Name: System do hodowli ex vivo zarodka trzustki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-27T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Poznaj metodę hodowli ex vivo zarodkowych pączków trzustki myszy do badań nad morfogenezą i różnicowaniem komórek. Technika umożliwia obserwację rozwoju trzustki w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania w laboratorium Spagnoli są finansowane przez Helmholtz Association, grant FP7-IRG-2008-ENDOPANC oraz grant ERC-2009-Starting HEPATOPANCREATIC.

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu został dostosowany z techniki pierwotnie opisanej przez Percivala i Slacka9 oraz zoptymalizowany pod kątem mikroskopii konfokalnej.
1. Powlekanie szalek hodowlanych z szklanym dnem
Następujące kroki należy przeprowadzić w warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
<ol>
 <li>Wyizolowane fragmenty trzustki (eksplanty) hoduje się w szalkach Petriego o średnicy 35 mm z szklanym dnem z mikrootworem o średnicy 20 mm (np. MatTek Corporation). Należy używać jednej szalki z szklanym dnem na jedną kulturę eksplantów przez cały czas trwania hodowli. W dniu poprzedzającym sekcję i izolację pączków trzustki należy pokryć mikrootwory szklanego dna fibronektyną.</li>
 <li>Sterylną fibronektynę rozcieńcza się w wodzie do hodowli komórkowych do stężenia końcowego 50 μg/ml, a następnie dodaje minimalną objętość (~150 μl) do 20-mm mikrootworu płytek MatTek, tak aby pokryć całą szklaną powierzchnię (Rysunek 1E). Szalki należy umieścić w lodówce w temperaturze 4 °C w celu inkubacji przez noc.</li>
 <li>W dniu sekcji należy odessać fibronektynę, wypłukać mikrootwór wodą do hodowli komórkowych i dodać minimalną objętość 150 μl pożywki BME (Basal Medium Eagle) uzupełnionej o Pen/Strep (1%), glutaminę (1%) oraz gentamycynę w stężeniu 50 μg/ml [Pożywka do sekcji]. Pokryte szalki należy pozostawić w komorze z laminarnym przepływem powietrza do momentu wysiania eksplantów.</li>
</ol>
Jeśli nie wszystkie szalki pokryte fibronektyną zostaną wykorzystane, można je przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C. Nie należy dopuścić do wyschnięcia szalek; należy je wypełnić pożywką do sekcji (Dissection Medium) i umieścić w lodówce.
Oprócz fibronektyny, eksplanty trzustki były z sukcesem hodowane na różnych podłożach, takich jak laminina9, matrigel10,11 lub membrany mikroporowe12. Ze względu na jej wpływ na rozgałęzianie, jako podłoże stosujemy fibronektynę9.
2. Disekcja grzbietowego pąka trzustki z embrionów myszy w dniach E11.5 - E12.5
<ol>
 <li>Zabija się ciążne myszy w 11,5 lub 12,5 dniu embrionalnym (E), a następnie pobiera embriony za pomocą narzędzi sekcyjnych uprzednio oczyszczonych 70% etanolem. Wypreparowaną macicę umieszcza się w płytkach 10-cm zawierających lodowaty PBS uzupełniony o 50 μg/ml gentamycyny.</li>
 <li>Pod stereomikroskopem z oświetleniem górnym macicę rozdziela się na poszczególne segmenty embrionalne za pomocą małych nożyczek lub pęsety Dumont, delikatnie oddzielając mięsień macicy i usuwając poszczególne embriony otoczone błoną decalidualną. Stosuje się standardowe techniki sekcji embrionów13, aby odsłonić embriony oraz usunąć worek żółtkowy i błonę owodniową. Następnie usuwa się górną część ciała embrionu (powyżej wątroby) oraz region ogona. Pozwoli to na odsłonięcie organów wewnętrznych (Rysunek 1B). Środkową część ciała embrionów przenosi się do płytek 10-cm zawierających lodowate medium do sekcji BME.</li>
 <li>Do wizualizacji i wypreparowania grzbietowego pąka trzustki pod stereomikroskopem stosuje się teraz wyłącznie oświetlenie prześwietlające od dołu. Delikatnie otwiera się środkową część ciała embrionu, wykonując pęsetą nacięcie boczne. Lokalizuje się żołądek i śledzionę. Grzbietowy pąk trzustki jest przytwierdzony bocznie do tylnej części żołądka (Rysunek 1C). Za pomocą pęsety Dumont wypreparowuje się grzbietowy pąk trzustki z sąsiednich struktur, takich jak żołądek i śledziona, pozostawiając niewielką ilość mezenchymy wokół nabłonka (Rysunek 1D). Za pomocą szklanej pipety Pasteura izolowany pąk przenosi się do szalki Petriego 35-mm zawierającej zimne medium do sekcji BME uzupełnione o 10% płodowej surowicy cielęcej [Medium hodowlane]. Kroki te powtarza się, aż wszystkie trzustki zostaną wyizolowane. W przypadku izolacji trzustek o różnych genotypach należy przechowywać je oddzielnie, używając płytek Nunc 4-dołkowych.</li>
