkręć je w nasadki. </li>
 <li> Wypełnij rurkę z PVC małymi kawałkami wełny szklanej. Do ciasnego upakowania użyj metalowego tłoka, np. zaworu silnika samochodowego. Upakowywanie nie wymaga dużej siły. Upakuj materiał na tyle ściśle, aby wełna szklana pozostała na miejscu i nie tworzyły się kanały. Jednak nie upakuj jej zbyt mocno, aby woda mogła przepływać przez filtr. Przy odpowiednim upakowaniu, przy podłączeniu filtra do kranów wodnych z ciśnieniem od 40-60 psi, powinno być możliwe osiągnięcie przepływu rzędu 4 do 5 litrów na minutę. Dla rozmiaru rurki z PVC określonego w tym protokole, na jedną rurkę zużywa się około 85 g wypłukanej i upakowanej wełny szklanej. Wyzeruj pustą rurkę z PVC na wadze górnej i wypełniaj ją wypłukaną wełną szklaną, aż masa rurki wzrośnie o 85 g. </li>
 <li> Włóż siatkę z polipropylenu do nasadek z PVC z przymocowanymi nylonowymi złączkami z adapterem męskim.</li>
 <li> Nałóż taśmę teflonową na gwintowane części rurki z PVC. </li>
 <li> Przykręć nasadki z PVC do rurki z PVC i oznacz jeden koniec filtra jako wlot, a drugi jako wylot. Jest to istotne w późniejszym etapie elucji. To, który koniec zostanie oznaczony jako wlot, nie ma znaczenia. </li>
 <li> Wprowadź 60 mL sterylnego roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (pH = 6.8) do filtra za pomocą strzykawki z końcówką cewnikową. Nadmiar wypłynie z przeciwległego końca. </li>
 <li> Szczelnie owiń końce folią Parafilm, aby zapobiec wyciekom. Filtry można przechowywać do 30 dni w temperaturze 4°C. </li>
</ol>
3. Pobieranie próbek
<ol>
 <li> Sterylizować węże używane do pobierania próbek poprzez recyrkulację lub zanurzenie elementów na 30 minut w 0,525% NaClO (tj. w 10% roztworze standardowego wybielacza domowego). Następnie należy spuścić roztwór podchlorynu i zneutralizować go 0,05% tiapplicantem sodu, przygotowanym przez dodanie 25 mL 2% roztworu zapasowego bezwodnego tiosiarczanu sodu do jednego litra wody z odwróconej osmozy. </li>
 <li> W przypadku wody z próbki o pH wyższym niż 7,5, należy dostosować pH do wartości między 6,5 a 7,0 za pomocą HCl. Stężenie HCl może wynosić od 0,25 M do 1 M. Cztery litry 0,5 M HCl są zazwyczaj wystarczające dla dwóch próbek o objętości 800 litrów, w zależności od pH otoczenia i pojemności buforowej wody. HCl należy wstrzykiwać podczas pobierania próbek za pomocą pompy perystaltycznej lub Venturiego (Rycina 2). Dostosować prędkość pompy lub otwór Venturiego, aby osiągnąć docelowe pH. pH należy mierzyć na wylocie linii pobierania próbek za pomocą polowego pH-metru.</li>
 <li> W przypadku zapchania filtra z wełny szklanej przez wodę o wysokiej mętności należy zastosować filtr wstępny. (Specyfikacje filtra wstępnego i jego obudowy znajdują się w internetowej liście materiałów). Ponieważ patogeny mogą być przyczepione do cząsteczek zatrzymanych przez filtr wstępny, musi on zostać poddany elucji wraz z filtrem z wełny szklanej (patrz poniżej). </li>
 <li> Dostosować natężenie przepływu do wartości między 2 a 4 litrami/minutę. Typowe objętości próbek wynoszą od 200 do 1 500 litrów. </li>
 <li> Odłączyć filtr z wełny szklanej i przechowywać w sterylnej plastikowej torbie w temperaturze 4°C przez maksymalnie 48 godzin. </li>
</ol>
4. Elucja
<ol>
 <li>Przymocuj filtr z wełny szklanej do statywu z pierścieniem tak, aby koniec wlotowy dla próbki był skierowany w dół, do butelki z polipropylenu. Elucję przeprowadź w kierunku przeciwnym do przepływu próbki. </li>
 <li>Przepchnij przez filtr 80 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5.</li>
 <li>Odczekaj 15 minut.</li>
 <li>Przepchnij przez filtr kolejne 80 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5.</li>
 <li>Przepychaj powietrze przez filtr, aż z wlotu filtra zacznie wydostawać się piana.</li>
 <li>Dostosuj pH eluatu do wartości między 7,0 a 7,5 za pomocą 1 M HCl.</li>
 <li>Przechowuj eluat w temperaturze 4°C do 24 godzin lub w -20°C przez dłuższy czas.</li>
 <li>Przeprowadź elucję z przedfiltru, jeśli był on użyty. Odkręć górną część obudowy wkładu i zlej całą pozostałą wodę z wnętrza obudowy, przytrzymując przedfiltr w miejscu dłońmi w sterylnych rękawiczkach.</li>
 <li>Wyjmij przedfiltr z obudowy wkładu i włóż go do woreczka strunowego o wymiarach 15" x 6".</li>
 <li>Wlej do woreczka 200 mL sterylnego 3% ekstraktu wołowego w 0,05 M glicynie o pH 9,5 i szczelnie zamknij go za pomocą zamknięcia strunowego.</li>
 <li>Kilkukrotnie odwróć woreczek z przedfiltrem, aby upewnić się, że cała jego powierzchnia ma kontakt z ekstraktem wołowym.</li>
 <li>Odczekaj 15 minut, okresowo odwracając i masując woreczek z przedfiltrem.</li>
 <li>Otwórz zamknięcie strunowe. Mocno ściśnij woreczek wokół przedfiltru, aby wycisnąć jak najwięcej ekstraktu wołowego, a następnie wyjmij przedfiltr dłońmi w sterylnych rękawiczkach.</li>
 <li>Przelej eluat z ekstraktu wołowego do butelki z polipropylenu.</li>
 <li>Dostosuj pH eluatu do wartości między 7,0 a 7,5 za pomocą 1 M HCl.</li>
 <li>Przechowuj eluat w temperaturze 4°C do 24 godzin lub w -20°C przez dłuższy czas. Eluat z przedfiltru można analizować oddzielnie pod kątem obecności patogenów lub połączyć z eluatem z filtra z wełny szklanej.</li>
</ol>









