Name: Test reporterowy Oct4GiP do badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Poznaj metodę reporterową Oct4GiP do badania genów regulujących samoodnawianie mysich embrionalnych komórek macierzystych. Technika wykorzystuje cytometrię przepływową do szybkiej oceny funkcji genów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Bradowi Lackfordowi za przeczytanie i redakcję manuskryptu. Badania te były wspierane przez National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health Intramural Research Program Z01ES102745 (dla G. H.).

1. Hodowla komórek ES myszy Oct4GiP
Komórki Oct4GiP zostały uprzejmie udostępnione przez dr. Austina Smitha. Pochodzą one od myszy szczepu 129/Ola niosących transgen Oct4-GFPiresPac 4,5 . Są one utrzymywane na płytkach do hodowli tkankowej powlekanych żelatyną w pełnej pożywce ESGRO complete plus clonal grade (Millipore) lub w pożywce M15: DMEM (Invitrogen) uzupełnionej o 15% FBS, 1000 U/ml ESGRO (Millipore), 1x nieessential amino acids (Invitrogen), 1x EmbryoMax Nucleasides (Millipore) oraz 10 μM β-merkaptoetanolu.
<ol>
	<li>Pokryć płytki 0,1% żelatyną (Sigma) w temperaturze pokojowej przez 30 minut (0,1 ml roztworu żelatyny/cm2).</li>
	<li>Wysiać komórki Oct4GiP na płytkach pokrytych żelatyną w zagęszczeniu ~2 x 104/cm2.</li>
	<li>Przesiewać komórki co dwa dni przy użyciu 0,05% trypsyny.</li>
</ol>
2. Transfekcja siRNA w komórkach Oct4GiP
Test reportera Oct4GiP najwygodniej jest przeprowadzać w płytkach 96- lub 384-dołkowych z płaskim dnem, pokrytych żelatyną (Corning lub BD), w pożywce M15. Ogólna procedura została przedstawiona na Rysunku 1.
<ol>
	<li>Przygotowanie kompleksów siRNA-lipid:
	<ol>
		<li>W przypadku transfekcji na płytkach 96-dołkowych, przygotować kompleksy siRNA-lipid w płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U.</li>
		<li>W każdym dołku zmieszać 10 μl OptiMEM (Invitrogen) oraz 0.3 μl Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
		<li>Do mieszaniny lipid-OptiMEM dodać 5 pmol siRNA i inkubować przez kolejne 15 minut. Stosunek siRNA : lipid wynosi 100 pmol : 6ul.</li>
		<li>Przenieść kompleksy siRNA-lipid w OptiMEM z płytki z dnem w kształcie litery U do płytki z płaskim dnem pokrytej żelatyną za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>W przypadku transfekcji na płytkach 384-dołkowych, przygotować kompleksy siRNA-lipid, stosując 0.1 μl Lipofectamine 2000 i 2 pmol siRNA w 10 μl OptiMEM.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Końcowe stężenie siRNA w transfekcjach wynosi 50 nM. Należy wykonać 3-4 powtórzenia biologiczne dla każdej transfekcji siRNA. Przygotować mieszaniny główne (master mix) kompleksów siRNA-lipid w płytce z wypukłym dnem (U-bottom), a następnie rozdzielić je do płytki z płaskim dnem pokrytej żelatyną.
<ol start="2">
	<li>Wysiew i transfekcja komórek Oct4GiP:
	<ol>
		<li>W przypadku transfekcji w płytkach 96-dołkowych, zebrać komórki Oct4GiP i resuspender je w świeżym medium M15 do stężenia 9 x 104 komórek/ml.</li>
		<li>Za pomocą pipety wielokanałowej nanieść 100 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka.</li>
		<li>Wymieszać zawiesinę komórkową z wcześniej naniesionymi kompleksami siRNA-lipidami w dołku, pipetując ciecz w górę i w dół 3-5 razy. Zmieniać końcówki przy transfekcjach różnymi siRNA.</li>
		<li>W przypadku transfekcji w płytkach 384-dołkowych, resuspender komórki Oct4GiP do stężenia 6 x 104 komórek/ml i nanieść 30 μl zawiesiny komórkowej do każdego dołka.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Uwaga: Optymalna gęstość wysiewu komórek to zazwyczaj 3 x 105 cells/cm2, jednak może ona wymagać dalszej optymalizacji w przypadku siRNAs, które drastycznie wpływają na wzrost lub żywotność komórek. Niska gęstość wysiewu prowadzi do słabej przeżywalności komórek podczas transfekcji. Wysoka gęstość wysiewu prowadzi do wysokiego tła z powodu różnicowania indukowanego wysoką konfluencją komórek. W razie potrzeby należy przetestować gęstość wysiewu w zakresie 2-4 x 105 cells/cm2.
<ol start="3">
	<li>Wymiana pożywki:
	<ol>
		<li>Usunąć starą pożywkę za pomocą aspiratora wielokanałowego (Corning) lub końcówki do aspiracji próżniowej (VP-Scientific). Należy uważać, aby nie uszkodzić komórek znajdujących się na dnie płytek.</li>
		<li>Codziennie dostarczać komórkom świeżą pożywkę dla komórek ES (100 μl dla płytki 96-dołkowej i 30 μl dla płytki 384-dołkowej) przy użyciu pipety wielokanałowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Analiza FACS
<ol>
	<li>Dysocjacja komórek:
	<ol>
		<li>Cztery dni po transfekcji usunąć medium za pomocą aspiratora wielokanałowego (Corning) lub ssawki próżniowej (VP-Scientific).</li>
		<li>W przypadku płytek 96-dołkowych wypłukać komórki raz 100 μl PBS.</li>
		<li>Do każdego dołka dodać 25 μl 0,25% trypsyny za pomocą pipety wielokanałowej.</li>