</ol>
3. Wysiew i hodowla eksplantów trzustki
Ostateczne wysianie eksplantatów przeprowadza się w pomieszczeniu do kultur tkankowych i/lub w bezpośrednim sąsiedztwie inkubatora do kultur tkankowych, aby zminimalizować przemieszczanie kultur.
<ol>
 <li>W warunkach sterylnych, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy zastąpić podłoże do sekcji BME w naczyniach MatTek powlekonych fibronektyną ok. 150 μl podłoża hodowlanego BME uprzednio ogrzanego do 37 °C.</li>
 <li>Przy użyciu szklanej pipety Pasteura ostrożnie przenieść eksplanty trzustki do powlekonych naczyń MatTek (jeden eksplant na naczynie) w celu długoterminowej hodowli. Aby zapewnić rozprzestrzenianie się tkanki podczas hodowli, w razie potrzeby można delikatnie naciąć mezenchymę otaczającą eksplanty za pomocą cienkiej igły.</li>
 <li>Kultury należy delikatnie umieścić w inkubatorze do hodowli tkanek (37 °C; 5% CO2) na kilka godzin, aby eksplanty przytwierdziły się do szklanego dna mikrowycieków. Po ich przytwierdzeniu należy dopełnić naczynia MatTek od 1,5 ml do 2 ml podłoża hodowlanego BME uprzednio ogrzanego do 37 °C. Dzień sekcji uznaje się za dzień 0.</li>
 <li>Manipulacje z kulturami eksplantów trzustki przeprowadza się w warunkach sterylnych w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Podłoże hodowlane BME wymienia się co drugi dzień, chyba że wymagania eksperymentalne narzucają inny harmonogram (np. inkubacja eksplantów z czynnikami chemicznymi). Eksplanty można hodować w tych warunkach od 5 dni do jednego tygodnia.</li>
</ol>
4. Protokół barwienia immunofluorescencyjnego całych preparatów dla eksplantów trzustki
Wszystkie etapy protokołu immunofluorescencji (od utrwalania po obrazowanie) są wykonywane w tej samej szalce MatTek, co pozwala na uzyskanie lepszych obrazów niż w przypadku szalek z plastikowym dnem. Po utrwaleniu hodowle eksplantów trzustki nie muszą być utrzymywane w warunkach sterylnych.
<ol>
 <li>Odssać pożywkę hodowlaną BME i wypłukać eksplant raz 2 ml 1X PBS.</li>
 <li>W celu utrwalenia eksplantu zastąpić PBS 2 ml schłodzonego do 0 °C 4% paraformaldehydu (PFA) i pozostawić naczynie na lodzie na 20 min. Od czasu do czasu delikatnie zakręcić płytką, unikając jednak korzystania z platform kołyszących, aby eksplant nie oddzielił się od podłoża.</li>
 <li>Usunąć PFA i wypłukać eksplant trzy razy 2 ml 1X PBS przez 10 min każdego płukania w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Zablokować wiązania niespecyficzne, stosując 2 ml roztworu blokującego (1X PBS + 0.1% Triton-X + 3% surowicy osła) przez co najmniej 30 min w RT.</li>
 <li>Rozcieńczyć przeciwciało pierwotne w roztworze blokującym i dodać ~150 μl rozcieńczenia bezpośrednio do 20-milimetrowej studni płytki MatTek, tak aby pokryć całą powierzchnię eksplantu, i inkubować przez noc w 4 °C. Aby zminimalizować przemieszczanie próbek, przeciwciało pierwotne należy dodać do eksplantów bezpośrednio w pomieszczeniu chłodniczym (4 °C). Aby zapobiec odparowywaniu, przed dodaniem przeciwciał płytki MatTek należy umieścić w komorze wilgotnościowej.</li>
 <li>Następnego dnia usunąć roztwór przeciwciał i wypłukać trzy razy 2 ml 1X PBS + 0.1 % Tween-20 (PBT) przez 30 min każdego płukania w RT.</li>
 <li>Rozcieńczyć przeciwciało wtórne w roztworze blokującym [zgodnie z zaleceniami producenta; stosujemy przeciwciała wtórne z barwnikami Alexa Fluor pochodzenia osiołkowego w rozcieńczeniu 1:750] i dodać ~150 μl rozcieńczenia bezpośrednio do 20-milimetrowej studni płytki MatTek, pokrywając całą powierzchnię eksplantu, i inkubować przez 1-2 h w RT w ciemności. W celu kontrastowania jąder komórkowych dodać Hoechst wraz z rozcieńczeniem przeciwciał wtórnych. Aby zapobiec odparowywaniu, przed dodaniem przeciwciał płytki MatTek należy umieścić w komorze wilgotnościowej.</li>
 <li>Wypłukać trzy razy 2 ml 1X PBS + 0.1 % Tween-20 (PBT) przez 30 min każdego płukania w RT.</li>