5. Reprezentatywne wyniki
<table border="1">
<tbody >
 <tr>
 <td>Patogen</td>
 <td>Poziom mętności wody (NTU) a</td>
 <td>Ilość zaszczepiona/L b,c,d</td>
 <td>% odzysku ± 1 SD</td>
 <td>Liczba niezależnych prób</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>0.5 </td>
 <td>500</td>
 <td>81% ± 11</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>0.5</td>
 <td>5000</td>
 <td>67% ± 12</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>215 </td>
 <td>500</td>
 <td>59% ± 32</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>215</td>
 <td>5000</td>
 <td>38% ± 22</td>
 <td>6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>447</td>
 <td>500</td>
 <td>56% ± 18</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Enterovirus- Poliovirus Sabin III</td>
 <td>447</td>
 <td>5000</td>
 <td>63% ± 37</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>0.5</td>
 <td>5</td>
 <td>38% ± 14</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>0.5</td>
 <td>50</td>
 <td>53% ± 19</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>215</td>
 <td>5</td>
 <td>40% ± 16</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>215</td>
 <td>50</td>
 <td>30% ±6</td>
 <td>6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>447</td>
 <td>5</td>
 <td>33% ± 13</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cryptosporidium parvum</td>
 <td>447</td>
 <td>50</td>
 <td>28% ± 11</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>0.5</td>
 <td>5</td>
 <td>29% ± 24</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>0.5</td>
 <td>500</td>
 <td>56% ± 16</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>215</td>
 <td>5</td>
 <td>32% ± 24</td>
 <td>7</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>215</td>
 <td>500</td>
 <td>34% ±11</td>
 <td>6</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>447</td>
 <td>5</td>
 <td>34% ± 18</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Salmonella enterica</td>
 <td>447</td>
 <td>500</td>
 <td>31% ± 24</td>
 <td>8</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol class="lalpha">
<li>Jednostka mętności nefelometrycznej</li>
<li>Enterowirusy zliczone metodą qPCR jako kopie genomowe/L</li>
<li> C. parvum zliczone metodą immunofluorescencji jako oocysty</li>
<li> S. enterica zliczone metodą hodowli jako jednostki tworzące kolonie</li>
</ol>
Tabela 1. Stężenie wełny szklanej przy zmiennej mętności wody i gęstości patogenów.
 <table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Patogen</td>
 <td>Miejsce pobrania próbki wody</td>
 <td>Ilość zaszczepiona/La</td>
 <td>% odzysku</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avian Influenza H5N2</td>
 <td>Sundi Lake, Anchorage Borough</td>
 <td>2500</td>
 <td>42.9%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avian Influenza H5N2</td>
 <td>Minto Flats, Fairbanks North Star Borough</td>
 <td>2500</td>
 <td>36.7%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avian Influenza H5N2</td>
 <td>Portage Valley, Anchorage Borough</td>
 <td>2500</td>
 <td>7.8%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avian Influenza H5N2</td>
 <td>Potter Marsh, Anchorage Borough</td>
 <td>2500</td>
 <td>41.5%</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Avian Influenza H5N2</td>
 <td>Willow Lake, Yukon-Koyukuk Borough</td>
 <td>2500</td>
 <td>15.5%</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
<ol class="lalpha">
<li> Zmierzono za pomocą qPCR jako kopie genomowe/L</li>
</ol>
Tabela 2. Koncentracja wirusa grypy ptaków na wełnie szklanej z wykorzystaniem wody z pięciu lokalizacji na Alasce.