		<li>Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut, okresowo wytrząsając i wizualnie sprawdzając, czy komórki całkowicie się odkleiły.</li>
		<li>Dodać 90 μl PBS z 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę, a następnie dysocjować komórki do postaci zawiesiny pojedynczych komórek poprzez wielokrotne pipetowanie.</li>
		<li>W przypadku płytek 384-dołkowych zdysocjować komórki za pomocą 10 μl trypsyny i zneutralizować 30 μl PBS z 10% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analiza FACS:
	<ol>
		<li>Analizę fluorescencji GFP przeprowadzić na analizatorze FACS BD LSRII wyposażonym w moduł HTS lub innym podobnie wyposażonym analizatorze FACS (np. Accuri lub Intellicyt).</li>
		<li>Użyć trybu wysokoprzepustowego w HTS i przeanalizować 10 μl zawiesiny komórek. Ustawić próg zliczania na 1,0 x 104 komórek.</li>
		<li>Dostosować napięcie PMT oraz próg, aby uchwycić komórki na wykresie rozrzutu forward vs. side-scatter. Wyznaczyć bramkę dla populacji żywych komórek na wykresie forward vs. side-scatter.</li>
		<li>Utworzyć histogram dla kanału GFP. Ustawić bramkę w kanale GFP tak, aby w komórkach poddanych transfekcji mock lub kontrolnym siRNA około 10% komórek wydawało się być GFP-ujemnych.</li>
		<li>Wyznaczyć % komórek GFP-ujemnych dla każdej próby: % komórek zróżnicowanych = % komórek GFP-ujemnych. Porównać % komórek zróżnicowanych między transfekcjami siRNA eksperymentalnymi a kontrolnymi za pomocą obustronnego testu t, a wyniki pozytywne ocenić przy wartościach p &lt; 0,01.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
Oct4, Nanog i Sox2 to trzy geny, które odgrywają krytyczną rolę w utrzymaniu zdolności do samoodnawiania komórek ES 6,7,9-11. Rycina 2 pokazuje, że test reporterowy Oct4GiP pozwala na łatwe wykrycie różnicowania wywołanego wyciszeniem tych czynników w komórkach ES Oct4GiP.
Rycina 2A pokazuje, że komórki ES Oct4GiP są dodatnie pod kątem GFP, gdy są utrzymywane jako komórki ES. Rycina 2B przedstawia wykres rozrzutu forward scatter vs. side scatter oraz histogram kanału GFP dla komórek Oct4GiP transfekowanych kontrolnymi siRNA lub siRNA przeciwko Oct4. Konieczne jest wyznaczenie bramki dla żywych komórek na wykresie forward scatter vs. side scatter, ponieważ martwe komórki i debris są ujemne pod kątem GFP i zwiększą tło. Z drugiej strony, dyskryminacja dubletów w celu wykluczenia możliwych skupisk komórek nie zawsze jest wymagana. W komórkach transfekowanych kontrolnym siRNA zdecydowana większość komórek powinna być dodatnia pod kątem GFP. Jeśli w studzienkach z komórkami transfekowanymi kontrolnym siRNA występują wyraźne populacje ujemne pod kątem GFP, może to oznaczać, że wyjściowe komórki Oct4GiP lub procedura transfekcji zostały naruszone, a wynik może być nieinterpretowalny.
Rycina 2C przedstawia wykres słupkowy obrazujący % zróżnicowanych komórek (% zróżnicowanych komórek = % komórek GFP-ujemnych) z komórek transfekowanych siRNA kontrolnym, Oct4-, Nanog- oraz Sox2-.
<img alt="Schemat transfekcji siRNA w komórkach ES Oct4GiP; analiza FACS komórek GFP-ujemnych." src="/files/ftp_upload/3987/3987fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Schemat testu reporterowego Oct4GiP.
<img alt="Cytometria przepływowa, analiza FACS dla GFP, efekty siRNA. Wykres słupkowy: procent różnicowania komórek." src="/files/ftp_upload/3987/3987fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Test reporterowy Oct4GiP umożliwia wykrycie różnicowania komórek ES wywołanego wyciszeniem Nanog, Oct4 lub Sox2. A) Komórki E14Tg2a (typ dziki, czarna linia) oraz Oct4GiP (zielona linia) poddano analizie FACS. Histogram kanału GFP pokazuje, że komórki Oct4GiP są dodatnie pod kątem GFP. B) Komórki Oct4GiP w płytkach 96-dołkowych przetransfekowano siRNA kontrolnym lub siRNA przeciwko Oct4, a następnie poddano analizie FACS 4 dni po transfekcji. Przedstawiono wykresy rozrzutu forward scatter vs side scatter oraz histogramy kanału GFP dla przetransfekowanych komórek. C) Komórki Oct4GiP przetransfekowano siRNA kontrolnym lub siRNA przeciwko Nanog, Oct4 lub Sox2. Procent zróżnicowanych komórek (% Differentiated Cells) określono na podstawie procentu komórek ujemnych pod kątem GFP 4 dni po transfekcji i przedstawiono jako średnią +/- błąd standardowy średniej (n = 4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3987/3987fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+differentiation%3A+emergence+of+a+new+era+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine.</a> Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).</li>
<li>Murry, C. E., Keller, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+embryonic+stem+cells+to+clinically+relevant+populations%3A+lessons+from+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development.</a> Cell. 132, 661-680 (2008).</li>