 <li>Przed montowaniem wypłukać raz 1X PBS, aby usunąć Tween-20. Zamontować preparat, dodając jedną kroplę wodnego medium montującego (z anty-fadingiem) do 20-milimetrowej studni płytki MatTek. Delikatnie przykryć eksplant szkiełkiem podstawowym, unikając pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Eksplanty na płytkach MatTek można oglądać za pomocą standardowej mikroskopii w kontraście fazowym lub mikroskopii konfokalnej, w zależności od celów eksperymentu. Do analizy mikroskopowej konfokalnej stosujemy odwrócony mikroskop Zeiss LSM 700. Należy ustawić odpowiednie lasery dla użytych fluoroforów. Wybrać obiektyw, który pozwoli obrazować pożądany obszar eksplantu trzustki. Obiektyw imersyjny wodny 10X jest odpowiedni do utrzymania całego eksplantu w polu widzenia. Obiektywy imersyjne wodne lub olejowe 40X są odpowiednie do obrazowania konkretnych regionów eksplantu trzustki z większą rozdzielczością. Eksplanty można poddać sekcjonowaniu optycznemu, a następnie zrekonstruować uzyskane stosy Z (Z-stacks) w 3D przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>
5. Protokół obrazowania żywych komórek w eksplantach trzustki
<ol>
 <li>Konfiguracja komory środowiskowej: należy użyć obudowy środowiskowej oraz małej komory inkubacyjnej [z kontrolą temperatury i poziomu CO2] umieszczonej na stoliku mikroskopu. Prawidłowa hodowla embrionalnej trzustki wymaga stabilnej temperatury 37 °C oraz kontrolowanej atmosfery z uwilgotnionym 5% CO2. Odpowiednie komory są dostępne u kilku dostawców (np. Zeiss, Nikon, Olympus). Zmontować moduł grzewczy i włączyć go co najmniej 1 hr przed rozpoczęciem obrazowania, aby sprzęt mógł się rozgrzać, a zawartość CO2 ustabilizować na poziomie 5%.</li>
 <li>Do obrazowania time-lapse kultur eksplantów trzustki używamy odwróconego mikroskopu Zeiss LSM 700. Dobór laserów i obiektywów opisano w punkcie 4.10.</li>
 <li>Przed rozpoczęciem obrazowania na żywo należy odczekać, aż eksplant trzustki dobrze przywrze do szalki z szklanym dnem. [Obrazowanie na żywo zazwyczaj rozpoczynamy w Dniu 1]. 
 W komorze z laminarnym przepływem powietrza należy odessać pożywkę z eksplantem i zastąpić ją świeżą pożywką hodowlaną BME, aby zapewnić optymalne warunki odżywcze na starcie.</li>
 <li>Ostrożnie przenieść eksplanty do pomieszczenia z mikroskopem i umieścić szalkę MatTek w komorze inkubacyjnej w uchwycie na preparaty mikroskopu konfokalnego.</li>
 <li>Przygotować obiektyw (np. dodać olej lub medium wodne, zależnie od wybranego obiektywu imersyjnego) i ustawić ostrość na interesujący obszar w eksplantcie. Prawidłowo zamknąć komorę środowiskową. Aby zapobiec parowaniu podczas akwizycji time-lapse z użyciem obiektywów imersyjnych wodnych, zamiast wody zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie lepkich cieczy imersyjnych (np. Zeiss Immersol W).</li>
 <li>Ustawić natężenie lasera, parametry akwizycji stosu Z oraz odstępy czasowe (patrz również sekcja Discussion w celu rozwiązywania problemów). Rozpocząć eksperyment.</li>
 <li>Po obrazowaniu wyeksportować stosy Z oraz wszystkie punkty czasowe i przeanalizować je za pomocą odpowiedniego oprogramowania (np. ImageJ, Volocity, Imaris, Huygens).</li>
</ol>
6. Reprezentatywne wyniki
Grzbietowe pączki trzustki (wraz z otaczającym je mezenchymem) wypreparowano z embrionów myszy między 11,5 a 12,5 dniem rozwoju (E11.5–E12.5) i wysiano bezpośrednio na szalki hodowlane z dna szklanego (Rysunek 1). Naczynia krwionośne występują w mezenchymie otaczającej nabłonek i mogą zostać uwidocznione poprzez immunobarwienie z użyciem markera śródbłonka Pecam12 (dane nie pokazano). Po dwóch dniach hodowli eksplantaty trzustki wykazaly znaczny wzrost i zaczely organizowac sie w rozgałęzione struktury nabłonkowe, których jądra były dodatnie pod kątem trzustkowego czynnika transkrypcyjnego Pdx1 (Rysunek 2A-C). Średnia grubość w osi z eksplantów trzustki w 3. dniu hodowli wynosi 60-80 μmPowierzchnię i objętość eksplantatów można zmierzyć przy użyciu odpowiedniego oprogramowania (np. Huygens). Analizy morfologiczne i immunofluorescencyjne wykazały, że eksplanty trzustki hodowane zgodnie z tym protokołem odtworzyły in vivo wczesna różnicowanie trzustki i zdarzenia morfogenetyczne5,10,11,14 (Rycina 2). Eksplanty trzustki w 4. dniu hodowli uległy typowej segregacji nabłonka na obszary „wierzchołkowe i pniowe” (tip and trunk)8, z widocznymi komórkami progenitorowymi cpa1+ na końcach odgałęzień nabłonkowych (Rycina 2C) oraz zróżnicowane komórki insulinowe (insulin+) i glukagonowe (glucagon+), zorganizowane w klastry wewnątrz pnia (Rysunek 2D). Ponadto nabłonek trzustki w ex vivo hodowle wykazały prawidłową organizację cytoszkieletu i polaryzację komórek, z apikalną lokalizacją aktyny F (Rycina 2E, na zielono) oraz integrynę $\beta 1$ w błonach podstawnych (Rycina 2E, na czerwono).
