Wykrywanie bakterii za pomocą fluorogennych DNAzymów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest szybkie wykrycie obecności określonych bakterii, takich jak E. coli, za pomocą nowych sond genicznych grypy, DNA, Zyme Po pierwsze, kompletnego genowego DNA. Sondy Zyme są generowane przez ligację. Bakterie są następnie hodowane w celu wzbogacenia liczby cząsteczek docelowych, a z supernatantu przygotowuje się mieszaninę zewnątrzkomórkową.

Surowa mieszanina zewnątrzkomórkowa jest następnie łączona z sondą zymu DNA interakcja między sondą DNA Zyme a cząsteczkami docelowymi, co powoduje rozszczepienie sondy, która następnie fluoryzuje za pomocą. Interakcja fluorymetru między sondą a celem jest postrzegana jako wzrost względnej fluorescencji. Wyniki są następnie weryfikowane za pomocą analizy elektroforezy w żelu poliakrylamidowym denaturującym.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z metodami PCR lub opartymi na przeciwciałach jest to, że procedura jest prostsza i łatwiejsza do wykonania. Chociaż metoda ta została opracowana z wykorzystaniem modelu bakterii e coli, może być stosowana do wykrywania wszelkich innych patogenów bakteryjnych przenoszonych przez żywność lub szpitalnych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ mogą nie być przyzwyczajone do obchodzenia się z syntetycznymi sondami DNA i bakteriami Demonstrując procedurę Sergio Aguire, asystent naukowy z mojego laboratorium i Monso Ali, doktor habilitowany dla tego protokołu.

R-F-D-E-C jednym z nich jest wyróżniony DNA Zyme. Składa się z sekwencji katalitycznej EC podkreślonej na czarno i sekwencji substratu FS podkreślonej na zielono, zawartej w substracie to wiązanie RNA oznaczone niebieskim r otoczone przez ID znakowane fluorem wskazane przez F i DT oznaczone QUENCHER wskazane przez kolejkę, RF SS jeden jest zaszyfrowaną wersją RFD EWG, w której sekwencja katalityczna EWG jest częściowo przetasowana do SS, ale jedna część FS pozostaje niezmieniona. RF DEC jeden i RF SS one są wytwarzane przez enzymatyczną ligację oligonukleotydu FS za pośrednictwem matrycy z oligonukleotydem EC jeden lub SS jeden w obecności LT jeden jako matrycy ligacyjnej do przygotowania surowych mieszanin zewnątrzkomórkowych lub cem, które zostaną wykorzystane jako cel dla R-F-D-E-C, należy rozpocząć od dozowania dwóch mililitrów LB do sterylnych 14-mililitrowych probówek hodowlanych za pomocą pistoletu do pipetowania.

Następnie, za pomocą sterylnej końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię E. coli z płytki ślimakowej i wrzuć ją do probówki hodowlanej zawierającej lb. Umieść probówki w inkubatorze ustawionym na 37 stopni Celsjusza i wstrząsaj z prędkością 250 obr./min przez 14 godzin po inkubacji. Aby wygenerować kulturę inokulacyjną 1%re, należy dozować dwa mililitry świeżego LB do 14-mililitrowych probówek hodowlanych i dodać 20 mikrolitrów kultury bakteryjnej z poprzedniego kroku.

Inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wytrząsając z prędkością 250 obr./min, aż każdy roztwór bakteryjny osiągnie OD 600 przy około jednym przeniesieniu. Jeden mililitr każdej kultury do nowej mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 mililitra i granulować komórki przez odwirowanie przy 11 000 G przez pięć minut. Po odwirowaniu przenieś klarowny supernatant do świeżej 1,5 mililitrowej mikroprobówki wirówkowej.

