Name: Wykrywanie bakterii za pomocą fluorogennych DNAzymów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Poznaj metodę wykrywania bakterii Escherichia coli za pomocą fluorogennych sond DNAzymowych. Technika ta oferuje szybszą i prostszą alternatywę dla PCR oraz metod opartych na przeciwciałach w diagnostyce mikrobiologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie niniejszych badań zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Sentinel Bioactive Paper Network.

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Principles+of+Bacterial+Detection%3A+Biosensors%2C+Recognition+Receptors+and+Microsystems%22">Principles of Bacterial Detection: Biosensors, Recognition Receptors and Microsystems</a>. Zourob, M., Elwary, S., Truner, A. , Springer. New York. (2008).</li>
<li>Call, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+and+Opportunities+for+Pathogen+Detection+Using+DNA+Microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Challenges and Opportunities for Pathogen Detection Using DNA Microarrays.</a> Crit. Rev. Microbiol. 31, 91-99 (2005).</li>
<li>Lazcka, O., Campo, D. el, J, F., Muñoz, F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+detection%3A+A+perspective+of+traditional+methods+and+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens.+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors.</a> Biosens. Bioelectron. 22, 1205-1217 (2007).</li>
<li>Velusamy, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+foodborne+pathogen+detection%3A+In+the+perspective+of+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Adv%22%5BJournal%5D)">An overview of foodborne pathogen detection: In the perspective of biosensors.</a> Biotechnol. Adv. 28, 232-254 (2010).</li>
<li>Ali, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNAzyme+Probes+as+Bacterial+Indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNAzyme Probes as Bacterial Indicators.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50, 3751-3754 (2011).</li>
<li>Navani, N. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+aptamers+and+enzymes+as+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid aptamers and enzymes as sensors.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 10, 272-281 (2006).</li>
<li>Liu, J., Cao, Z., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Nucleic+Acid+Sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional Nucleic Acid Sensors.</a> Chem. Rev. 109, 1948-1998 (2009).</li>
<li>Li, Y., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Y+%22Functional+Nucleic+Acids+for+Analytical+Applications%22">Functional Nucleic Acids for Analytical Applications</a>. , Springer. New York. (2009).</li>
<li>Tuerk, C., Gold, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evolution+of+ligands+by+exponential+enrichment%3A+RNA+ligands+to+bacteriophage+T4+DNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.</a> Science. 249, 505-510 (1990).</li>
<li>Ellington, A. D., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+RNA+molecules+that+bind+specific+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.</a> Nature. 346, 818-822 (1990).</li>
<li>Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forty+Years+of+In+Vitro+Evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Forty Years of In Vitro Evolution.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 46, 6420-6436 (2007).</li>
<li>Breaker, R. R., Joyce, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+enzyme+that+cleaves+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">A DNA enzyme that cleaves RNA.</a> Chem. Biol. 1, 223-229 (1994).</li>
<li>Cuenoud, B., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+metalloenzyme+with+DNA+ligase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A DNA metalloenzyme with DNA ligase activity.</a> Nature. 375, 611-614 (1995).</li>
<li>Chinnapen, D. J., Sen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deoxyribozyme+that+harnesses+light+to+repair+thymine+dimers+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A deoxyribozyme that harnesses light to repair thymine dimers in DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 65-69 (2004).</li>
<li>Schlosser, K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+inspired+synthetic+enzymes+made+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biologically inspired synthetic enzymes made from DNA.</a> Chem. Biol. 16, 311-322 (2009).</li>
<li>Silverman, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+as+a+versatile+chemical+component+for+catalysis%2C+encoding%2C+and+stereocontrol%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">DNA as a versatile chemical component for catalysis, encoding, and stereocontrol.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 49, 7180-7201 (2010).</li>
