Name: Ustanowienie mikrobiologicznych kultur wzbogacających w eukariotyzm z chemicznie rozwarstwionego jeziora antarktycznego i ocena potencjału wiązania węgla (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji eukariotów mikrobiologicznych z jeziora Bonney na Antarktydzie i oceny ich potencjału wiązania węgla za pomocą testu izotopowego RubisCO.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują J. Priscu, A. Chiuchiolo oraz zespołowi limnologicznemu McMurdo LTER za pomoc w pobieraniu i konserwowaniu próbek na Antarktydzie. Dziękujemy firmom Ratheon Polar Services oraz PHI helicopters za wsparcie logistyczne. Mikrografie świetlne zostały wykonane w Center for Advanced Microscopy and Imaging Center w Miami. Praca ta była wspierana przez granty NSF Office of Polar Programs 0631659 oraz 1056396.

1. Pozyskiwanie próbek
<ol>
	<li>Wybierz i przygotuj miejsce poboru próbek na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem lodu w otworze. Wyznacz lokalizację miejsca wiercenia za pomocą GPS.</li>
	<li>Aby uzyskać dostęp do kolumny wody, rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra lodowego Jiffy z dołączonym 4-calowym przedłużeniem i wiertłem. Aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze, staraj się unikać wiercenia w wodzie ciekłej, przerywając wiercenie około 4-6 cali nad górną powierzchnią kolumny wody.</li>
	<li>Przed pobraniem próbek średnica otworu wiertniczego musi zostać powiększona z 15 do 60 cm. Jest to realizowane za pomocą urządzenia do topienia otworów (model Hotsy), które tłoczy podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Topnienie otworu trwa zazwyczaj do 18 godzin.</li>
	<li>Przed pobraniem próbek z kolumny wody upewnij się, że cały wymagany sprzęt i naczynia do przechowywania próbek znajdują się w miejscu poboru. Materiały do pobierania próbek obejmują: butlę Niskin (pojemność 5-10 L), wyciągarkę z kabelkiem skalibrowanym pod kątem głębokości, ciężarek (messenger), odpowiednią liczbę butelek na każdą głębokość poboru oraz chłodnie do transportu próbek.</li>
	<li>Rozpocznij pobieranie próbek wcześnie rano (~godz. 5:00), ponieważ filtrowanie wody jeziornej powinno zostać zakończone w dniu poboru. Pobierz próbki wody (1-5 L) z wybranych głębokości (w niniejszym badaniu: głębokości 6 m, 15 m i 18 m, mierzone od piezometrycznego poziomu wody w otworze lodowym), używając próbąbnika Niskin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wyciągarki. Aby uniknąć zaburzenia kolumny wody, pobieraj próbki z mniejszych głębokości przed próbkami z głębokości większych.</li>
	<li>Przechowuj próbki jeziorne w chłodniach i transportuj je z miejsca poboru do laboratorium polowego za pomocą sani przyczepionych do pojazdu ATV (pojazd terenowy). Próbki powinny zostać przetworzone lub ustabilizowane (np. poprzez szybkie zamrażanie w ciekłym azocie) w laboratorium polowym niezwłocznie po pobraniu.</li>
</ol>
2. Tworzenie kultur wzbogaconych
<ol>
	<li>W celu hodowli kultur wzbogaconych, skoncentruj 0,5-1 L wody jeziornej na filtrach z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze oczek 0,45 μm, stosując łagodną filtrację (&lt; 0,3 atm). Jeśli wymagana jest analiza różnorodności naturalnej społeczności, przefiltruj drugą próbkę na filtry z polietersulfonu o średnicy 47 mm i rozmiarze oczek 0,45 μm, a następnie postępuj zgodnie z protokołami Bielewicz et al. 4 w celu oceny różnorodności filogenetycznej eukariotów.</li>
	<li>Przenieś filtr do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 mL zawierającej ok. 20 mL filtrowanej wody jeziornej, pobranej z tej samej głębokości co próbka do filtracji. Delikatnie wypłucz komórki z filtra za pomocą sterylnej pipety.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórkowych o powierzchni 25 cm2. Dodaj filtrowaną wodę jeziorną pobraną z każdej głębokości próbkowania, aby zwiększyć objętość hodowli do 45 mL. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości próbkowania, jeśli planowane jest wzbogacanie na różnych pożywkach.</li>
	<li>Uzupełnij kolby hodowlane sterylnymi roztworami 50X do końcowego stężenia 1X następujących pożywek: Bold's Basal Medium, BG11 i F/2. Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, przygotuj dwa naczynia z dodatkiem F/2 i do jednej z kolb dodaj 2-3 ziarna sterylnego ryżu.</li>