<img src="/files/ftp_upload/3930/3930fig1.jpg" alt="Schemat systemu filtracji z PVC; szczegóły rury przelewowej, gwintowanego korka i sitek prysznicowych." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat myjki z wełny szklanej. Może ona być stosowana zamiast wiadra, co pozwala zaoszczędzić czas podczas płukania. Koncepcja ta jest podobna do myjki do pipet szklanych.
<img src="/files/ftp_upload/3930/3930fig2.jpg" alt="Układ do separacji chemicznej z rurkami, manometrem i pompą; stosowany w procesie chromatografii." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Filtracja przez watę szklaną z wstrzykiwaniem kwasu za pomocą pompy perystaltycznej. Należy zwrócić uwagę na złączkę w kształcie litery „T”, w której rurka pompy wprowadza kwas do linii z próbką pomiędzy kranem wodnym a filtrem z waty szklanej. Regulacja pH jest konieczna tylko wtedy, gdy pobrana woda ma pH &gt; 7.5. 
Filtry z wełny szklanej są skuteczne w zagęszczaniu patogenów z wody o szerokim zakresie mętności i gęstości patogenów (Tabela 1). Aby to sprawdzić, 20 litrów odchlorowanej wody z kranu zmieszano z wysuszonymi glebami pyłowymi (0, 1,27 lub 2,75 g/L), aby uzyskać pożądany poziom mętności, a następnie zaszczepiono patogenami o różnych gęstościach. Wodę przepuszczono przez filtr z wełny szklanej, a następnie policzono zagęszczone patogeny w eluate, co stanowiło licznik w obliczeniach procentowego odzysku. Ilość patogenów zaszczepionych do wody, czyli mianownik w obliczeniach procentowego odzysku, określono poprzez wcześniejsze zaszczepienie patogenów do eluatu ujemnego, a następnie ich policzenie. Eluat ujemny przygotowano poprzez przepuszczenie niezaszczepionej próbki o objętości 20 litrów przez filtr i przeprowadzenie elucji. Ilościowe oznaczenie zaszczepionych patogenów w eluacie ujemnym pozwala uniknąć różnic w liczeniu patogenów, które mogłyby wynikać z różnic w matrycy powstałych w wyniku filtracji wełną szklaną. Znaczenie tego kroku przy ilościowym oznaczaniu patogenów metodą qPCR omówiono w pracy Lambertini et al.3. Próbkę kontrolną ujemną o objętości 20 litrów zagęszczono za pomocą filtracji wełną szklaną, aby upewnić się, że nie występują w niej naturalne patogeny, które mogłyby zakłócić obliczenia procentowego odzysku. W przypadku poziomu mętności ≥ 215 NTU zastosowano przefiltrowanie wstępne przy użyciu filtra o nominalnej wielkości porów 10 μm.
Ilość poliwirusa określono za pomocą qPCR w czasie rzeczywistym, wykorzystując procedury wtórnego zagęszczania i ekstrakcji kwasów nukleinowych oraz startery i sondy opisane przez Lambertini et al.3. Ilość Cryptosporidium parvum określono w końcowej objętości próbki zagęszczonej (FCSV), otrzymanej w wyniku procedury wtórnego zagęszczania poliwirusa. Oocysty z wizualizowano za pomocą immunofluorescencji (MeriFluor Cryptosporidium &amp; Giardia Detection Kit, Meridian Life Science, Inc., Cincinnati, OH). Ilość Salmonella enterica w FCSV określono poprzez wysiew na agar XLD (Remel, Lenexa, KS) i liczenie jednostek tworzących kolonie.
Filtry z wełny szklanej są skuteczne w zagęszczaniu wirusów grypy ptaków (Tabela 2). Wirus grypy ptaków o niskiej zjadliwości (H5N2) został zaszczepiony do próbek wody z kilku lokalizacji na Alasce, a procent odzysku obliczono zgodnie z powyższym opisem. Procedury wtórnego zagęszczania oraz izolacji kwasów nukleinowych przeprowadzono analogicznie jak w przypadku poliovirusa; wirusa oznaczono metodą qPCR, wykorzystując startery i sondę opisane przez Spackmana et al.4

