Name: Badanie roli tkanki limfatycznej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: Poznaj metody badania roli tkanki limfatycznej NALT w odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki donosowe. Wykorzystaj model chirurgiczny i hodowle ex vivo do analizy lokalnej i ogólnoustrojowej odpowiedzi humoralnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wsparcie zapewniła firma Becton Dickinson Technologies. Poglądy wyrażone w niniejszym opracowaniu są opiniami autorów i nie mają na celu odzwierciedlenia oficjalnej polityki rządu USA. Badania zostały przeprowadzone zgodnie z ustawą Animal Welfare Act oraz innymi federalnymi statutami i przepisami dotyczącymi zwierząt i eksperymentów z udziałem zwierząt, a także zgodnie z zasadami określonymi w Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, National Research Council, 1996. Placówka, w której przeprowadzono te badania, posiada pełną akredytację Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International.

1. Pobieranie i hodowla NALT
<ol>
	<li>Uśmierć myszy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT. Przenieś myszy do aseptycznego stanowiska pracy lub komory bezpieczeństwa biologicznego. Usuń dolną szczękę myszy i oczyść obszar podniebienia twardego za pomocą gazików nasączonych alkoholem i jodyną.</li>
	<li>Używając skalpela z ostrzem nr 11 w uchwycie chirurgicznym, ostrożnie przetnij i wyciśnij podniebienie twarde, prowadząc cięcie wzdłuż wewnętrznego obrysu siekaczy i zębów trzonowych myszy.</li>
	<li>Delikatnie odchyl podniebienie pęsetą, uważając, aby go nie przerwać.</li>
	<li>Krok ten jest niezbędny w celu zmniejszenia kontaminacji kultur i jest przeznaczony do przetwarzania wielu próbek podniebienia. Umieść podniebienia w oddzielnych dołkach w pierwszej kolumnie sterylnej płytki 48-dołkowej, uprzednio wypełnionej 250 μL kompletnej pożywki hodowlanej (37 °C), składającej się z RPMI 1640 uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 μg/mL streptomycyny, 100 UI/mL penicyliny, 50 μg/mL gentamycyny i 1 μg/mL fungizone/amfoterycyny. Pożywka powinna być buforowana węglanami, jeśli podniebienia są hodowane w inkubatorze z 5% CO2/95% wilgotnego powietrza (37 °C), lub alternatywnie należy zastosować 10 mM HEPES pH 7.4 w przypadku hodowli bez CO2.</li>
	<li>Aby wypłukać podniebienia, przenieś je pęsetą do kolejnych dołków w rzędzie, ostrożnie opukując płytkę pomiędzy płukaniami, aż podniebienie zostanie poddane łącznie ośmiu płukaniom.</li>
	<li>Przenieś podniebienia do nowej sterylnej płytki 48-dołkowej zawierającej w dołkach 250 μL świeżej, kompletnej pożywki hodowlanej (37 °C).</li>
	<li>Umieść płytki z podniebieniami w inkubatorze 37 °C na czas trwania badania.</li>
	<li>Pobieraj próbki do analizy poprzez aseptyczne przeniesienie 100 μL pożywki z dołków hodowlanych do probówek Eppendorf co 24 godziny, zastępując je 100 μL świeżej pożywki hodowlanej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Wiruj próbki pożywek hodowlanych przy 380 x g przez 10 minut w 4 °C, aby osadzić zanieczyszczenia.</li>
	<li>Przenieś nadsącz z odwirowanej próbki do nowych probówek Eppendorf i przechowuj w -20 °C do momentu analizy.</li>
	<li>Antygenowo specyficzne IgG, IgM i IgA lub wydzielane cytokiny są mierzone w nadsączach z hodowli tkankowych za pomocą standardowych testów immunoenzymatycznych (ELISA).</li>
</ol>
2. Chirurgiczna ablacja NALT
<ol>
	<li>Odpowiednimi obiektami badawczymi są samice myszy BALB/c w wieku od 7 do 9 tygodni, choć dopuszczalne są również inne szczepy. Na trzy dni przed operacją należy podawać żelową mokrą karmę, aby przyzwyczaić mysz do zamiennika pokarmu i wody, który będzie podawany po zabiegu.</li>
	<li>Przed operacją należy podać do jamy ustnej jedną kroplę leku przeciwbólowego Metacam (1,5 mg/ml lub 0,05 mg/kropla).</li>
	<li>Myszy należy znieczulić zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC, na przykład mieszanką ketaminy, acepromazyny i ksylazyny (KAX), a na oczy nałożyć maść Puralube Vet, aby zapobiec ich wysychaniu. Należy unikać stosowania anestetyków inhalacyjnych, które mogą wpływać na NALT. Znieczulenie można potwierdzić brakiem reakcji odruchowej na delikatne uciśnięcie palców u stóp.</li>
	<li>Aby zapobiec potencjalnemu odwodnieniu myszy po operacji, należy podskórnie wstrzyknąć 1 mL soli fizjologicznej (0,9% sodium chloride injection USP) między łopatki za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22-28 G. Należy również podać podskórnie między łopatki 0,1 mL preparatu Respiram za pomocą strzykawki z igłą o rozmiarze 22-28 G, aby wspomóc prawidłową czynność oddechową w trakcie i po operacji.</li>
	<li>Podczas wszystkich kolejnych czynności należy zapewnić myszy wsparcie termiczne.</li>
	<li>Znieczuloną mysz należy ułożyć na plecach i za pomocą dwóch oddzielnych pętli nici chirurgicznej wokół górnych i dolnych siekaczy delikatnie rozewrzeć pysk, odsłaniając podniebienie twarde.</li>
	<li>Za pomocą skalpela nr 11 należy wykonać nacięcie o długości około 3 mm wzdłuż linii środkowej podniebienia twardego w miejscu położenia NALT.</li>
	<li>Do nacięcia należy wprowadzić mikrokuretkę o rozmiarze 0,5 mm i delikatnie zeskrobać tkankę pod krawędziami, aby uszkodzić NALT.</li>
	<li>Nacięcie należy przyżegać w celu zatamowania krwawienia, używając prostej, cienkiej pętli w urządzeniu do kauteryzacji termicznej.</li>