	<li>Inkubuj kolby hodowlane w niskiej temperaturze (4 °C) i przy niskim natężeniu promieniowania (20 μmol photons m-2 s-1) w inkubatorze wzrostu z kontrolą temperatury przez co najmniej 4 tygodnie w Antarktyce przed wysyłką do laboratorium w USA. Jeśli pożądane są izolaty, po 2 tygodniach inkubacji wysej 250 μL kultury wzbogaconej na płytki z agarem zawierającym odpowiednie pożywki.</li>
	<li>Do transportu do USA przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek typu Falcon 50-mL. W zleceniu transportowym zaznacz wymagania „nie zamrażać” (do not freeze) oraz „przechowywać w chłodzie” (keep cool). Chociaż proces transportu z Antarktyki jest stosunkowo szybki (2 tygodnie transportem lotniczym) i wysoce niezawodny, istnieje możliwość utraty organizmów wymagających podczas transportu. Dlatego badacze mogą chcieć zachować podpróbkę przed wysyłką, aby móc ocenić utratę niektórych gatunków w trakcie transportu.</li>
	<li>Po przybyciu do USA przenieś 5 mL kultury wzbogaconej do 45 mL odpowiedniej pożywki w sterylnej kolbie Erlenmeyera o pojemności 125 mL, zamkniętej sterylną gąbką. Kultury wzbogacone powinny być utrzymywane jako kultury stojące w komorze wzrostu z kontrolowanym środowiskiem (Diurnal Growth Chamber, VWR) w temperaturze 4 °C i przy natężeniu 20 μmol photons m-2 s-1. Kultury należy przelewać do świeżych pożywek co 30 dni.</li>
</ol>
3. Ekstrakcja lizatu komórkowego z wzbogaconych próbek po filtracji
<ol>
	<li>Przefiltrować 5 mL kultury wzbogaconej przez filtr Whatman GF/F o średnicy 25 mm, stosując delikatną próżnię (&lt;10 psi). Filtr można przechowywać przez kilka tygodni w temperaturze -80 °C przed oznaczeniem aktywności RubisCO.</li>
	<li>Przeciąć filtr na 4-5 części za pomocą sterylnych stalowych nożyczek i przenieść fragmenty sterylną pęsetą do probówki z nakrętką o pojemności 2 mL, wypełnionej w jednej piątej części kuleczkami z cyrkonii/krzemionki o średnicy 0,1 mm.</li>
	<li>Dodać 1,25 mL buforu do ekstrakcji filtra (50 mM bicyny, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mg/mL BSA i 0,1% Triton X-100; dodać świeżo: 10 mM NaHCO3, 10 mM DTT, 3,3 mM kwasu aminokapronowego, 0,7 mM benzamidyny, pH 7,8) 13 i rozbić komórki za pomocą homogenizatora kuleczkowego (Minibead beater) trzykrotnie przez 30 s przy ustawieniu prędkości 48. Aby zapobiec nagrzewaniu się próbki, należy przeplatać homogenizację z 1-minutową inkubacją w lodzie.</li>
	<li>Wirować zawiesinę z filtra przez 2 min przy 3000 x g w temperaturze 4 °C, aby utworzyć luźny osad z włókien filtra GF/F i szczątków ścian komórkowych.</li>
	<li>Pobrać alikwot 200 μL i zanurzyć w 800 μL lodowatego 90% acetonu. Zmierzyć ilość ekstrahowalnego chlorofilu (chl) a w spektrofotometrze przy długościach fal 664 nm i 647 nm 14. Przenieść nadsącz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.</li>
	<li>Wirować pozostały nadsącz w temperaturze 4 °C przez 2 min przy 15 000 x g i przenieść nadsącz (unikając osadu z nierozpuszczalnych błon komórkowych i pozostałych włókien filtra GF/F) do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może zostać teraz wykorzystany w teście aktywności karboksylazy RubisCO.</li>
	<li>Lizat można przechowywać w temperaturze -80 °C po dodaniu 12,5% glicerolu i szybkim zamrożeniu w ciekłym azocie. Po wielokrotnych cyklach zamrażania i rozmrażania może nastąpić utrata aktywności, w zależności od wrażliwości enzymów w lizacie. Dlatego przed ekstrakcjami lizatów komórkowych na dużą skalę należy sprawdzić aktywność lizatu świeżego w porównaniu z mrożonym.</li>
</ol>
4. Analiza aktywności karboksylazy RubisCO z wykorzystaniem filtracji
<ol>
	<li>Przenieś 125 μL rozpuszczalnego lizatu do schłodzonej na lodzie probówki do mikrowirówki o pojemności 15 mL z nakrętką (nakrętka nie jest wymagana). W przypadku próbek kontroli negatywnej dodaj 125 μL rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrowirówki o pojemności 15 mL z nakrętką, ale nie dodawaj substratu (w kroku 4.7). Przeprowadź reakcje w dubletach dla wszystkich próbek i kontroli negatywnych.</li>
	<li>Przygotuj świeżą porcję 10 mL buforu do analizy (50 mM Bicine-NaOH, pH 8.0, 50 mM NaHCO3, 25 mM MgCl2) i schłodź na lodzie. Odmierz wystarczającą ilość buforu do analizy dla wszystkich próbek i kontroli negatywnych (100 μL na próbkę/kontrolę plus dodatkowe 100 μL) do probówki o pojemności 5 mL. Wszystkie kolejne kroki wykonuj pod dygestorium.</li>
	<li>Dodaj 40 μL NaH14CO3 (500 μCi/mL) na każdy 1 mL buforu do analizy do odmierzonego buforu i utrzymuj go na lodzie.</li>