Aby badać rozgałęzianie trzustki w czasie rzeczywistym, embrionalne eksplanty trzustki wyizolowano z dwukolorowej fluorescencyjnej linii reporterowej myszy membrane-Tomato/membrane-Green15 (mT/mG; linia myszy dostępna w Jackson Laboratory) (Rycina 3). Pojedyncze klatki z filmu time-lapse przedstawiającego eksplanty trzustki mT/mG hodowane in vitro pokazano na Rycynie 3. Lokalizacja białka fluorescencyjnego mT w strukturach błonowych zarysowuje morfologię komórek i pozwala na rozróżnienie drobnych wypustek komórkowych, co umożliwia śledzenie przebudowy i migracji komórek w czasie.
Po 12-godzinnym eksperymencie time-lapse sygnał fluorescencyjny mT pozostaje aktywny i wykrywalny, mimo że jego intensywność ulega zmniejszeniu, co najprawdopodobniej wynika z fotouszkodzeń (Rycina 3). Rozwiązania techniczne pozwalające uniknąć lub ograniczyć fotouszkodzenia i fototoksyczność omówiono w sekcji Dyskusja.
<img alt="Schemat analizy zarodka; stadia rozwojowe; preparowane zarodki w laboratorium; opisane szczegóły." src="/files/ftp_upload/3979/3979fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schematyczna reprezentacja preparowania grzbietowego pączka trzustki z zarodka myszy w stadium E12.5. (A) Obraz w polu jasnym zarodka myszy E12.5. Górna część ciała zarodka (powyżej wątroby) oraz obszar ogona zostają usunięte, aby wyizolować środkową część ciała (B). Nacięcia zaznaczono czerwonymi liniami przerywanymi. (C) Dalsza dyssekcja prowadzi do odsłonięcia obszaru żołądka i dwunastnicy (zaznaczonego przerywaną ramką). Grzbietowy pączek trzustki (patrz czerwone przerywane koło) znajduje się u podstawy żołądka, obok primordium śledziony. Wypreparowany grzbietowy pączek trzustki (D) zostaje przeniesiony pipetą Pasteura do mikrododatka szalki z przeszklonym dnem zawierającej pożywkę hodowlaną BME (E, F). Skróty: sto (żołądek), sp (śledziona), dp (grzbietowy pączek trzustki), duo (dwunastnica). Paski skali, 1000 μm (A, C).
<img alt="Analiza różnicowania i wzrostu komórek; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; markery białkowe Pdx1, Cpa1." src="/files/ftp_upload/3979/3979fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Analiza immunofluorescencyjna całych preparatów (whole-mount) konfokalna kultur eksplantów trzustki. (A) Obrazy w polu jasnym eksplantów trzustki w 1. i 2. dniu hodowli ex vivo. Czerwona przerywana linia wskazuje początek rozgałęziania nabłonka. (B) Rekonstrukcja 3D całego preparatu po immunobarwieniu na Pdx1 w 3. dniu hodowli trzustki. Eksplanty trzustki wykazały obecność cewek komórek Pdx1+ ulegających intensywnemu rozgałęzianiu po 48 h hodowli. (C) Immunobarwienie całego preparatu eksplantu trzustki w 3. dniu z użyciem przeciwciał przeciwko markerowi błony podstawno-bocznej E-kadherynie (Ecad), markerowi progenitorów końcowych, karboksypeptydazie 1 (Cpa1) oraz fosfo-histonie H3 (pHH3). Większość aktywnych mitotycznie komórek pHH3+ kolokalizuje się na peryferyjnych końcówkach z komórkami Cpa1+. Linie przerywane wskazują końcówki gałęzi. (D) Immunobarwienie całego preparatu na markery linii endokrynnej, insulinę (Ins) i glukagon (Gluca) w 3. dniu. Żółte strzałki wskazują skupiska komórek Ins+ i Gluca+. Wstawka (D'), powiększenie jednego ze skupisk komórek endokrynnych. (E) Immunobarwienie całego preparatu eksplantu trzustki w 3. dniu na Pdx1, integrynę β1 (β1int) i F-aktynę (Fact). Komórki mezenchymalne (gwiazdki) przeplatające się z komórkami nabłonkowymi Pdx1-dodatnimi. Obrazy przedstawione w C, D i E są pojedynczymi konfokalnymi przekrojami optycznymi z serii Z. Paski skali, 100 μm (A, B); 50 μm (C-E).
<img alt="Mikroskopia poklatkowa wzrostu komórkowego wykazanego przez czerwoną fluorescencję w ciągu 12 godzin." src="/files/ftp_upload/3979/3979fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Reprezentatywne obrazowanie żywych komórek eksplantu trzustki hodowanego ex vivo. (A-D) Klatki z filmu poklatkowego eksplantu trzustki z zarodka transgenicznej myszy mT/mG. Czas obrazowania podano w godzinach:minutach. Obrazowanie eksplantu rozpoczęto w 1. dniu. Obrazy serii Z (Z-stack) pozyskiwano za pomocą obiektywu imersyjnego olejowego 40X co 12 min przez łącznie 15 hr. Linie przerywane wskazują końce rozgałęzień oraz granicę między nabłonkiem a mezenchymą. Pasek skali, 50 μm.