<li>Mei, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+RNA-cleaving+DNA+enzyme+that+synchronizes+catalysis+with+fluorescence+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">An efficient RNA-cleaving DNA enzyme that synchronizes catalysis with fluorescence signaling.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 412-420 (2003).</li>
<li>Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assemblage+of+signaling+DNA+enzymes+with+intriguing+metal-ion+specificities+and+pH+dependences%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Assemblage of signaling DNA enzymes with intriguing metal-ion specificities and pH dependences.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 7539-7545 (2003).</li>
<li>Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+catalytically+efficient+acidic+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of a catalytically efficient acidic RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Nucleic Acids Res. 33, 7164-7175 (2005).</li>
<li>Rupcich, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quenching+of+fluorophore-labeled+DNA+oligonucleotides+by+divalent+metal+ions%3A+implications+for+selection%2C+design%2C+and+applications+of+signaling+aptamers+and+signaling+deoxyribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Quenching of fluorophore-labeled DNA oligonucleotides by divalent metal ions: implications for selection, design, and applications of signaling aptamers and signaling deoxyribozymes.</a> J. Am. Chem. Soc. 128, 780-790 (2005).</li>
<li>Shen, Y., Brennan, J. D., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+secondary+structure+and+identifying+functionally+essential+nucleotides+of+pH6DZ1%2C+a+fluorescence-signaling+and+RNA-cleaving+deoxyribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterizing the secondary structure and identifying functionally essential nucleotides of pH6DZ1, a fluorescence-signaling and RNA-cleaving deoxyribozyme.</a> Biochemistry. 44, 12066-12076 (2005).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revitalization+of+six+abandoned+catalytic+DNA+species+reveals+a+common+three-way+junction+framework+and+diverse+catalytic+cores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Revitalization of six abandoned catalytic DNA species reveals a common three-way junction framework and diverse catalytic cores.</a> J. Mol. Biol. 357, 748-754 (2006).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+high-branching+deoxyribozymes+from+a+catalytic+DNA+with+a+three-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of high-branching deoxyribozymes from a catalytic DNA with a three-way junction.</a> Chem. Biol. 13, 1061-1069 (2006).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalysis+and+rational+engineering+of+trans-acting+pH6DZ1%2C+an+RNA-cleaving+and+fluorescence-signaling+deoxyribozyme+with+a+four-way+junction+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+BioChem%22%5BJournal%5D)">Catalysis and rational engineering of trans-acting pH6DZ1, an RNA-cleaving and fluorescence-signaling deoxyribozyme with a four-way junction structure.</a> Chem BioChem. 7, 1343-1348 (2006).</li>
<li>Ali, M. M., Kandadai, S. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+pH3DZ1+-+An+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+3%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of pH3DZ1 - An RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 3.</a> Can. J. Chem. 85, 261-273 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+signaling+platforms+built+from+a+small+catalytic+DNA+and+doubly+labeled+fluorogenic+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Efficient signaling platforms built from a small catalytic DNA and doubly labeled fluorogenic substrates.</a> Nucleic Acids Res. 35, 401-405 (2007).</li>
<li>Chiuman, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+fluorescent+sensors+engineered+with+catalytic+DNA+MgZ+based+on+a+non-classic+allosteric+design%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Simple fluorescent sensors engineered with catalytic DNA MgZ based on a non-classic allosteric design.</a> PLoS ONE. 2, e1224(2007).</li>
<li>Shen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entrapment+of+fluorescence+signaling+DNA+enzymes+in+sol+gel-derived+materials+for+metal+ion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Entrapment of fluorescence signaling DNA enzymes in sol gel-derived materials for metal ion sensing.</a> Anal. Chem. 79, 3494-3503 (2007).</li>
<li>Kandadai, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+RNA-cleaving+deoxyribozyme+with+optimal+activity+at+pH+5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of an RNA-cleaving deoxyribozyme with optimal activity at pH 5.</a> Biochemistry. 48, 7383-7391 (2009).</li>
<li>Zhao, W., Brook, M. A., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+assembly+of+nanospecies+on+repetitive+DNA+sequences+generated+on+gold+nanoparticles+by+rolling+circle+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Periodic assembly of nanospecies on repetitive DNA sequences generated on gold nanoparticles by rolling circle amplification.</a> Methods Mol. Biol. 474, 79-90 (2008).</li>
