Miksery mikrofluidyczne do badania fałdowania białek

Ogólnym celem niniejszej procedury jest szybkie zmieszanie dwóch roztworów w celu zainicjowania reakcji biochemicznej w skali mikrosekundowej. Jest to osiągane poprzez wstępne wykonanie mikropłynnego mieszalnika. Drugim krokiem jest przyłączenie chipa do szkiełka nakrywkowego w celu uszczelnienia kanałów.

Następnie chip zostaje zamontowany w kolektorze zawierającym zbiorniki z roztworami. Ostatnim krokiem jest obrazowanie zmieszanego roztworu przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej. W efekcie reakcja biochemiczna jest rejestrowana w skali mikrosekundowej poprzez przeliczenie odległości wzdłuż kanału wylotowego na czas.

Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mieszanie w układzie stop-flow, jest to, że mieszanie nie jest ograniczone turbulencjami i następuje w ciągu kilku mikrosekund. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie zwijania białek, takie jak: kiedy następuje kolaps hydrofobowy? Procedurę zademonstruje Ling Woo, postdoc w moim laboratorium, rozpoczynając proces wytwarzania mikroprzepływowych chipów mieszających.

W pierwszej kolejności należy oczyścić czterocalowe wafle krzemowe FU świeżym roztworem piranha, zgodnie z opisem w protokole pisemnym towarzyszącym temu filmowi. Następnie, przy użyciu pieca do osadzania chemicznego z fazy gazowej przy niskim ciśnieniu (LPCVD), należy nałożyć powłokę z polikrzemu o grubości około 1 µm na każde planowane 10 µm głębokości końcowych kanałów mikroprzepływowych. Po przeprowadzeniu dalszej obróbki wafli opisanej w tekście, należy nałożyć na nie metodą spin-coatingu warstwę fotorezystu Z 52 14 o grubości 900 nm, a następnie przeprowadzić wstępne wypalanie (soft bake) bezpośrednio na płycie grzejnej w temperaturze 90 °C przez jedną minutę lub w piecu w temperaturze 110 °C przez 30 minut.

Po wyrównaniu maski światłoczułej należy zapewnić twardy kontakt próżniowy, najpierw naświetlając fotorezyst światłem UV przez kilka sekund. Następnie należy wywołać wzór w fotorezyście zgodnie z instrukcjami zawartymi w protokole pisemnym. Sprawdzić cechy na waflu za pomocą mikroskopu, a następnie przeprowadzić wygrzewanie (hard bake) w temperaturze 115 °C bezpośrednio na płycie grzejnej przez dwie minuty.

Następnie przeprowadź oczyszczanie powierzchni (DCU) wafli w urządzeniu Asher lub za pomocą plazmy tlenowej przez 2,5 minuty przy mocy RF 100 watów. Używając głębokiego trawienia reaktywnego jonami (DRIE), wytraw warstwę polikrzemionki w całości, aż do znajdującej się poniżej krzemionki topionej. Usuń pozostałości fotorezystu i opracuj wafel zgodnie z instrukcjami zawartymi w tekście.

Zmierzyć głębokość trawienia, aby upewnić się, że powłoka polimerowa została całkowicie przetrawiona. Używając głębokiego trawienia jonowego (DRIE) przeznaczonego dla tlenków, wytrawić krzemionkę stopioną na głębokość około 10 mikronów na każdy mikron grubości powłoki polimerowej. Oczyścić wafelek w urządzeniu Asher matrix przez cztery minuty przy mocy RF 100 watów, a następnie usunąć polikrzem w trawaczu dwufluorkiem ksenonu; przed wykonaniem otworów w wafelku, nanieść metodą spin coatingu nową warstwę fotorezystu o grubości jednego mikrona w celu zabezpieczenia kanałów podczas kolejnych etapów manipulacji.

Następnie przymocuj wafelek stroną z naniesionymi strukturami do szklanej płytki poświęcalnej, używając Aqua Bond 55. Dbając o to, aby w spoiwie nie pozostały pęcherzyki powietrza, użyj sterowanego komputerowo wiertła z diamentową końcówką i mikro roztworem czyszczącym 90. Zapobiega to przywieraniu małych odłamków szkła do kanałów, co mogłoby doprowadzić do zapchania układu podczas użytkowania.

Następnie należy wywiercić otwory wejściowe i wyjściowe w każdym chipie. Opłukać wafelek wodą dejonizowaną, używając strzykawki do wtryskiwania wody do każdego otworu. Po usunięciu fotomaski namoczyć w wodzie z mydłem przez jedną godzinę.

