Name: Mieszalniki mikroprzepływowe do badania fałdowania białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Poznaj technikę mieszalników mikroprzepływowych do badania dynamiki fałdowania białek z rozdzielczością mikrosekundową. Metoda umożliwia szybkie mieszanie roztworów w około 8 mikrosekund bez turbulencji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest wspierana przez National Science Foundation FIBR (NSF EF-0623664) oraz IDBR (NSF DBI-0754570). Praca ta została częściowo sfinansowana z grantu National Science Foundation FIBR 0623664, zarządzanego przez Center for Biophotonics, National Science and Technology Center NSF, prowadzone przez University of California, Davis, na mocy umowy o współpracy PHY 0120999. Badania prowadzone przez dr Lisę Lapidus są częściowo wspierane przez Career Award at the Scientific Interface z funduszu Burroughs Welcome Fund.

<ol><li>Eaton, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+kinetics+and+mechanisms+in+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Fast kinetics and mechanisms in protein folding.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 29, 327-359 (2000).</li>
<li>Hertzog, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtomole+mixer+for+microsecond+kinetic+studies+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Femtomole mixer for microsecond kinetic studies of protein folding.</a> Analytical Chemistry. 76, 7169-7178 (2004).</li>
<li>Hertzog, D. E., Ivorra, B., Mohammadi, B., Bakajin, O., Santiago, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+microfluidic+mixer+for+studying+protein+folding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of a microfluidic mixer for studying protein folding kinetics.</a> Analytical Chemistry. 78, 4299-4306 (2006).</li>
<li>Yao, S., Bakajin, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+in+Mixing+Time+and+Mixing+Uniformity+in+Devices+Designed+for+Studies+of+Protein+Folding+Kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Improvements in Mixing Time and Mixing Uniformity in Devices Designed for Studies of Protein Folding Kinetics.</a> Analytical Chemistry. 79, 5753-5759 (2007).</li>
<li>Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Hydrophobic+Collapse+and+Early+Folding+Steps+Observed+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Hydrophobic Collapse and Early Folding Steps Observed in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 93, 218-224 (2007).</li>
<li>Bilsel, O., Kayatekin, C., Wallace, L. A., Matthews, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microchannel+solution+mixer+for+studying+microsecond+protein+folding+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">A microchannel solution mixer for studying microsecond protein folding reactions.</a> Review of Scientific Instruments. 76, (2005).</li>
<li>Chan, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submillisecond+protein+folding+kinetics+studied+by+ultrarapid+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Submillisecond protein folding kinetics studied by ultrarapid mixing.</a> PNAS. 94, 1779-1784 (1997).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Luck, S. D., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous-flow+capillary+mixing+method+to+monitor+reactions+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">A continuous-flow capillary mixing method to monitor reactions on the microsecond time scale.</a> Biophysical Journal. 74, 2714-2721 (1998).</li>
<li>Pollack, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compactness+of+the+denatured+state+of+a+fast-folding+protein+measured+by+submillisecond+small-angle+x-ray+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Compactness of the denatured state of a fast-folding protein measured by submillisecond small-angle x-ray scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10115-10117 (1999).</li>
<li>Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+cytochrome+c+initiated+by+submillisecond+mixing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Folding of cytochrome c initiated by submillisecond mixing.</a> Nature Structural Molecular Biology. 4, 44-50 (1997).</li>
<li>Knight, J. B., Vishwanath, A., Brody, J. P., Austin, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+focusing+on+a+silicon+chip%3A+Mixing+nanoliters+in+microseconds%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic focusing on a silicon chip: Mixing nanoliters in microseconds.</a> Physical Review Letters. 80, 3863-3866 (1998).</li>
<li>DeCamp, S. J., Naganathan, A. N., Waldauer, S. A., Bakajin, O., Lapidus, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Observation+of+Downhill+Folding+of+lambda-Repressor+in+a+Microfluidic+Mixer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Direct Observation of Downhill Folding of lambda-Repressor in a Microfluidic Mixer.</a> Biophysical Journal. 97, 1772-1777 (2009).</li>
<li>Waldauer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruggedness+in+the+folding+landscape+of+protein+L%5BTitle%5D)+AND+%22Hfsp+Journal%22%5BJournal%5D)">Ruggedness in the folding landscape of protein L.</a> Hfsp Journal. 2, 388-395 (2008).</li>
<li>Shastry, M. C. R., Roder, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+barrier-limited+protein+folding+kinetics+on+the+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence for barrier-limited protein folding kinetics on the microsecond time scale.</a> Nature Structural Biology. 5, 385-392 (1998).</li>
<li>Uzawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collapse+and+search+dynamics+of+apomyoglobin+folding+revealed+by+submillisecond+observations+of+alpha-helical+content+and+compactness%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Collapse and search dynamics of apomyoglobin folding revealed by submillisecond observations of alpha-helical content and compactness.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 1171-1176 (2004).</li>