<li>Navani, N. K., Mok, W. K., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+selection+of+protein-binding+DNA+aptamers+as+ligands+for+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro selection of protein-binding DNA aptamers as ligands for biosensing applications.</a> Methods Mol. Biol. 504, 399-415 (2009).</li>
<li>Ali, M. M., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorimetric+sensing+by+using+allosteric-DNAzyme-coupled+rolling+circle+amplification+and+a+peptide+nucleic+acid-organic+dye+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Colorimetric sensing by using allosteric-DNAzyme-coupled rolling circle amplification and a peptide nucleic acid-organic dye probe.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48, 3512-3515 (2009).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Większość powszechnie stosowanych obecnie metod wykrywania bakterii jest albo powolna (klasyczna mikrobiologia), albo wymagająca technicznie (przeciwciała, PCR). W związku z tym uważamy, że nowa generacja narzędzi detekcyjnych powinna kłaść nacisk na szybkość i prostotę. W tym celu stworzyliśmy DNAzym rozcinający RNA i generujący sygnał fluorescencyjny, który może być wykorzystany do opracowania prostych testów zgłaszających obecność bakterii poprzez generowanie sygnału fluorescencji. Przedstawiona sonda DNAzymowa, RFD-EC1, jest aktywowana przez CEM produkowane podczas wzrostu E. coli w pożywkach hodowlanych. Ponieważ nasza metoda wykorzystuje surowe mieszaniny zewnątrzkomórkowe bakterii jako cel detekcji i pomija żmudne etapy ekstrakcji oraz amplifikacji celu, może być ona stosowana do tworzenia bardzo prostych testów typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Zastosowanie naszego DNAzymu nie ogranicza się do metod detekcji opartych na fluorescencji. Przykładowo, detekcję kolorymetryczną z wykorzystaniem tego samego układu DNAzymowego można zaprojektować, stosując wcześniej opisaną metodę wykorzystującą amplifikację przez toczący się krąg (RCA) w połączeniu z barwnikiem organicznym.32 Przewidujemy, że wykorzystanie DNAzymów do wykrywania bakterii będzie atrakcyjnym kierunkiem w tworzeniu nowych biosensorów bakteryjnych o większej prostocie operacyjnej.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Persiarzan sodu (APS)</td><td>BioShop Canada</td><td>AMP001</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid/Bis-akrylamid (40%, 29:1)</td><td>BioShop Canada</td><td>ACR004</td><td></td></tr><tr><td>Kwas borowy</td><td>BioShop Canada</td><td>BOR001</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>EXO539-1</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38281</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>BioShop Canada</td><td>HEP001</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka LB</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>EMD Millipore</td><td>B10149-34</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>EMD Millipore</td><td>SXO255-1</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>EMD Millipore</td><td>SXO590-1</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioShop Canada</td><td>SDS001</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>BioShop Canada</td><td>TEM001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>BioShop Canada</td><td>BST666</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>BioShop Canada</td><td>URE001</td><td></td></tr><tr><td>Ksylenocyjanol FF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>Koncentrator DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant DNA SpeedVac 120</td><td></td></tr><tr><td>Jednostka filtrująca Millex</td><td>EMD Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do nakładania na żel</td><td>Diamed</td><td>TEC200EX-K</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ImageQuant</td><td>Molecular Dynamics</td><td>Version 5.0</td><td></td></tr><tr><td>Chusteczki Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34705</td><td></td></tr><tr><td>Mini-vortex</td><td>VWR international</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>Fisherbrand 08-757-12</td><td></td></tr><tr><td>Stripettor Plus (pistolet do pipet)</td><td>Corning</td><td>07764714</td><td></td></tr><tr><td>Kuwety kwarcowe</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>66-100216-00</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator z wytrząsarką</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Classic Series C24</td><td></td></tr><tr><td>Skaner Typhoon</td><td>GE Healthcare</td><td>9200 Variable mode</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>Allegra X22-R</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>GenesysUV 10</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr fluorescencyjny</td><td>Varian Inc., Agilent</td><td>Cary Eclipse</td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych dnazymów