	<li>Należy kontynuować wsparcie termiczne, dopóki mysz nie odzyska pełnej świadomości i aktywności.</li>
	<li>W razie potrzeby, aby zapobiec odwodnieniu, należy podawać myszy sól fizjologiczną podskórnie do trzech razy dziennie (1 mL na wstrzyknięcie między łopatki), a raz dziennie przez 3 dni po operacji podawać doustny lek przeciwbólowy. Odwodnienie należy oceniać, wykonując test fałdu skórnego w celu sprawdzenia turgoru skóry. Należy chwycić skórę i futro między łopatkami tak, aby utworzył się fałd. Jeśli skóra szybko wraca do pierwotnej pozycji, mysz nie jest odwodniona. Jeśli skóra pozostaje uniesiona i powoli wraca na miejsce, mysz znajduje się w stanie odwodnienia i wymaga podania soli fizjologicznej. Przez co najmniej trzy dni po operacji należy podawać mokrą karmę, aby zapewnić wystarczający czas na rekonwalescencję.</li>
	<li>Przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur eksperymentalnych należy obserwować myszy przez 8-10 dni, monitorując przyrost masy ciała. Słabe odzyskiwanie masy ciała zazwyczaj wskazuje na niepełne zagojenie podniebienia; takie myszy należy wykluczyć z dalszych badań.</li>
</ol>
3. Przygotowanie NALT do badania histologicznego i ocena powodzenia operacji NALT
<ol>
	<li>Powodzenie operacji NALT musi zostać potwierdzone histologicznie zgodnie z poniższym opisem. Po zakończeniu wszystkich badań eksperymentalnych przygotować myszy do pobrania tkanek czaszkowych, przeprowadzając eutanazję zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT.</li>
	<li>Chwycić mysz za kark. Usunąć dolną szczękę z reszty czaszki, przecinając nożyczkami wyrostki kłykowe po obu stronach.</li>
	<li>Zaczynając od karku, usunąć skórę i futro z czaszki, powoli oddzierając i wycinając je w kierunku strony brzusznej czaszki.</li>
	<li>Ostrożnie usunąć skórę wokół obszaru nosa i odciąć skórę z czubka pyska, aby całkowicie ją usunąć.</li>
	<li>Oddzielić czaszkę od kręgów za pomocą nożyczek.</li>
	<li>Wprowadzić nożyczki do foramen magnum i przeciąć czaszkę wzdłuż linii środkowej do połowy, aby umożliwić przenikanie formaliny do tkanek miękkich podczas utrwalania.</li>
	<li>Utrwalić czaszkę w 10% neutralnym buforowanym formalinie (NBF) przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>W celu dekalcyfikacji umieścić próbkę i osobną kasetkę, owiniętą gazą, aby zapobiec stykaniu się Rexynu z kością, w butelce z mieszaniną kwasu mrówkowego. Inkubować przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, a następnie płukać stale pod bieżącą wodą przez około 20 minut.</li>
	<li>Przyciąć próbkę do przegrody nosowej i poza oczodołami za pomocą żyletki.</li>
	<li>Próbkę i kasetkę można przechowywać krótkoterminowo w 10% NBF.</li>
	<li>Umieścić próbkę w procesorze tkanek na nocne przetwarzanie. Ma to na celu usunięcie wody z próbki w przygotowaniu do zatapiania w parafinie.</li>
	<li>Wyjąć przetworzoną tkankę, zatopić w bloku parafiny z pyskiem skierowanym w dół i pozostawić do ostygnięcia.</li>
	<li>Wyciąć automatycznym mikrotomem przybliżone przekroje poprzeczne o grubości 15 μm, zbliżając się do przybliżonej lokalizacji NALT, a następnie kontynuować cięcie w sekcjach o grubości 5 μm w celu naniesienia na szkiełka w kąpieli wodnej o temperaturze 44,3 °C.</li>
	<li>Do oceny ablacji NALT należy zastosować barwienie histologiczne hematoksyliną i eozyną (H&amp;E).</li>
</ol>
4. Pobieranie próbek biologicznych od myszy
4.1 Surowica
<ol>
	<li>Ostrożne podniesienie temperatury ciała za pomocą lampy grzewczej zwiększy przepływ krwi. Krew należy pobrać, wykonując nacięcie bocznej żyły ogonowej za pomocą skalpela chirurgicznego. Pozostawić krew, aby swobodnie ściekała do probówki Microtainer z separatorem serum.</li>
	<li>Miejsce nacięcia należy lekko ucisnąć materiałem chłonnym, takim jak gaza lub ręcznik, aby zatamować krwawienie.</li>
	<li>Krew pozostawić do skrzepnięcia w probówkach Microtainer na 30 minut, a następnie wirować w zakresie 6-15 x 1 000 g przez co najmniej 90 sekund.</li>
	<li>Oddzielone serum przenieść z probówki Microtainer do czystej probówki Eppendorf w celu przechowywania w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
4.2 Ślina
<ol>
	<li>Trzymając znieczuloną mysz w pozycji pionowej, pipetować 20-30 μL sterylnego roztworu soli fosforanowej (PBS) pomiędzy policzek a linię dziąseł. Zebrać rozcieńczoną ślinę, kierując końcówkę pipety pomiędzy policzek a linię dziąseł.</li>
	<li>Przenieść rozcieńczoną ślinę do nowej probówki zawierającej 10 μL 2x inhibitora proteaz i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4.3 Wydzielina z nosa
<ol>
	<li>Poddać mysz eutanazji przed pobraniem wydzieliny z nosa, zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC. Należy unikać stosowania anestetyków wziewnych, które mogą wpływać na NALT.</li>
	<li>Trzymając mysz w pozycji pionowej, ostrożnie pipetować 30 μL sterylnego PBS do jednego otworu nosowego i zebrać płukanie z drugiego otworu nosowego.</li>
	<li>Przenieść płukanie do nowej probówki zawierającej 10 μL 2x inhibitora proteaz i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
4.4 Wydzielina pochwy
<ol>
	<li>Wprowadź końcówkę mikropipety do otworu sromu u uśpionej myszy, wypłucz pochwę 50 μL sterylnego PBS i pobierz cały płyn za pomocą mikropipety.</li>
	<li>Przenieś płyn z płukania do nowej probówki zawierającej 10 μL inhibitora proteaz 2x i przechowuj w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