<li>Zhu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+of+Multiple+Folding+Pathways+for+the+Villin+Headpiece+Subdomain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">Evidence of Multiple Folding Pathways for the Villin Headpiece Subdomain.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 115, 12632-12637 (2011).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Szybkie mieszanie od wielu lat stanowi cel rozwojowy w dziedzinie zwijania białek, ponieważ od dawna wiadomo, że procesy molekularne biomolekuł zachodzą w skalach czasowych od pikosekund do sekund. Konwencjonalne mieszalniki typu stopped-flow mają martwe czasy rzędu 1-5 ms, co wynika przede wszystkim z turbulencji. W ciągu ostatnich 15 lat niewielka liczba grup opracowała turbulentne mieszalniki przepływowe z czasami mieszania wynoszącymi 30-300 μs, jednak zazwyczaj wymagają one wysokich prędkości przepływu do osiągnięcia takich czasów mieszania, co wiąże się z dużym zużyciem próbek6-8.
Niniejszy protokół opisuje zastosowanie mikrofluidycznych chipów mieszających w celu uzyskania szybkiego rozcieńczenia w reżimie przepływu laminarnego. Praca w tym reżimie niesie ze sobą wiele zalet, z których główną jest możliwość precyzyjnej symulacji całego procesu mieszania, co pozwala na modyfikację odpowiedzi mieszania. Mieszalniki typu T opracowane przez inne grupy o prostych geometriach wykazały czasy mieszania rzędu 100-200 μs, co było ograniczone przede wszystkim rozmiarem kanałów9-10. Poprzez zmniejszenie rozmiaru kanałów do 10 μm Knight zredukował czas mieszania do ~10 μs11. Yao i Bakajin wykazali, że niewielkie zmiany w geometrii mogą prowadzić do znacznej poprawy czasu mieszania4. Praca ta wykazała jednak, że przyspieszenie mieszania może prowadzić również do wystąpienia wolniejszych faz. Konstrukcja zastosowana w niniejszej pracy12-13 stanowi kompromis między dwoma najlepszymi projektami z referencji4, mający na celu zminimalizowanie wolniejszego wykładniczego spadku stężenia denaturantu oraz zwiększenie powtarzalności struktur podczas trawienia DRIE.
W dziedzinie ultraszybkiego mieszania istniały pewne kontrowersje dotyczące definicji czasu mieszania. Ważne jest rozróżnienie między „czasem mieszania” a „czasem martwym”. Czas martwy w mieszalniku turbulentnym definiuje się jako czas, w którym nie można dokonać pomiaru, i w rzeczywistości może on być znacznie dłuższy niż rzeczywisty czas mieszania. Jest on zazwyczaj wyznaczany poprzez wykonanie kilku pomiarów reakcji bimolekularnej rzekomego pierwszego rzędu (takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez N-bromosuccynian) przy różnych stężeniach. Obserwowane wygaszania wykładnicze są dopasowywane tak, aby zbiegały się w jednej wartości przyjętej za t=0 s, a czas między tym punktem a pierwszym zmierzonym punktem stanowi czas martwy. W przypadku mieszalników o przepływie laminarnym pomiary mogą być wykonywane w trakcie procesu mieszania, zatem nie występuje czas martwy, a jedynie czas mieszania. Czas mieszania to po prostu czas potrzebny na połączenie dwóch roztworów do osiągnięcia wystarczającej jednorodności. Wcześniej definiowaliśmy czas mieszania jako czas 90/10, czyli czas, w którym stężenie denaturanta spada z 90% do 10% wartości początkowej (przed zmieszaniem). Jednak kształt krzywej mieszania nie jest idealnie symetryczny, a końcowy etap wygaszania wykazuje niewielką składową wykładniczą. Co więcej, zwijanie białek wykazuje silną nieliniową zależność od stężenia denaturanta, tak że proces zwijania może często rozpocząć się nawet wtedy, gdy stężenie denaturanta zostanie zredukowane tylko dwukrotnie. Dlatego w ostatnim czasie zdefiniowaliśmy czas mieszania jako czas potrzebny do zredukowania stężenia denaturanta o 80%. Oczywiście, w zależności od wymagań eksperymentu, można stosować inne definicje.
Zastosowanie tego miksera do badania fałdowania białek konsekwentnie dostarcza zaskakujących wyników. Od dawna wiadomo, że fałdowanie cytochromu c oraz apomioglobiny przebiega w wielu etapach, a wczesne wyniki uzyskane przy użyciu mikserów przepływowych wykazały, że zapadanie struktury (collapse) następuje w skali czasu ~100 μs10,14-15. Nasze pomiary wykonane tym mikserem wykazały istnienie co najmniej dwóch etapów w tej skali czasu: bardzo szybkiego, prawdopodobnie niespecyficznego zapadania (mierzonego przesunięciem widma fluorescencji Trp) w czasie mieszania, po którym następuje wolniejsza faza (mierzona wygaszaniem całkowitej emisji Trp), będąca prawdopodobnie pierwszym etapem formowania struktury natywnej5. Zaobserwowaliśmy również proces trwający 50 μs w domenie B1 białka L, co obala konwencjonalną interpretację, według której białko to fałduje się w modelu dwustanowym13.
Zaletą tego szybkiego miksera jest możliwość badania zwijania najszybciej zwijających się białek, które zazwyczaj można było mierzyć jedynie za pomocą instrumentów do skoków temperatury (T-jump) w skali nanosekundowej. Metoda T-jump zazwyczaj wymaga obserwacji relaksacji zwijania/rozwijania w pobliżu temperatury topnienia białka, przez co nigdy nie pozwala na śledzenie zwijania całej populacji. Za pomocą tego miksera zbadaliśmy zwijanie represora γ (λ6-86) przy użyciu całkowitej emisji Trp oraz przesunięcia widmowego, co dostarczyło dowodów na to, że białko to nie posiada bariery zwijania w silnych warunkach sprzyjających zwijaniu, które nie były dostępne dla wcześniejszych pomiarów T-jump12. Na koniec zmierzyliśmy zwijanie fragmentu głowowego villiny HP-35, jednego z najszybciej zwijających się białek, jakie dotychczas zmierzono, i stwierdziliśmy, że szybkość zwijania mierzona po zmieszaniu jest około 5 razy wolniejsza niż mierzona metodą T-jump w tych samych warunkach16. Sugeruje to, że kinetyka zwijania zależy od warunków początkowych, co podważa główne założenie w tej dziedzinie.