Detection of Bacteria Using Fluorogenic DNAzymes

Ogniska chorób związane z patogenami przenoszonymi przez żywność oraz patogenami szpitalnymi powodują miliony zgonów i hospitalizacji, a także kolosalne straty ekonomiczne każdego roku. Zapobieganie takim ogniskom oraz minimalizacja skutków trwającej epidemii generują stale rosnący popyt na metody analityczne, które potrafią precyzyjnie zidentyfikować sprawcze patogeny na najwcześniejszym etapie. Chociaż istnieje szeroki wachlarz skutecznych metod wykrywania patogenów, żadna z nich nie spełnia wszystkich pięciu kluczowych wymagań stawianych idealnej metodzie detekcji: wysokiej swoistości (wykrywanie tylko interesującej nas bakterii), wysokiej czułości (zdolność do wykrycia nawet pojedynczej żywej komórki bakteryjnej), krótkiego czasu oczekiwania na wynik (od kilku minut do kilku godzin), dużej prostoty operacyjnej (brak konieczności przeprowadzania długotrwałych procedur pobierania próbek i stosowania specjalistycznego sprzętu) oraz opłacalności kosztowej. Przykładowo, klasyczne metody mikrobiologiczne są wysoce swoiste, ale wymagają dużo czasu (od kilku dni do kilku tygodni) na uzyskanie ostatecznego wyniku.1 Techniki oparte na PCR i przeciwciałach oferują krótszy czas oczekiwania (od kilku godzin do kilku dni), ale wymagają zastosowania drogich odczynników i/lub zaawansowanego sprzętu.2-4 W związku z tym wciąż istnieje duże zapotrzebowanie na badania naukowe nad opracowaniem innowacyjnych metod detekcji bakterii, które oferowałyby poprawione właściwości w jednym lub kilku z wyżej wymienionych aspektów. Nasze laboratorium jest zainteresowane zbadaniem potencjału DNAzymów jako nowej klasy sond molekularnych w zastosowaniach biosensorycznych, w tym w detekcji bakterii.5
DNAzymy (znane również jako ksyloribozymy lub enzymy DNA) to syntetyczne jednoniciowe cząsteczki DNA posiadające zdolność katalizowania reakcji chemicznych.6-8 Cząsteczki te mogą być izolowane z ogromnej puli DNA o losowych sekwencjach (zawierającej nawet 1016 poszczególnych sekwencji) za pomocą procesu znanego jako „selekcja in vitro” lub „SELEX” (systematyczna ewolucja ligandów poprzez wzbogacanie wykładnicze).9-16 Te specjalne cząsteczki DNA były w ostatnich latach szeroko badane jako narzędzia molekularne w zastosowaniach biosensorycznych.6-8
W naszym laboratorium opracowano procedury selekcji in vitro w celu wyizolowania fluorescencyjnych DNAzymów tnących RNA (RFDs; Rys. 1) oraz zbadano zastosowanie RFDs jako narzędzi analitycznych.17-29 RFDs katalizują rozszczepienie chimerycznego substratu DNA-RNA w obrębie pojedynczego złącza rybonukleotydowego (R), które jest flankowane przez fluorofor (F) i wygaszacz (Q). Bliska odległość między F a Q sprawia, że nierozszczepiony substrat wykazuje minimalną fluorescencję. Jednak zdarzenie rozszczepienia prowadzi do rozdzielenia F i Q, czemu towarzyszy znaczny wzrost intensywności fluorescencji.
W ostatnim czasie opracowaliśmy metodę izolacji RFD do detekcji bakteryjnej.5 Te specjalne RFD zostały wyizolowane tak, aby „rozświetlać się” w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) pozostawianej przez konkretny rodzaj bakterii w środowisku lub w pożywce, w której są hodowane (Rys. 1). Wykorzystanie surowej mieszaniny pozwala uniknąć żmudnego procesu oczyszczania i identyfikacji odpowiedniego celu z interesującego mikroba w celu opracowania biosensora (co mogłoby zająć miesiące lub lata). Zastosowanie celów zewnątrzkomórkowych sprawia, że procedura analizy jest prosta, ponieważ nie ma potrzeby wykonywania etapów pozyskiwania celów wewnątrzkomórkowych.
Stosując powyższe podejście, opracowaliśmy RFD, który rozszczepia swój substrat (FS1; Rys. 2A) wyłącznie w obecności CEM produkowanego przez E. coli (CEM-EC).5 Stwierdzono, że ten wykrywający E. coli RFD, nazwany RFD-EC1 (Rys. 2A), reaguje ściśle na CEM-EC, lecz nie wykazuje reakcji na CEM pochodzące od szeregu innych bakterii (Rys. 3).
W niniejszym opracowaniu przedstawiamy kluczowe procedury eksperymentalne służące do przygotowania testów detekcji E. coli z wykorzystaniem RFD-EC1 oraz reprezentatywne wyniki.

