Name: Szybszy, oparty na mtPA-GFP test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, uzyskujący dane kinetyczne wielu komórek równolegle za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-20T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj zautomatyzowaną metodę pomiaru fuzji mitochondrialnej w wielu komórkach równolegle przy użyciu fotoaktywowalnego GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika ta zapewnia wysokorozdzielcze dane kinetyczne dla badań nad cukrzycą i chorobami neurodegeneracyjnymi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Tufts Center for Neuroscience Research, P30 NS047243 (Jackson), Mitochondria Affinity Research Collaborative (mtARC) wspieranemu przez Evans Center for Interdisciplinary Biomedical Research na kampusie medycznym Boston University, Link Medicine Corporation oraz firmie Zeiss za wsparcie tej pracy.

1. Przygotowanie płytki obrazowej
<ol>
 <li>Hodować komórki INS1 w pożywce RPMI zawierającej 10% standardowej płatkowej surowicy bydlęcej, 1% penicyliny i streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 50 μM 2-merkaptoetanolu, 5 mM NaHCO3, 2 mM HEPES, 2 mM kwasu pirowinowego oraz 11 mM glukozy do osiągnięcia 80% konfluencji.</li>
 <li>Poddać kultury komórek INS1 trypsynizacji przy użyciu 0,05% trypsyny i wysiać je na płytki do obrazowania z dnem z szkiełek podstawkowych powlekonych poli-D-lizyną (konfluencja 30-40%).</li>
 <li>Pozostawić płytki do osiągnięcia 60-80% konfluencji (~2 dni) i dodać adenowirusowy PA-GFP skierowany do macierzy mitochondrialnej (COXVIII) na 24 h (MOI=5). Wymienić pożywkę i pozostawić komórki do wzrostu przez kolejne 2 dni przed obrazowaniem.</li>
 <li>W dniu obrazowania dodać 7-15 nM TMRE do płytek do obrazowania i inkubować w celu wyrównania przez co najmniej 45 min.</li>
 <li>W tym czasie włączyć inkubator (tutaj zastosowano inkubator stołowy) i pozwolić mikroskopowi wyrównać temperaturę do 37 °C przez około 1 godzinę. Włączyć dopływ 5% CO2.</li>
</ol>
2. Parametry obrazowania dla konfokalnego mikroskopu Zeiss LSM 710
<ol>
 <li>Po ustabilizowaniu mikroskopu, w zakładce Acquisition kliknij „show manual tools”, otwórz panel konfiguracji obrazowania, wybierz „channel mode” i ustaw przełączanie ścieżki na każdą „frame”.</li>
 <li>W panelu ścieżki światła wybierz LSM oraz tryb kanału. Idąc od ikony preparatu w górę, zaznacz „rear”, MBS 690+ oraz MBS 488. Na dole panelu wybierz „T-PMT”, aby włączyć wizualizację kanału bright field lub DIC.</li>
 <li>Zakończ regulację parametrów ścieżki światła, ustawiając zakres dla barwnika GFP na 490-540 nm oraz dla barwnika TMRE na 580-700 nm.</li>
 <li>W trybie akwizycji ustaw pole skanowania na 512 × 512 pikseli, średnią z 4 obrazów (average 4x) i wybierz współczynnik powiększenia (zoom factor), który warto zachować na stałe w celu późniejszej kalibracji.</li>
</ol>
3. Optymalizacja parametrów obrazowania
<ol>
 <li>Używając obiektywu plan-apochromatu 100x (1,4 NA), ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła halogenowego, a nie fluorescencyjnego, aby chronić mitochondria przed fototoksycznością.</li>
 <li>Wyszukaj komórki wykazujące ekspresję PA-GFP, stosując maksymalnie otwartą dziurkę otworową (pinhole) i skanując obraz w celu znalezienia komórek o intensywniejszej zielonej fluorescencji.</li>
 <li>Wyznacz najniższą moc lasera dwufotonowego niezbędną do aktywacji PA-GFP i zoptymalizuj parametry obrazowania, upewniając się, że sygnał nie nasyca detektora. Sprawdź w kilku seriach Z, czy sygnał PA-GFP kolokalizuje z sygnałem TMRE. Utrata sygnału TMRE świadczy o depolaryzacji mitochondrialnej lub fototoksyczności; komórki wykazujące takie cechy nie powinny być wykorzystywane do analizy.</li>
 <li>Znajdź komórkę wykazującą ekspresję PA-GFP i określ współczynnik powiększenia (zoom).</li>
 <li>Ustaw zakres serii Z tak, aby zebrać 6 przekrojów (zakres ten musi być odpowiedni dla wszystkich 10 komórek, chyba że dla każdej pozycji zostanie ustawiona osobna ostrość w osi Z).</li>
 <li>Zapisz metodę obrazowania dla każdej komórki (komórka 1, komórka 2 itd.).</li>
</ol>
4. Dostosuj zautomatyzowaną część programu i wyznacz 10 komórek, które będą obserwowane w ramach 1-godzinnego testu fuzji mitochondriów
<ol>
 <li>W lewym panelu okna multitime wybierz panel „saving” (zapisywanie) i określ lokalizację, w której będą zapisywane pliki.</li>
 <li>W panelu „Acquisition” (akwizycja) wczytaj metodę akwizycji zapisaną dla komórki 1 w konfiguracji skanowania i zaznacz pole z stack. Wybierz również opcję „marked Z- middle of z stack”.</li>
 <li>W panelu „blocks” (bloki) wybierz „single block at each location”. Kliknij „add blocks” dla każdego interwału, który ma zostać zmierzony.</li>
 <li>W panelu „timing” (czas) wybierz „wait interval” i wpisz „0” w polu „wait interval before block at first location only”. Bloki 2-4 będą miały w tej sekcji wartość „15 min”.</li>
 <li>W panelu lokalizacji wybierz „move focus to load position between locations” oraz „load scan config when 'move to loc' or 'next loc' clicked”. W sekcji „edit locations list” wybierz „clear all”, a następnie zaznacz „multiple locations motorized stage”.</li>
 <li>W panelu „Bleach” zaznacz pole „bleach” i w rozwijanym menu „config” wskaż plik konfiguracyjny zgodnie z ustawieniami w głównym oknie oprogramowania. Następnie w oknie „bleaching” zapisz odpowiednią metodę fotoaktywacji. W panelu obszarów wybierz ROI dla tej konkretnej komórki i dodaj to ROI do multitime, wybierając okno „add current region to ROI list”. Upewnij się, że w rozwijanym menu „ROI” wybrana jest ta sama lokalizacja.</li>
</ol>