<table><tbody><tr><td>Fotorezyst AZ P4110</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wywoływacz AZ 400 K</td><td>AZ Electronic Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zmywacz fotorezystu Baker PRS 2000</td><td>Avantor Performance Materials</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AquaBond</td><td>AquaBond Technologies</td><td>AquaBond 55</td><td></td></tr><tr><td>Wafer pokrywowy 500 &amp;mu;m</td><td>SENSOR Prep Services</td><td></td><td>: 100 mm &amp;#177; 0.5 mm&lt;br/&gt;Grubość: 0.5 mm &amp;#177; 0.025 mm&lt;br/&gt;Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej)&lt;br/&gt;Wykończenie powierzchni: SI: 4-8&amp;#197;; SII: 8-12&amp;#197;&lt;br/&gt;Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza&lt;br/&gt;Czysty i polerowany z obu stron</td></tr><tr><td>Wafer pokrywowy 170 &amp;mu;m</td><td>SENSOR Prep Services</td><td>Wafery 7980 2G</td><td>: 100 mm &amp;#177; 0.5 mm&lt;br/&gt;Grubość: 0.17 mm &amp;#177; 0.025 mm&lt;br/&gt;Tolerancje standardowe (chyba że zaznaczono inaczej)&lt;br/&gt;Wykończenie powierzchni: SI: 4-8&amp;#197;; SII: 8-12&amp;#197;&lt;br/&gt;Krawędzie płaskie: jedna główna SEMI-STD, jedna pomocnicza&lt;br/&gt;Czysty i polerowany z obu stron</td></tr><tr><td>Urządzenie do głębokiego trawienia jonowego dla tlenków</td><td>ULVAC</td><td>ULVAC NL-6000</td><td></td></tr><tr><td>Laser jonowy argonowy</td><td>Cambridge Laser Laboratories</td><td>Lexel 95-SHG</td><td>&amp;#955;=258 nm</td></tr><tr><td>Laser jonowy argonowy</td><td>Melles Griot</td><td></td><td>&amp;#955;=488 nm</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td>IX-51</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopu</td><td>Thorlabs Inc.</td><td>OFR LMU-40X-UVB 0.5 NA</td><td>&amp;#955;= 258 nm</td></tr><tr><td>Obiektyw mikroskopu</td><td>Olympus Corporation</td><td>UPLSAPO 60XW 1.2 NA</td><td>&amp;#955;=488 nm</td></tr><tr><td>Nanopozycjoner</td><td>Mad City Labs</td><td>Nano-LP100</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany stół translacyjny</td><td>Semprex Corp</td><td>KL-Series 12-6436</td><td></td></tr><tr><td>Licznik fotonów GaAsP</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>H7421-40</td><td></td></tr><tr><td>Monochromator</td><td>Horiba Instruments Inc</td><td>MicroHR</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Andor</td><td>iDus 420A-BU</td><td></td></tr><tr><td>Chlorowodorek guanidyny (GuHCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4505</td><td></td></tr></tbody></table>

miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

Proces, w którym białko zwija się do swojej natywnej konformacji, ma ogromne znaczenie dla biologii i zdrowia ludzi, a mimo to wciąż nie jest w pełni zrozumiały. Jedną z przyczyn tego stanu rzeczy jest fakt, że zwijanie odbywa się w bardzo szerokim zakresie czasowym, od nanosekund do sekund lub dłużej, w zależności od białka1. Konwencjonalne miksery typu stopped-flow umożliwiły pomiar kinetyki zwijania począwszy od około 1 ms. Opracowaliśmy niedawno mikromieszalnik mikrofluidyczny, który rozcieńcza denaturant około 100-krotnie w czasie ~8 μs2. W przeciwieństwie do miksera stopped-flow, urządzenie to pracuje w reżimie przepływu laminarnego, w którym nie występuje turbulencja. Brak turbulencji pozwala na precyzyjną symulację numeryczną wszystkich przepływów wewnątrz mieszalnika, wykazując doskonałą zgodność z wynikami eksperymentalnymi3-4.
Przepływ laminarny uzyskuje się dla liczb Reynoldsa Re ≤100. W przypadku roztworów wodnych wymaga to geometrii w skali mikronowej. Używamy twardego podłoża, takiego jak krzem lub kwarc topiony, aby stworzyć kanały o szerokości 5-10 μm i głębokości 10 μm (patrz Rysunek 1). Najmniejsze wymiary, przy wlocie do obszaru mieszania, są rzędu 1 μm. Układ jest uszczelniany cienką szklaną przykrywką lub przykrywką z kwarcytu topionego w celu zapewnienia dostępu optycznego. Typowe całkowite liniowe prędkości przepływu wynoszą ~1 m/s, co daje Re~10, jednak zużycie białka wynosi zaledwie ~0,5 nL/s lub 1,8 μL/hr. Stężenie białka zależy od metody detekcji: dla fluorescencji tryptofanu typowe stężenie wynosi 100 μM (dla 1 Trp/białko), a dla FRET typowe stężenie wynosi ~100 nM.
Proces fałdowania jest inicjowany poprzez szybkie rozcieńczenie denaturanta z 6 M do 0,06 M chlorku guanidyny. Białko w wysokim stężeniu denaturanta przepływa przez kanał centralny i w obszarze mieszania spotyka się z obu stron z buforem bez denaturanta, który porusza się około 100 razy szybciej (patrz Rycina 2). Taka geometria powoduje szybkie zwężenie strumienia białka do wąskiego dżetu o szerokości około 100 nm. Dyfuzja lekkich cząsteczek denaturanta jest bardzo szybka, podczas gdy dyfuzja ciężkich cząsteczek białka jest znacznie wolniejsza i wynosi mniej niż 1 μm w 1 ms. Różnica w stałej dyfuzji denaturanta i białka prowadzi do szybkiego rozcieńczenia denaturanta w strumieniu białka, co obniża jego efektywne stężenie wokół białka. Dżet białka przepływa ze stałą prędkością przez kanał obserwacyjny, a fluorescencję białka podczas fałdowania można obserwować za pomocą skanującego mikroskopu konfokalnego5.