5. Przeciwciała swoiste dla antygenu lub cytokiny w zebranych próbkach można zmierzyć za pomocą metody ELISA lub innej metody ilościowej.
6. Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1 przedstawia ogólny schemat etapów przetwarzania tkanki zawierającej NALT do analizy ex vivo. Na Rysunku 2 (A, B) pokazano wielkość podniebienia oraz miejsce nacięcia podczas operacji ablacji (A), oznaczone linią przerywaną. Lokalizacja NALT została wskazana strzałkami w obszarze przedtrzonowców na wyciętym i barwionym hematoksyliną podniebieniu na Rysunku 2 (C), co obrazuje równoległe tkanki.
Rycina 3 przedstawia etapy operacji uszkodzenia NALT, pokazując odsłonięcie podniebienia twardego w celu uzyskania dostępu do NALT (A, B), ablację (C) oraz końcową kauteryzację nacięcia (D). Przekrój poprzeczny obszaru zatok nosowych otaczających NALT przed operacją, wykonany metodą H &amp; E, przedstawiono na Rycini 3E, natomiast obraz uszkodzenia NALT mikrokuretką bezpośrednio po operacji widoczny jest na Rycinie 3F. Po zapewnieniu odpowiedniego czasu na rekonwalescencję pooperacyjną nacięcia powinny być zamknięte, a jama nosowa pozbawiona NALT (Rycina 3G).
Typowe wyniki eksperymentalne uzyskane przy użyciu tych technik przedstawiono na Rysunku 4, porównując nadsączki z hodowli tkankowych i próbki biologiczne z badania nad szczepionką podjednostkową przeciwko gronkowcowi (STEBVax). Myszy otrzymały STEBVax drogą donosową (IN) lub dosytnieniową (IP). Szczepionka została sformułowana z adiuwantem aktywującym szlak receptora Toll-podobnego 43,14, a grupom kontrolnym podano wyłącznie sól fizjologiczną lub szczepionkę bez adiuwantu. Hodowle NALT uzyskane z grup eksperymentalnych wydzielały do pożywki swoiste dla antygenu immunoglobuliny, które można było zmierzyć za pomocą testu ELISA. W tym przykładzie (Rysunek 4A) wyniki wskazują, że największe ilości IgA były uwalniane przez NALT uzyskane od myszy szczepionych donosowo szczepionką podjednostkową w połączeniu z adiuwantem.
Próbki biologiczne (takie jak surowica, ślina, wydzieliny z nosa, wydzieliny z pochwy) pobrane od myszy kontrolnych lub pozbawionych NALT można wykorzystać do profilowania odpowiedzi immunologicznej in vivo na antygeny nosowe w celu porównania z wynikami hodowli tkankowych. Na Rysunku 4B odpowiedzi IgA i IgG na szczepienie donosowe były znacznie obniżone w przypadku braku funkcjonalnej tkanki NALT. Poziomy swoistych dla antygenu IgA były zazwyczaj wyższe niż IgG w wydzielinach błon śluzowych (ślina, płukanie nosa) u myszy zaszczepionych.
<img alt="Schemat przygotowania tkanki podniebienia myszy; technika sterylna; hodowla tkankowa; proces wirowania." src="/files/ftp_upload/3960/3960fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Schemat pobierania NALT i hodowli ex vivo.
<img alt="Anatomia języka myszy; obrazy sekcji, pomiaru i barwienia histologicznego do celów badawczych." src="/files/ftp_upload/3960/3960fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Wizualizacja podniebienia myszy z zaznaczeniem położenia NALT oraz nacięcia chirurgicznego. Wielkość i lokalizacja górnego podniebienia z nacięciem chirurgicznym zaznaczonym linią przerywaną (A); wycięte górne podniebienie (B) lub barwione hematoksyliną (C) w celu uwidocznienia równoległego NALT w obszarze przedtrzonkowym podniebienia (zbarwione na ciemnofioletowo po stronie przedniej podniebienia). NALT wskazano strzałkami.
<img alt="Procedura ekstrakcji zęba u zwierzęcia, obrazy histologiczne, chirurgia stomatologiczna, analiza tkanek." src="/files/ftp_upload/3960/3960fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Chirurgiczne przerwanie NALT. Kluczowe etapy operacji przerwania NALT: widok podgrzbietowy podniebienia górnego myszy przed operacją (A); nacięcie w linii środkowej podniebienia górnego w celu uzyskania dostępu do NALT (B); wprowadzenie mikrokyrety przez nacięcie w linii środkowej w celu naruszenia integralności struktury NALT (C); kauteryzacja nacięcia po zakończeniu operacji (D). Obrazy mikroskopowe jam nosowych, barwienie H&amp;E, przed operacją (E); bezpośrednio po operacji (F); oraz mysz z pomyślnie zagojoną raną, pozbawiona NALT (G).
<img alt="Wykresy słupkowe absorbancji przeciwciał IgA, analiza odpowiedzi immunologicznej, porównanie danych z nosa i śliny." src="/files/ftp_upload/3960/3960fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Przeciwciała specyficzne dla szczepionki z hodowli NALT, śliny i wydzieliny z nosa pobranych od szczepionych myszy. Myszy kontrolne z usuniętą tkanką NALT lub myszy prawidłowe zostały zaszczepione drogą donosową (IN) lub dosytroniczną (IP) STEBVax, a następnie pobrano próbki biologiczne. Poziomy przeciwciał w próbkach wykonanych w trzech powtórzeniach zmierzono za pomocą testu ELISA. (A) Tkankę NALT usunięto z myszy kontrolnych (brak manipulacji chirurgicznych) i poddano hodowli w celu zbadania odpowiedzi przeciwciał. Odpowiedź IgA specyficzna dla szczepionki w hodowli dla myszy szczepionych drogą IN była statystycznie różna od grupy kontrolnej (test t Studenta, p ≤ 0.01, w porównaniu do braku adiuwantu lub braku szczepionki). (B) Usunięcie NALT znacznie zredukowało specyficzne odpowiedzi przeciwciał po szczepieniu drogą IN. Wystąpiły istotne różnice między poziomami specyficznych przeciwciał w grupach NALT- i NALT+ (brak operacji lub operacja kontrolna) we wszystkich porównaniach z wyjątkiem wyników dla IgG w ślinie (test t Studenta, p≤ 0.05).