Aby synchronizacja czasu przebiegała prawidłowo i każda komórka miała 15-minutowy odstęp, należy zapisać dwie metody. Na liście bloków pierwszy będzie posiadał „prawdziwą” konfigurację fotoaktywacji, a pozostałe będą miały konfigurację „pozorną” (mock), która nie wykorzystuje lasera dwufotonowego. Pierwszy blok będzie również jedynym blokiem bez opóźnienia (BKIntv=0). W związku z tym metoda rozpoczyna się od jednego skanu bazowego, po którym następuje skan fotoaktywacji. Pozostałe bloki mają wartość BkIntv wynoszącą 900 s i w każdym punkcie czasowym wykonuje się dwa skany, podobnie jak w czasie 0 s, aby zachować spójność czasową.
<ol start="7">
 <li>Dla każdej z 10 komórek, które będą monitorowane w czasie, wykonaj następującą sekwencję: 
 Znajdź komórkę wykazującą ekspresję PAGFP – zapisz metodę obrazowania 
 Panel lokalizacji (Location panel) – zaznacz pozycję stolika, określ metodę obrazowania 
 Główny panel ROI – wybierz obszar zainteresowania do fotoaktywacji. Panel wybielania (Bleach panel) – zapisz konkretny obszar ROI i wczytaj go również do pola ROI: 
 Usuń ROI i zresetuj powiększenie skanowania do 1 
 Znajdź kolejną komórkę i ustaw powiększenie 
 Powtórz ten proces dla kolejnych 9 komórek</li>
</ol>
Upewnij się, że każda lokalizacja na stole oraz wszystkie bloki mają przypisaną odpowiednią metodę obrazowania (konfigurację skanowania). Upewnij się również, że pierwszy blok w każdej lokalizacji odpowiada odpowiedniej metodzie fotoaktywacji, podczas gdy pozostałe zawierają metodę „mock”. Na koniec wybierz „run”.
5. Analiza intensywności sygnału PA-GFP
<ol>
 <li>W przypadku komórek, w których sygnał fotoaktywnego GFP kolokalizuje z czerwonym sygnałem TMRE, należy odjąć tło w obrazach PAGFP (w tym przypadku użyto programu Metamorph).</li>
 <li>Następnie wyeksportuj dane do programu Excel i oblicz średnią intensywność dla stosów z-stack w każdym punkcie czasowym. Odrzuć przekroje optyczne pozbawione sygnału.</li>
 <li>Zmierz rozcieńczenie sygnału w każdym stosie z-stack, obliczając procent pierwotnego sygnału fotoaktywnego.</li>
</ol>
Każdy punkt danych jest skanowany i rejestrowany dwukrotnie, co skutkuje uzyskaniem podwojonych informacji o stosach z dla każdego punktu czasowego. Należy sprawdzić, czy wartości stosów z są zgodne. W przeciwnym razie wskazuje to na wystąpienie problemu (np. z ogniskowaniem lub ruchem komórek).
6. Reprezentatywne wyniki
Gdy dojdzie do fuzji aktywowanego i nieaktywowanego mitochondrium z PA-GFP, białko PA-GFP w macierzy mitochondrialnej miesza się z macierzą nieoznaczoną i ulega rozcieńczeniu na większym obszarze, co prowadzi do spadku intensywności sygnału (Rysunek 1A). W komórce INS1 znaczący spadek intensywności sygnału występuje co 15 minut, aż do osiągnięcia stanu równowagi fuzji mitochondrialnej (około 1 godziny). Należy zauważyć, że komórka na Rysunku 1B wykazuje niemal całkowitą kolokalizację sygnałów PA-GFP i TMRE. W tych analizach stosuje się bardzo niskie stężenie TMRE (15 nM), aby wspomóc celowanie w fotoaktywację PA-GFP, a także w celu monitorowania stanu zdrowia komórek. Komórki z dużą liczbą zdepolaryzowanych mitochondriów będą wykazywać niepełną kolokalizację PA-GFP i TMRE i nie powinny być analizowane, ponieważ wskazuje to albo na fototoksyczność, albo na komórki w stanie obumierania.
Czas równoważenia dla fuzji mitochondrialnej w komórkach INS1 zazwyczaj wynosi 1 hr, gdy aktywowane zostaje około 15% objętości mitochondriów. Czasami, nawet przy naświetleniu niewielkiego obszaru, większość mitochondriów ulega fotoaktywacji ze względu na ich silne powiązanie w sieci, co utrudnia wykrycie dalszej fuzji. Inne typy komórek mogą wykazywać inne czasy równoważenia i powinny być badane w krótszych odstępach czasu oraz przez dłuższy okres w celu scharakteryzowania dynamiki mitochondriów. Aby zahamować fuzję mitochondrialną, komórki można umieścić w środowisku lipotoksycznym. Wcześniej wykazano, że 0,4 mM palmitanu powoduje fragmentację mitochondriów i hamuje ich fuzję9. Efekt ten widoczny jest na Rysunku 2, gdzie mitochondria są pofragmentowane, ale intensywność sygnału mtPAGFP nie zmienia się tak bardzo, jak w warunkach normalnych (Rysunek 1). W związku z tym rozcieńczenie sygnału PA-GFP wynika prawdopodobnie z fuzji mitochondrialnej, a nie z fisji. W przypadku innych typów komórek sugerujemy zastosowanie innych znanych metod indukowania fragmentacji mitochondriów, takich jak wyciszenie białka OPA1, które jest niezbędne do fuzji mitochondrialnej14.
<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna, lokalizacja białka w czasie, analiza widmowa, proces obrazowania time-lapse." src="/files/ftp_upload/3991/3991fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Typowe rozcieńczenie sygnału PA-GFP po fotoaktywacji podczas testu fuzji mitochondriów. A. PA-GFP staje się stopniowo słabszy z powodu zdarzeń fuzji mitochondriów, co prowadzi do rozcieńczenia białka na coraz większym obszarze, co widać na tych obrazach projekcyjnych z 6 przekrojów optycznych ilościowanych co 15 minut. B. TMRE z PA-GFP wykazuje, że mitochondria są aktywne i nie są zdepolaryzowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig1large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.
<img alt="Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej, lokalizacja białek, time-lapse komponentów komórkowych, wyniki eksperymentalne." src="/files/ftp_upload/3991/3991fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Hamowanie fuzji mitochondrialnej za pomocą 0,4 mM palmitanu zmniejsza rozcieńczenie PA-GFP. A. Projekcje 6 przekrojów optycznych ukazujące krótkie mitochondria z niezmienną w czasie intensywnością sygnału. B. Kolokalizacja PA-GFP z TMRE wykazuje, że mitochondria nie są zdepolaryzowane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3991/3991fig2large.jpg" target="_blank"> Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększony rysunek</a>.