Nałożyć rezyst i warstwę wiążącą zgodnie z opisem w tekście. Przepłukać wafelek wodą dejonizowaną oraz ciepłą wodą z mydłem. Ponownie przepłukać każdy otwór za pomocą strzykawki, omijając wytrawione elementy, a następnie przedmuchać wafelek azotem.

Kontynuuj suszenie w piecu próżniowym ustawionym na 120 °C. Sprawdź otwory, aby upewnić się, że są wolne od zanieczyszczeń, i w razie potrzeby powtórz etapy czyszczenia. Kolejne kroki powinny być wykonywane w pomieszczeniu czystym.

Zmierz głębokość kanałów za pomocą optycznego lub mechanicznego profilometru powierzchniowego. Oczyść wafelek oraz szklane przykrycie z topionego kwarcu zgodnie z opisem w tekście w pomieszczeniu czystym. Dokładnie osusz wafelek strumieniem azotu przez co najmniej pięć minut.

Następnie połóż podłoże krzemowe stroną z naniesionymi strukturami do góry na stos trzech do czterech chusteczek do czystych pomieszczeń, umieszczonych na twardej, płaskiej powierzchni, np. na małej tafli szkła. Powtórz tę czynność z szkiełkiem nakrywnym. Chwyć szkiełko nakrywne za krawędź i odwróć je tak, aby strona polerowana znajdowała się skierowana w dół nad podłożem krzemowym.

Ostrożnie dopasuj płaskie krawędzie, upuść szkiełko nakrywkowe na wafer i pozwól mu osiąść, przesuwając go jedynie w poziomie w celu skorygowania wyrównania. Jednym palcem dociśnij środek wafera. Powinien pojawić się front wiązania rozprzestrzeniający się promieniście na zewnątrz.

W razie potrzeby należy przyłożyć dodatkowy nacisk w innych miejscach wokół wafla, aby przesunąć front wiązania. Po umieszczeniu zamkniętych wafli w piecu wysokotemperaturowym zaprogramowanym zgodnie z profilem temperatury opisanym w tekście, należy pociąć wafel za pomocą pralki do wafli na pojedyncze chipy. Kolektor do utrzymania chipu mieszającego i roztworów może być wykonany z tworzywa sztucznego, takiego jak lexan lub pleksiglas, lub z aluminium.

W celu kontroli temperatury przymocuj chip do kolektora za pomocą małych o-ringów i utrwal go pierścieniem zabezpieczającym, który zapewnia niezakłócony widok optyczny centrum chipa. Rowki pod o-ringi powinny być płytsze niż standardowo, aby zapewnić szczelne dopasowanie bez wywierania nadmiernego nacisku na chip. Po zamontowaniu chipa dodaj roztwory do zbiorników centralnego i bocznych, dbając o usunięcie wszelkich pęcherzyków powietrza uwięzionych na dnie studni.

Umieść kolektor na odwróconym mikroskopie i obejrzyj obszar mieszania za pomocą okularu lub wyjścia kamery. Latarka żarowa umieszczona na górze kolektora zapewni odpowiednią ilość światła. Aby zaobserwować strumień, zastosuj barwnik lub roztwór o wysokim współczynniku załamania światła w kanale środkowym.

Ponieważ objętości stosowane w tym mieszalniku są bardzo małe, przepływem można sterować za pomocą ciśnienia powietrza przyłożonego nad studzienkami z roztworem. Aby zwizualizować strumień, należy rozpocząć od ciśnienia w kanale bocznym wynoszącego zero psi i powoli zwiększać je do poziomu równego ciśnieniu w kanale centralnym. Jeśli jeden z kanałów bocznych jest zapchany, strumień zostanie przesunięty w stronę jednej ze ścianek kanału wylotowego.

W przypadku pojawienia się widocznego zatoru można go usunąć, przykładając ciśnienie lub próżnię do kanału wylotowego za pomocą strzykawki. Jeśli chip zostanie zapchany białkami lub innym materiałem organicznym, można go oczyścić, mocząc w roztworze piranha przez noc. Wprowadź skupioną wiązkę laserową do mikroskopu klasy badawczej, korzystając z lustra dichroicznego znajdującego się wewnątrz lub bezpośrednio na zewnątrz mikroskopu.

Ustaw laser tak, aby ognisko było widoczne w okularze lub kamerze w niewielkiej odległości od obszaru mieszania. Fluorescencja białka w mieszalniku jest zbierana przez obiektyw, przechodzi przez lustro dichroiczne, jest skupiana przez soczewkę na otworze zwężającym (pinhole), a następnie obrazowana na liczniku fotonów. Skanuj chip za pomocą skanera piezoelektrycznego w osiach x i y, aby uzyskać obraz obszaru mieszania.