Niedawno opisaliśmy nowatorskie podejście do generowania fluorogennych sond DNAzymowych, które mogą być wykorzystane do stworzenia prostego, fluorescencyjnego testu typu „wymieszaj i odczytaj” do wykrywania bakterii. Te specjalne sondy DNA katalizują rozszczepienie zmodyfikowanego chromoforem substratu chimerycznego DNA-RNA w obecności surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej (CEM) produkowanej przez konkretną bakterię, przekładając tym samym detekcję bakterii na generowanie sygnału fluorescencyjnego. W niniejszym raporcie opiszemy kluczowe procedury eksperymentalne, w których specyficzna sonda DNAzymowa oznaczona jako „RFD-EC1” jest wykorzystywana do wykrywania modelowej bakterii Escherichia coli (E. coli).

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Ogniska chorób związane z patogenami przenoszonymi przez żywność oraz patogenami szpitalnymi odpowiadają za miliony zgonów i hospitalizacji, a także za kolosalne straty ekonomiczne ...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest szybkie wykrycie obecności konkretnych bakterii, takich jak e coli, przy użyciu nowatorskich sond flu genicznych DNA Zyme. Najpierw, geniczne sondy DNA Zyme są generowane poprzez ligację. Następnie bakterie są hodowane w celu zwiększenia liczby cząsteczek docelowych, a z supernatantu przygotowywana jest odpowiednia mieszanina zewnątrzkomórkowa.Surową mieszaninę zewnątrzkomórkową łączy się następnie z sondą DNAzymem; oddziaływanie pomiędzy sondą DNAzymem a cząsteczkami docelowymi prowadzi do rozcięcia sondy, która następnie fluorescencyjnie sygnalizuje obecność celu. Oddziaływanie pomiędzy sondą a celem jest wykrywane za pomocą fluorymetru jako wzrost względnej fluorescencji. Wyniki są następnie weryfikowane za pomocą analizy w denaturującej elektroforezie w żelu poliakrylamidowym.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami opartymi na PCR lub przeciwciałach jest to, że procedura jest prostsza i łatwiejsza do przeprowadzenia. Choć metoda ta została opracowana z wykorzystaniem bakterii modelowej e coli, może ona zostać zastosowana do wykrywania innych bakterii chorobotwórczych przenoszonych przez żywność lub patogenów szpitalnych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ mogą nie być przyzwyczajone do obchodzenia się z syntetycznymi sondami DNA i bakteriami. Procedurę w tym protokole prezentują Sergio Aguire, asystent badawczy z mojego laboratorium oraz Monso Ali, stażysta podoktorski.R-F-D-E-C one to wyróżniony DNA Zyme. Składa się on z sekwencji katalitycznej EC one podkreślonej na czarno oraz sekwencji substratu FS one podkreślonej na zielono; w obrębie substratu znajduje się wiązanie RNA oznaczone niebieskim r, flankowane przez DT znakowane fluorescencyjnie oznaczone jako F oraz DT znakowane wygaszaczem oznaczone jako queue. RF SS one jest wersją przetasowaną RFD EEC one, w której sekwencja katalityczna EEC one jest częściowo przemieszana w SS one, natomiast część FS one pozostaje niezmieniona. RF DEC one oraz RF SS one są otrzymywane poprzez enzymatyczną ligację oligonukleotydu FS one z oligonukleotydem EC one lub SS one przy użyciu LT one jako matrycy ligacji, w celu przygotowania surowych mieszanin zewnątrzkomórkowych (cems), które będą służyć jako cel dla R-F-D-E-C one. Należy rozpocząć od odpipetowania 2 mL pożywki LB do sterylnych probówek hodowlanych o pojemności 14 mL przy użyciu pipety wielokanałowej.Następnie, używając sterylnego końcówki do pipety, pobierz pojedynczą kolonię e coli z płytki agarowej i przenieś ją do probówki z pożywką LB. Umieść probówki w inkubatorze ustawionym na 37 °C i inkubuj przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM przez 14 godzin. Aby przygotować kulturę szczepionkową o stężeniu 1%, odmierz 2 ml świeżej pożywki LB do probówek o pojemności 14 ml i dodaj 20 µL kultury bakterii z poprzedniego etapu.Inkubować probówki w temperaturze 37°C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM, aż każda zawiesina bakteryjna osiągnie wartość OD 600 wynoszącą około 1. Przenieść 1 mL każdej hodowli do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL i odwirować komórki przy 11 000 G przez pięć minut. Po wirowaniu przenieść klarowny nadsącz do nowej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Przechowywać nadsącz w temperaturze -20°C. Jeśli nie zostanie on niezwłocznie wykorzystany do określenia, czy w wyniku oddziaływania enzymów DNA z surowym ekstraktem komórkowym powstaje sygnał fluorescencyjny, próbki analizuje się metodą spektrofotometrii. Włączyć spektrofotometr fluorescencyjny i ustawić parametry akwizycji danych z wzbudzeniem przy 488 nm i emisją przy 520 nm.Należy również ustawić instrument tak, aby dokonywał odczytów co minutę przez jedną godzinę. Trzy kuwety z kryształu kwarcowego należy przemyć najpierw wodą destylowaną i dejonizowaną, a następnie 100% etanolem. Kuwety należy osuszyć, przedmuchując je gazem azotowym.Oznakuj kuwety: C1 dla kontroli 1, C2 dla kontroli 2 oraz T dla próby. Następnie przenieś 24 µL destylowanej wody dejonizowanej do kuwety C1 oraz 24 µL przygotowanej surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej E. coli do kuwet C2 i T. Do każdej kuwety dodaj 25 µL 2X RB i umieść je w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Rozpocznij