<ol><li>Braschi, E., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+and+the+culture+of+the+Borg%3A+understanding+the+integration+of+mitochondrial+function+within+the+reticulum%2C+the+cell%2C+and+the+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Mitochondria and the culture of the Borg: understanding the integration of mitochondrial function within the reticulum, the cell, and the organism.</a> Bioessays. 32, 958-966 (2010).</li>
<li>Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+dynamic+organelles+in+disease%2C+aging%2C+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: dynamic organelles in disease, aging, and development.</a> Cell. 125, 1241-1252 (2006).</li>
<li>Chan, D. C., Detmer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+dysfunctions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Functions and dysfunctions of mitochondrial dynamics.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 870-879 (2007).</li>
<li>Han, X. J., Tomizawa, K., Fujimura, A., Ohmori, I., Nishiki, T., Matsushita, M., Matsui, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+dynamics+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Med+Okayama%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases.</a> Acta Med Okayama. 65, 1-10 (2011).</li>
<li>Huang, H., Choi, S. Y., Frohman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+assay+for+mitochondrial+fusion+using+Renilla+luciferase+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">A quantitative assay for mitochondrial fusion using Renilla luciferase complementation.</a> Mitochondrion. 10, 559-566 (2010).</li>
<li>Karbowski, M., Arnoult, D., Chen, H., Chan, D. C., Smith, C. L., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+mitochondrial+dynamics+by+photolabeling+of+individual+organelles+shows+that+mitochondrial+fusion+is+blocked+during+the+Bax+activation+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitation of mitochondrial dynamics by photolabeling of individual organelles shows that mitochondrial fusion is blocked during the Bax activation phase of apoptosis.</a> J. Cell. Biol. 164, 493-499 (2004).</li>
<li>Legros, F., Lombes, A., Frachon, P., Rojo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion+in+human+cells+is+efficient%2C+requires+the+inner+membrane+potential%2C+and+is+mediated+by+mitofusins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion in human cells is efficient, requires the inner membrane potential, and is mediated by mitofusins.</a> Mol. Biol. Cell. 13, 4343-4354 (2002).</li>
<li>Molina, A. J., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+mitochondrial+dynamics+with+photoactivatable+%5Bcorrected%5D+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Monitoring mitochondrial dynamics with photoactivatable [corrected] green fluorescent protein.</a> Methods Enzymol. 457, 289-304 (2009).</li>
<li>Molina, A. J., Wikstrom, J. D., Stiles, L., Las, G., Mohamed, H., Elorza, A., Walzer, G., Twig, G., Katz, S., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+networking+protects+beta-cells+from+nutrient-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial networking protects beta-cells from nutrient-induced apoptosis.</a> Diabetes. 58, 2303-2315 (2009).</li>
<li>Otera, H., Mihara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+and+physiologic+functions+of+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms and physiologic functions of mitochondrial dynamics.</a> J. Biochem. 149, 241-251 (2011).</li>
<li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297, 1873-1877 (2002).</li>
<li>Schauss, A. C., Huang, H., Choi, S. Y., Xu, L., Soubeyrand, S., Bilodeau, P., Zunino, R., Rippstein, P., Frohman, M. A., McBride, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+cell-free+mitochondrial+fusion+assay+amenable+for+high-throughput+screenings+of+fusion+modulators%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel cell-free mitochondrial fusion assay amenable for high-throughput screenings of fusion modulators.</a> BMC Biol. 8, 100(2011).</li>
<li>Sheridan, C., Martin, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fission%2Ffusion+dynamics+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fission/fusion dynamics and apoptosis.</a> Mitochondrion. 10, 640-648 (2010).</li>
<li>Twig, G., Elorza, A., Molina, A. J., Mohamed, H., Wikstrom, J. D., Walzer, G., Stiles, L., Haigh, S. E., Katz, S., Las, G., Alroy, J., Wu, M., Py, B. F., Yuan, J., Deeney, J. T., Corkey, B. E., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fission+and+selective+fusion+govern+mitochondrial+segregation+and+elimination+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy.</a> EMBO J. 27, 433-446 (2008).</li>
<li>Twig, G., Graf, S. A., Wikstrom, J. D., Mohamed, H., Haigh, S. E., Elorza, A., Deutsch, M., Zurgil, N., Reynolds, N., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+and+tracking+individual+networks+within+a+complex+mitochondrial+web+with+photoactivatable+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Tagging and tracking individual networks within a complex mitochondrial web with photoactivatable GFP.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 291, C176-C184 (2006).</li>
<li>Twig, G., Hyde, B., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+fusion%2C+fission+and+autophagy+as+a+quality+control+axis%3A+the+bioenergetic+view%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial fusion, fission and autophagy as a quality control axis: the bioenergetic view.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1777, 1092-1097 (2008).</li>
<li>Twig, G., Liu, X., Liesa, M., Wikstrom, J. D., Molina, A. J., Las, G., Yaniv, G., Hajnoczky, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+properties+of+mitochondrial+fusion+events+in+pancreatic+beta-cells+and+cardiac+cells+unravel+potential+control+mechanisms+of+its+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Biophysical properties of mitochondrial fusion events in pancreatic beta-cells and cardiac cells unravel potential control mechanisms of its selectivity.</a> Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299, C477-C487 (2010).</li>
<li>Twig, G., Shirihai, O. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+between+mitochondrial+dynamics+and+mitophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid.+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The interplay between mitochondrial dynamics and mitophagy.</a> Antioxid. Redox Signal. 14, 1939-1951 (2011).</li>
</ol>

Produkcja i bezpłatny dostęp do tego artykułu są sponsorowane przez Zeiss, Inc.