<li>Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+RNAi+screen+identifies+a+new+transcriptional+module+required+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for self-renewal.</a> Genes Dev. 23, 837-848 (2009).</li>
<li>Ying, Q. L., Nichols, J., Evans, E. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changing+potency+by+spontaneous+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Changing potency by spontaneous fusion.</a> Nature. 416, 545-548 (2002).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Nichols, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+pluripotent+stem+cells+in+the+mammalian+embryo+depends+on+the+POU+transcription+factor+Oct4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4.</a> Cell. 95, 379-391 (1998).</li>
<li>Niwa, H., Miyazaki, J., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+expression+of+Oct-3%2F4+defines+differentiation%2C+dedifferentiation+or+self-renewal+of+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative expression of Oct-3/4 defines differentiation, dedifferentiation or self-renewal of ES cells.</a> Nat. Genet. 24, 372-376 (2000).</li>
<li>Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+RNAi+screen+for+Oct4+modulators+defines+a+role+of+the+Paf1+complex+for+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for embryonic stem cell identity.</a> Cell Stem Cell. 4, 403-415 (2009).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+cloning+of+Nanog%2C+a+pluripotency+sustaining+factor+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells.</a> Cell. 113, 643-655 (2003).</li>
<li>Masui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotency+governed+by+Sox2+via+regulation+of+Oct3%2F4+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pluripotency governed by Sox2 via regulation of Oct3/4 expression in mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Cell Biol. 9, 625-635 (2007).</li>
<li>Mitsui, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+homeoprotein+Nanog+is+required+for+maintenance+of+pluripotency+in+mouse+epiblast+and+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The homeoprotein Nanog is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells.</a> Cell. 113, 631-642 (2003).</li>
<li>Fazzio, T. G., Huff, J. T., Panning, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNAi+screen+of+chromatin+proteins+identifies+Tip60-p400+as+a+regulator+of+embryonic+stem+cell+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An RNAi screen of chromatin proteins identifies Tip60-p400 as a regulator of embryonic stem cell identity.</a> Cell. 134, 162-174 (2008).</li>
<li>Pease, S., Braghetta, P., Gearing, D., Grail, D., Williams, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+embryonic+stem+%28ES%29+cells+in+media+supplemented+with+recombinant+leukemia+inhibitory+factor%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Isolation of embryonic stem (ES) cells in media supplemented with recombinant leukemia inhibitory factor.</a> 141, 344-352 (1990).</li>
<li>Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+embryonic+stem+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the embryonic stem cell state.</a> Cell. 144, 940-954 (2011).</li>
<li>Chambers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450, 1230-1234 (2007).</li>
<li>Maherali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directly+reprogrammed+fibroblasts+show+global+epigenetic+remodeling+and+widespread+tissue+contribution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li>
<li>Rodda, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+nanog+by+OCT4+and+SOX2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of nanog by OCT4 and SOX2.</a> J. Biol. Chem. 280, 24731-24737 (2005).</li>
<li>Schaniel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+short+hairpin+RNAs--triggers+of+gene+silencing--into+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Delivery of short hairpin RNAs--triggers of gene silencing--into mouse embryonic stem cells.</a> Nat. Methods. 3, 397-400 (2006).</li>
<li>Toyooka, Y., Shimosato, D., Murakami, K., Takahashi, K., Niwa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+subpopulations+in+undifferentiated+ES+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture.</a> Development. 135, 909-918 (2008).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Opisany powyżej test reporterowy Oct4GiP pozwala na ilościowy pomiar zakresu samoodnawiania w stosunku do różnicowania. W porównaniu z innymi dostępnymi metodami, takimi jak testy oparte na morfologii 12 oraz proliferacji/żywotności, oferuje on wyższą czułość i przepustowość, a także bardziej bezpośredni pomiar stanu komórek ES. Jest on zatem odpowiedni do prowadzenia przesiewów na dużą skalę oraz analizy epistazy genetycznej. Rzeczywiście, my oraz inni badacze z sukcesem wykorzystaliśmy test reporterowy Oct4G...