W niniejszej pracy wyjaśniamy sposób wykonania i zastosowania mikropłynnego mieszalnika zdolnego do mieszania dwóch roztworów w czasie ~8 μs. Demonstrujemy również wykorzystanie tych mieszalników w detekcji spektroskopowej z użyciem fluorescencji UV oraz fluorescencyjnego transferu energii w rezonansie (FRET).

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Proces, w wyniku którego białko zwija się do swojej natywnej konformacji, ma ogromne znaczenie dla biologii i zdrowia ludzi, a mimo to pozostaje wciąż słabo poznany. Jednym z powodów...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie zmieszanie dwóch roztworów w celu zainicjowania reakcji biochemicznej w skali mikrosekundowej. Jest to realizowane poprzez najpierw wykonanie mikropłynnego mieszalnika. Drugim krokiem jest połączenie płytki ze szkiełkiem przykrywkowym w celu uszczelnienia kanałów.Następnie chip zostaje zamocowany do kolektora zawierającego zbiorniki z roztworami. Ostatnim krokiem jest obrazowanie zmieszanego roztworu przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W rezultacie reakcja biochemiczna zostaje zarejestrowana w skali mikrosekundowej poprzez przeliczenie odległości wzdłuż kanału wylotowego na czas.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mieszanie stop-flow, jest fakt, że mieszanie nie jest ograniczone przez turbulencje i zachodzi w ciągu kilku mikrosekund. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny zwijania białek, takie jak: kiedy następuje kolaps hydrofobowy? Procedurę zademonstruje Ling Woo, postdoc w moim laboratorium, rozpoczynając proces wytwarzania mikrofluidycznych chipów do mieszania.W pierwszej kolejności oczyść czterocalowe wafle krzemowe FU świeżym roztworem piranha, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Następnie, przy użyciu pieca do niskociśnieniowego chemicznego osadzania z fazy gazowej, nanieś powłokę polikrzemową o grubości około jednego mikrona na każde planowane 10 mikronów głębokości końcowych kanałów mikrofluidycznych. Po dalszej obróbce wafli opisanej w tekście, nanieś na nie metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu Z 52 14 o grubości 900 nanometrów, a następnie przeprowadź wstępne wypiekanie w temperaturze 90 stopni Celsius bezpośrednio na płycie grzejnej przez jedną minutę lub w piecu w temperaturze 110 stopni Celsius przez 30 minut.Po wyrównaniu maski fotograficznej należy zapewnić twardy kontakt próżniowy, naświetlając początkowo fotorezyst światłem UV przez kilka sekund. Następnie należy wywołać wzór w fotorezyście zgodnie z opisem w protokole pisemnym. Elementy na płytce krzemowej należy sprawdzić pod mikroskopem, a następnie przeprowadzić wygrzewanie końcowe w temperaturze 115 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez dwie minuty.Następnie przeprowadź proces DCU wafli za pomocą urządzenia Asher lub plazmy tlenowej przez 2,5 minuty przy mocy RF wynoszącej 100 watów. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE), wytraw warstwę polikrzemionową w całości, aż do znajdującej się poniżej krzemionki topionej. Usuń pozostałości fotorezystu i potraktuj wafel zgodnie z instrukcjami zawartymi w tekście.Zmierz głębokość trawienia, aby upewnić się, że powłoka poliimideowa została całkowicie przetrawiona. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE) przeznaczonego do tlenków, wytraw fused silica na głębokość około 10 mikronów na każdy mikron grubości powłoki poliimideowej. Oczyść wafelek w systemie Asher dla matryc przez cztery minuty przy mocy RF 100 W, a następnie usuń polikrzem usuwając go w trawaczu difluorkiem ksenonu. Przed wykonaniem otworów w wafelku, nanieś metodą spin-coatingu nową warstwę fotorezystu o grubości jednego mikrona, aby chronić kanały podczas dalszej obróbki.Następnie przymocuj wafelek stroną z naniesionymi strukturami do szklanej płytki poświęcalnej za pomocą Aqua Bond 55. Dbając o to, aby w spoiwie nie powstały pęcherzyki powietrza, użyj sterowanej komputerowo wiertarki z diamentowym wiertłem i roztworem czyszczącym