Metoda ta pozwala na obrazowanie około 10 komórek jednocześnie, jeśli akwizycja odbywa się co 15 minut po fotoaktywacji. Dokładna liczba komórek zależy od tego, jak szybko uda się zlokalizować i oznaczyć komórki wykazujące ekspresję mtPAGFP w naczyniu hodowlanym oraz jak szybko zostaną skonfigurowane wszystkie parametry oprogramowania. Aby automatyzacja przebiegała sprawnie, należy zastosować równomierną warstwę komórek, ponieważ wyznaczone marginesy stosu z będą obowiązywać dla wszystkich komórek.
Wielkość tego początkowego obszaru fotoaktywacji będzie determinować czas equilibracji. Aby móc mierzyć fuzję mitochondriów, ważne jest, aby fotoaktywować jedynie 10-20% sieci, tak aby można było monitorować rozprzestrzenianie się sygnału do pozostałej części sieci w czasie. Jeśli zostanie fotoaktywowana zbyt duża część sieci, możliwe jest, że całkowita fuzja nastąpi zbyt szybko i zdarzenie to nie zostanie zarejestrowane.
Należy zachować szczególną ostrożność przy regulacji mocy lasera dwufotonowego oraz stężenia TMRE, aby uniknąć fototoksyczności prowadzącej do depolaryzacji mitochondriów. Potwierdzenie, że sygnał mtPAGFP kolokalizuje z sygnałem TMRE, może pomóc w ocenie fototoksyczności i ogólnego stanu zdrowia komórek 8,15. Należy unikać naświetlania światłem epifluorescencyjnym. Podczas poszukiwania komórek wykazujących ekspresję mtPAGFP, otwór (pinhole) powinien być maksymalnie otwarty podczas skanowania przy użyciu niskiej mocy wzbudzenia 488nm. Dostrojenie mocy lasera dwufotonowego tak, aby fotoaktywować wystarczającą ilość PA-GFP do pomiaru sygnału przez 1 godzinę, ale bez doprowadzenia do przesycenia którakolwiek z komórek, może być trudne 8. Warto jednak poświęcić czas na ten etap optymalizacji, ponieważ po uruchomieniu programu automatycznego jego zatrzymanie w celu wyboru większej liczby komórek i ponowne wznowienie jest uciążliwe.
W ramach kontroli jakości bardzo pomocne może być pozyskanie obrazu w kontraście interferencyjnym różnicowym (DIC) (lub w świetle przechodzącym), aby monitorować ostrość ustawioną na komórkach, a także w celu wykrycia pęcherzyków powietrza powstałych w oleju imersyjnym podczas skanowania; zdarza się to czasami w wyniku ruchów stolika.
Choć zastosowanie metody mtPAGFP pozwala na gromadzenie danych o jednokierunkowym przemieszczaniu się białek macierzy mitochondrialnej z mitochondriów fotoaktywowanych do tych nieoznaczonych, można tę technikę wykorzystać do badania innych procesów. Na przykład do białek błonowych można przyłączyć specyficzne fluorochromy, aby obserwować ich specyficzny ruch podczas zdarzeń fuzji, co wykazano w przypadku ABC-me, którego fuzja zachodzi w innej skali czasowej niż mieszanie rozpuszczalnych białek macierzy 15.

<table><tbody><tr><td>COXIII-adenowiralny PA-GFP</td><td>Dr. Lippincott-Schwartz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMRE</td><td>Invitrogen</td><td>T669</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop Zeiss LSM 710</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtpa-gfp, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

A Faster, High Resolution, mtPA-GFP-based Mitochondrial Fusion Assay Acquiring Kinetic Data of Multiple Cells in Parallel Using Confocal Microscopy