<ol><li>US Environmental Protection Agency. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+1623%3A+Cryptosporidium+and+Giardia+in+Water+by+Filtration%2FIMS%2FFA%5BTitle%5D)+AND+%22EPA+815-R-05-002%22%5BJournal%5D)">Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by Filtration/IMS/FA.</a> EPA 815-R-05-002. , (2012).</li>
<li>Cashdollar, J. L., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+method+to+re-use+electropositive+cartridge+filters+for+concentrating+viruses+from+tap+and+river+water%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a method to re-use electropositive cartridge filters for concentrating viruses from tap and river water.</a> J. Virol. Methods. 132, 13-17 (2006).</li>
<li>Lambertini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+of+enteroviruses%2C+adenoviruses%2C+and+noroviruses+from+drinking+water+by+use+of+glass+wool+filters%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Concentration of enteroviruses, adenoviruses, and noroviruses from drinking water by use of glass wool filters.</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 2990-2996 (2008).</li>
<li>Spackman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+real-time+reverse+transcription+PCR+assay+for+Type+A+influenza+virus+and+the+avian+H5+and+H7+hemagglutinin+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development of a real-time reverse transcription PCR assay for Type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes.</a> J. Clin. Microbiol. 40, 3256-3260 (2002).</li>
<li>Environment Agency. Optimisation of a new method for detection of viruses in groundwater. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+No.+NC%2F99%2F40%22">Report No. NC/99/40</a>. , Environment Agency, National Groundwater and Contaminated Land Centre. West Midlands, United Kingdom. (2000).</li>
<li>Vilaginés, P., Sarrette, B., Husson, G., Vilaginés, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glass+wool+for+virus+concentration+at+ambient+water+pH+level%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Glass wool for virus concentration at ambient water pH level.</a> Water Sci. Technol. 27, 299-306 (1993).</li>
<li>Vivier, J. C., Ehlers, M. M., Grabow, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+enteroviruses+in+treated+drinking+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of enteroviruses in treated drinking water.</a> Water Res. 38, 2699-2705 (2004).</li>
<li>Powell, K. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPowell%2C+KL+%22Enteric+virus+detection+in+groundwater+using+a+glass+wool+trap.+In%3A+Groundwater%3A+Past+Achievements+and+Future+Challenges%22">Enteric virus detection in groundwater using a glass wool trap. In: Groundwater: Past Achievements and Future Challenges</a>. Sililo, O. , Balkema, Rotterdam. 813-816 (2000).</li>
<li>Hunt, R. J., Borchardt, M. A., Richards, K. D., Spencer, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+sewer+source+contamination+of+drinking+water+wells+using+tracers+and+human+enteric+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Assessment of sewer source contamination of drinking water wells using tracers and human enteric viruses.</a> Environ. Sci. Technol. 44, 7956-7963 (2010).</li>
<li>van Heerden, J., Ehlers, M. M., Heim, A., Grabow, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+quantification+and+typing+of+adenoviruses+detected+in+river+and+treated+drinking+water+in+South+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prevalence, quantification and typing of adenoviruses detected in river and treated drinking water in South Africa.</a> J. Appl. Microbiol. 99, 234-242 (2005).</li>
<li>Vilaginés, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+robin+investigation+of+glass+wool+method+for+poliovirus+recovery+from+drinking+water+and+sea+water%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Sci.+Technol%22%5BJournal%5D)">Round robin investigation of glass wool method for poliovirus recovery from drinking water and sea water.</a> Water Sci. Technol. 35, 445-449 (1997).</li>
<li>Gantzer, C., Senouci, S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterovirus+genomes+in+wastewater%3A+concentration+on+glass+wool+and+glass+powder+and+detection+by+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR.</a> J. Virol. Methods. 65, 265-271 (1997).</li>
<li>Pathogen losses in surface water runoff from dairy manure applied to corn fields. Borchardt, M. A., Jokela, W. E., Spencer, S. K. American Society for Microbiology General Meeting, New Orleans, LA, , (2011).</li>
<li>Deboosere, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+concentration+method+for+the+detection+of+influenza+A+viruses+from+large+volumes+of+surface+water%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a concentration method for the detection of influenza A viruses from large volumes of surface water.</a> Appl. Environ. Microbiol. 77, 3802-3808 (2011).</li>
<li>Lambertini, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+contamination+from+operation+and+maintenance+practices+in+small+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Water+Health%22%5BJournal%5D)">Virus contamination from operation and maintenance practices in small drinking water distribution systems.</a> J. Water Health. 9, 799-812 (2011).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane przez kilka zespołów badawczych3,5,6 do zagęszczania ludzkich wirusów jelitowych z różnych źródeł wody, takich jak uzdatkowiona woda pitna7, woda podziemna8,9, woda powierzchniowa10, woda morska11, ścieki12 oraz spływy rolnicze13. W niniejszej pracy wykazujemy, że filtry te są również skuteczne w zagęszczaniu wirusa grypy ptaków, a także bakterii i pierwotniaków chorobotwórczych: odpowiednio Salmon...