Wybierz pozycję na strumieniu i wykonaj skanowanie w osiach X i Y, aby znaleźć punkt ostrzenia w centrum kanału w płaszczyźnie pionowej. Głębia ostrości mikroskopu jest znacznie mniejsza niż głębokość kanału, a prędkość przepływu w kanale jest jednorodna, z wyjątkiem obszaru jednego mikrona od ścianek. W związku z tym rozdzielczość czasowa obserwowanej fluorescencji jest determinowana przede wszystkim przez rozmiar plamki konfokalnej.

Skanuj poziomo w obrębie kanału wylotowego w odstępach 100 µm wzdłuż strumienia, obserwując każdą pozycję przez około jedną milisekundę. Przesuń stoлик mikroskopu o 80 do 90 µm wzdłuż strumienia, aby uchwycić późniejsze momenty czasowe. Alternatywnie światło może być wykrywane przez spektrograf i detektor CCD za lustrem dichroicznym, stosując soczewkę do skupienia światła na szczelinie wejściowej.

Ponieważ zbieranie danych jest wolniejsze niż w przypadku licznika fotonów, zazwyczaj najpierw obrazuje się strumień za pomocą licznika fotonów, a następnie mierzy się punkty wzdłuż strumienia za pomocą spektrografu. Dane z licznika fotonów analizuje się poprzez sumowanie od trzech do pięciu pikseli wokół strumienia w każdej pozycji, aby stworzyć wykres natężenia w funkcji odległości. Czas oblicza się z odległości, korzystając z wyznaczonej prędkości na podstawie przyłożonych ciśnień.

W ostatnim kroku należy przeanalizować dane ze spektrografu, korzystając z jednej z metod opisanych w tekście. Przedstawiono tutaj wykres konturowy natężenia w obszarze mieszania, zmierzony za pomocą licznika fotonów. Tło w kanale wylotowym poza strumieniem powinno być zbliżone do poziomu szumów detektora i zazwyczaj nie jest odejmowane.

Wyższe tło może wskazywać na niewłaściwe ustawienie lub to, że białko przykleja się do ścianek kanału. Z kolei strumień, który wydaje się załamany lub krzywy, szczególnie w pobliżu obszaru mieszania, wskazuje na wadliwe wytrawienie dysz. Przedstawiono widma rozdzielone w czasie dla białka ACell coenzyme a binding protein lub A CBP znakowanego barwnikami Alexa 488 i Alexa 647.

Zielone i czerwone prostokąty wskazują długości fal wyznaczone odpowiednio jako kanały donora i akceptora. Z tych danych odjęto tło, aby usunąć prąd ciemny i sygnał laserowy. Sygnał tła zarejestrowano przy ciśnieniu w kanale centralnym wynoszącym zero funtów na cal kwadratowy.

Czas mieszania można wyznaczyć poprzez pomiar szybkiej reakcji, która przebiega znacznie szybciej niż samo mieszanie, takiej jak gaszenie fluorescencji tryptofanu przez jodek potasu. Ponieważ strumień jest mniejszy niż rozdzielczość optyczna mikroskopu, w obszarze mieszania następuje znaczny spadek intensywności. Wraz z formowaniem się strumienia odpowiedź instrumentu może zostać usunięta poprzez wykonanie pomiaru kontrolnego, w którym warunki roztworów nie ulegają zmianie.

Na tej rycinie przedstawiono stosunek eksperymentów z mieszaniem i bez mieszania fluorescencji N-acetylo-tryptofanoamidu. Linia wskazuje przewidywane stężenie jodku potasu uzyskane z modelowania i symulacji w programie COMSOL Multiphysics. Czas mieszania, mierzony jako czas potrzebny na spadek stężenia o 80%, wynosi osiem mikrosekund.

Wykres ten przedstawia zmiany FRET w białku A CBP po rozcieńczeniu denaturatora z poziomu 6 M do 0,06 M. Dane te nie wymagają przeprowadzenia eksperymentu kontrolnego. Ponieważ FRET jest już wartością względną (stosunkiem), a odpowiedź urządzenia została już usunięta, gwałtowny skok w pobliżu T równym zero reprezentuje szybką zmianę sygnału FRET w czasie mieszania.

Po tym odkryciu technika ta utorowała badaczom z dziedziny zwijania białek drogę do zgłębiania najwcześniejszych etapów formowania się struktury białek.