<table><tbody><tr><td>pożywka ESGRO complete plus clonal grade</td><td>EMD Millipore</td><td>SF001-500P</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (wysoka zawartość glukozy, 1X)</td><td>Invitrogen</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>0,25% trypsyna-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>1001817</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM (pożywka z obniżoną zawartością surowicy)</td><td>Invitrogen</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO mLIF (10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt; jednostek/1 ml)</td><td>EMD Millipore</td><td>DAM1776540</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA (aminokwasy nieessentialne)</td><td>Invitrogen</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>100x nukleozydy dla komórek ES </td><td>EMD Millipore</td><td>10620-1</td><td></td></tr><tr><td>2-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522-100ml</td><td></td></tr><tr><td>płodowa surowica bydlęca kwalifikowana pod kątem ES</td><td>Invitrogen</td><td>10437</td><td></td></tr><tr><td>siRNA przeciwko Nanog</td><td>Invitrogen</td><td>MSS231181</td><td></td></tr><tr><td>siRNA przeciwko Oct4</td><td>Dharmacon</td><td>D-046256-02</td><td></td></tr><tr><td>siRNA przeciwko Sox2</td><td>Dharmacon</td><td>M-058489-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Kontrolne siRNA: dupleks siRNA celujący w lucyferazę świetlika (5&amp;rsquo;-CGTACGCGGAATACTTCGA) zsyntezowany przez firmę Dharamcon.</td></tr></tbody></table>