<ol><li>Wiley, J. A., Tighe, M. P., Harmsen, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upper+respiratory+tract+resistance+to+influenza+infection+is+not+prevented+by+the+absence+of+either+nasal-associated+lymphoid+tissue+or+cervical+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Upper respiratory tract resistance to influenza infection is not prevented by the absence of either nasal-associated lymphoid tissue or cervical lymph nodes.</a> J. Immunol. 175, 3186-3196 (2005).</li>
<li>W, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intranasal+immunisation+with+conjugate+vaccine+protects+mice+from+systemic+and+respiratory+tract+infection+with+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Intranasal immunisation with conjugate vaccine protects mice from systemic and respiratory tract infection with Pseudomonas aeruginosa.</a> Vaccine. 24, 4333-4342 (2006).</li>
<li>Fernandez, S., Cisney, E. D., Hall, S. I., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+immunity+to+staphylococcal+toxic+shock+is+controlled+by+the+nasopharynx-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal immunity to staphylococcal toxic shock is controlled by the nasopharynx-associated lymphoid tissue.</a> Clin. Vaccine Immunol. 18, 667-675 (2011).</li>
<li>Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+mouse+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of mouse nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. Methods. 202, 123-131 (1997).</li>
<li>Casteleyn, C., Broos, A. M., Simoens, P., Van den Broeck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT+%28nasal+cavity-associated+lymphoid+tissue%29+in+the+rabbit%5BTitle%5D)+AND+%22Vet.+Immunol.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">NALT (nasal cavity-associated lymphoid tissue) in the rabbit.</a> Vet. Immunol. Immunopathol. 133, 212-218 (2010).</li>
<li>Debertin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29%3A+frequency+and+localization+in+young+children%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue (NALT): frequency and localization in young children.</a> Clin. Exp. Immunol. 134, 503-507 (2003).</li>
<li>Csencsits, K. L., Jutila, M. A., Pascual, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+phenotypic+and+functional+evidence+for+the+primary+role+of+peripheral+node+addressin+in+na%C3%AFve+lymphocyte+adhesion+to+high+endothelial+venules+in+a+mucosal+site%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue: phenotypic and functional evidence for the primary role of peripheral node addressin in naïve lymphocyte adhesion to high endothelial venules in a mucosal site.</a> J. Immunol. 163, 1382-1389 (1999).</li>
<li>Zuercher, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal-associated+lymphoid+tissue+is+a+mucosal+inductive+site+for+virus-specific+humoral+and+cellular+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nasal-associated lymphoid tissue is a mucosal inductive site for virus-specific humoral and cellular immune responses.</a> J. Immunol. 168, 1796-1803 (2002).</li>
<li>Park, H. S., Francis, K. P., Yu, J., Cleary, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membranous+cells+in+nasal-associated+lymphoid+tissue%3A+a+portal+of+entry+for+the+respiratory+mucosal+pathogen+group+A+streptococcus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membranous cells in nasal-associated lymphoid tissue: a portal of entry for the respiratory mucosal pathogen group A streptococcus.</a> J. Immunol. 171, 2532-2537 (2003).</li>
<li>Tyrer, P., Foxwell, A. R., Cripps, A. W., Apicella, M. A., Kyd, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+pattern+recognition+receptors+mediate+M-cell+uptake+of+a+gram-negative+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Microbial pattern recognition receptors mediate M-cell uptake of a gram-negative bacterium.</a> Infect. Immun. 74, 625-631 (2006).</li>
<li>Wu, A. W., Russell, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+lymphoid+tissue%2C+intranasal+immunization%2C+and+compartmentalization+of+the+common+mucosal+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Res%22%5BJournal%5D)">Nasal lymphoid tissue, intranasal immunization, and compartmentalization of the common mucosal immune system.</a> Immunol. Res. 16, 187-201 (1997).</li>
<li>Harmsen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+organogenesis+of+nasal-associated+lymphoid+tissue+%28NALT%29+occurs+independently+of+lymphotoxin-alpha+%28LT+alpha%29+and+retinoic+acid+receptor-related+orphan+receptor-gamma%2C+but+the+organization+of+NALT+is+LT+alpha+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: organogenesis of nasal-associated lymphoid tissue (NALT) occurs independently of lymphotoxin-alpha (LT alpha) and retinoic acid receptor-related orphan receptor-gamma, but the organization of NALT is LT alpha dependent.</a> J. Immunol. 168, 986-990 (2002).</li>
<li>Rangel-Moreno, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+CXC+chemokine+ligand+13%2C+CC+chemokine+ligand+%28CCL%29+19%2C+and+CCL21+in+the+organization+and+function+of+nasal-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Role of CXC chemokine ligand 13, CC chemokine ligand (CCL) 19, and CCL21 in the organization and function of nasal-associated lymphoid tissue.</a> J. Immunol. 175, 4904-4913 (2005).</li>
<li>Morefield, G. L., Hawkins, L. D., Ishizaka, S. T., Kissner, T. L., Ulrich, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+Toll-like+receptor+4+agonist+enhances+vaccine+efficacy+in+an+experimental+model+of+toxic+shock+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Synthetic Toll-like receptor 4 agonist enhances vaccine efficacy in an experimental model of toxic shock syndrome.</a> Clin. Vaccine Immunol. 14, 1499-1504 (2007).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Przedstawiliśmy zbiorcze metody opracowania modelu zwierzęcego, pobierania próbek biologicznych oraz testy służące do badania odpowiedzi immunologicznych związanych z NALT1-4. Podczas wykonywania tych metod należy wziąć pod uwagę dodatkowe czynniki. Należy stosować standardowe techniki sterylne podczas operacji i hodowli tkankowej. Ryzyko kontaminacji zostanie zredukowane dzięki zastosowaniu kombinacji środków przeciwbakteryjnych i przeciwgrzybiczych podczas izolacji i hodowli, a także poprzez utrzymywanie sterylności narzędzi, obszaru roboczego i zdezynfekowanych płytek. Próbki śliny, płukania nosa i podobne próbki wydzielin śluzowych powinny zostać sprawdzone pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia krwią, ponieważ przeciwciała surowicze występują zazwyczaj w wyższych stężeniach. Ponadto wydzieliny śluzowe powinny być jedynie lekko rozcieńczone do analizy, ponieważ w tych próbkach obecne są niższe stężenia przeciwciał w porównaniu do surowicy.
Myszy muszą być utrzymywane w cieple bezpośrednio po operacji, aby zapobiec potencjalnej hipotermii wywołanej przez znieczulenie. Podczas rekonwalescencji pooperacyjnej należy na zmianę układać odpoczywające myszy na bokach, aby zminimalizować ryzyko nieregularnego oddychania. Procedura chirurgiczna jest bardziej efektywna, gdy zadania te wykonuje trzy osoby: jedna przeprowadzająca operację, jedna pomagająca w utrzymaniu otwartego pyska oraz jedna zapewniająca opiekę pooperacyjną podczas wybudzania się myszy z narkozy.
Po zakończeniu wszystkich procedur eksperymentalnych lub badań konieczne jest przeprowadzenie barwienia H&amp;E przekrojów poprzecznych czaszki, aby zweryfikować powodzenie operacji u każdej myszy. Możliwe wyniki operacji to: całkowita i obustronna ablacja NALT, niepełna ablacja lub nienaruszony NALT. Ponieważ nie wszystkie operacje zakończą się całkowitą utratą NALT, zwierzęta z resztkowym lub nienaruszonym NALT mogą służyć jako kontrole wewnętrzne. Innym potencjalnym wynikiem jest brak całkowitego zagojenia podniebienia, co pozostawia otwór łączący jamę nosową z jamą ustną. Niepełne zagojenie podniebienia spowoduje niską masę ciała i zahamowanie wzrostu, a takie osobniki powinny zostać wykluczone z badań.
Badanie odpowiedzi na szczepionkę w pierwszej kolejności w modelu mysim posłuży do ustalenia roli NALT w zamierzonym wyniku badania (odpowiedź przeciwciał, przeżywalność itp.). Chirurgiczne usunięcie NALT ułatwia określenie wkładu dróg nosowych w odporność miejscową i systemową. Opisane tutaj podejście chirurgiczne jest najbardziej bezpośrednią metodą uzyskania modelu mysiego pozbawionego NALT. Doniesiono, że niektóre wybrane modele myszy z nokautem nie posiadają NALT, jednak zwierzęta te wykazują również niedobory cytokin lub chemokin niezbędnych do rozwoju innych wtórnych tkanek limfatycznych i mogą posiadać dodatkowe wady12,13. Co więcej, metody opisane w niniejszej pracy zostały opracowane w celu zbadania kilku aspektów odpowiedzi immunologicznej powstającej w obrębie jam nosowych. Nasze wyniki eksperymentalne opierają się na badaniach z wykorzystaniem całego podniebienia twardego myszy do hodowli tkankowej, choć możliwe jest zastosowanie przekrojów. Wreszcie, model hodowlany NALT jest użyteczny do przeprowadzania eksperymentów w całości w hodowli tkankowej.