<ol><li>Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+biology+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Developmental biology of the pancreas.</a> Development. 121, 1569-1580 (1995).</li>
<li>Pan, F., Wright, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+organogenesis%3A+from+bud+to+plexus+to+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pancreas organogenesis: from bud to plexus to gland.</a> Dev. Dyn. 240, 530-565 (2011).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Plasticity+within+the+Pancreas-+Lessons+Learned+from+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Plasticity within the Pancreas- Lessons Learned from Development.</a> Developmental Cell. 18, 342-356 (2010).</li>
<li>Spagnoli, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+endoderm+to+pancreas%3A+a+multistep+journey%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">From endoderm to pancreas: a multistep journey.</a> Cell. Mol. Life Sci. 64, 2378-2390 (2007).</li>
<li>Hick, A. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+primitive+duct+formation+in+the+pancreas+and+submandibular+glands%3A+a+role+for+SDF-1%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of primitive duct formation in the pancreas and submandibular glands: a role for SDF-1.</a> BMC Dev. Biol. 9, 1-17 (2009).</li>
<li>Villasenor, A., Chong, D., Henkemeyer, M., Cleaver, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+dynamics+of+pancreatic+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis.</a> Development. 137, 4295-4305 (2010).</li>
<li>Kesavan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42-Mediated+Tubulogenesis+Controls+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cdc42-Mediated Tubulogenesis Controls Cell Specification.</a> Cell. 139, 791-801 (2009).</li>
<li>Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Multipotent+Progenitor+Domain+Guides+Pancreatic+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Multipotent Progenitor Domain Guides Pancreatic Organogenesis.</a> Developmental Cell. 13, 103-114 (2007).</li>
<li>Percival, A., Slack, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+pancreatic+development+using+a+cell+lineage+label%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Analysis of pancreatic development using a cell lineage label.</a> Exp. Cell Res. 247, 123-132 (1999).</li>
<li>Miralles, F., Czernichow, P., Ozaki, K., Itoh, N., Scharfmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+through+fibroblast+growth+factor+receptor+2b+plays+a+key+role+in+the+development+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signaling through fibroblast growth factor receptor 2b plays a key role in the development of the exocrine pancreas.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 6267-6272 (1999).</li>
<li>Puri, S., Hebrok, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+embryonic+pancreas+development+using+real-time+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of embryonic pancreas development using real-time imaging.</a> Dev. Biol. 306, 82-93 (2007).</li>
<li>Magenheim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+restrain+pancreas+branching%2C+differentiation+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Blood vessels restrain pancreas branching, differentiation and growth.</a> Development. 138, 4743-4752 (2011).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+A+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual</a>. , Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2003).</li>
<li>Horb, L. D., Slack, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cell+division+in+branching+morphogenesis+and+differentiation+of+the+embryonic+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of cell division in branching morphogenesis and differentiation of the embryonic pancreas.</a> Int. J. Dev. Biol. 44, 791-796 (2000).</li>
<li>Muzumdar, M., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45, 593-605 (2007).</li>
</ol>