analiza reporterowa oct4gip w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotencjalność i zdolność do samoodnowy to dwie definiujące cechy embrionalnych komórek macierzystych (komórek ES). Zrozumienie podstawowych mechanizmów molekularnych znacznie ułatwi wykorzystanie komórek ES w badaniach nad biologią rozwoju, modelowaniu chorób, odkrywaniu leków oraz w medycynie regeneracyjnej (przegląd w 1,2).
Aby przyspieszyć identyfikację i charakterystykę nowych regulatorów utrzymania oraz samoodnawiania komórek ES, opracowaliśmy test oparty na fluorescencyjnym reporterze do ilościowego pomiaru stanu samoodnawiania w mysich komórkach ES z wykorzystaniem linii Oct4GiP 3. Komórki Oct4GiP wykazują ekspresję zielonego białka fluorescencyjnego (GFP) pod kontrolą regionu promotora genu Oct4 4,5. Oct4 jest niezbędny do samoodnawiania komórek ES, wykazuje wysoką ekspresję w tych komórkach i jest szybko wyciszany podczas różnicowania 6,7. W rezultacie ekspresja GFP i fluorescencja w komórkach reporterowych ściśle korelują z tożsamością komórek ES 5, a analiza za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) może być wykorzystana do precyzyjnego monitorowania stanu samoodnawiania komórek na poziomie pojedynczej komórki 3,8.
W połączeniu z RNAi, test reporterowy Oct4GiP może być wykorzystany do szybkiej identyfikacji i badania regulatorów utrzymania oraz samoodnawiania komórek ES 3,8. W porównaniu do innych metod oceny samoodnawiania jest on wygodniejszy, bardziej czuły, ilościowy i tańszy. Może być przeprowadzany w płytkach 96- lub 384-dołkowych w celu prowadzenia badań na dużą skalę, takich jak przesiewy wysokoprzepustowe czy analiza epistazy genetycznej. Wreszcie, dzięki zastosowaniu innych linii komórek ES z reporterami specyficznymi dla danej linii komórkowej, opisany tutaj test może zostać zmodyfikowany w celu badania specyfikacji losu podczas różnicowania komórek ES.

