Szybszy, oparty na mtPA-GFP test fuzji mitochondrialnej o wysokiej rozdzielczości, uzyskujący dane kinetyczne wielu komórek równolegle za pomocą mikroskopii konfokalnej

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zmierzenie fuzji mitochondriów w wysoce rozdzielczych obrazach 3D wielu komórek równolegle. Osiąga się to poprzez pierwszą ekspresję zdjęcia mitochondrialnego, GFP w interesujących komórkach. Następnie GFP jest aktywowany fotoaktywem w niewielkim regionie populacji mitochondrialnej w każdej komórce.

Następnie co 15 minut pobiera się sześć sekcji optycznych każdej komórki, aż do osiągnięcia równowagi sygnału w celu oceny zakresu fuzji mitochondrialnej, ostatecznie rozcieńczenia fotoaktywatu ukierunkowanego na mitochondria, można ocenić intensywność GFP w komórkach poddawanych fuzji mitochondrialnej na podstawie kwantyfikacji sygnału fluorescencyjnego. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona zautomatyzowana, dzięki czemu można szybciej zbierać dane o wysokiej rozdzielczości z wielu komórek. Chociaż metoda ta zostanie zademonstrowana przy użyciu komórek INS one i zapewni wgląd w cukrzycę, można ją zastosować do innych typów komórek w celu zbadania całej fuzji mitochondrialnej w procesie starzenia się, a także chorób metabolicznych i neurodegeneracyjnych.

Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy automatyzacji obrazowania nie są opisane nigdzie indziej. Po wyhodowaniu INS jednej komórki do 80% konfluencji, odłącz kultury z 0,05% trypsyny i umieść zawieszone komórki na górnych płytkach obrazowych pokrytych poli de lizyną pokrytych szkiełkiem nakrywkowym. Po dwóch dniach hodowli dodaj do płytek macierz mitochondrialną ukierunkowaną fotoaktywację adenowirusową GFP.

Następnie, po hodowli komórek przez 24 godziny, wymień pożywkę i pozwól komórkom rosnąć przez kolejne dwa dni. W dniu obrazowania dodać od siedmiu do 15 nanomolowców TMRE do płytek obrazowych i równoważyć hodowle przez co najmniej 45 minut. W tym czasie włącz 5% dwutlenek węgla, inkubator i mikroskop po wyrównaniu mikroskopu.

Na karcie pobierania kliknij pokaż narzędzia ręczne. Otwórz panel ustawień obrazowania, a następnie wybierz tryb kanału i przełącz. Śledź każdą klatkę w panelu ścieżki światła.

Wybierz LSM i tryb kanału. Następnie z ikony próbki działającej w górę wybierz tylne MBS six 90 plus i MBS 4 88 u dołu panelu, sprawdź TPMT, aby włączyć wizualizację kanałów jasnego pola lub DIC. Zakończ regulację parametrów ścieżki światła, ustawiając zakres dla barwnika GFP na 490 do 540 nanometrów i na 580 do 700 nanometrów dla barwnika TMRE.

Na koniec otwórz tryb akwizycji i ustaw pole skanowania o wymiarach 512 na 512 pikseli w rozmiarze klatki, rozwiń menu i średnią cztery x w menu liczby uśredniania. Teraz za pomocą soczewki obiektywowej skup się na komórkach za pomocą światła halogenowego. Otwórz otwór do maksimum i zeskanuj, aby znaleźć jasnozielone komórki wyrażające GFP z aktywacją fotoaktywną.

Wybierz dowolne zdjęcie mocy lasera, aktywuj ogniwo, a następnie wykonaj przez nie serię przekrojów optycznych w kształcie litery Z, aby sprawdzić, czy aktywacja jest wystarczająca. Następnie dostosuj laser obrazujący 488 nanometrów do niskiej mocy, nie maksymalizując całkowicie wzmocnienia detektora, aby zachować dobry stosunek sygnału do szumu. Po upewnieniu się, że sygnał nie jest nasycony, upewnij się, że sygnał GFP aktywowany fotograficznie jest zlokalizowany razem z sygnałem TMRE.

Na koniec otwórz otwór i zwiększ wzmocnienie detektora, a następnie znajdź nową komórkę wyrażającą GFP aktywowaną zdjęciem i określ współczynnik powiększenia. Następnie ustaw zakres serii Z tak, aby zebrał sześć wycinków i zapisz metodę obrazowania. Teraz otwórz okno wielokrotne w lewym panelu.

Wybierz panel zapisywania i kliknij wybierz folder obrazów, aby określić lokalizację, w której pliki zostaną zapisane. Następnie w panelu akwizycji wybierz właśnie zapisaną metodę obrazowania z menu rozwijanego konfiguracji skanowania. Następnie wybierz oznaczony środek stosu Z .