<table><tbody><tr><td>Sterylne chirurgiczne ostrza ze stali nierdzewnej, nr 11</td><td>Miltex</td><td>4-311</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela, nr 3</td><td>Miltex</td><td>4-7</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki do hodowli komórkowej</td><td>Costar</td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Invitrogen</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana ciepłem</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>16000-044</td><td>Stężenie końcowe: 10% objętościowo w pośrodku hodowlanym</td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td>Stężenie końcowe: 100 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Penicylina</td><td>Sigma</td><td>P7794</td><td>Stężenie końcowe: 100 UI/mL</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397-10ML</td><td>Stężenie końcowe: 50 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco/Invitrogen</td><td>15290-018</td><td>Stężenie końcowe: 1 &amp;mu;g/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td>Stężenie końcowe: 10 mM</td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>022364111</td><td></td></tr><tr><td>Mokra karma dla myszy Nutra-gel o smaku wiśniowym</td><td>Bio-Serve</td><td>S4798-TRAY</td><td></td></tr><tr><td>Metacam</td><td>Boehringer Ingelheim</td><td>601531000</td><td>Jedna kropla zawiesiny doustnej 1,5 mg/mL</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer</td><td>00856440301</td><td>Stężenie końcowe: 6,06 mg/mL</td></tr><tr><td>Acepromazyna</td><td>Vedco</td><td>VEDC207</td><td>Stężenie końcowe: 0,061 mg/mL</td></tr><tr><td>Ksylazyna</td><td>Lloyd</td><td>4811</td><td>Stężenie końcowe: 0,667 mg/mL</td></tr><tr><td>Maść weterynaryjna Puralube Vet</td><td>Pharmaderm Animal Health</td><td>1621</td><td></td></tr><tr><td>0,9% roztwór wstrzykiwalny chlorku sodu USP</td><td>Baxter</td><td>2B1302</td><td></td></tr><tr><td>Mikrokureta 0,5 mm</td><td>Roboz</td><td>RS-6350</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do kauteryzacji termicznej</td><td>Geiger</td><td>150-S/150A-S</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka zamienna TCU, pętla prosta, cienka</td><td>Geiger</td><td>214</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% neutralny bufor formaliny</td><td>Sigma</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Fisher</td><td>A119P-4</td><td>Wymieszać 426 mL kwasu mrówkowego z 1047 mL wody z kranu, a następnie dodać 45 mL Rexyn 101 (H)</td></tr><tr><td>Rexyn 101 (H)</td><td>Fisher</td><td>R231-500</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek VIP E150/E300</td><td>Sakura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom obrotowy</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Mayera</td><td>Sigma</td><td>MHS16-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hematoksylina Gilla nr 1</td><td>Sigma</td><td>GHS116</td><td></td></tr><tr><td>Eozyna B</td><td>Sigma</td><td>2853</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówka z separatorem surowicy Microtainer</td><td>BD Medical</td><td>365956</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td></td><td></td><td>100 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 140 mM NaCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>Koktajl inhibitorów proteaz, bez EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>78415</td><td></td></tr></tbody></table>

badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (nalt) w odpowiedziach myszy na szczepionki

Examining the Role of Nasopharyngeal-associated Lymphoreticular Tissue (NALT) in Mouse Responses to Vaccines

Tkanki limforetykularne związane z nosogardzielą (NALT), występujące u ludzi, gryzoni i innych ssaków, przyczyniają się do odporności w zatokach nosowych1-3. NALT to dwie równoległe struktury w kształcie dzwona, zlokalizowane w przewodach nosowych powyżej podniebienia twardego, zazwyczaj uznawane za wtórne komponenty układu limfatycznego związanego z błonami śluzowymi4-6. W obrębie NALT znajdują się odrębne przedziały limfocytów B i T, przeplatane dendrytycznymi komórkami prezentującymi antygen4,7,8. Komórki te są otoczone warstwą komórek nabłonkowych z przeplatającymi się komórkami M, które odpowiadają za wychwytywanie antygenów z powierzchni błon śluzowych dróg oddechowych9,10. Naiwne limfocyty krążące przez NALT są przygotowane do odpowiedzi na pierwsze spotkania z patogenami układu oddechowego7. Podczas gdy NALT zanikają u ludzi do drugiego roku życia, pierścień Waldeyera i podobnie zbudowane organy limfatyczne utrzymują się przez całe życie6. W przeciwieństwie do ludzi, myszy zachowują NALT przez całe życie, co czyni je wygodnym modelem zwierzęcym do badania odpowiedzi immunologicznych rozpoczynających się w zatokach nosowych11.
Hodowle zawiesin pojedynczych komórek NALT nie są praktyczne ze względu na niską wydajność komórek jednojądrowych. Biologię NALT można jednak badać poprzez hodowlę ex vivo całego narządu, a metoda ta ma dodatkową zaletę w postaci zachowania naturalnej struktury tkanki. W przypadku badań in vivo modele z nokautem genetycznym wykazujące defekty ograniczone do NALT nie są obecnie dostępne ze względu na słabo rozpoznany szlak rozwojowy. Na przykład, choć myszy z nokautem limfotoksyny-α mają zanikłe NALT, w tych genetycznie zmodyfikowanych myszach zmienione są również kępki Peyera, obwodowe węzły chłonne, komórki dendrytyczne pęcherzykowe i inne tkanki limfatyczne12,13. Jako alternatywa dla myszy z nokautem genowym, ablacja chirurgiczna trwale usuwa NALT z dróg nosowych bez wpływu na inne tkanki. Powstały model mysi był wykorzystywany do ustalenia zależności między NALT a odpowiedziami immunologicznymi na szczepionki1,3. Seryjne pobieranie surowicy, śliny, płukanek nosowych i wydzielin z pochwy jest niezbędne do ustalenia podstaw odpowiedzi gospodarza na szczepienie, natomiast odpowiedzi immunologiczne pochodzące bezpośrednio z NALT można potwierdzić za pomocą hodowli tkankowej. Poniższe procedury opisują operacje, hodowlę tkanek i pobieranie próbek niezbędne do zbadania lokalnych i systemowych humoralnych odpowiedzi immunologicznych na szczepienie donosowe (IN).

Opisano metody badania udziału tkanki chłonnej związanej z nosogardłem (NALT) w nosowych i systemicznych odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki podawane donosowo. Przedstawiamy procedurę chirurgiczną służącą do stworzenia modelu mysiego zależnego od NALT oraz hodowle ex vivo wyizolowanej tkanki NALT.

Badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki

Tkanki limfokinetyczne związane z nosogardzielą (NALT), występujące u ludzi, gryzoni i innych ssaków, przyczyniają się do odporności w zatokach nosowych1-3. ...