Opisujemy test z reporterem fluorescencyjnym służący do szybkiej identyfikacji i charakterystyki genów regulujących utrzymanie oraz samoodnawianie embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Pluripotencja i zdolność do samoodnowy to dwie definiujące cechy zarodkowych komórek macierzystych (komórek ES). Zrozumienie leżącego u ich podstaw mechanizmu molekularnego pozwoli...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest szybkie określenie roli badanego genu w utrzymaniu zdolności do samoodnawiania się embrionalnych komórek macierzystych myszy, czyli komórek ES. Osiąga się to poprzez przygotowanie w pierwszej kolejności mieszaniny głównej do transfekcji, która zostanie wykorzystana do wyciszenia badanych genów. Jako drugi krok.Mieszaninę główną do transfekcji przenosi się na płytkę powlekaną żelatyną i dodaje komórki T 4G IP. Następnie komórki hoduje się w standardowych warunkach hodowli komórek ES, aby umożliwić wystąpienie efektu wyciszenia genu. Po czterech dniach hodowli komórki odrywa się od płytki i określa ich status samoodnawiania za pomocą cytometrii przepływowej. Ostatecznie różnice w procencie komórek GFP-ujemnych pomiędzy kontrolnymi a eksperymentalnymi komórkami T 4G IP poddanymi transfekcji siRNA można ocenić za pomocą analizy statystycznej.Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak analiza morfologii komórek czy markerów linii komórkowych, jest wyższa czułość i przepustowość, co czyni ją bardziej odpowiednią do prowadzenia przesiewów genetycznych na średnią i dużą skalę lub analizy epistazy genetycznej. Metoda ta może znacznie ułatwić badanie genów istotnych dla utrzymania i samoodnawiania się ESL. Może ona zostać również dostosowana do zdarzeń związanych z samookreślaniem, które zachodzą podczas różnicowania ESL.Komórki T 4G IP hoduje się na płytkach powlekanych żelatyną. Wysiewa się je w zagęszczeniu około 2 × 10⁴/cm² i pasażuje co dwa do trzech dni przed transfekcją. W przypadku 96-dołkowych płytek z płaskim dnem, należy rozpocząć od powlekania płytki 0,1% żelatyną, a następnie przygotować master mix Optum i Lipectomy 2000 i rozdzielić go do 96-dołkowej płytki z dnem w kształcie litery U.Inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie dodaj pięć picomoli I a do mieszaniny lipidowej optimum i inkubuj przez kolejne 15 minut. Następnie usuń żelatynę z płaskodنnej płytki 96-dołkowej i użyj pipety wielokanałowej, aby przenieść kompleksy i a lipidowe w optimum z płytki z dnem w kształcie litery U do płytek płaskodnnych. Teraz zbierz komórki OC 4G IP i resuspenduj je w świeżej pożywce M 15 do stężenia dziewięciu razy 10 do potęgi czwartej komórek na mililitr.Następnie za pomocą pipety wielokanałowej dodaj 100 µL zawiesiny komórkowej do każdej studni płaskodنnej płytki 96-dołkowej, pipetując w górę i w dół od trzech do pięciu razy, aby zmieszać zawiesinę komórkową z kompleksami sirtalipidowymi, zmieniając końcówki dla różnych transfekcji. Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 i hoduj komórki przez cztery dni. W każdym dniu hodowli użyj aspiratora wielokanałowego do usunięcia starego medium, uważając, aby nie uszkodzić komórek znajdujących się na dnie płytek.Następnie, cztery dni po transfekcji, należy podać komórkom 100 µL świeżej pożywki do hodowli komórek ES za pomocą pipety wielokanałowej. Pożywkę należy usunąć przy użyciu aspiratora wielokanałowego, a następnie raz przepłukać komórki 100 µL PBS. Po tym użyć pipety wielokanałowej, aby dodać po 25 µL 0,25% trypsyny do każdej próbki.Komórki inkubujemy przez pięć minut w temperaturze pokojowej, okazjonalnie wytrząsając naczynie. Następnie wizualnie sprawdzamy płytkę, aby upewnić się, że komórki całkowicie się oddzieliły. Po oddzieleniu komórek dodajemy 90 µL PBS z 10% FBS w celu inaktywacji trypsyny, a następnie kilkakrotnie pipetujemy zawiesinę komórkową, aby rozbić skupiska i uzyskać jednoprzeciągłą zawiesinę pojedynczych komórek.Na koniec, używając trybu wysokiej przepustowości w jednostce HTS analizatora FACS, przeanalizuj 10 µL zawiesiny komórkowej. Ustaw próg zliczania na 1,0 × 10⁴ komórek i dostosuj napięcie PMT, aby uchwycić komórki na wykresie rozrzutu forward scatter versus side scatter. Ustaw bramkę analizy dla populacji żywych komórek na wykresie rozrzutu forward scatter versus side scatter, a następnie utwórz histogram dla kanału GFP.Ustawienie bramki w kanale GFP w taki sposób, aby około 10% komórek wydawało się negatywne pod kątem GFP w komórkach kontrolnych (mock) lub komórkach transfekowanych SINA, pozwala wyznaczyć odsetek komórek zróżnicowanych na podstawie odsetka komórek negatywnych pod kątem GFP. Dla każdej metody traktowania należy porównać odsetek komórek zróżnicowanych między grupami eksperymentalnymi a kontrolnymi transfekcjami irna.Pierwszy rysunek pokazuje, że komórki E 14 TG two A typu dzikiego, reprezentowane przez czarny histogram, są negatywne pod kątem GFP, podczas gdy komórki T 4G IP, reprezentowane przez zielony histogram, są pozytywne pod kątem GFP podczas utrzymywania ich jako komórki ES. Na kolejnych dwóch rysunkach przedstawiono wykresy rozproszenia forward scatter versus side scatter oraz histogramy kanału GFP dla komórek T 4G IP cztery dni po transfekcji kontrolnymi siRNA lub siRNA przeciwko T four. W pierwszej kolejności na wykresie rozproszenia forward scatter versus side scatter wyznaczono bramkę dla żywych komórek, ponieważ martwe komórki i debris są negatywne pod kątem GFP i zwiększają tło. Jak widać w danych histogramowych, w komórkach transfekowanych kontrolnym siRNA ogromna większość komórek jest pozytywna pod kątem GFP.Niniejsze wykresy słupkowe przedstawiają procent zróżnicowanych komórek w grupie kontrolnej oraz w grupach komórek z transfekcją siRNA przeciwko OCT 4 i SOX 2, w przypadku komórek OCT 4G IP, cztery dni po transfekcji. W każdym przypadku, zgodnie z oczekiwaniami, stwierdzono, że komórki z transfekcją siRNA wykazują wyższy stopień zróżnicowania niż grupa kontrolna. Po opanowaniu tej techniki czas pracy własnej przy jednej płytce 96-dołkowej wynosi jedną godzinę.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać test reporterowy Oxford GIP do szybkiego określenia roli interesującego Cię genu w utrzymaniu stanu ESL u myszy.