Fuzja mitochondriów odgrywa kluczową rolę w homeostazie wapnia w mitochondriach, bioenergetyce, autofagii i kontroli jakości. Fuzję w żywych komórkach ilościowo określa się poprzez fotokonwersję skierowanego do macierzy fotoaktywnego GFP (mtPAGFP) w podgrupie mitochondriów. Szybkość, z jaką sfotokonwertowane cząsteczki równoważą się w całej populacji mitochondriów, służy jako miara aktywności fuzji. Do tej pory pomiary przeprowadzano przy użyciu podejścia time-lapse dla pojedynczej komórki, ilościowo określając równowagę w jednej komórce w ciągu godziny. W niniejszej pracy skalujemy i automatyzujemy wcześniej opisaną metodę dla żywych komórek, opartą na wykorzystaniu mtPAGFP i niskiego stężenia TMRE (15 nm). Metoda ta polega na fotoaktywacji niewielkiej części sieci mitochondrialnej, zbieraniu wysoko rozdzielczych stosów przekrojów konfokalnych co 15 min przez 1 godzinę oraz ilościowym określeniu zmiany natężenia sygnału. W zależności od kilku czynników, takich jak łatwość znalezienia komórek wykazujących ekspresję PAGFP oraz sygnał z regionów fotoaktywowanych, możliwe jest zebranie danych z około 10 komórek w odstępach 15 min. Zapewnia to znaczną poprawę wydajności czasowej tego testu, przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej rozdzielczości ilościowej na poziomie subkomórkowym, a także parametrów kinetycznych niezbędnych do uchwycenia szczegółów zachowania mitochondriów w ich naturalnym środowisku cytoarchitektonicznym.
Dynamika mitochondrialna odgrywa istotną rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w oddychaniu, regulacji poziomu wapnia i apoptozie1,2,3,13. Struktura sieci mitochondrialnej wpływa na funkcję mitochondriów oraz sposób, w jaki oddziałują one z resztą komórki. Podlegając ciągłym procesom podziału i łączenia, sieci mitochondrialne przyjmują różne kształty – od sieci silnie połączonych po struktury bardziej pofragmentowane. Co ciekawe, choroba Alzheimera, choroba Parkinsona, choroba Charcota-Marie-Totha typu 2A oraz dominująca zanik nerwu wzrokowego są skorelowane ze zmianami morfologii mitochondriów, a konkretnie z fragmentacją sieci4,10,13. Często po fragmentacji mitochondria ulegają depolaryzacji, a ich nagromadzenie prowadzi do upośledzenia funkcji komórki18. Wykazano, że podział mitochondriów może być sygnałem dla komórki do przejścia w stan apoptozy. Może on również stanowić mechanizm oddzielania zdepolaryzowanych i nieaktywnych mitochondriów, co pozwala zachować sprawność głównej części sieci14. Z kolei łączenie się mitochondriów prowadzi do wymiany białek macierzy, substancji rozpuszczonych, mtDNA oraz gradientu elektrochemicznego i wydaje się zapobiegać postępowaniu w stronę apoptozy9. Wpływ podziału i łączenia się mitochondriów na homeostazę komórkową, a w konsekwencji na funkcjonowanie organizmu, wymaga dalszych badań, dlatego niezbędny jest ciągły rozwój i optymalizacja metod gromadzenia informacji na temat tych zjawisk.
Istniejące testy fuzji mitochondriów dostarczyły wielu cennych informacji na temat fizjologii mitochondriów, a każda z tych metod posiada własne zalety. Hybrydowy test fuzji z użyciem PEG7 polega na mieszaniu dwóch populacji komórek znakowanych w różny sposób (mtRFP i mtYFP), a następnie analizie stopnia mieszania i kolokalizacji fluoroforów w zfuzjowanych komórkach wielojądrowych. Choć metoda ta dostarczyła istotnych danych, nie wszystkie typy komórek mogą ulegać fuzji, a warunki stymulujące ten proces wiążą się z zastosowaniem toksycznych leków, które prawdopodobnie wpływają na naturalny przebieg fuzji. W ostatnim czasie opracowano technikę bezkomórkową, wykorzystującą izolowane mitochondria do obserwacji zdarzeń fuzji w oparciu o test lucyferazy1,5. Dwie linie komórkowe człowieka są celowane za pomocą odpowiednio części aminowej lub karboksylowej lucyferazy Renilla wraz z tzw. zamkiem leucynowym (leucine zipper), aby zapewnić dimeryzację po zmieszaniu. Mitochondria są izolowane z każdej z linii komórkowych, a następnie poddawane fuzji. Reakcja fuzji może zachodzić bez obecności cytozolu w warunkach fizjologicznych, przy dostępie do energii, odpowiedniej temperaturze oraz zachowaniu potencjału wewnętrznej błony mitochondrialnej. Co ciekawe, stwierdzono, że cytozol moduluje zakres fuzji, co dowodzi, że sygnalizacja komórkowa reguluje proces fuzji 4,5. Test ten będzie bardzo użyteczny w badaniach wysokoprzepustowych w celu identyfikacji komponentów aparatu fuzyjnego, a także związków farmakologicznych, które mogą wpływać na dynamikę mitochondriów. Niemniej jednak, aby uzupełnić ten test in vitro i zaobserwować te zdarzenia w środowisku komórkowym, konieczne będzie zastosowanie bardziej szczegółowych testów mitochondrialnych przeprowadzanych na całych komórkach.
Od pewnego czasu stosowana jest technika monitorowania dynamiki mitochondriów w całych komórkach, oparta na skierowanym do mitochondriów fotoaktywowalnym białku GFP (mtPAGFP)6,11. Po ekspresji mtPAGFP niewielka część sieci mitochondrialnej (10-20%) zostaje fotoaktywowana, a rozprzestrzenianie się sygnału na resztę sieci mitochondrialnej jest rejestrowane co 15 minut przez 1 godzinę przy użyciu konfokalnej obrazowni poklatkowej. Każde zdarzenie fuzji prowadzi do rozcieńczenia intensywności sygnału, co umożliwia kwantyfikację szybkości fuzji. Chociaż fuzja i fisja zachodzą w komórkach w sposób ciągły, technika ta monitoruje jedynie fuzję, ponieważ fisja nie prowadzi do rozcieńczenia sygnału PAGFP6. Współoznaczenie niskimi stężeniami TMRE (7-15 nM w komórkach INS1) pozwala na kwantyfikację potencjału błonowego mitochondriów. Gdy mitochondria są hiperpolaryzowane, pobierają więcej TMRE, a gdy ulegają depolaryzacji, tracą barwnik TMRE. Mitochondria, które ulegają depolaryzacji, nie posiadają już wystarczającego potencjału błonowego i mają tendencję do mniej wydajnej fuzji lub całkowitego braku fuzji. Dlatego aktywne mitochondria ulegające fuzji można śledzić przy tych niskich stężeniach TMRE9,15. Akumulacja zdepolaryzowanych mitochondriów pozbawionych sygnału TMRE może być oznaką fototoksyczności lub śmierci komórki. Wyższe stężenia TMRE sprawiają, że mitochondria stają się bardzo wrażliwe na światło laserowe, dlatego należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć nadmiernego znakowania TMRE. Jeśli przedmiotem zainteresowania jest efekt depolaryzacji mitochondriów, można zastosować technikę z użyciem nieco wyższych stężeń TMRE i intensywniejszego światła laserowego, aby zdepolaryzować mitochondria w sposób kontrolowany (Mitra i Lippincott-Schwartz, 2010). Aby upewnić się, że toksyczność wywołana przez TMRE nie stanowi problemu, sugerujemy poddanie obciążonych komórek (3-15 nM TMRE) parametrom obrazowania, które będą stosowane w analizie (np. 7 stosów po 6 przekrojów optycznych jeden po drugim), i ocenę stanu zdrowia komórek po 2 godzinach. Jeśli mitochondria wydają się zbyt pofragmentowane, a komórki obumierają, zamiast TMRE można zastosować inne markery mitochondrialne, takie jak dsRED lub Mitotracker red.
Metoda mtPAGFP ujawniła szczegóły dotyczące zachowania sieci mitochondrialnej, których nie można było zwizualizować za pomocą innych metod. Wiemy na przykład, że fuzja mitochondrialna może być pełna lub przejściowa, przy czym zawartość macierzy może mieszać się bez zmiany ogólnej morfologii sieci. Dodatkowo wiemy, że prawdopodobieństwo fuzji jest niezależne od czasu trwania kontaktu i wymiarów organelli, a zależy od ruchliwości organelli, potencjału błonowego oraz historii poprzedniej aktywności fuzyjnej8,15,16,17.
W niniejszym manuskrypcie opisujemy metodologię skalowania wcześniej opublikowanego protokołu z wykorzystaniem mtPAGFP i 15nM TMRE8 w celu badania wielu komórek jednocześnie i zwiększenia efektywności czasowej gromadzenia danych bez utraty rozdzielczości subkomórkowej. Stało się to możliwe dzięki zastosowaniu zautomatyzowanego stolika mikroskopowego oraz programowalnego oprogramowania do akwizycji obrazów. Oprogramowanie Zen firmy Zeiss umożliwia użytkownikowi oznakowanie i śledzenie kilku wybranych komórek wykazujących ekspresję mtPAGFP. Każda z tych komórek może zostać fotoaktywowana w określonym obszarze zainteresowania, a stosy przekrojów konfokalnych mogą być monitorowane pod kątem sygnału mtPAGFP oraz TMRE w określonych odstępach czasu. Do przeprowadzenia tego protokołu można użyć innych systemów konfokalnych, pod warunkiem dostępności programowalnego, zautomatyzowanego stolika, inkubatora z CO2 oraz sposobu fotoaktywacji PAGFP; może to być laser wielofotonowy lub laser diodowy o długości fali 405 nm.