Celem niniejszej procedury jest zbadanie roli NALT (tkanki limfatyczno-siateczkowej związanej z nosogardłem) w nosowych i systemowych odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki podawane donosowo. Jest to realizowane poprzez badanie kultur ex vivo nienaruszonej tkanki NALT; w modelu mysim nienaruszoną tkankę NALT pobiera się, a następnie poddaje seryjnemu przemywaniu i oczyszczaniu. Następnie hoduje się tkanki i w określonych odstępach czasu pobiera ich alikwoty.Próbki te są wirowane, przechowywane, a następnie badane pod kątem wystąpienia odpowiedzi immunologicznej. Chirurgiczne usunięcie Nat z przewodów nosowych myszy jest przeprowadzane ostrożnie, aby nie uszkodzić otaczających tkanek. Po przeprowadzeniu eksperymentów na myszach poddanych zabiegowi, sukces operacji jest oceniany za pomocą badania histologicznego.Ostatecznie wyniki są wykorzystywane do oceny lokalnych i systemowych humoralnych odpowiedzi odpornościowych na szczepienie donosowe. Chociaż ścieżka rozwojowa null została opisana przynajmniej częściowo, modele mysie dla historii nulls oparte na pojedynczych nokautach genów nie są obecnie dostępne. Jako alternatywa dla pojedynczego nokautu genowego, ablacja chirurgiczna całkowicie usunęła null z przewodów nosowych, nie wpływając na żadną z tkanek.Ten model mysi był wykorzystywany do opisania zależności między alt a szczepionkami lub antygenami a odpornością miejscową i systemową. Choć metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat podstaw odpowiedzi gospodarza na szczepienia donosowe u myszy, można ją również zastosować do badania adiuwantów lub innych produktów farmaceutycznych, które mogą wpływać na odporność nosową. Wizualizacja tej metody jest kluczowa, ponieważ kroki chirurgiczne są powszechnie stosowane, lecz trudne, gdyż praca odbywa się na niewielkim obszarze z ograniczoną widocznością i w krótkim przedziale czasu niezbędnym do przeprowadzenia procedury w celu zachowania zdrowia zwierząt.Przed pobraniem wypełnienia pęcherzyka, wszystkie dołki płytki hodowlanej 48-dołkowej należy wypełnić 250 µL ogrzanego medium; analogicznie postępujemy w jednej kolumnie drugiej płytki 48-dołkowej. Obie płytki należy utrzymywać w cieple do momentu użycia. Mysz należy uśmiercić zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IACUC, stosując znieczulenie wstrzykiwane, a nie wziewne, w sterylnym obszarze roboczym. Aby pobrać wypełnienie pęcherzyka, należy najpierw usunąć dolną szczękę myszy.Następnie należy oczyścić obszar podniebienia twardego za pomocą gazików nasączonych alkoholem i jodyną, używając skalpela z ostrzem nr 11. Ostrożnie wyciąć i usunąć podniebienie twarde, prowadząc cięcie wzdłuż wewnętrznego obrysu siekaczy i zębów trzonowych myszy. Delikatnie odsunąć podniebienie za pomocą pęsety.Należy zachować ostrożność, aby nie rozerwać peletu. Każdy pelet należy zebrać do studni w pierwszej kolumnie płytki 48-dołkowej wypełnionej pożywką. Pelety należy przemyć, przenosząc je kolejno przez każdą studnię w rzędzie.Ostrożnie opukaj paletę pomiędzy kolejnymi etapami przemywania. Po ośmiokrotnym przemyciu przenieś palety do dołka wypełnionego medium w drugiej płytce. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C. Przez cały czas trwania badania, co 24 godziny, pobieraj z każdej hodowli próbkę 100 µL medium.Przed powrotem płytki do inkubatora należy zastąpić medium 100 µL świeżego, ogrzanego medium hodowlanego. Próbki medium hodowlanego należy odwirować, aby sfragmentować osad. Należy przenieść nadsącz do nowych probówek i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu przeprowadzenia testu ELISA dla wszystkich próbek.Aby oznaczyć swoiste przeciwciała IgG, IgM i IgA lub wydzielane cytokiny, przez trzy dni przed operacją podawaj myszom w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni żelową karmę mokrą, aby przyzwyczaić je do zamiennika pokarmu i wody podawanego po zabiegu, przed przeprowadzeniem znieczulenia. Myszy w wieku od siedmiu do dziewięciu tygodni otrzymają lek przeciwbólowy podany do jamy ustnej. Znieczul myszy zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi IUC.Należy nałożyć maść para lube veto na oczy, a następnie powtórzyć tę czynność. Nie należy stosować anestetyków wziewnych, gdy zwierzę przestaje reagować na uciśnięcie palca u nogi; należy podać jeden mililitr soli fizjologicznej podskórnie między łopatkami za pomocą igły o rozmiarze od 22 do 28 G. Zapobiega to potencjalnemu odwodnieniu myszy po operacji; w ten sam sposób należy podać 0,1 mililitra ream podskórnie między łopatkami.Sprzyja to prawidłowej wentylacji w trakcie i po operacji. Umieść mysz w pozycji grzbietowej, zapewniając wsparcie termiczne. Utrzymuj wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu.Delikatnie rozewrzyj pysk, używając dwóch oddzielnych pętli nici chirurgicznych wokół górnych i dolnych siekaczy, aby odsłonić podniebienie twarde. Użyj ostrza chirurgicznego nr 11, aby wykonać nacięcie o długości około 3 mm wzdłuż linii środkowej górnego podniebienia w miejscu występowania K.Następnie wprowadź mikuretaż o średnicy 0,5 mm i delikatnie zeskrob tkankę pod obiema krawędziami nacięcia, aby przerwać knut. Używając prostej, cienkiej pętli w urządzeniu do kauteryzacji termicznej, zamykaj nacięcie, aby zatamować krwawienie po kauteryzacji.Pozostaw mysz na podkładce termicznej do czasu pełnego odzyskania przytomności. Przez kolejne trzy dni wstrzykuj myszy 1 ml soli fizjologicznej, aby zapobiec odwodnieniu.Aby ocenić poziom nawodnienia, należy przeprowadzić test fałdu skórnego w celu sprawdzenia turgoru skóry. W razie potrzeby czynność tę należy powtarzać do trzech razy dziennie. Podobnie, należy podawać doustne leki przeciwbólowe raz na dobę.Mokrą karmę należy podawać przez co najmniej trzy dni przed przystąpieniem do jakichkolwiek procedur eksperymentalnych. Myszy należy obserwować przez od 8 do 10 dni, monitorując przyrost ich masy ciała. Słaba regeneracja masy ciała zazwyczaj wskazuje na niepełne gojenie się podniebienia; takie zwierzęta należy wykluczyć z dalszych badań.Sukces operacji należy potwierdzić badaniem histologicznym. Po zakończeniu eksperymentu mysz należy uśmiercić zgodnie z wcześniej opisaną procedurą, a następnie dopełnić procesu poprzez zwichnięcie stawów szyjnych. Następnie należy oddzielić dolną szczękę od reszty czaszki, przecinając wyrostki kłykciowe nożyczkami.Powtórz tę czynność po obu stronach. Zaczynając od karku, usuń skórę i futro z czaszki, powoli odwarstwiając i wycinając je w kierunku strony brzusznej czaszki. Ostrożnie usuń skórę z okolic nosa.Następnie odetnij skórę z koniuszka pyska i całkowicie ją usuń. Teraz oddziel czaszkę od kręgów za pomocą nożyczek. Wprowadź nożyczki do otworu wielkiego czaszki i przetnij czaszkę wzdłuż linii środkowej do połowy jej długości.Pozwala to na przenikanie forminy do tkanek miękkich podczas utrwalania. Utrwal czaszkę w 10% neutralnym buforowanym formalinie przez 24 godziny. Następnego dnia, w temperaturze pokojowej, odwapnij próbkę, umieszczając ją w kasecie, owijając kasetę gazą i wkładając ją do butelki z mieszaniną kwasu mrówkowego.Inkubować próbkę przez 12 godzin w temperaturze pokojowej po upływie 12 godzin. Oczyścić próbkę, płucząc ją pod bieżącą wodą przez 20 minut. Za pomocą żyletki przyciąć próbkę do przegrody i przejść przez oczodoły. Do krótkotrwałego przechowywania próbkę i kasetkę można trzymać w 10% NBF.Podczas zatapiania należy upewnić się, że koniec ssam jest zatopiony w parafinie, a koniec kasety znajduje się na górze, po stronie oczodołu. Następnie należy kontynuować wypełnianie górnej części kasety parafiną i pozostawić ją do ostygnięcia przed umieszczeniem w mikrotomie. Po przygotowaniu należy przeprowadzić standardowe badanie histologiczne.Wykonaj pięciomikronowe przekroje poprzeczne pyska i zastosuj barwienie h i d. Potwierdzenie ablacji węzła za pomocą badania histologicznego jest niezbędne do interpretacji wyników i powinno nastąpić po pomyślnym zakończeniu każdego eksperymentu. Brak skupisk komórek jednojądrowych po stronie alt świadczy o pomyślnym przeprowadzeniu ablacji.Przekrój poprzeczny obszaru zatoki nosowej wokół knt barwiony H&amp;E zazwyczaj przedstawia skupiska komórek zjądrzastych otoczone warstwą komórek nabłonkowych. Po operacji powinno być widoczne wyraźne przerwanie ciągłości podniebienia twardego, a także naruszenie integralności nat. Po rekonwalescencji pooperacyjnej nacięcie powinno być zamknięte, a jama nosowa wolna od nat. Myszy otrzymują szczepionkę STX sformułowaną z adiuwantem aktywującym receptor Toll-podobny 4.Kontrole szlaku otrzymywały wyłącznie sól fizjologiczną lub szczepionkę bez adiuwanta w hodowli. NALT uzyskany z grup eksperymentalnych wydzielał do medium swoiste dla antygenu immunoglobuliny, które można było zmierzyć za pomocą testu ELISA. Porównanie dwóch dróg podania szczepionki wykazało, że największe ilości IgA były uwalniane przez NALT uzyskany od myszy szczepionych donosowo szczepionką podjednostkową.W połączeniu z dodatkowymi próbkami biologicznymi pobranymi od myszy kontrolnych lub pozbawionych MALT, można je wykorzystać do profilowania in vivo odpowiedzi immunologicznej na antygeny nosowe. W porównaniu z wynikami kultur tkankowych, odpowiedzi IgA i IgG na szczepienie donosowe były znacząco obniżone bez funkcjonalnych poziomów MALT; poziomy IgA specyficznych dla antygenu były zazwyczaj wyższe niż poziomy IgG w wydzielinach śluzowych zaszczepionych myszy. Po opanowaniu techniki, pobieranie i hodowla węzłów mogą zostać ukończone w około 30 minut dla jednego węzła, wliczając w to pobranie w jednym punkcie czasowym po 24 godzinach.Przy prawidłowym wykonaniu wykwalifikowany pracownik może zebrać i hodować kilka nat w ciągu jednego dnia. Skrobanie pod podniebieniem musi być wystarczające, aby usunąć nat. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, aby uniknąć utraty krwi.Pozwoli to na wyraźną wizualizację nacięcia i utrzymanie zwierząt w dobrym stanie zdrowotnym. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak badać wkład tkanki limfatycznej błony śluzowej myszy w lokalne i systemowe odpowiedzi immunologiczne po szczepieniu donosowym.