Nie zgłoszono konfliktów interesów.

Po określeniu losu trzustki, komórki progenitorowe trzustki przechodzą intensywną proliferację, różnicowanie i morfogenezę, aby ostatecznie utworzyć dojrzały i funkcjonalny organ2,4. Obecnie w dużej mierze nie wiadomo, w jaki sposób zachodzi rozgałęzianie w trzustce i jak jest ono powiązane z proliferacją i różnicowaniem progenitorów. Hodowle eksplantów trzustki stanowią idealny system do wyjaśnienia tych procesów ex vivo5,9,11. Dzięki połączeniu obrazowania żywych komórek z eksplantami <em...

<table><tbody><tr><td>Przeciwciała:&lt;br/&gt;Karboksypeptydaza&lt;br/&gt;E-kadheryna&lt;br/&gt;aktyna F&lt;br/&gt;Glukagon&lt;br/&gt;Insulina&lt;br/&gt;&amp;#946;integrina 1&lt;br/&gt;Pdx1&lt;br/&gt;Pdx1&lt;br/&gt;Fosfo-histona H3</td><td>AbD Serotec&lt;br/&gt;Invitrogen&lt;br/&gt;Sondy molekularne&lt;br/&gt;ImmunoStar&lt;br/&gt;Millipore&lt;br/&gt;Millipore&lt;br/&gt;Abcam&lt;br/&gt;Bank hybrydomów&lt;br/&gt;Sygnalizacja komórkowa</td><td>1810-0006&lt;br/&gt;13-1900&lt;br/&gt;A-12373&lt;br/&gt;20076&lt;br/&gt;4011-01&lt;br/&gt;MAB1997&lt;br/&gt;ab47267&lt;br/&gt;F109-D12&lt;br/&gt;9706</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże podstawowe Eagle (BME)</td><td>Sigma</td><td>B1522-500ML</td><td>Przechowywane w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Woda o jakości do hodowli komórkowych</td><td>PAA</td><td>S15-012</td><td>Przechowywane w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Szalki hodowlane (z dnem szklanym), 35 mm </td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>surowica osła</td><td>Chemicon</td><td>S30-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>Płódka cielęca Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Przechowywane w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>Invitrogen</td><td>330100-8</td><td>Roztwór zapasowy 1 mg/ml w wodzie klasy do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Gentamycyna </td><td>Invitrogen</td><td>15750-037</td><td>Przechowywać w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-024</td><td>Przechowywać w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Multidyszki 4-dołkowe</td><td>Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopy:&lt;br/&gt;Odwrócony mikroskop konfokalny (LSM 700) &lt;br/&gt;Stereomikroskop (Discovery V12)</td><td>Zeiss&lt;trzon mózgu&gt;&lt;br/&gt;Zeiss</td><td></td><td>Cele:&lt;br/&gt;C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (odległość robocza 1,8 mm; głębokość obrazowania ~100 μm); C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (odległość robocza 0,28 mm; głębokość obrazowania ~50 μm) &amp;mu;m)&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Transiluminacja od dołu i oświetlenie światłowodowe od góry</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td>Roztwór stokowy 20% </td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura (szklana), 150 mm</td><td>VWR</td><td>HECH567/1</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>PAA</td><td>P11-010</td><td>Przechowywać w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 60 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 35 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627161</td><td></td></tr><tr><td>1X PBS, pH 7,4</td><td>PAA</td><td>H15-002</td><td>Przechowywać w warunkach sterylnych</td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe z zakrzywionym ostrzem 8 mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15023-10</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta zegarmistrzowska Dumont #5</td><td>Roth</td><td>K342.1</td><td></td></tr></tbody></table>