Fuzję mitochondriów mierzono poprzez śledzenie wyrównywania rozkładu fotokonwertowanego GFP skierowanego do macierzy w całej sieci mitochondrialnej w czasie. Do tej pory jednorazowo analizie kinetycznej trwającej godzinę mogła zostać poddana tylko jedna komórka. Przedstawiamy metodę, która umożliwia jednoczesny pomiar w wielu komórkach, co przyspiesza proces gromadzenia danych.

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Fuzja mitochondrialna odgrywa kluczową rolę w homeostazie wapnia w mitochondriach, bioenergetyce, autofagii oraz kontroli jakości. Fuzję ilościowo określa się w...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest pomiar fuzji mitochondriów w obrazach 3D o wysokiej rozdzielczości w wielu komórkach jednocześnie. Osiąga się to poprzez uprzednią ekspresję fotoprzestawialnego białka GFP w analizowanych komórkach. Następnie GFP jest fotoaktywowane w niewielkim obszarze populacji mitochondriów w każdej komórce.Następnie co 15 minut pobieranych jest sześć przekrojów optycznych każdej komórki, aż do momentu wyrównania sygnału, aby ocenić stopień fuzji mitochondriów; ostatecznie, na podstawie kwantyfikacji sygnału fluorescencyjnego, można ocenić rozcieńczenie intensywności GFP w mitochondriach aktywowanych fotoaktywacją w komórkach podlegających fuzji mitochondrialnej. Główną zaletą tej techniki jest jej zautomatyzowany charakter, co pozwala na szybsze gromadzenie danych o wysokiej rozdzielczości z wielu komórek. Choć metoda ta zostanie zaprezentowana z wykorzystaniem komórek INS one i dostarczy wiedzy na temat cukrzycy, może ona zostać zastosowana do innych typów komórek w celu zbadania zjawiska fuzji mitochondriów w procesach starzenia, a także w chorobach metabolicznych i neurodegeneracyjnych.Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy automatyzacji obrazowania nie zostały opisane w innym miejscu. Po wyhodowaniu komórek INS one do 80% konfluencji, należy odseparować hodowle za pomocą 0,05% trypsyny i wysiać resuspenderowane komórki na płytki obrazujące z dnem z szkiełek pokrytych poli-D-lizyną. Po dwóch dniach hodowli do płytek należy dodać adenowirusowy fotoaktywacyjny GFP skierowany do macierzy mitochondrialnej.Następnie, po hodowli komórek przez 24 godziny, wymienić medium i pozwolić komórkom rosnąć przez kolejne dwa dni. W dniu obrazowania dodać od 7 do 15 nM TMRE do płytek do obrazowania i inkubować kultury przez co najmniej 45 minut w celu wyrównania stężeń. W tym czasie włączyć dopływ 5% carbon dioxide, inkubator oraz mikroskop po ustabilizowaniu się temperatury urządzenia.W zakładce akwizycji kliknij przycisk pokaż narzędzia ręczne. Otwórz panel konfiguracji obrazowania, wybierz tryb kanału oraz przełącznik. W panelu ścieżki światła ustaw śledzenie każdej klatki.Wybierz tryb LSM oraz tryb kanałów. Następnie, korzystając z ikony preparatu i przesuwając się w górę, zaznacz tylne MBS six 90 plus oraz MBS 4 88 na dole panelu; sprawdź TPMT, aby włączyć wizualizację kanałów brightfield lub DIC. Zakończ konfigurację parametrów drogi optycznej, ustawiając zakres dla barwnika GFP od 490 do 540 nanometrów oraz od 580 do 700 nanometrów dla barwnika TMRE.Na koniec otwórz tryb akwizycji i w menu rozmiaru ramki ustaw pole skanowania o wymiarach 512 na 512 pikseli, a w menu liczby uśrednień wybierz średnią z czterech powtórzeń. Następnie, korzystając z obiektywu, ustaw ostrość na komórkach przy użyciu światła halogenowego. Otwórz w pełni otwór pinhole i wykonaj skanowanie, aby odnaleźć jasnozielone komórki wykazujące ekspresję fotoaktywnego GFP.Wybierz dowolną moc lasera do fotoaktywacji, aktywuj komórkę, a następnie wykonaj serię Z przekrojów optycznych, aby sprawdzić, czy aktywacja jest wystarczająca. Następnie ustaw moc lasera obrazującego o długości fali 488 nanometrów na niski poziom, nie zwiększając całkowicie wzmocnienia detektora, aby zachować korzystny stosunek sygnału do szumu. Po upewnieniu się, że sygnał nie jest nasycony, potwierdź, że sygnał fotoaktywowanej GFP kolokuje się z sygnałem TMRE.Na koniec otwórz otwór diaphragmowy (pinhole), zwiększ wzmocnienie detektora, a następnie znajdź nową komórkę wykazującą ekspresję GFP poddaną fotoaktywacji i określ stopień powiększenia (zoom). Następnie ustaw zakres serii Z tak, aby zebrać sześć przekrojów, i zapisz metodę obrazowania. Teraz otwórz okno wielokrotności czasu w lewym panelu.Wybierz panel zapisu i kliknij przycisk wyboru folderu obrazów, aby określić lokalizację zapisu plików. Następnie w panelu akwizycji, z rozwijanego menu konfiguracji skanowania, wybierz właśnie zapisaną metodę obrazowania. W kolejnym