	<li>Pobierz 10 μL buforu do analizy zawierającego 14C i rozcieńcz w 1 mL buforu do analizy. Po wymieszaniu poprzez odwrócenie probówki, dodaj 100 μL rozcieńczonej mieszaniny (1:100) do 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II w fiolce scyntylacyjnej. Wymieszaj poprzez odwrócenie. Przed kontynuacją analizy liczba zliczeń scyntylacyjnych (Beckman LS6500) powinna przekraczać 18 000 cpm.</li>
	<li>Po dodaniu odpowiedniej ilości NaH14CO3 do buforu do analizy, przenieś probówki z reakcją do blokowej grzałki ustawionej na 25 °C i inkubuj przez 3-5 min.</li>
	<li>Dodaj 100 μL buforu do analizy do lizatów i inkubuj przez 5 min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Dodaj 20 μL 15 mM rybulozobisfosforanu do próbek i pozwól reakcji przebiegać przez 5-10 min w temperaturze 25 °C.</li>
	<li>Dodaj 100 μL kwasu propionowego (100%) (Fisher), aby zatrzymać reakcję. Wiruj przez 1 godzinę przy 2 000 x g, aby usunąć niewprowadzony do związku 14C.</li>
	<li>Przenieś całkowitą objętość próbek do fiolek scyntylacyjnych zawierających 3 mL koktajlu do zliczania scyntylacyjnego Bio-Safe II. Wyznacz cpm kwasostabilnych produktów końcowych za pomocą zliczania scyntylacyjnego (B. Witte, R. Tabita komunikacja osobista).</li>
	<li>Oblicz tempo aktywności RubisCO w przeliczeniu na zawartość chl a 14.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
Wykorzystaliśmy hodowle wzbogacone do wyizolowania zimnolubnych protist fototroficznych i miksotroficznych zamieszkujących antarktyczne jezioro Bonney. Aby uchwycić większą różnorodność organizmów, przetestowano trzy rodzaje pożywek wzrostowych: Bold's Basal Medium (BBM) 15, F/2-Si Marine Medium 16, 17 oraz pożywkę BG11 18. Inspekcja wizualna kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne (o czym świadczyła obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek), a dodatkowo występowała różnorodność morfologii komórek w zależności od głębokości pobrania inokulum oraz rodzaju pożywki zastosowanej w hodowli (Rys. 1).
Maksymalne tempo aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym RubisCO zmierzono jako wskaźnik potencjału wiązania węgla. Monitorowano również zawartość chl a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych (Fig. 2). Pomimo hodowli wszystkich kultur w tym samym reżimie temperatury i oświetlenia (tj. 4 °C/20 μmol m-2 s-1), potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna różniły się drastycznie pomiędzy kulturami wzbogaconymi. Maksymalną aktywność RubisCO zaobserwowano w kulturach wzbogaconych rosnących w pożywkach BBM (wzbogacenia 4 i 6) lub BG11 (wzbogacenia 13 i 14), podczas gdy kultury wzbogacone na pożywce F/2 (wzbogacenia 19, 21, 23) wykazały od 4 do 34 razy niższą maksymalną aktywność karboksylazy. Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w kulturach F/2, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w przeliczeniu na chl a. Co więcej, aktywność RubisCO nie korelowała z koncentracją chl a (r = -0,023, p&gt;0,1; Fig. 2, wstawka). Kultury BBM zaszczepione wodą jeziorną z głębokości 6 m i 15 m (wzbogacenia 4 i 5) miały najwyższe poziomy chl a, podczas gdy wszystkie pozostałe kultury wykazały stosunkowo niską zawartość chl a, niezależnie od aktywności enzymu RubisCO (Fig. 2).
<img alt="Porównanie gatunków mikroalg; obraz mikroskopowy przedstawia cztery szczepy MDVENR do analizy komórkowej." src="/files/ftp_upload/3992/3992fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne kultury wzbogacone mikroorganizmów eukariotycznych, w których wyselekcjonowano wzrost różnych organizmów. Tożsamość kultury podano w lewym dolnym rogu paneli. Wszystkie obrazy to mikrofotografie świetlne wykonane z użyciem imersji olejowej przy powiększeniu 1000X.
<img alt="Wykres słupkowy aktywności RubisCO i wydajności chlorofilu wraz z wykresem korelacji; analiza wydajności enzymu." src="/files/ftp_upload/3992/3992fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Potencjalna zdolność do fiksacji węgla oraz poziomy ekstrahowalnego chlorofilu a w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotycznych mikroorganizmów izolowanych z jeziora Bonney i hodowanych na różnych podłożach kulturacyjnych. Szczegóły dotyczące kultur znajdują się w Tabeli 1. Wstawka: Korelacja Pearsona między zawartością chlorofilu a a potencjałem fiksacji węgla w kulturach wzbogaconych antarktycznych eukariotycznych mikroorganizmów.