gromadzenie danych fluorescencji; po pięciu minutach dodaj 1 µL 5 µM RFS S1 do C2 oraz 1 µL 5 µM RFD eec1 do T i C1, dbając o to, aby pomiary fluorescencji nie zostały przerwane. Wymieszaj każdy roztwór poprzez pipetowanie, a następnie pozwól reakcji przebiegać do końca okresu akwizycji.Zapisz dane w formacie pliku Excel. Następnie przenieś dane na komputer osobisty i użyj programu Excel do stworzenia wykresu. Użyto tych samych mieszanin reakcyjnych, które zostały wykorzystane do analizy za pomocą Spectra.Fotometria może być wykorzystana do analizy za pomocą elektroforezy w żelu. Po godzinie akwizycji należy wyjąć kuwety ze spektrofotometru i przenieść roztwory do nowych probówek do mikrocentryfugi.Zatrzymaj reakcje, dodając 5 µL 3 M octanu sodu oraz 125 µL 100% etanolu. Wymieszaj każdy roztwór za pomocą vortexa, a następnie umieść probówki w zamrażarce w temperaturze -20 °C na jedną godzinę. Po inkubacji odwiruj mieszaniny reakcyjne przy 11 000 ×g przez 20 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety.Osady należy wysuszyć za pomocą koncentratora DNA przez 10 minut. Następnie dodać 20 µL buforu do ładowania żelu i krótko wymieszać w wirówce typu vortex. Próbki należy krótko odwirować w wirówce laboratoryjnej.Następnie, po zakończeniu procesu, nanieś 10 µL próbek reakcyjnych do każdego dołka żelu 10% Dage. Zdejmij szklane płytki i dokładnie opłucz je wodą z kranu. Aby usunąć pozostałości żelu, przetrzyj płytki chusteczką Kimwipe.Zeskanuj płytkę żelową pod kątem fluorescencji za pomocą skanera Typhoon. Przeanalizuj uzyskane obrazy przy użyciu oprogramowania do kwantyfikacji obrazów, aby ocenić czułość układu. Kultury poddane rozcieńczeniom seryjnym są inkubowane przez coraz dłuższe okresy czasu.Aby określić minimalny czas inkubacji wymagany do wykrycia pojedynczej bakterii, należy przygotować 10 probówek z kulturą zawierających 2 mL lb, zaszczepić każdą kulturę 100 µL zapasu glicerolowego e coli o stężeniu 2 CFU/mL i inkubować w temperaturze 37 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Z każdej zaszczepionej probówki z kulturą należy pobrać 300 µL, biorąc pod uwagę, że w próbkach pobranych w punktach czasowych 4, 8 i 12 godzin mogą nie występować wykrywalne bakterie.Pozostaw pozostałą hodowlę do wzrostu na 24 godziny w celu zidentyfikowania kultur zawierających bakterie. Zmierz OD 600 i osadź komórki poprzez wirowanie przy 11, 000 G przez pięć minut. Przenieś nadsącz zawierający CEMS do nowych probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do dnia następnego.Obejrzyj hodowle pod kątem wzrostu. Tylko jedna lub dwie z 10 hodowli mogą zawierać e coli po inokulacji, a pozostałe probówki nie będą zawierały żadnych komórek. Użyj CEMS odzyskanych z pozytywnych hodowli w wyznaczonych punktach czasowych do przygotowania reakcji rozszczepienia z RFD EEC one; analizuj mieszaniny reakcyjne za pomocą elektroforezy w żelu DAGE, zgodnie z wcześniejszym opisem. Zarówno sondy RFD EEC one, jak i RF SS one zostały przygotowane poprzez ligację enzymatyczną fragmentów DNAzymu do substratu.Interakcję FS one z CEM EEC oraz RFD EEC one lub RF SS one oceniono następnie za pomocą spektrometrii. Jak widać tutaj, R-F-D-E-C one wygenerowało wysoki poziom sygnału fluorescencyjnego po dodaniu CEM ec.W wyraźnym kontraście R FS S one nie wygenerowało silnego sygnału fluorescencyjnego. Zatem funkcja wytwarzania fluorescencji RFD EEC one. Po kontakcie z CEM EC następuje sekwencjonowanie.Aby zweryfikować, czy zaobserwowany wzrost fluorescencji wynikał z rozszczepienia wiązania RNA, przeprowadzono analizę mieszanin reakcyjnych. Rozszczepienie RFD eec za pomocą 0,25 M wodorotlenku sodu powinno prowadzić do powstania fragmentów RNA: fragmentu 5', zachowującego fluorofor, oraz fragmentu 3', zachowującego wygaszacz. Jak widać tutaj.Mieszanina reakcyjna RFD EEC CEM EEC rzeczywiście przyniosła oczekiwany produkt rozszczepienia. Co więcej, tylko UNC rozszczepiło R-F-D-E-C, a fragment 5' mógł zostać wykryty za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Aby zbadać swoistość RFD EEC, przeprowadzono testy fluorescencyjne z wykorzystaniem CEMS pobranych wyłącznie z kilku innych bakterii gram-ujemnych i gram-dodatnich.Próbka zawierająca CEM EC wywołała wzrost fluorescencji. Brak reaktywności krzyżowej z CEMS pochodzącymi od innych bakterii wskazuje, że R-F-D-E-C one jest wysoce selektywne względem e coli. Aby określić minimalny czas hodowli wymagany do wykrycia pojedynczej komórki e coli, e coli rozcieńczono do poziomu 1 CFU na mililitr w 100 µL i hodowano w pożywce przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Otrzymane CEMS zmieszano z R-F-D-E-C one, a stopień cięcia oceniono za pomocą dage, jak pokazano tutaj.Obraz z analizy Dage wskazuje, że próba R-F-D-E-C nie wytworzyła oczekiwanego produktu cięcia. Po reakcji z CEM, ECS zebrane w czwartej i ósmej godzinie wzrostu wskazują, że po opanowaniu metody wymagany będzie 12-godzinny czas hodowli.Kluczowym elementem tej techniki jest to, że test oparty na enzymie DNAza może zostać przeprowadzony w 60 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Po tym opracowaniu procedura otworzyła badaczom w dziedzinie bioanalizy drogę do badania allogennych enzymów DNA w celu wykrywania szerokiego zakresu patogenów bakteryjnych.