kroku zaznacz opcję środka stosu Z (Z middle of Z stack).Teraz otwórz panel bloków i wybierz pojedynczy blok dla każdej lokalizacji. Następnie kliknij dodaj bloki dla każdego mierzonego interwału, otwórz panel czasowy, wybierz interwał wagowy, a następnie wpisz zero w polu interwał wagowy przed blokiem tylko w pierwszej lokalizacji. Po wybraniu panelu lokalizacji wybierz przenieś focus na pozycję ładowania pomiędzy lokalizacjami oraz konfigurację skanowania obciążenia podczas kliknięcia przejdź do LO lub następne LO pod listą edycji lokalizacji, wybierz wyczyść wszystko, a następnie wybierz zmotoryzowany stół do wielu lokalizacji w panelu wybielania, kliknij pole wybielania i wskaż plik konfiguracyjny w rozwijanym menu konfiguracji.Następnie w oknie wybielania (bleaching window) głównego oprogramowania zapisz odpowiednią metodę fotoaktywacji w panelu obszarów. Wybierz ROI dla tej konkretnej komórki i dodaj to ROI do serii czasowej, wybierając okno dodawania bieżącego obszaru do listy ROI. Upewnij się, że w menu rozwijanym ROI wybrałeś tę samą lokalizację.Na koniec, w odniesieniu do każdej z 10 komórek monitorowanych w czasie, przeprowadź następującą sekwencję czynności. Najpierw, po zlokalizowaniu komórki, zaznacz pozycję stolika w panelu lokalizacji i określ szczegółową metodę konfiguracji skanowania w panelu akwizycji. Należy upewnić się, że konfiguracja skanowania została określona dla wszystkich bloków.Następnie w głównym panelu obszarów wybierz obszar zainteresowania (ROI), który ma zostać poddany fotoaktywacji. Następnie w panelu wybielania zapisz ROI i wczytaj go w oknie ROI. Po tym usuń ROI z głównego okna obszarów i zresetuj skanowanie.Ustaw powiększenie na 1, znajdź następną komórkę i określ zoom. Po powtórzeniu tego procesu dla kolejnych dziewięciu komórek sprawdź, czy dla każdego miejsca etapu oraz wszystkich bloków wyznaczono odpowiednią konfigurację skanowania i czy pierwszy blok w każdym miejscu odpowiada odpowiedniej metodzie fotoaktywacji, podczas gdy pozostałe zawierają metodę kontrolną (mock). Następnie uruchom pomiar dla komórek, w których sygnał fotoaktywnego GFP w większości kolokuje się z czerwonym sygnałem TMRE.Odejmij tło z obrazów GFP po fotoaktywacji, a następnie skonfiguruj pomiary obszarów tak, aby raportowały średnią intensywność. Następnie wyeksportuj dane do pliku Excel dla każdego przekroju stosu ZS. Po pominięciu płaszczyzn pozbawionych sygnału, podziel intensywność stosu ZS dla każdego punktu czasowego przez początkową intensywność po fotoaktywacji, aby uzyskać procent pierwotnego sygnału w jednej komórce INS.Znaczący spadek intensywności sygnału następuje co 15 minut przez godzinę, aż do momentu osiągnięcia równowagi fuzji mitochondrialnej. Zostało to wykazane na tych obrazach rzutowych sześciu przekrojów optycznych, ilościowo określonych co 15 minut podczas typowego testu fuzji mitochondrialnej. W tych testach stosuje się bardzo niskie stężenie TMRE, aby pomóc w ukierunkowaniu fotoaktywacji GFP oraz monitorować kondycję komórek.Należy zauważyć, że komórka wykazuje niemal całkowitą kolokalizację sygnałów fotoaktywnego GFP w kolorze zielonym oraz TMRE w kolorze czerwonym, a jednoczesne barwienie tymi barwnikami dowodzi, że mitochondria są aktywne i nie są zdepolaryzowane przy niskich stężeniach milimolarnych. Palmitat powoduje fragmentację mitochondriów i hamuje ich fuzję. W związku z tym, jak widać na tych przekrojach optycznych komórki traktowanej palmitatem, mitochondria są pofragmentowane, a intensywność sygnału fotoaktywnego GFP skierowanego do macierzy nie zmieniła się tak znacząco, jak w warunkach normalnych, co przedstawiono na poprzedniej rycinie.W związku z tym rozcieńczenie sygnału GFP po fotoaktywacji widoczne na tej rycinie wynika prawdopodobnie z fuzji mitochondriów, a nie z ich podziału. Podczas opracowywania tej metody należy pamiętać o wyborze komórek z ko-lokalizacją GFP i TMRE, aby fotoaktywować wystarczającą ilość GFP do utrzymania sygnału, lecz nie tak dużą, by nie przeoczyć zdarzeń fuzji mitochondriów, oraz o objęciu całego obszaru mitochondriów w obrębie przekrojów optycznych. W celu ustalenia, co dzieje się z sieciami mitochondrialnymi wobec braku określonych białek regulacyjnych lub cząsteczek sygnałowych, test ten można przeprowadzić w kilku grupach eksperymentalnych, w których geny są wyciszone lub komórki są traktowane różnymi odczynnikami. Możliwość kwantyfikacji fuzji mitochondrialnej oraz statycznej analizy parametrów pozwala na badanie dynamiki mitochondriów w stanach chorobowych i umożliwia opracowanie metod terapeutycznych.