Przechowywać supernatant w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Jeśli nie zostanie natychmiast wykorzystany do określenia, czy sygnał fluorescencyjny jest generowany w wyniku interakcji enzymów DNA z surowym ekstraktem komórkowym, próbki są oznaczane za pomocą fotometrii widmowej. Włącz spektrofotometr fluorescencyjny i ustaw parametry akwizycji danych ze wzbudzeniem na 488 nanometrach i emisją na 520 nanometrach.

Skonfiguruj również przyrząd tak, aby dokonywał odczytów co minutę przez jedną godzinę. Umyj trzy kuwety z kryształu kwarcu najpierw destylowaną wodą dejonizowaną, a następnie 100% etanolem. Wysuszyć kuwety, rozpylając gazowy azot.

Oznaczyć kuwety jako C, jeden dla kontroli, jeden, C, dwa dla kontroli, drugi i T do testu, następnie przenieś 24 mikrolitry destylowanej wody dejonizowanej do C jeden i 24 mikrolitry przygotowanej surowej mieszaniny zewnątrzkomórkowej E coli do C dwa i T. Dodaj 25 mikrolitrów dwóch X RB do każdego weterynarza Q i umieść je w spektrofotometrze fluorescencyjnym. Rozpocznij zbieranie danych fluorescencyjnych po pięciu minutach, dodaj jeden mikrolitr pięciu mikromolowych RFS S jeden do C dwa i jeden mikrolitr pięciu mikromolowych, RFD eec jeden do T i C jeden, upewniając się, że odczyty fluorescencji nie zostaną przerwane. Wymieszać każdy roztwór przez pipetowanie, a następnie pozostawić reakcję do końca okresu akwizycji.

Zapisz dane w formacie pliku Excel. Następnie przenieś dane na komputer osobisty i użyj programu Excel, aby utworzyć obraz graficzny. Te same mieszaniny reakcyjne, które zostały użyte do analizy przez Spectra.

Fotometria może być wykorzystana do analizy za pomocą elektroforezy żelowej. Po godzinie od nabycia. Wyjmij kuwety ze spektrofotometru i przenieś roztwory do nowych probówek do mikrowirówek.

Ugasić reakcje, dodając pięć mikrolitrów trzech molowych octanu sodu i 125 mikrolitrów 100% etanolu. Wymieszaj każdy roztwór przez wirowanie i umieść probówki w zamrażarce o temperaturze minus 20 stopni Celsjusza na godzinę po wirówce inkubacyjnej. Mieszaniny reakcyjne sporządza się w temperaturze 11 000 G przez 20 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza i ostrożnie usunąć supernatant przez pipetowanie.

Suszyć granulki za pomocą koncentratora DNA przez 10 minut. Dodaj 20 mikrolitrów żelowego buforu ładującego i krótko wiruj. Odwiruj krótko za pomocą wirówki stołowej.

Następnie po przebiegu załaduj 10 mikrolitrów próbek reakcyjnych na studzienkę żelu 10%Dage. Zdejmij szklane płytki i dokładnie umyj je wodą z kranu. Aby usunąć wszelkie kawałki żelu, przetrzyj płytki chusteczką Kim.

Zeskanuj płytkę żelową pod kątem fluorescencji za pomocą skanera tajfunów. Przeanalizuj wynikowe obrazy za pomocą oprogramowania do pomiaru ilości obrazu, aby ocenić czułość systemu. Seryjnie rozcieńczane kultury są uprawiane przez coraz dłuższy czas.

Aby określić minimalny okres inkubacji wymagany do wykrycia pojedynczej bakterii, przygotuj 10 probówek hodowlanych zawierających dwa mililitry funta, zaszczep każdą kulturę 100 mikrolitrami dwóch CFU na mililitr glicerolu E coli i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z wytrząsaniem przy 250 obr./min przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Zbierz 300 mikrolitrów z każdej z zaszczepionych probówek hodowlanych, ponieważ w próbkach pobranych w tym czasie może nie być wykrywalnych bakterii. Punkty 4 8 12.