<table><tbody><tr><td>Kwas solny</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>BP359-212</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Fosforanowy bufor solny&lt;/em&gt; Chlorek sodu Fosforan potasu(II) Fosforan potasu(I)</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>BP358-212 BP363-500 BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>Podchloran sodu t.j. wybielacz domowy</td><td><a href="http://www.clorox.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Clorox</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tiosiarczan sodu, bezwodny</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>S 475-212</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt wołowy, suszony</td><td><a href="http://www.bd.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> BD Biosciences</a></td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>Glicyna</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>G46-500</td><td></td></tr><tr><td>Naoliwiona wełna szklana sodowo-wapniowa Lub niepowlekana izolacja z włókna szklanego R-11 </td><td><a href="http://www.jm.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Johns Manville</a></td><td>Bourre 725 QN</td><td></td></tr><tr><td>Siatka z polipropylenu</td><td><a href="http://www.industrialnetting.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Industrial Netting</a></td><td>xN4510</td><td></td></tr><tr><td>Gwintowany nippel z PVC 2"x4" Sch 80</td><td><a href="http://www.grainger.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Grainger</a></td><td>6MW35</td><td></td></tr><tr><td>Zaślepka z PVC 2" Sch 40</td><td><a href="http://www.grainger.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Grainger</a></td><td>5WDW3</td><td></td></tr><tr><td>Nylonowy adapter zewnętrzny (1/2"x1/2")</td><td><a href="http://www.usplastic.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> US Plastic Corp.</a></td><td>62178</td><td></td></tr><tr><td>Butelki na eluat - 1 litr</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>03-313-4F</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60 mL</td><td><a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Fisher Scientific</a></td><td>NC9661991</td><td></td></tr><tr><td>Paski pH</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Whatman, GE Healthcare</a></td><td>2614 991</td><td></td></tr><tr><td>Prefiltr, polipropylenowy, wkład 10 cali, 10 &amp;mu;m</td><td>McMaster-Carr</td><td>4411K75</td><td></td></tr><tr><td>Obudowa prefiltra</td><td>Cole-Parmer</td><td>S-29820-10</td><td></td></tr></tbody></table>

filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

Kluczowym pierwszym krokiem w ocenie poziomu patogenów w wodzie z podejrzeniem zanieczyszczenia jest ich zagęszczenie. Metody zagęszczania są zazwyczaj specyficzne dla konkretnej grupy patogenów, na przykład metoda 1623 Amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (US Environmental Protection Agency) dla Giardia i Cryptosporidium1, co oznacza, że w przypadku programów pobierania próbek obejmujących więcej niż jedną grupę patogenów wymagane jest zastosowanie wielu metod. Inną wadą obecnych metod jest fakt, że sprzęt może być skomplikowany i kosztowny, czego przykładem jest metoda VIRADEL z zastosowaniem wkładu filtrującego 1MDS do zagęszczania wirusów2. W niniejszym artykule opisujemy sposób konstrukcji filtrów z wełny szklanej do zagęszczania patogenów przenoszonych przez wodę. Po elucji z filtra koncentrat może zostać poddany drugiemu etapowi zagęszczania, takiemu jak wirowanie, a następnie detekcji i enumeracji patogenów za pomocą metod hodowlanych lub molekularnych. Filtry te mają kilka zalet. Ich konstrukcja jest prosta, a filtry mogą być budowane w dowolnym rozmiarze, aby spełnić konkretne wymogi pobierania próbek. Elementy filtru są niedrogie, co umożliwia zebranie dużej liczby próbek bez znaczącego obciążenia budżetu projektu. Możliwe jest zagęszczenie dużych objętości próbek (od setek do tysięcy L), w zależności od tempa zapychania się filtra wynikającego z mętności próbki. Filtry są wysoce mobilne i przy minimalnym wyposażeniu, takim jak pompa i przepływomierz, mogą być stosowane w terenie do pobierania próbek uzdatkowionej wody pitnej, wód powierzchniowych, wód podziemnych oraz spływów rolniczych. Wreszcie, filtracja wełną szklaną jest skuteczna w zagęszczaniu różnych typów patogenów, więc wystarczająca jest tylko jedna metoda. W pracy tej raportujemy skuteczność filtrów w zagęszczaniu ludzkich enterowirusów przenoszonych przez wodę, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum oraz wirusa grypy ptaków.

Filtry z wełny szklanej były wykorzystywane do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę przez liczne grupy badawcze na całym świecie. W niniejszej pracy przedstawiamy prostą metodę konstruowania filtrów z wełny szklanej i wykazujemy, że są one również skuteczne w zagęszczaniu wodnych patogenów wirusowych, bakteryjnych i pierwotniakowych.

Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Kluczowym pierwszym krokiem w ocenie poziomu patogenów w wodzie z podejrzeniem zanieczyszczenia jest ich zagęszczenie. Metody zagęszczania są zazwyczaj specyficzne dla...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest stworzenie niedrogiego i skutecznego filtra do zagęszczania szerokiej gamy patogenów przenoszonych przez wodę z dużych objętości wody. Konstrukcję filtra realizuje się poprzez wstępne płukanie wełny szklanej, jej mycie kwasem oraz zasadą, a następnie ponowne płukanie wełny aż do uzyskania neutralnego pH. Następnie wełnę szklaną płucze się w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym.W następnym kroku wełnę szklaną upakowuje się w rurce z PVC, aby utworzyć filtr z wełny szklanej. Po wykorzystaniu filtra do pobierania próbek wody przeprowadza się etap elucji. Próbkę można następnie przechowywać, dodatkowo zagęścić lub poddać analizie w kierunku patogenów za pomocą metod hodowlanych lub molekularnych.Choroby przenoszone drogą wodną stanowią istotne zagrożenie dla zdrowia publicznego. Transmisja chorób na świecie może następować poprzez spożycie wody pitnej oraz podczas rekreacyjnych aktywności wodnych. Jednym z podejść do oceny jakości sanitarnej wody jest bezpośrednie badanie jej pod kątem obecności patogenów wywołujących choroby.Stosowanie filtrów z wełny szklanej niesie ze sobą szereg korzyści w porównaniu z innymi tradycyjnymi filtrami do pa

glass-wool-filters-for-concentrating-waterborne-viruses-agricultural

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Filtry z wełny szklanej do koncentracji wirusów przenoszonych drogą wodną i rolniczych zoonotycznych patogenów

Szybkość wymiany wirusów w systemach morskich i słodkowodnych można oszacować za pomocą techniki redukcji i ponownego pojawienia się. Uzyskane dane pozwalają badaczom wywnioskować tempo śmiertelności mikroorganizmów indukowanej przez wirusy w systemach wodnych.