Teraz otwórz panel bloków i wybierz pojedynczy blok w każdej lokalizacji. Następnie kliknij dodaj bloki dla każdego mierzonego interwału, otwórz panel pomiaru czasu, wybierz przedział wagowy, a następnie wpisz zero w polu przedział wagowy przed blokiem tylko w pierwszej lokalizacji. Po wybraniu panelu lokalizacji, wybierz przesuń fokus, aby załadować pozycję między lokalizacjami i konfigurację skanowania ładowania po przejściu do LO lub następnym LO klikniętym pod listą edycji lokalizacji, wybierz wyczyść wszystko, a następnie wybierz wiele lokalizacji zmotoryzowany etap pod panelem wybielania, kliknij pole wybielacza i wyznacz plik konfiguracyjny w menu rozwijanym konfiguracji.

Następnie w oknie wybielania głównego oprogramowania zapisz odpowiednią metodę aktywacji zdjęcia w panelu regionu. Wybierz ROI dla tej konkretnej komórki i dodaj ten ROI do wielokrotnego czasu, wybierając opcję dodaj bieżący region do okna listy ROI. Pamiętaj, aby wybrać tę samą lokalizację z menu rozwijanego ROI.

Na koniec, dla każdej z 10 komórek, które mają być obserwowane w czasie, wykonaj następującą sekwencję. Po pierwsze, podczas znajdowania komórki wskaż jej pozycję etapu w panelu lokalizacji i określ jej konkretną metodę konfiguracji skanowania w panelu akwizycji. Pamiętaj, aby określić konfigurację skanowania dla wszystkich bloków.

Następnie w panelu głównych regionów wybierz obszar zainteresowania, który chcesz aktywować zdjęcie. Następnie w panelu wybielacza zapisz ROI i załaduj go w oknie ROI. Następnie usuń ROI w głównym oknie regionów i zresetuj skanowanie.

Powiększ do jednego, w końcu znajdź następną komórkę i ustaw powiększenie. Po powtórzeniu procesu dla następnych dziewięciu komórek sprawdź, czy każda lokalizacja etapu i wszystkie bloki mają wyznaczoną odpowiednią konfigurację skanowania i czy pierwszy blok w każdej lokalizacji odpowiada odpowiedniej metodzie aktywacji fotograficznej, podczas gdy pozostałe zawierają metodę próbną. Następnie wybierz uruchom dla komórek, w których sygnał GFP aktywowany zdjęciem w większości pokrywa się z czerwonym sygnałem TMRE.

Odejmij tło na zdjęciach aktywowanych GFP, a następnie skonfiguruj pomiary regionu, aby raportować średnią intensywność. Następnie wyeksportuj dane do pliku Excel dla każdego wycinka stosu ZS. Po pominięciu płaszczyzn, które nie mają sygnału, podziel intensywność stosu ZS każdego punktu czasowego przez początkową intensywność aktywowaną zdjęciem i uzyskaj procent oryginalnego sygnału w jednej komórce INS.

Znaczny spadek intensywności sygnału następuje co 15 minut przez godzinę, aż do osiągnięcia równowagi fuzji mitochondrialnej. Jak wykazano na tych rzutowanych obrazach sześciu sekcji optycznych oznaczanych ilościowo co 15 minut podczas typowego testu fuzji mitochondrialnej. W tych testach stosuje się bardzo niskie stężenie TMRE, aby pomóc w ukierunkowaniu fotoaktywacji GFP na fotoaktywację i monitorować stan komórek.

Należy zauważyć, że komórka prawie całkowicie kolokalizuje zdjęcie aktywuje GFP na zielono i TMRE na czerwono, a barwienie cos barwników pokazuje, że mitochondria są aktywne i nie są zdepolaryzowane przy niskich stężeniach milimolowych. Palmitynian rozdrabnia mitochondria i hamuje fuzję mitochondriów. Tak więc, jak widać w tych sekcjach optycznych komórki poddanej działaniu palmitynianu, mitochondria są pofragmentowane, a intensywność sygnału GFP ukierunkowanego na matrycę fotoaktywatu nie zmieniła się tak bardzo, jak w normalnych warunkach, jak pokazano na poprzednim rysunku.

W związku z tym rozcieńczenie sygnału fotoaktywatu GFP widoczne na tym rysunku prawdopodobnie jest spowodowane fuzją mitochondriów, a nie rozszczepieniem Podczas ustawiania tej metody należy pamiętać, aby wybrać komórki kolokalizujące GFP i TMRE, aby fotoaktywować wystarczającą ilość GFP, aby utrzymać sygnał, ale nie za bardzo, aby nie przegapić zdarzeń fuzji mitochondrialnej i zebrać całą objętość mitochondriów w sekcjach optycznych Aby określić, co dzieje się z sieciami mitochondrialnymi. W przypadku braku pewnych białek regulatorowych lub cząsteczek sygnałowych, test ten można przeprowadzić w wielu grupach eksperymentalnych, w których geny są wyciszane lub komórki są traktowane różnymi środkami. Możliwość ilościowego określenia fuzji mitochondrialnej i statystycznej analizy parametru pozwala na badanie dynamiki mitochondriów w stanach chorobowych i umożliwia opracowywanie metod leczenia.