<ol><li>Morgan-Kiss, R. M., Priscu, J. P., Pocock, T., Gudynaite-Savitch, L., Hüner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+acclimation+of+photosynthetic+microorganisms+to+permanently+cold+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol.+Biol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Adaptation and acclimation of photosynthetic microorganisms to permanently cold environments.</a> Microbiol Mol. Biol. Rev. 70, 222-252 (2006).</li>
<li>Priscu, J. C., Wolf, C. F., Takacs, C. D., Fritsen, C. H., Laybourn-Parry, J., Roberts, J. K. M., Berry-Lyons, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbon+transformations+in+the+water+column+of+a+perennially+ice-covered+Antarctic+Lake%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci%22%5BJournal%5D)">Carbon transformations in the water column of a perennially ice-covered Antarctic Lake.</a> Biosci. 49, 997-1008 (1999).</li>
<li>Caron, D. A., Worden, A. Z., Countway, P. D., Demir, E., Heidelberg, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protists+are+microbes+too%3A+a+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Protists are microbes too: a perspective.</a> ISME J. 3, 4-12 (2009).</li>
<li>Bielewicz, S., Bell, E. M., Kong, W., Friedberg, I., Priscu, J. C., Morgan-Kiss, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protist+diversity+in+a+permanently+ice-covered+Antarctic+lake+during+the+polar+night+transition%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Protist diversity in a permanently ice-covered Antarctic lake during the polar night transition.</a> ISME J. 5, 1559-1564 (2011).</li>
<li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+too+cold%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">No place too cold.</a> Science. 324, 1521-1522 (2009).</li>
<li>Roberts, E. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophic+cryptophytes+and+their+predators+in+the+Dry+Valley+lakes+of+Antarctica%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwat.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mixotrophic cryptophytes and their predators in the Dry Valley lakes of Antarctica.</a> Freshwat. Biol. 41, 737-746 (1999).</li>
<li>Roberts, E. C., Priscu, J. C., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microplankton+dynamics+in+a+perennially+ice-covered+Antarctic+lake-Lake+Hoare%5BTitle%5D)+AND+%22Freshwat+Biol%22%5BJournal%5D)">Microplankton dynamics in a perennially ice-covered Antarctic lake-Lake Hoare.</a> Freshwat Biol. 27, 238-249 (2004).</li>
<li>Bell, E. M., Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixotrophy+in+the+Antarctic+phytoflagellate+Pyramimonas+gelidicola%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Mixotrophy in the Antarctic phytoflagellate Pyramimonas gelidicola.</a> J. Phycol. 39, 644-649 (2003).</li>
<li>De Wever, A., Leliaert, F., Verleyen, E., Vanormelingen, P., Van der Gucht, K., Hodgson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+levels+of+phylodiversity+in+Antarctic+green+algae%3A+further+evidence+for+the+existence+of+glacial+refugia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Hidden levels of phylodiversity in Antarctic green algae: further evidence for the existence of glacial refugia.</a> Proc. Biol. Sci. , 276-3591 (2009).</li>
<li>Laybourn-Parry, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+mechanisms+in+Antarctic+lakes%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Survival mechanisms in Antarctic lakes.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 357, 863-869 (2002).</li>
<li>Lizotte, M. P., Priscu, J. C. Distribution, succession and fate of phytoplankton in the dry valley lakes of Antarctica, based on pigment analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizotte%2C+MP+%22Ecosystem+Dynamics+in+a+Polar+Desert%3A+The+McMurdo+Dry+Valleys%22">Ecosystem Dynamics in a Polar Desert: The McMurdo Dry Valleys</a>. Priscu, J. C. , 229-240 (1998).</li>
<li>Ellis, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Most+abundance+protein+in+the+world%5BTitle%5D)+AND+%22Tren.+Biochem.+Sci%22%5BJournal%5D)">Most abundance protein in the world.</a> Tren. Biochem. Sci. 4, 241-244 (1979).</li>
<li>Tortell, P. D., Martin, C. L., Corkum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inorganic+carbon+uptake+and+intracellular+assimilation+by+subarctic+Pacific+phytoplankton+assemblages%5BTitle%5D)+AND+%22Limnol.+Oceanogr%22%5BJournal%5D)">Inorganic carbon uptake and intracellular assimilation by subarctic Pacific phytoplankton assemblages.</a> Limnol. Oceanogr. 51, 2102-2110 (2006).</li>
<li>Jeffrey, S. W., Humphrey, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+spectrophotometric+equations+for+determining+chlorophyll+a%2C+b%2C+c1%2C+c2+in+higher+plants%2C+algae+and+natural+phytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Physiol.+Pflanz%22%5BJournal%5D)">New spectrophotometric equations for determining chlorophyll a, b, c1, c2 in higher plants, algae and natural phytoplankton.</a> Biochem. Physiol. Pflanz. 167, 191-194 (1975).</li>
<li>Morgan, R. M., Ivanov, A. G., Priscu, J. C., Maxwell, D. P., Hüner, N. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+composition+of+the+photochemical+apparatus+of+the+Antarctic+green+alga%2C+Chlamydomonas+subcaudata%5BTitle%5D)+AND+%22Photosyn.+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and composition of the photochemical apparatus of the Antarctic green alga, Chlamydomonas subcaudata.</a> Photosyn. Res. 56, 303-314 (1998).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+Marine+Invertebrate+Animals%22">Culture of Marine Invertebrate Animals</a>. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Plenum Publishing. New York. 29-60 (1975).</li>
<li>Johnson, M. D., Tengs, T., Oldach, D., Stoecker, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequestration%2C+performance%2C+and+functional+control+of+cryptophyte+plastids+in+the+ciliate+Myrionecta+rubra+%28Ciliophora%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Sequestration, performance, and functional control of cryptophyte plastids in the ciliate Myrionecta rubra (Ciliophora.</a> J. Phycol. 42, 1235-1246 (2006).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J., Herdman, M., Stanier, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+assignments%2C+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.</a> J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).</li>
<li>Not, F., del Campo, J., Balague, V., De Vargas, C., Massana, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+diversity+of+marine+picoeukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">New insights into the diversity of marine picoeukaryotes.</a> PLoS ONE. 4, e7143(2009).</li>
<li>Sherr, B. F., Sherr, E. B., Caron, D. A., Vaulot, D., Worden, A. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oceanic+Protists%5BTitle%5D)+AND+%22Oceanography%22%5BJournal%5D)">Oceanic Protists.</a> Oceanography. 20, 130-135 (2007).</li>
<li>Finlay, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protist+taxonomy%3A+an+ecological+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Philos.+Trans.+R.+Soc.+Lond.+B.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Protist taxonomy: an ecological perspective.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 359, 599-610 (2004).</li>
<li>Foissner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protist+diversity%3A+estimates+of+the+near-imponderable%5BTitle%5D)+AND+%22Protist%22%5BJournal%5D)">Protist diversity: estimates of the near-imponderable.</a> Protist. 150, 363-368 (1999).</li>
<li>Gast, R. J., Moran, D. M., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kleptoplasty+in+an+Antarctic+dinoflagellate%3A+caught+in+evolutionary+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Kleptoplasty in an Antarctic dinoflagellate: caught in evolutionary transition.</a> Environmental Microbiology. 9, 39-45 (2007).</li>
<li>Gast, R. J., Moran, M. A., Beaudoin, D. J., Blythe, J. N., Dennett, M. R., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+abundance+of+a+novel+dinoflagellate+phylotype+in+the+Ross+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22Antarctica.+J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">High abundance of a novel dinoflagellate phylotype in the Ross Sea.</a> Antarctica. J. Phycol. 42, 233-242 (2006).</li>
<li>Moran, D. M., Anderson, O. R., Dennett, M. R., Caron, D. A., Gast, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Description+of+Seven+Antarctic+Marine+Gymnamoebae+Including+a+New+Subspecies%2C+Two+New+Species+and+a+New+Genus%3A+Neoparamoeba+aestuarina+antarctica+n.+subsp.%2C+Platyamoeba+oblongata+n.+sp.%2C+Platyamoeba+contorta+n.+sp.+and+Vermistella+antarctica+n.+gen.+n.+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Eukaryotic+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A Description of Seven Antarctic Marine Gymnamoebae Including a New Subspecies, Two New Species and a New Genus: Neoparamoeba aestuarina antarctica n. subsp., Platyamoeba oblongata n. sp., Platyamoeba contorta n. sp. and Vermistella antarctica n. gen. n. sp.</a> Journal of Eukaryotic Microbiology. 54, 169-183 (2007).</li>
<li>Rose, J. M., Vora, N. M., Countway, P. D., Gast, R. J., Caron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+temperature+on+growth+rate+and+gross+growth+efficiency+of+an+Antarctic+bacterivorous+protist%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Effects of temperature on growth rate and gross growth efficiency of an Antarctic bacterivorous protist.</a> The ISME journal. 3, 252-260 (2009).</li>
</ol>