detection-of-bacteria-using-fluorogenic-dnazymes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Wykrywanie bakterii za pomocą fluorogenicznych DNAzymów

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Ten film demonstruje technikę wykrywania zanieczyszczeń bakteryjnych w próbkach żywności i wody za pomocą nanosensorów. Docelowe bakterie chorobotwórcze są wykrywane poprzez połączenie modalności relaksacji magnetycznej i emisji fluorescencji.

Wykrywanie skażenia bakteryjnego za pomocą nanoczujników magnetofluorescencyjnych

Kluczowe dla dziedziny patogenezy bakteryjnej jest możliwość określenia, czy i jak mikroby przeżywają po ekspozycji na komórki eukariotyczne.  W tym artykule przedstawiono protokoły stosowania barwników fluorescencyjnych, które ujawniają żywotność poszczególnych bakterii znajdujących się wewnątrz komórek gospodarza i związanych z nimi.

Metody mikroskopii fluorescencyjnej do określania żywotności bakterii w połączeniu z komórkami ssaków

Tutaj opisano metodę lokalizacji bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą znakowanych DIG sond DNA 16S ukierunkowanych na rRNA. Protokół ten można zastosować do badania roli bakterii w różnych chorobach, takich jak zapalenie przyzębia, nowotwory i zapalne choroby immunologiczne.