Szacowanie szybkości produkcji wirusów w systemach wodnych

Niniejszy protokół opisuje zastosowanie systemu zagęszczania próbek z wykorzystaniem ultrafiltracji stycznoprzepływowej z pustymi włóknami oraz dysocjacji termicznej jako alternatywnych kroków w wykrywaniu gatunków Cryptosporidium i Giardia przenoszonych przez wodę zgodnie z metodą EPA 1623.

Zmodyfikowana metoda EPA 1623 wykorzystująca ultrafiltrację przezroświećną z przepływem stycznym oraz etapy dysocjacji termicznej do wykrywania wodnych Cryptosporidium i Giardia spp.

Opracowano podejście do identyfikacji optymalnych warunków koncentracji wirusa dla małych objętości próbek wody przy użyciu kolców ludzkiego adenowirusa. Opisane tutaj techniki są wykorzystywane do identyfikacji parametrów stężenia dla innych celów wirusowych i stosowane do eksperymentów z stężeniem wirusa na dużą skalę.

Procedura małej objętości do pomiaru stężenia wirusa z wody

Metoda EPA 1615 wykorzystuje filtr elektrododatni do koncentracji enterowirusów i norowirusów w środowisku i wodach pitnych. Niniejszy manuskrypt opisuje procedurę pobierania próbek do analiz metodą 1615.

Metoda EPA 1615. Pomiar występowania enterowirusów i norowirusów w wodzie za pomocą hodowli i RT-qPCR. I. Pobieranie próbek wirusów

Pokazano metodę opartą na żywicy anionowymiennej, dostosowaną do pobierania próbek wirusów z bioaerozolu na bazie płynnych uderzeń. W połączeniu z detekcją molekularną, metoda ta pozwala na łatwe i czułe wykrywanie wirusów w bioaerozolach.

Wykrywanie wirusów w bioaerozolach za pomocą żywicy anionowymiennej

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Liczne nowe sekwencje wirusopodobne zostały znalezione u komarów dzięki szerokiemu zastosowaniu technologii sekwencjonowania. Zapewniamy skuteczną procedurę izolacji i amplifikacji wirusów przy użyciu linii komórkowych kręgowców i komarów, która może posłużyć jako podstawa do przyszłych badań nad wirusami związanymi z komarami, w tym wirusami przenoszonymi przez komary i specyficznymi dla komarów.

Izolacja wirusa związanego z komarami od komarów zebranych na polu

Stężenie wirusa z próbek wody i ścieków środowiskowych jest trudnym zadaniem, przeprowadzanym głównie w celu identyfikacji i kwantyfikacji wirusów. Chociaż opracowano i przetestowano kilka metod koncentracji wirusów, tutaj wykazujemy skuteczność ultrafiltracji i flokulacji mleka odtłuszczonego dla wirusów RNA z różnymi typami próbek.

Zagęszczenie cząstek wirusa w próbkach wody i ścieków środowiskowych przy użyciu flokulacji mleka odtłuszczonego i ultrafiltracji

W tym miejscu opisano metody pobierania próbek ze stref eufotowych ekosystemów morskich i słodkowodnych w celu wyizolowania cyjanofagów (i ich gospodarzy) oraz procesy po pobraniu próbek, które wzbogacają pojedyncze genotypy i charakteryzują dynamikę interakcji wirus-gospodarz.

Pobieranie próbek środowiskowych mikroorganizmów fotosyntetycznych i ich wirusów: od terenu do laboratorium

Przedstawiamy tutaj badanie mające na celu ocenę skuteczności przeciwwirusowej powłok powierzchniowych na filtrach powietrza na bazie miedzi i srebra. Korzystając z komory bioaerozolowej i bakteriofaga Phi6, ta metoda mierzy nieaktywację wirusów i efektywność mechanicznej filtracji dla samoczyszczących technologii czyszczenia powietrza wewnętrznego.

Ocena wpływu pokrytych filtrów i filtrów wstępnych na zakaźność i stężenie aerozolu zawierającego wirusa Phi6

Naucz się konstruować filtry z waty szklanej do koncentracji wirusów, bakterii i pierwotniaków z dużych objętości wody. Ta ekonomiczna metoda umożliwia skuteczną detekcję patogenów przenoszonych drogą wodną w badaniach mikrobiologicznych.

Filtry z wełny szklanej do zagęszczania wirusów przenoszonych przez wodę oraz rolniczych patogenów odzwierzęcych

Przeglądaj więcej filmów