a-faster-high-resolution-mtpa-gfp-based-mitochondrial-fusion-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Szybszy, wysokorozdzielczy test fuzji mitochondriów oparty na mtPA-GFP, umożliwiający zbieranie danych kinetycznych z wielu komórek równolegle za pomocą mikroskopii konfokalnej

Niniejszy eksperyment w formie wizualizacji jest przewodnikiem po wykorzystaniu fluorescencyjnego klonu molekularnego HIV do eksperymentów z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek.

Wizualizacja transferu HIV między komórkami z wykorzystaniem fluorescencyjnych klonów HIV oraz konfokalnej mikroskopii żywych komórek

Multiple-Target Tracing to autorski algorytm opracowany do śledzenia pojedynczo znakowanych cząsteczek w błonie plazmatycznej żywych komórek. Efektywne wykrywanie, szacowanie i śledzenie cząsteczek w czasie przy wysokiej gęstości znakowania zapewnia przyjazne dla użytkownika, kompleksowe narzędzie do badania dynamiki błon w skali nanometrycznej.

Mapowanie dyfuzji molekularnej w błonie plazmatycznej za pomocą Multiple-Target Tracing (MTT)

Źródło: Kennedy, L. H., et. al. Wizualizacja i obrazowanie na żywo organelli oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem i mikroskopii konfokalnej. J. Vis. Exp. (2017)Ten film pokazuje obrazowanie mitochondriów oligodendrocytów w organotypowych wycinkach mózgu myszy. Plaster umieszcza się w komorze kąpielowej z ciągłą cyrkulacją płynu i kontrolowaną temperaturą. Po ustawieniu różnych parametrów mikroskopu konfokalnego wykonywane są obrazy...

Obrazowanie konfokalne ruchu mitochondriów w oligodendrocytach w organotypowych kulturach wycinków mózgu

Opisujemy użycie dwóch ratiometrycznych, genetycznie kodowanych biosensorów, które są oparte na GFP, do monitorowania mitochondrialnego stanu redoks i poziomów ATP w rozdzielczości subkomórkowej w żywych komórkach drożdży.

Biosensory ratiometryczne, które mierzą mitochondrialny stan redoks i ATP w żywych komórkach drożdży

Konfokalna mikroskopia skaningowa jest stosowana do obrazowania pojedynczych zdarzeń mitochondrialnych w perfundowanych mięśniach serca lub szkieletowych u żywych zwierząt. Monitorowanie w czasie rzeczywistym pojedynczych procesów mitochondrialnych, takich jak błyski ponadtlenkowe i wahania potencjału błonowego, umożliwia ocenę funkcji mitochondriów w fizjologicznie istotnym kontekście i podczas patologicznych perturbacji.

Obrazowanie konfokalne pojedynczych mitochondrialnych błysków ponadtlenkowych w nienaruszonym sercu lub in vivo

Tutaj szczegółowo opisujemy podejście do pomiaru czasowej rekrutacji EYFP-Parkiny za pomocą poklatkowej mikroskopii podczas selektywnego usuwania uszkodzonych mitochondriów. Ten dynamiczny proces usuwania uszkodzonych mitochondriów zależny od EYFP-Parkina może być wykorzystany jako wskaźnik zdrowia komórek w różnych warunkach eksperymentalnych.

Wideomikroskopia poklatkowa do oceny agregacji EYFP-Parkiny jako markera mitofagii komórkowej

Przedstawiamy protokół podwójnej synchronizacji komórek HeLa z tymidyną, a następnie analizę za pomocą mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości. Metoda ta jest kluczem do uzyskania dużej liczby komórek, które przechodzą synchronicznie z fazy S do mitozy, umożliwiając badania nad mitotycznymi rolami wielofunkcyjnych białek, które również pełnią funkcje interfazowe.

Połączenie mitotycznej synchronizacji komórek i mikroskopii konfokalnej o wysokiej rozdzielczości w celu zbadania roli wielofunkcyjnych białek cyklu komórkowego podczas mitozy

Ten protokół opisuje nową metodę pozwalającą na ilościową wizualizację złożonego tworzenia białek SNARE, opartą na transferze energii rezonansu Förstera i mikroskopii obrazowania życia fluorescencji.

Wizualizacja wewnątrzkomórkowego transportu SNARE za pomocą mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Artykuł ten opisuje wykorzystanie mikroskopii konfokalnej oraz ImageJ do oceny dynamiki rozszczepienia i fuzji mitochondriów za pomocą fluorescencji przełączającej się foto Dendra2.

Ocena dynamiki rozszczepienia/fuzji mitochondrialnej w komórkach rurkowatych nerek bliższych

Poznaj zautomatyzowaną metodę pomiaru fuzji mitochondrialnej w wielu komórkach równolegle przy użyciu fotoaktywowalnego GFP i mikroskopii konfokalnej. Technika ta zapewnia wysokorozdzielcze dane kinetyczne dla badań nad cukrzycą i chorobami neurodegeneracyjnymi.

Szybszy, oparty na mtPA-GFP test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, uzyskujący dane kinetyczne wielu komórek równolegle za pomocą mikroskopii konfokalnej (Wideo) | JoVE Journal

Szybszy test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, oparty na mtPA-GFP, umożliwiający równoległe pozyskiwanie danych kinetycznych z wielu komórek przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Przeglądaj więcej filmów