micro 90. Zapobiega to przywieraniu małych odłamków szkła do kanałów, co mogłoby doprowadzić do zapchania chipu podczas użytkowania.Następnie należy wywiercić otwory wejściowe i wyjściowe w każdym chipie. Przemyć wafelek wodą dejonizowaną, używając strzykawki do wstrzyknięcia wody do każdego otworu. Następnie, po usunięciu fotomaski, moczyć w wodzie z mydłem przez godzinę.Nałożyć rezyst i czynnik wiążący zgodnie z opisem w tekście. Przepłukać wafer wodą dejonizowaną oraz ciepłą wodą z mydłem. Ponownie przepłukać każdy otwór za pomocą strzykawki, unikając kontaktu z wytrawionymi strukturami po przedmuchaniu wafera azotem.Kontynuuj suszenie w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C. Sprawdź otwory, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, i w razie potrzeby powtórz etapy czyszczenia. Następne kroki należy wykonać w pomieszczeniu czystym.Zmierz głębokość kanałów za pomocą optycznego lub mechanicznego profilometru powierzchniowego. Oczyść wafelek oraz pokrycie szklane z topionego kwarcu zgodnie z opisem w tekście w pomieszczeniu czystym (clean room). Thoroughly wysusz wafelek prądem gazu azotowego przez co najmniej pięć minut.Następnie należy położyć wafelek stroną z naniesionymi strukturami do góry na stosie trzech do czterech chusteczek do czystych pomieszczeń, umieszczonych na twardej, płaskiej powierzchni, takiej jak mała tafla szkła. Powtórz tę czynność z deactivate szkiełkiem podstawowym. Chwyć szkiełko podstawowe za krawędź i odwróć je tak, aby strona polerowana znajdowała się skierowana w dół nad waflekiem.Ostrożnie wyrównaj płaskie krawędzie, upuść szkiełko przykrywowe na wafer i poczekaj, aż osiądzie, przesuwając go wyłącznie w poziomie w celu skorygowania wyrównania. Jednym palcem naciśnij środek wafera. Powinien pojawić się front wiązania, który zacznie rozprzestrzeniać się na zewnątrz.W razie potrzeby należy wywrzeć dodatkowy nacisk w innych miejscach wokół wafla, aby przesunąć front wiązania. Po umieszczeniu szczelnie zamkniętych wafli w piecu wysokotemperaturowym zaprogramowanym zgodnie z profilem temperatury opisanym w tekście, należy pociąć wafel za pomocą piły do wafli na pojedyncze chipy. Kolektor do utrzymania chipa mieszającego i roztworów może być wykonany z tworzywa sztucznego, takiego jak lexan lub pleksiglas, lub z aluminium.W celu kontroli temperatury przymocuj chip do kolektora za pomocą małych o-ringów i utrwal go pierścieniem zabezpieczającym, który zapewnia niezakłócony widok optyczny centrum chipa. Rowki pod o-ringi powinny być płytsze niż standardowo, aby zapewnić szczelne dopasowanie bez wywierania nadmiernego nacisku na chip. Po zamontowaniu chipa dodaj roztwory do zbiorników centralnego i bocznych, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych na dnie studzienek.Umieść rozdzielacz na odwróconym mikroskopie i zbadaj obszar mieszania za pomocą okularu lub wyjścia z kamery. Latarka żarowa umieszczona na górze rozdzielacza zapewni wystarczające oświetlenie. Aby zobaczyć strumień, zastosuj barwnik lub roztwór o wysokim współczynniku załamania światła w kanale centralnym.Ponieważ objętości stosowane w tym mieszalniku są bardzo małe, przepływem można sterować za pomocą ciśnienia powietrza przyłożonego nad studzienkami z roztworem. Aby zwizualizować strumień, należy rozpocząć od ciśnienia w kanale bocznym wynoszącego zero psi i powoli zwiększać je, aż zrówna się z ciśnieniem w kanale środkowym. Jeśli jeden z kanałów bocznych jest zapchany, strumień zostanie pchnięty w stronę jednej ze ścianek kanału wylotowego.Jeśli pojawi się widoczny zator, można go usunąć, przykładając ciśnienie lub próżnię do kanału wyjściowego za pomocą strzykawki. W przypadku zablokowania chipa przez białka lub inny materiał organiczny, można go oczyścić, namaczając w roztworze pirania przez całą noc. Wprowadź skupioną wiązkę laserową do mikroskopu klasy badawczej, używając lustra dichroicznego umieszczonego wewnątrz lub bezpośrednio na zewnątrz mikroskopu.Ustaw laser w taki sposób, aby ogniska było widać