system do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Trzustka kontroluje życiowe funkcje naszego organizmu, w tym produkcję enzymów trawiennych i regulację poziomu cukru we krwi1. Chociaż w ostatniej dekadzie wiele badań przyczyniło się do zbudowania solidnych podstaw zrozumienia organogenezy trzustki, w naszej wiedzy na temat wczesnego formowania się tego narządu wciąż istnieją istotne luki2. Pełne zrozumienie tych wczesnych zdarzeń dostarczy wiedzy nie tylko na temat rozwoju tego organu, ale także na temat nieuleczalnych chorób atakujących trzustkę, takich jak cukrzyca czy rak trzustki. Wreszcie, informacje te posłużą jako wzorzec do opracowania terapii zastępczych komórek w kontekście cukrzycy.
 Podczas embriogenezy trzustka powstaje z odrębnych embrionalnych wypustek endodermy przedjelita grzbietowej i brzusznej w 9,5 dniu embrionalnym (E) u zarodka myszy3,4. Obie wypustki wyewaginują do otaczającego mezenchymy jako lite pąki nabłonkowe, które ulegają proliferacji, rozgałęzianiu i różnicowaniu, aby stworzyć w pełni dojrzały organ2,5,6. Niedawne dowody sugerują, że wzrost i różnicowanie linii komórkowych trzustki, w tym produkujących insulinę komórek β, zależy od właściwej architektury tkankowej, przebudowy nabłonka oraz rozmieszczenia komórek w obrębie rozgałęziającego się nabłonka trzustki7,8. Jednak sposób, w jaki przebiega morfogeneza rozgałęziania i jak jest ona koordynowana z proliferacją i różnicowaniem w trzustce, pozostaje w dużej mierze nieznany. Wynika to częściowo z faktu, że obecna wiedza na temat tych procesów rozwojowych opierała się niemal wyłącznie na analizie utrwalonych preparatów, podczas gdy zdarzenia morfogenetyczne są wysoce dynamiczne.
 W niniejszej pracy przedstawiamy metodę wycinania i hodowli pączków trzustki zarodka myszy ex vivo na szalkach z szklanym dnem, co umożliwia bezpośrednią wizualizację rozwijającej się trzustki (Rysunek 1). System hodowli ten został zaprojektowany z myślą o konfokalnej mikroskopii skaningowej, a w szczególności o obrazowaniu żywych komórek. Eksplanty trzustki można przygotować nie tylko z embrionów myszy typu dzikiego, ale również ze szczepów myszy modyfikowanych genetycznie (np. transgenicznych lub knockout), co pozwala na badania fenotypów mutantów w czasie rzeczywistym. Co więcej, ten system hodowli ex vivo jest cenny w badaniu wpływu związków chemicznych na rozwój trzustki, umożliwiając uzyskanie ilościowych danych na temat proliferacji, wzrostu, wydłużania, rozgałęziania, tubulogenezy i różnicowania. Podsumowując, opracowanie metody hodowli eksplantów trzustki ex vivo w połączeniu z obrazowaniem o wysokiej rozdzielczości stanowi doskonałą platformę do obserwacji zdarzeń morfogenetycznych i różnicowania zachodzących w rozwijającym się zarodku myszy.

W niniejszej pracy opisujemy metodę izolacji, hodowli i manipulacji embrionalną trzustką myszy. Stanowi ona doskonały system ex vivo do badania różnych aspektów rozwoju trzustki, w tym morfogenezy, różnicowania i wzrostu. Eksplanty pąka trzustki mogą być hodowane przez kilka dni i wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, w tym w immunofluorescencji całych preparatów oraz obrazowaniu na żywo.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Trzustka kontroluje kluczowe funkcje naszego organizmu, w tym produkcję enzymów trawiennych oraz regulację poziomu cukru we krwi1. Chociaż w...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i hodowla pączków trzustki zarodka myszy ex vivo, co umożliwia bezpośrednią wizualizację rozwijającej się trzustki. Osiąga się to poprzez wstępną sekcję zarodków myszy w 11,5 lub 12,5 dniu embrionalnym oraz usunięcie górnej części ciała i regionu ogona w celu wyizolowania środkowej części ciała zarodka. W drugim kroku odsłania się region dwunastnicy oraz żołądek w celu lokalizacji, a następnie przeprowadza sekcję grzbietowego pączka trzustki.Następnie pączek zostaje przeniesiony do mikrootworu płytki MacTech i hodowany przez maksymalnie jeden tydzień. Na koniec eksplant można poddać obrazowaniu żywych komórek lub utrwalić, barwić metodą whole mount i analizować za pomocą obrazowania immunofluorescencyjnego. Ostatecznie można ocenić różnicowanie komórek trzustki, organizację cytoszkieletu, polaryzację komórek oraz morfogenezę rozgałęzioną.Hodowla ex vivo eksplantów trzustki może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące organogenezy trzustki, takie jak morfogeneza rozgałęzieniowa. Sposób, w jaki przebiega ona w rozwijającej się trzustce oraz związek tego procesu ze wzrostem i różnicowaniem, pozostają istotnymi za