oct4gip-reporter-assay-to-study-genes-that-regulate-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Test reporterowy Oct4-4GiP do badania genów regulujących utrzymanie i samoregenerację mysich komórek macierzystych embrionalnych

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Zestaw lentiwirusów Stemgent Dox Inducible Mouse TF umożliwia reprogramowanie embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) do indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS). W niniejszym materiale przedstawiamy protokół indukcji ekspresji mysich czynników transkrypcyjnych reprogramujących Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc za pomocą doksycykliny (DOX) w celu wytworzenia kolonii iPS wykazujących ekspresję typowych markerów pluripotencji mES.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez reprogramowanie embrionalnych fibroblastów myszy z wykorzystaniem indukowanego doksycykliną lentiwirusowego systemu transdukcji czterech czynników transkrypcyjnych

SC1 działa poprzez podwójne hamowanie Ras-GAP oraz ERK1. Przebadaliśmy funkcję SC1 w wspieraniu samoodnawiania się mysich komórek ES w obecności braku LIF i wykazaliśmy, że SC1 jest w stanie utrzymać samoodnawianie się kultur mysich komórek ES.

Zastosowanie SC1 (Pluripotin) w celu wspierania samoodnowy mESC wobec braku LIF

Ten film demonstruje technikę oceny aktywności kwasu retinowego w zarodkach myszy. Po wyizolowaniu komórek z zarodków myszy, komórki są hodowane wspólnie z komórkami reporterowymi kwasu retinowego (RA). Komórki embrionalne wytwarzają RZS, który indukuje ekspresję beta-galaktozydazy w komórkach reporterowych, wskazując na aktywność RA w komórkach embrionalnych.

Wykorzystanie komórek reporterowych w kokulturze do badania produkcji kwasu retinowego przez komórki embrionalne myszy

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

W tym badaniu generujemy indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste z komórek płynu owodniowego myszy, używając systemu transpozonów nieopartego na wirusach.

Produkcja pluripotencjalnych komórek macierzystych z komórek płynu owodniowego myszy przy użyciu systemu transpozonów

Tutaj prezentujemy ilościowy i skalowalny protokół do przeprowadzania ukierunkowanych badań przesiewowych małych cząsteczek dla regulatorów kinaz naiwnie zaszczepionego przejścia pluripotencjalnego.

Prosta metoda identyfikacji kinaz, które regulują pluripotencję embrionalnych komórek macierzystych za pomocą wysokoprzepustowych badań przesiewowych inhibitorów

Opisaliśmy szczegółowo dwa protokoły chemiczne do hodowli embrionalnych komórek macierzystych myszy. Ta nowa metoda wykorzystuje synergiczne mechanizmy promowania utleniania za pośrednictwem Tet (przez witaminę C) i tłumienia syntezy de novo 5-metylocytozyny (przez PD0325901) w celu utrzymania hipometylacji DNA i pluripotencji embrionalnych komórek macierzystych myszy.

Alternatywna metoda hodowli w celu utrzymania genomowej hipometylacji embrionalnych komórek macierzystych myszy przy użyciu inhibitora MEK PD0325901 i witaminy C

Protokół ten ilościowo mierzy stabilność i okres półtrwania intergenowych i intragenowych RNA wzmacniających w embrionalnych komórkach macierzystych myszy za pomocą leczenia aktinomycyną D, RT-qPCR oraz analizy regresji nieliniowej. Stosuje się strategie normalizacji specyficzne dla pozycji, aby dokładnie modelować dynamikę rozpadu eRNA w sposób zależny od kontekstu.

Zoptymalizowana ilościowa ocena stabilności RNA wzmacniającego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Protokół ten zapewnia uproszczony proces obliczeniowy do ilościowej identyfikacji początkujących transkrypcji wzmacniaczy. Integrując dostępność chromatyny, cechy chromatyny oraz dane transkrypcyjne, umożliwia dokładne wykrywanie i analizę aktywności wzmacniacza specyficzną dla nici w złożonych regionach intragenowych, pozostając jednocześnie dostępnym dla badaczy bez rozległego szkolenia bioinformatycznego.

Tok obliczeniowy do ilościowej identyfikacji RNA intergenowego/wewnątrzgenowego w embrionalnych komórkach macierzystych myszy

Poznaj metodę reporterową Oct4GiP do badania genów regulujących samoodnawianie mysich embrionalnych komórek macierzystych. Technika wykorzystuje cytometrię przepływową do szybkiej oceny funkcji genów.

Analiza reporterowa Oct4GiP w celu badania genów regulujących utrzymanie i samoodnawianie macierzystych komórek embrionalnych myszy

Przeglądaj więcej filmów