w okularze lub na kamerze w pobliżu obszaru mieszania. Fluorescencja białka w mieszalniku jest zbierana przez obiektyw i przesyłana przez lustro dichroiczne, skupiana przez soczewkę w otworze udiernikowym (pinhole) i obrazowana na liczniku fotonów. Przeskanuj chip za pomocą skanera piezoelektrycznego w osiach x i y, aby uzyskać obraz obszaru mieszania.Wybierz pozycję na strumieniu i wykonaj skanowanie w osiach X i Y, aby odnaleźć ognisko w centrum kanału w płaszczyźnie pionowej. Głębia ostrości mikroskopu jest znacznie mniejsza niż głębokość kanału, a szybkość przepływu w kanale jest jednorodna, z wyjątkiem obszaru w odległości jednego mikrona od ścianek. Zatem rozdzielczość czasowa obserwowanej fluorescencji jest określana przede wszystkim przez rozmiar plamki konfokalnej.Wykonaj skanowanie poziome w kanale wylotowym w odstępach 100 micronów wzdłuż strumienia, obserwując każdą pozycję przez około jedną milisekundę. Przesuń stolik mikroskopu o 80 do 90 micronów wzdłuż strumienia, aby zarejestrować późniejsze punkty czasowe. Alternatywnie światło może być detektowane przez spektrograf i CCD za lustrem dichroicznym, przy użyciu soczewki skupiającej światło na szczelinie wlotowej.Ponieważ zbieranie danych jest wolniejsze niż w przypadku licznika fotonów, zazwyczaj najpierw wykonuje się obrazowanie strumienia za pomocą licznika fotonów, a następnie mierzy się punkty wzdłuż strumienia za pomocą spektrografu. Dane z licznika fotonów analizuje się poprzez sumowanie od trzech do pięciu pikseli wokół strumienia w każdej pozycji, aby utworzyć wykres intensywności w funkcji odległości. Czas oblicza się na podstawie odległości, wykorzystując prędkość wyliczoną z przyłożonych ciśnień.W ramach ostatniego kroku należy przeanalizować dane ze spektrografu, korzystając z jednej z metod opisanych w tekście. Przedstawiono tutaj wykres konturowy natężenia w obszarze mieszania, zmierzonego za pomocą licznika fotonów. Tło w kanale wylotowym poza strumieniem powinno być bliskie poziomowi szumów detektora i zazwyczaj nie jest odejmowane.Wyższe tło może wskazywać na niewłaściwe wyrównanie lub na to, że białko przywiera do ścianek kanału. I odwrotnie, strumień, który wygląda na załamany lub skrzywiony, szczególnie w pobliżu obszaru mieszania, świadczy o złym wytrawieniu dysz. Przedstawiono widmo rozdzielone w czasie dla białka ACell coenzyme a binding protein lub A CBP znakowanego barwnikami Alexa 4 88 i Alexa 6 47.Zielone i czerwone prostokąty wskazują długości fal przypisane odpowiednio do kanałów donora i akceptora. Z danych tych odjęto tło, aby usunąć prąd ciemny oraz sygnał laserowy. Sygnał tła zarejestrowano przy ciśnieniu w kanale środkowym wynoszącym zero funtów na cal kwadratowy.Czas mieszania można określić poprzez pomiar szybkiej reakcji, która przebiega znacznie szybciej niż proces mieszania, takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez jodek potasu. Ponieważ strumień jest mniejszy niż rozdzielczość optyczna mikroskopu, w obszarze mieszania występuje znaczny spadek intensywności. W momencie formowania się strumienia odpowiedź aparatury można usunąć, wykonując pomiar kontrolny, w którym nie zmieniono warunków roztworu.Na rysunku przedstawiono stosunek eksperymentów z mieszaniem i bez mieszania dla fluorescencji N-acetylotryptofanu. Linia wskazuje przewidywane stężenie jodku potasu uzyskane z modelowania i symulacji w programie COMSOL Multiphysics. Czas mieszania, mierzony jako czas potrzebny do spadku stężenia o 80%, wynosi osiem mikrosekund.Wykres ten przedstawia zmiany FRET w białku A CBP po rozcieńczeniu denaturatora z stężenia 6 M do 0,06 M. Dane te nie wymagają przeprowadzenia eksperymentu kontrolnego. Ponieważ FRET jest już wartością względną, a odpowiedź instrumentu została usunięta, gwałtowny skok w pobliżu T równym zero reprezentuje szybką zmianę sygnału FRET w czasie mieszania.Po tym osiągnięciu technika ta utorowała drogę badaczom zajmującym się zwijaniem białek do analizy najwcześniejszych etapów formowania się struktury białek.