a-system-for-ex-vivo-culturing-of-embryonic-pancreas

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System do ex vivo hodowli trzustki zarodkowej

Niniejsze badanie opisuje metodę ukierunkowanego różnicowania w celu indukowania różnicowania komórek macierzystych zarodkowych człowieka w kierunku trzustkowym. Szczególnie istotnym odkryciem jest fakt, że kokultura z komórkami śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych progenitorów trzustkowych do komórek wykazujących ekspresję insuliny.

Kowykultura komórek śródbłonka pośredniczy w dojrzewaniu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do insulinotwórczych komórek trzustki w podejściu ukierunkowanego różnicowania

W tej publikacji opisujemy szybką i wygodną procedurę izolacji i hodowli pierwotnych komórek groniastych trzustki z mysiej trzustki. Metoda ta stanowi cenne podejście do badania fizjologii świeżych, pierwotnych, normalnych/nieprzekształconych zewnątrzwydzielniczych komórek trzustki.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek groniastych trzustki myszy

Opisano protokół izolacji, hodowli i obrazowania klastrów komórek wysp trzustkowych (ICC) pochodzących z ludzkich komórek trzustki płodu. Metoda szczegółowo opisuje kroki niezbędne do wygenerowania ICC z tkanki, hodowli jako monowarstw lub w zawiesinie jako agregatów, oraz obrazu dla markerów proliferacji i decyzji o losie komórek trzustki.

Izolacja, hodowla i obrazowanie klastrów ludzkich płodowych komórek trzustkowych

Metoda hodowli trójwymiarowej opisana w tym protokole podsumowuje rozwój trzustki z rozproszonych embrionalnych przodków trzustki myszy, włączając ich znaczną ekspansję, różnicowanie i morfogenezę do rozgałęzionego organu. Ta metoda jest podatna na obrazowanie, funkcjonalną ingerencję i manipulację niszą.

In vitro Organogeneza trzustki z rozproszonych przodków embrionalnych myszy

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Opisujemy tutaj protokół izolowania nienaruszonych wysepek od nowonarodzonych myszy. Trzustkę częściowo trawiono kolagenazą, a następnie myto i zbierano ręcznie. Od nowo narodzonych myszy można uzyskać od 20 do 80 klastrów wysp trzustkowych na trzustkę, które nadają się do kilku badań na wyspach trzustkowych.

Skuteczna izolacja funkcjonalnych wysp trzustkowych z trzustki noworodka myszy

Tutaj prezentujemy protokół generowania ekspresji insuliny 3D mysich trzustek z swobodnie pływających e10.5 dysocjowanych komórek progenitorowych trzustki i związanych z nimi mezenchymów.

Wytwarzanie bezrusztowaniowych, trójwymiarowych trzustek eksprymujących insulinę z mysich progenitorów trzustki in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) w komórki białka homeobox 1+ trzustki/dwunastnicy (PDX1+) w celu wytworzenia linii trzustki w oparciu o jednowarstwowy wzrost pojedynczych komórek bez typu kolonijnego. Metoda ta jest odpowiednia do wytwarzania jednorodnych komórek pochodzących z hPSC, manipulacji genetycznych i badań przesiewowych.

Wydajne wytwarzanie białka homeobox trzustki/dwunastnicy 1+ w tylnym odcinku jelita przedniego/trzustki z hPSC w kulturach adhezyjnych

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Poznaj metodę hodowli ex vivo zarodkowych pączków trzustki myszy do badań nad morfogenezą i różnicowaniem komórek. Technika umożliwia obserwację rozwoju trzustki w kontrolowanych warunkach.

System do hodowli ex vivo trzustki embrionalnej

Przeglądaj więcej filmów