Nie mamy nic do ujawnienia.

Niedawne badania molekularne wykazały wysoką różnorodność jednokomórkowych eukariotów w różnych środowiskach 3, 19, 20; jednak ze względu na brak izolatów z pełnego zakresu siedlisk protistów, funkcjonalne role tych poszczególnych gatunków w sieciach troficznych pozostają w dużej mierze nieznane. W niniejszym badaniu opisaliśmy metodologie wzbogacania gatunków mikrobiologicznych eukariotów wykazujących wszechstronność metaboliczną ze środowiska stosunkowo słabo przebadanego – stale pokrytego lodem jeziora anta...

<table><tbody><tr><td>BBM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5282</td><td></td></tr><tr><td>BG11</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3061</td><td></td></tr><tr><td>F/2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9903</td><td></td></tr><tr><td>filtr GF/F, 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-64</td><td></td></tr><tr><td>filtr GF/F, 47 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-874-71</td><td></td></tr><tr><td>Filtr z polietersulfonu, 0,45 &amp;mu;pore m, 47 mm</td><td>Pall Corporation</td><td>61854</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna k flask do hodowli komórkowej, 25 cm²&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>Komora wzrostowa z cyklem dobowym</td><td>VWR International</td><td>35960-076</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki z cyrkonii/krzemionki, średnica 0,1 mm</td><td>Produkty Biospec</td><td>Niestety, przesłany przez Ciebie tekst składa się jedynie z ciągu cyfr i liter (11079101z), który nie zawiera treści merytorycznej do tłumaczenia. Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego w języku angielskim, aby możliwe było przygotowanie profesjonalnego tłumaczenia naukowego.</td><td></td></tr><tr><td>Miniaturowy homogenizator kuleczkowy</td><td>Produkty Biospec</td><td>3110BX</td><td></td></tr><tr><td>probówka do mikrowirówki z nakrętką (1,5 &amp;mu;L)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1415-8700</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;Tlenek węgla&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>ViTrax</td><td>VC 194</td><td>Przechowywać w aliquotach po 400 &amp;#x03BC;L przy -20&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>RuBP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0878-100mg</td><td>Rozpuścić w 10 mM buforze Tris-kwas propionowy (pH 6,5)</td></tr></tbody></table>

ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Establishment of Microbial Eukaryotic Enrichment Cultures from a Chemically Stratified Antarctic Lake and Assessment of Carbon Fixation Potential

Jezioro Bonney jest jednym z wielu stale pokrytych lodem jezior położonych w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Całoroczna pokrywa lodowa utrzymuje chemiczne uwarstwienie kolumny wody i, w przeciwieństwie do innych śródlądowych zbiorników wodnych, w znacznym stopniu zapobiega zewnętrznemu dopływowi węgla i składników odżywczych ze strumieni. Biota jest narażona na liczne stresory środowiskowe, w tym całoroczny silny niedobór składników odżywczych, niskie temperatury, ekstremalny cień, hypersalinity oraz 24-godzinny mrok podczas zimy 1. Te ekstremalne warunki środowiskowe ograniczają biotę w jeziorze Bonney niemal wyłącznie do mikroorganizmów 2.
Jednokomórkowe mikroorganizmy eukariotyczne (nazywane „protistami”) są istotnymi uczestnikami globalnego cyklu biogeochemicznego 3 i pełnią ważne role ekologiczne w obiegu węgla w jeziorach suchych dolin, zajmując zarówno role pierwotne, jak i trzeciorzędowe w wodnej sieci troficznej. W wodnej sieci troficznej suchych dolin protisty wiążące węgiel nieorganiczny (autotrofia) są głównymi producentami węgla organicznego dla organizmów organotroficznych 4, 2. Protisty fagotroficzne lub heterotroficzne, zdolne do pochłaniania bakterii i mniejszych protistów, pełnią rolę drapieżników szczytowych w sieci troficznej 5. Ponadto nieznana część populacji protistów jest zdolna do połączonego metabolizmu miksotroficznego 6, 7. Miksotrofia u protistów polega na zdolności do łączenia funkcji fotosyntetycznych z fagotroficznym pochłanianiem mikroorganizmów będących ofiarami. Ta forma miksotrofii różni się od metabolizmu miksotroficznego u gatunków bakterii, który zazwyczaj polega na pobieraniu rozpuszczonych cząsteczek węgla. Obecnie istnieje bardzo niewiele izolatów protistów z polarnych jezior stale pokrytych lodem, a badania nad różnorodnością i ekologią protistów w tym ekstremalnym środowisku były ograniczone 8, 4, 9, 10, 5. Lepsze zrozumienie wszechstronności metabolicznej protistów w prostej sieci troficznej jezior suchych dolin pomoże w opracowaniu modeli dotyczących roli protistów w globalnym cyklu węglowym.
Zastosowano metodę hodowli wzbogaconej w celu wyizolowania potencjalnie fototroficznych i miksotroficznych protistów z jeziora Bonney. Głębie poboru próbek z kolumny wody wybrano w oparciu o lokalizację maksimów produkcji pierwotnej i różnorodność filogenetyczną protistów 4, 11, a także zmienność głównych czynników abiotycznych wpływających na troficzne tryby odżywiania protistów: płytkie głębokości poboru są ograniczone pod względem głównych składników odżywczych, natomiast głębsze są ograniczone przez dostępność światła. Ponadto próbki wody jeziornej uzupełniono różnymi rodzajami pożywek wzrostowych, aby stymulować wzrost różnorodnych organizmów fototroficznych.
RubisCO katalizuje etap limitujący szybkość w cyklu Calvina-Bensona-Basshama (CBB), głównym szlaku, za pomocą którego organizmy autotroficzne wiążą węgiel nieorganiczny i dostarczają węgiel organiczny dla wyższych poziomów troficznych w wodnych i lądowych sieciach pokarmowych 12. W niniejszej badaniu zastosowano test radioizotopowy zmodyfikowany dla próbek filtrowanych 13, aby monitorować maksymalną aktywność karboksylazy jako wskaźnik potencjału wiązania węgla i wszechstronności metabolicznej w kulturach wzbogaconych z jeziora Bonney.