microfluidic-mixers-for-studying-protein-folding

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikropłytkowe miksery do badań nad fałdowaniem białek

Tutaj opisujemy procedurę, która wykorzystuje technikę schlierena w mikroskali do pomiaru niejednorodności mieszania w urządzeniu mikroprzepływowym. Dzięki kalibracji można wyprowadzić rozkład gradientu stężeń na podstawie obrazu mikro-schlierena.

Analiza niejednorodności mieszania w urządzeniu mikroprzepływowym za pomocą mikroskalowej techniki Schliarenna

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Demonstrujemy produkcję i użycie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia wielokrotne pomiary mikroreologii śledzenia cząstek w celu zbadania reologicznych efektów powtarzających się przemian fazowych na miękkiej materii.

Połączenie mikrofluidyki i mikroreologii w celu określenia właściwości reologicznych miękkiej materii podczas powtarzających się przemian fazowych

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Protokół przedstawiony tutaj opisuje użycie Spotiton, nowatorskiego systemu robotycznego, do dostarczenia dwóch interesujących próbek na samozasłaniającą się, nanodrucianą siatkę, które mieszają się przez minimum 90 ms przed zeszkleniem w płynnym kriogenie.

Przygotowanie mikroskopowej siatki krioelektronowej do badań rozdzielczych w czasie przy użyciu nowatorskiego systemu robotycznego, Spotiton

Prezentujemy protokoły prostych testów mikroprzepływowych filamentów aktynowych, w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, które pozwalają na dokładne monitorowanie poszczególnych filamentów aktynowych w czasie rzeczywistym, podczas sekwencyjnego wystawiania ich na działanie różnych roztworów białkowych.

Wykorzystanie mikrofluidyki i mikroskopii fluorescencyjnej do badania dynamiki składania pojedynczych filamentów i wiązek aktyny

Ten protokół łączy masową fotometrię z nowatorskim systemem mikroprzepływowym do badania interakcji białko-białko o niskim powinowactwie. Podejście to opiera się na szybkim rozcieńczaniu silnie skoncentrowanych kompleksów w roztworze, co umożliwia pomiary o niskim powinowactwie i rozszerza zastosowanie fotometrii masowej.

Analiza tworzenia kompleksów białkowych w stężeniach mikromolowych poprzez sprzężenie mikrofluidyki z fotometrią masową

Prezentacja dwuwarstwowego urządzenia opartego na polidimetylosiloksanie (PDMS) do produkcji bibliotek kombinatorycznych w emulsjach (korkach) typu woda w oleju jest przedstawiona. Niezbędny sprzęt i oprogramowanie wymagane do automatyzacji produkcji zatyczek jest szczegółowo opisane w protokole, a także pokazano produkcję ilościowej biblioteki zatyczek fluorescencyjnych.

Dwuwarstwowe urządzenie mikroprzepływowe do kombinatorycznej produkcji korków

Ten protokół szczegółowo opisuje projekt i wykonanie urządzenia mikroprzepływowego odpowiedniego do badania mechaniki polimerów mikrotubul. Synteza technik mikrowytwarzania, zautomatyzowanej kontroli przepływu i modelowania obliczeniowego umożliwia stworzenie elastycznego systemu idealnie nadającego się do sondowania cytoszkieletu komórkowego in vitro.

Opracowanie opartego na mikrofluidyce podejścia do badania mechaniki polimerów mikrotubul

W niniejszym artykule przedstawiamy metodę ograniczania cząstek opartą na mikroprzepływach i przepływie hydrodynamicznym. Demonstrujemy stabilne pułapkowanie cząstek w punkcie stagnacji płynu przy użyciu mechanizmu sterowania sprzężeniem zwrotnym, co umożliwia ograniczanie i mikromanipulację dowolnymi cząstkami w zintegrowanym urządzeniu mikroprzepływowym.

Mikrofluidyczna pułapka hydrodynamiczna dla pojedynczych cząstek

Poznaj technikę mieszalników mikroprzepływowych do badania dynamiki fałdowania białek z rozdzielczością mikrosekundową. Metoda umożliwia szybkie mieszanie roztworów w około 8 mikrosekund bez turbulencji.

Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Przeglądaj więcej filmów