In Situ Wykrywanie bakterii w tkankach zatopionych w parafinie za pomocą sondy DNA znakowanej digoksyną ukierunkowanej na 16S rRNA

Opisujemy protokół kolorymetrycznego wykrywania E. coli za pomocą zmodyfikowanego testu lakmusowego, który wykorzystuje DNA rozszczepiające RNA, ureazę i kulki magnetyczne.

Kolorymetryczne wykrywanie bakterii za pomocą papierka lakmusowego

Zrozumienie funkcji podstawowych procesów zachodzących w bakteriach jest wyzwaniem. Mikroskopia fluorescencyjna z barwnikami specyficznymi dla celu może dostarczyć kluczowych informacji na temat wzrostu komórek drobnoustrojów i progresji cyklu komórkowego. W tym przypadku Agrobacterium tumefaciens jest używany jako bakteria modelowa w celu podkreślenia metod obrazowania żywych komórek w celu scharakteryzowania podstawowych procesów.

Mikroskopia fluorescencyjna żywych komórek w celu obserwacji podstawowych procesów podczas wzrostu komórek drobnoustrojów

Obecna diagnostyka multipleksowa do wykrywania wirusów Zika, chikungunya i denga wymaga skomplikowanego przygotowania próbek i kosztownego oprzyrządowania, a także jest trudna do użycia w środowiskach o niskich zasobach. Pokazujemy diagnostykę, która wykorzystuje amplifikację izotermiczną z sondami z przemieszczonymi niciami specyficznymi dla celu, aby wykryć i zróżnicować te wirusy z wysoką czułością i swoistością.

Multipleksowana platforma diagnostyczna oparta na amplifikacji izotermicznej do wykrywania wirusów Zika, Chikungunya i Denga 1

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół dla zmodyfikowanej techniki zymograficznej, w której peptydy fluorescencyjne są używane jako degradowalny substrat zamiast natywnych białek. Elektroforeza próbek biologicznych w fluorescencyjnych zymogramach peptydowych umożliwia wykrycie szerszego zakresu proteaz niż dotychczasowe techniki zymograficzne.

Wykrywanie aktywności proteazy za pomocą fluorescencyjnej symografii peptydowej

Fluorescencyjnie oznaczone antybiotyki są potężnymi narzędziami, które mogą być używane do badania wielu aspektów oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe. W artykule opisano przygotowanie antybiotyków znakowanych fluorescencyjnie i ich zastosowanie do badania antybiotykooporności bakterii. Sondy mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów oporności bakterii (np. wypływu) za pomocą spektrofotometrii, cytometrii przepływowej i mikroskopii.

Wizualizacja oporności bakterii za pomocą fluorescencyjnych sond antybiotykowych

Prezentowany tutaj jest protokół dla metody obrazowania fluorescencyjnego, multiplex immunofluorescencyjna metodawykrywania DNA, RNA i proteiny (MICDDRP), metoda zdolna do jednoczesnej fluorescencyjnej wizualizacji pojedynczych komórek białka wirusowego i kwasów nukleinowych o różnym typie i nici. Takie podejście można zastosować do różnych systemów.

Obrazowanie fluorescencyjne z multipleksem pojedynczych komórek w celu wizualizacji wirusowych kwasów nukleinowych i białek oraz monitorowania zakażeń HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika i grypy

Nanomaszyny oparte na DNAzyme mogą być używane do wysoce selektywnego i czułego wykrywania kwasów nukleinowych. W artykule opisano szczegółowy protokół projektowania nanomaszyn opartych na DNAzyme z rdzeniem 10-23 przy użyciu wolnego oprogramowania i ich zastosowania w wykrywaniu fragmentu wirusa Epsteina-Barr jako przykładu.

DNAzyme 10-23 - Nanomaszyny do rozpoznawania kwasów nukleinowych

Poznaj metodę wykrywania bakterii Escherichia coli za pomocą fluorogennych sond DNAzymowych. Technika ta oferuje szybszą i prostszą alternatywę dla PCR oraz metod opartych na przeciwciałach w diagnostyce mikrobiologicznej.

Wykrywanie bakterii przy użyciu fluorogennych DNAzymów

Przeglądaj więcej filmów