Eukarioty mikrobiologiczne są zarówno źródłem węgla pochodzenia fotosyntetycznego, jak i drapieżnymi gatunkami szczytowymi w stale pokrytych lodem jeziorach Antarktydy. Niniejszy raport opisuje podejście oparte na kulturach wzbogaconych w celu izolacji metabolicznie wszechstronnych eukariotów mikrobiologicznych z antarktycznego jeziora Bonney oraz ocenia potencjał asymilacji węgla nieorganicznego przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy (RubisCO).

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Jezioro Bonney jest jednym z wielu jezior trwale pokrytych lodem, znajdujących się w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Wieloletnia pokrywa lodowa utrzymuje...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wytworzenie kultur wzbogaconych protistów z antarktycznego jeziora Bonnie oraz pomiar fiksacji węgla jako wstępnego wskaźnika różnorodności metabolicznej. Cel ten osiąga się poprzez pobranie próbek wody z głębokości jeziora Bonnie odpowiadających znanym szczytom liczebności protistów i fitoplanktonu. Próbki wody jeziornej są następnie szczepione w różnych pożywkach wzrostowych i inkubowane w komorze wzrostowej wyposażonej w regulator temperatury i oświetlenie przez okres od czterech do sześciu tygodni.Kultury można transportować w razie potrzeby w temperaturze 4 °C. Kolejnym krokiem jest wyekstrahowanie surowych lizatów komórkowych z kultur wzbogaconych. Ostatnim etapem tej procedury jest ocena potencjału wiązania węgla w lizacie komórkowym przy użyciu testu radioizotopowego na aktywność rybulozobisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy, czyli RubisCO.W rezultacie kultury wzbogaceń prokazotroficznych wykazują zróżnicowanie potencjału wiązania węgla w naturalnej społeczności protistów. Ta metoda może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące ekologii mikrobów w jeziorach. Przykładem jest rola eukariotycznych mikroorganizmów w cyklu węglowym na różnych etapach w stratyfikowanych jeziorach Antarktydy.Chociaż pobieranie próbek z kolumny wody do kolejnych generacji kultur wzbogaconych jest często stosowaną techniką, niniejsza metoda zawiera modyfikacje pozwalające na pracę w ekstremalnie zimnym środowisku, w którym mogą wystąpić nieprzewidziane komplikacje. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas poszukiwania sposobów na przetestowanie testu Redisco w naturalnych próbkach jeziornych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pobierania próbek są trudne do wyobrażenia, gdyż miejsca poboru znajdują się w środowisku obcym dla wielu badaczy.Próbki są pobierane z jeziora Bonnie, jednego z wielu jezior trwale pokrytych lodem, znajdujących się w suchych dolinach McMurdo na Antarktydzie. Na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody należy wybrać i przygotować miejsce poboru. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem lodu w otworze. Wyznacz lokalizację miejsca wiercenia za pomocą GPS, aby uzyskać dostęp do kolumny wody.Rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra Jiffy Ice z dołączonym czterocalowym przedłużeniem Jiffy flight oraz odpowiednim wiertłem, aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze. Staraj się uniknąć wiercenia w wodzie ciekłej, zatrzymując proces wiercenia około czterech do sześciu cali nad lustrem wody. Otwór wiertniczy musi zostać poszerzony z średnicy sześciu cali do dwóch stóp w celu pobrania próbek.Zostaje to osiągnięte przy użyciu urządzenia do wytapiania otworów w modelu gorzego morza, które tłoczy podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Proces wytapiania trwa zazwyczaj do 18 godzin i jest przeprowadzany w dniu poprzedzającym pobieranie próbek z kolumny wody. Należy upewnić się, że cały wymagany sprzęt oraz naczynia do przechowywania próbek znajdują się w miejscu poboru.Materiały do pobierania próbek obejmują butlę NICU o pojemności od pięciu do 10 litrów, wciągarkę z kablem skalibrowanym pod kątem głębokości, odpowiednią liczbę butelek na próbki dla każdej głębokości poboru, ciężarek przekaźnikowy (messenger) oraz lodówki do transportu próbek. Pobieranie próbek należy rozpocząć wcześnie rano, około godziny 5:00, ponieważ filtrowanie wody jeziornej powinno zostać zakończone w dniu poboru. Do pobierania próbek należy użyć czerpaka Kin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wciągarki.Pobierz próbki wody o objętości od jednego do pięciu litrów z głębokości wybranych na potrzeby niniejszego badania. Głębokości poboru próbek wynoszą sześć metrów, 15 metrów i 18 metrów, mierzone od symetrycznego poziomu wody PI w otworze lodowym. Próbki jeziora przechowuj w chłodniach i transportuj z miejsca poboru do laboratorium polowego.Próbki pobrane za pomocą sań przymocowanych do ATv należy przetworzyć lub ustabilizować w polowym laboratorium. Bezpośrednio po pobraniu próbek, po ich transporcie do laboratorium polowego, należy rozpocząć hodowlę kultur wzbogaconych. Skoncentrować od 0,5 do 1 litra wody jeziornej na filtrze o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.Filtry z polietersulfonu w procesie łagodnej filtracji. Jeśli wymagana jest analiza różnorodności zbiorności naturalnej, przefiltruj drugą próbkę na filtr o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.Filtry z polietersulfonu zamrażamy błyskawicznie w ciekłym azocie. Każdy filtr przenosimy do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml zawierającej około 20 ml przefiltrowanej wody jeziornej, pobranej z tej samej głębokości co próbka na filtrze.Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórek o przekroju 25 cm w celu namnażania na różnych pożywkach. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości pobierania próbek. Uzupełnij każdą kolbę hodowlaną o 50 x sterylne roztwory następujących pożywek: bold basil medium, BG 11 oraz F two.Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, należy przygotować dwa naczynia uzupełnione pożywką F/2 i dodać dwa do trzech ziaren sterylnego ryżu do jednej z kolb z kulturą, a następnie inkubować w inkubatorze wzrostowym z kontrolą temperatury, w niskiej temperaturze i przy mniejszym natężeniu promieniowania przez co najmniej cztery tygodnie przed wysyłką do laboratorium w USA. Przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek Falcon o pojemności 50 ml. W zgłoszeniu wysyłkowym wysuń wymagania dotyczące transportu: nie zamrażać i przechowywać w chłodzie. Po dotarciu do USA przenieś 5 ml każdej kultury wzbogaconej do 45 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej w naczyniu o pojemności 125 ml.Sterylna kolba Erlenmeyera zamknięta sterylną gąbką. Przechowując kultury wzbogacone jako kultury stacjonarne w komorze wzrostowej o kontrolowanej temperaturze 4 °C, przenosić kultury do świeżych mediów co 30 dni. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji lizatu komórkowego, przefiltrować 5 l kultury wzbogaconej na filtr Watman GF/F o średnicy 25 mm przy użyciu delikatnej próżni.Następnie przetnij filtr na cztery lub pięć części za pomocą sterylnych stalowych nożyczek. Potem za pomocą sterylnej pęsety przenieś fragmenty do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml, wypełnionej w jednej piątej objętości 0,1 mm średnicy.Kuleczki cyrkonio-krzemianowe. Do probówki dodać 1,25 milliliters buforu do ekstrakcji filtracyjnej, a następnie przeprowadzić lizę komórek w mini homogenizatorze kuleczkowym przez 30 seconds przy ustawieniu prędkości 48, po czym inkubować na lodzie przez jedną minutę. Powtórzyć proces homogenizacji kuleczkowej jeszcze dwukrotnie, stosując jednominutowe inkubacje na lodzie pomiędzy cyklami, aby zapobiec przegrzaniu próbki w wirówce.Odwirować zawiesinę przez dwie minuty przy 3000 ×g w temperaturze 4 °C, aby utworzyć luźny pellet włókien filtra GFF i szczątków ścian komórkowych. Pobrać 200 µl osadu i zanurzyć w 800 µl lodowatego 90% acetonu.Przenieś pozostały supernatant do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra. Zmierz ilość ekstrahowalnego chlorofilu A w spektrofotometrze przy długościach fali 664 nanometrów i 647 nanometrów. Odwiruj pozostały supernatant przez dwie minuty przy 15 000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Przenieś S do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, unikając pobrania osadu z nierozpuszczalnych błon komórkowych oraz pozostałych włókien filtra GFF. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może teraz zostać wykorzystany w teście aktywności rubisko karboksylazy, który zostanie zaprezentowany w dalszej części. Aby rozpocząć ten test, przenieś 125 µL każdego rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrocentryfugi z nakrętką o pojemności 1,5 ml, która została schłodzona na lodzie.W przypadku próbek kontrolnych negatywnych, do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z nakrętką należy dodać 125 µl rozpuszczalnego lizatu, pomijając dodanie substratu. Następnie przeprowadzić reakcje w dubletach dla wszystkich próbek oraz kontroli negatywnych. Przygotować 10 ml świeżego buforu do analizy i schłodzić go na lodzie.Wlej do probówki o pojemności pięciu mililitrów odpowiednią ilość buforu do testu dla wszystkich próbek oraz kontroli negatywnych. Od tego momentu wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane pod wyciągiem chemicznym. Dodaj do przygotowanego buforu wodorowęglan sodu znakowany C 14 i przechowuj bufor w lodzie.Pobrać 10 µL buforu do analizy zawierającego C 14 i rozcieńczyć go w jednym mililitrze buforu do analizy, odwracając probówkę w celu wymieszania. Dodać 100 µL rozcieńczonej mieszaniny do trzech mililitrów koktajlu scyntylacyjnego Bios Safe 2 w fiolce scyntylacyjnej i odwrócić, aby wymieszać. Zmierzyć liczbę zliczeń C 14 za pomocą licznika Beckman LS 6, 500; przed kontynuowaniem analizy liczba zliczeń powinna przekraczać 18 000 zliczeń na minutę.Po dodaniu odpowiedniej ilości wodorowęglanu sodu znakowanego C 14 do buforu do analizy, przenieś probówki z reakcją do bloku grzewczego ustawionego na 25 °C i inkubuj przez trzy do pięciu minut. Następnie dodaj 100 µL buforu do analizy do lizatów i inkubuj w temperaturze 25 °C przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj rybulozobisfosforan do każdej próbki i pozostaw reakcję na pięć do 10 minut w temperaturze 25 °C.Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 100 µL 100% kwasu probiotycznego, a następnie wirować przez jedną godzinę przy 2000 ×g w celu usunięcia niewprowadzonego C 14. Na koniec całą objętość próbek należy przenieść do fiolek scyntylacyjnych zawierających trzy ml bios. Safe 2 koktajlu do zliczania scyntylacyjnego, aby określić liczbę impulsów na minutę w próbce stabilnej z kwasem.Produkty końcowe określono za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Do izolacji nowych, przystosowanych do zimna protistów fototroficznych i miksotroficznych z antarktycznego jeziora Bonnie na trzech głębokościach zastosowano hodowle wzbogacone. Aby wyselekcjonować większą różnorodność organizmów, wykorzystano różne rodzaje pożywek wzrostowych: pożywkę Bolds, pożywkę BBMF dwa si, pożywkę morską oraz pożywkę BG 11.Stężenie składników odżywczych oraz promieniowanie aktywnie syntetyzujące lub PAR przedstawione w tej tabeli odzwierciedlają warunki panujące w momencie pobierania próbek. Inspekcja wizualna kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne, o czym świadczyła obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek. Kultury zawierały również różnorodne morfologie komórek, zależnie od głębokości pobrania inokulum oraz rodzaju pożywki zastosowanej w hodowli.Maksymalne szybkości aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym rubis były mierzone w kulturach wzbogaconych jako wskaźnik wiązania węgla. Monitorowano również zawartość chlorofilu a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych, co przedstawiono tutaj.Pomimo hodowli wszystkich kultur w tej samej temperaturze, potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna różniły się znacznie pomiędzy kulturami wzbogaconymi, mimo zastosowania tego samego reżimu oświetleniowego. Maksymalna aktywność rubis O zaobserwowana była w kulturach wzbogaconych cztery i sześć hodowanych na pożywce BBM oraz w kulturach wzbogaconych 13 i 14 hodowanych na pożywce BG 11. W przeciwieństwie do nich, kultury 1921 i 23 wzbogacone na pożywce wzrostowej F dwa wykazały maksymalne aktywności karboksylazy, które były od 4 do 34 razy niższe.Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w dwóch kulturach F, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w odniesieniu do zawartości chlorofilu a. Co więcej, analiza korelacji Pearsona wykazała, że aktywność RubisCO nie korelowała z koncentracją chlorofilu a. Kultury BBM zaszczepiono wodą jeziorną pobraną z głębokości sześciu metrów oraz 15 metrów.Kultura wzbogacona nr 5 wykazywała najwyższe poziomy chlorofilu A, podczas gdy wszystkie pozostałe kultury charakteryzowały się stosunkowo niską zawartością chlorofilu a, niezależnie od aktywności enzymu RubisCO. Po opanowaniu techniki, pobieranie próbek z jeziora zajmuje około dwóch godzin. W zależności od liczby pobranych próbek, analizę aktywności karboksylazy przeprowadza się również w ciągu dwóch godzin, pod warunkiem prawidłowego wykonania procedury. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak analiza aktywności enzymów heterotroficznych, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. na jakiej głębokości występują heterotrofy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat sposobu pobierania próbek z jeziora, ich wzbogacania oraz oznaczania aktywności karboksylazy RubisCO.