examining-role-nasopharyngeal-associated-lymphoreticular-tissue-nalt

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Badanie roli tkanki limfatycznej związanej z nosogłębką (NALT) w reakcjach myszy na szczepionki

W niniejszym opracowaniu opisujemy protokoły izolacji makrofagów pęcherzykowych myszy, które są rezydującymi w płucach komórkami odporności wrodzonej, oraz badania ich aktywacji w odpowiedzi na kokulturę z nanocząsteczkami polianhydrydowymi.

Pozyskiwanie makrofagów pęcherzykowych myszy oraz ocena aktywacji komórkowej indukowanej przez nanocząsteczki polianhydrydu

Opisano wydajną metodę izolacji limfocytów z dróg rodnych myszy. Metoda ta wykorzystuje trawienie enzymatyczne oraz separację w gradiencie Percoll w celu zapewnienia efektywnej izolacji. Technikę tę można również dostosować do zastosowania u innych...

Izolacja limfocytów z błony śluzowej dróg rodnych myszy

Źródło: Zhang, J., et al. P. Dissecting Innate Immune Signaling in Viral Evasion of Cytokine Production. J. Vis. Exp. (2014)W niniejszym filmie zaprezentowano podanie donosowe herpeswirusa mysiego u myszy w celu wywołania swoistej dla płuc odpowiedzi immunologicznej. Następnie tkanka płuc jest przetwarzana w celu uzyskania nadsączów zawierających cytokiny do dalszej oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza.

Donosowa infekcja myszy wirusem herpes myszy w celu oceny odpowiedzi immunologicznej gospodarza

Profilaktyczne i terapeutyczne szczepienia często nie stymulują silnej odpowiedzi immunologicznej z powodu tygodniowego drenażu szczepionki do węzłów chłonnych, a w konsekwencji słabego zaangażowania komórek odpornościowych. Poprzez bezpośrednie wstrzyknięcie szczepionki do węzłów chłonnych, tzw. wstrzyknięcie dolimfatyczne, można znacznie poprawić skuteczność szczepionki i zmniejszyć dawki szczepionki.

Immunoterapia dolimfatyczna i szczepienie u myszy

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Istnieje ogólny brak wiedzy na temat działania szczepionek. W tym miejscu proponujemy połączone zastosowanie genetyki odwrotnej i chimerycznych myszy szpiku kostnego w celu uzyskania wglądu we wczesną odpowiedź immunologiczną gospodarza na szczepionki, ze szczególnym uwzględnieniem komórek dendrytycznych i odporności limfocytów T.

Donosowe podawanie rekombinowanych szczepionek przeciw grypie w chimerycznych modelach mysich w celu zbadania odporności błony śluzowej

Szczegółowo opisujemy metodologię stosowaną do porównania skuteczności ochronnej i odpowiedzi immunologicznej płuc indukowanej przez donosowe i podskórne szczepienie z BCG w modelu mysim. Nasze wyniki pokazują korzyści płynące ze szczepienia płuc i sugerują rolę odpowiedzi za pośrednictwem IL17 w ochronie indukowanej szczepionką.

Skuteczność ochronna i odpowiedź immunologiczna płuc po podaniu podskórnym i donosowym BCG myszom

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Tutaj prezentujemy elegancki protokół do oceny in vivo skuteczności szczepionki i odpowiedzi immunologicznej gospodarza. Protokół ten można dostosować do modeli szczepionek, które badają patogeny wirusowe, bakteryjne lub pasożytnicze.

Ocena odpowiedzi gospodarz-patogen i skuteczności szczepionki u myszy

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Obecny protokół opisuje nowatorską metodę unikania zanieczyszczenia krwi mysim płynem do płukania nosa (NLF). Ponieważ metoda ta zapewnia pobranie NLF bez zanieczyszczenia krwi, pozwala na dokładniejsze wykrywanie składników immunologicznych i różnych patogenów układu oddechowego.

Pobieranie płynu do płukania nosa dla myszy bez zanieczyszczenia krwi

Poznaj metody badania roli tkanki limfatycznej NALT w odpowiedziach immunologicznych myszy na szczepionki donosowe. Wykorzystaj model chirurgiczny i hodowle ex vivo do analizy lokalnej i ogólnoustrojowej odpowiedzi humoralnej.

Badanie roli tkanki limforetykularnej związanej z nosogardzielą (NALT) w odpowiedziach myszy na szczepionki

Przeglądaj więcej filmów