Pozwól pozostałej kulturze rosnąć przez 24 godziny w celu zidentyfikowania kultur zawierających bakterie. Zmierzyć średnicę zewnętrznej 600 i wytrącić komórki przez odwirowanie w stężeniu 11 000 G przez pięć minut. Przenieś supernatant zawierający CEMS do świeżych 1,5 mililitrowych mikroprobówek wirówkowych i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do użycia następnego dnia.

Sprawdź kultury pod kątem wzrostu. Tylko jedna lub dwie z 10 kultur mogą zawierać E. coli po zaszczepieniu, a pozostałe probówki nie będą zawierały żadnych komórek. Użyj CEMS odzyskanego z dodatnich kultur w wyznaczonych punktach czasowych Aby przygotować reakcje rozszczepienia za pomocą RFD EEC one, przeanalizować mieszaniny reakcyjne za pomocą elektroforezy żelowej DAGE, jak opisano wcześniej, zarówno sondy RFD EEC one, jak i RF SS one przygotowano przez enzymatyczną ligację porcji zymu DNA do substratu.

Oddziaływanie FS one CEM, EEC i RFD, EEC lub RF SS oceniano następnie za pomocą spektrometrii. Jak można zobaczyć tutaj. Jeden R-F-D-E-C wytwarzał wysoki poziom sygnału fluorescencyjnego po dodaniu CEM ec.

W przeciwieństwie do tego, R FS S one nie wytwarzał silnego sygnału fluorescencyjnego. Stąd funkcja wytwarzania fluorescencji RFD EEC jeden. Po skontaktowaniu się z CEM EC jest sekwencjonowany.

Specyficzne w celu sprawdzenia, czy obserwowany wzrost fluorescencji był spowodowany rozszczepieniem wiązania RNA. Mieszaniny reakcyjne analizowano przez rozszczepienie RFD eec, oczekuje się, że wodorotlenek sodu o wymiarach jeden na 0,25 mola wygeneruje fragmenty 2D NA, pięcioma fragmentami pierwszymi zatrzymującymi fluor i trzypierwszym fragmentem zachowującym wygaszacz. Jak można zobaczyć tutaj.

Mieszanina reakcyjna RFD, EEC, CEM, EEC rzeczywiście wytworzyła oczekiwany produkt rozszczepienia. Co więcej, tylko UNC rozszczepił R-F-D-E-C jeden i pięciokrotny fragment mógł być wykryty przez obrazowanie fluorescencyjne. Aby zbadać swoistość RFD EEC, przeprowadzono jeden test fluorescencyjny przy użyciu CEMS pobranego tylko z kilku innych bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich.

Próbka zawierająca CEM EC spowodowała wzrost fluorescencji. Brak reaktywności krzyżowej z CEMS z innymi bakteriami wskazuje, że R-F-D-E-C jeden jest wysoce selektywny dla E. coli w celu określenia minimalnego czasu hodowli wymaganego do wykrycia pojedynczej komórki E. Coli E coli rozcieńczonej do jednego CFU na mililitr w 100 mikrolitrach hodowanych z pożywką wzrostową przez 4, 8, 12, 16 i 24 godziny. Otrzymany CEMS zmieszany z R-F-D-E-C i rozszczepieniem oceniano za pomocą dage, jak pokazano tutaj.

Obraz testu Dage wskazuje, że test R-F-D-E-C nie wytworzył oczekiwanego produktu rozszczepienia. W reakcji z CEM. ECS zebrane po czterech i ośmiu godzinach wzrostu, co wskazuje, że po opanowaniu potrzebny jest czas hodowli wynoszący 12 godzin.

Kluczowym elementem tej techniki, jakim jest test oparty na enzymie DA, można wykonać w ciągu 60 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo Po tym rozwoju. Procedura ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się analizą biologiczną do zbadania allogenicznych enzymów DNA do wykrywania szerokiej gamy patogenów bakteryjnych.