establishment-microbial-eukaryotic-enrichment-cultures-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Utworzenie wzbogaconych kultur mikrobiologicznych eukariontów z chemicznie wielowarstwowego antarktycznego jeziora oraz ocena potencjału wiązania węgla

Źródło: Villela, H. D. M. i in. Poszukiwanie szczepów mikroorganizmów do bioremediacji oraz rozwój probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje selektywną izolację bakterii morskich degradujących ropę poprzez wzbogacanie próbek wody morskiej na nośnikach olejowych, co umożliwia odzyskiwanie czystych szczepów z potencjalnymi zastosowaniami w bioremediacji ropy naftowej i oczyszczaniu środowiska.

Selektywne wzbogacanie i izolacja bakterii morskich degradujących ropę z próbek wody morskiej

Demonstrujemy metodę zbierania bakterii magnetotaktycznych (MTB), które można zastosować do naturalnych wód.  MTB można wyizolować i wzbogacić z próbek osadu przy użyciu stosunkowo prostej konfiguracji, która wykorzystuje naturalny magnetyzm bakterii.  Wyizolowany MTB można następnie szczegółowo zbadać zarówno za pomocą mikroskopii świetlnej, jak i elektronowej.

Zbieranie, izolacja i wzbogacanie naturalnie występujących bakterii magnetotaktycznych ze środowiska

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Kriosfera oferuje dostęp do zachowanych organizmów, które przetrwały w poprzednich warunkach środowiskowych. Przedstawiono protokół zbierania i odkażania rdzeni wiecznej zmarzliny gleb i lodu. Brak egzogennych kolonii i DNA sugeruje, że wykryte mikroorganizmy reprezentują materiał, a nie zanieczyszczenie pochodzące z wiercenia lub przetwarzania.

Usuwanie materiałów egzogenicznych z zewnętrznej części zamrożonych rdzeni w celu zbadania starożytnych zbiorowisk biologicznych znajdujących się w środku

Symulowaliśmy prekambryjski system upwellingu morskiego w pionowej kolumnie przepływowej na skalę laboratoryjną. Celem było zrozumienie, w jaki sposób profile geochemiczneO2 i Fe(II) ewoluują, gdy cyjanobakterie wytwarzająO2. Wyniki wskazują na powstanie chemokliny w wyniku utleniania Fe(II) przez fotosyntetycznie wytwarzanyO2.

Symulacja laboratoryjna bogatego w żelazo(II) prekambryjskiego systemu upwellingu morskiego w celu zbadania wzrostu bakterii fotosyntetycznych

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Zanieczyszczenie wpływa na wszystkie biomy. Szczególnie ucierpiały środowiska morskie, zwłaszcza rafy koralowe, jeden z najbardziej wrażliwych ekosystemów na Ziemi. Bioremediacja to zdolność organizmów do rozkładu zanieczyszczeń. W tym miejscu opisujemy metodologie izolowania i testowania drobnoustrojów prezentujących zdolność bioremediacji i potencjalne cechy probiotyczne dla koralowców.

Poszukiwanie szczepów drobnoustrojów do bioremediacji i rozwoju probiotyków do badań i ochrony metaorganizmów

Strumienie węgla w kriosferze są jeszcze prawie nie oszacowane, ale są kluczowe dla zmian klimatycznych. Prezentujemy nowatorskie prototypowe urządzenie, które rejestruje potencjał fototroficzny w środowiskach nadraglacyjnych w oparciu o technologię emisji fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.), oferując dane o wysokiej rozdzielczości spektralnej i przestrzennej w warunkach in situ.

Emisja fluorescencji indukowanej laserem (L.I.F.E.) jako nowatorskie nieinwazyjne narzędzie do pomiarów in situ biomarkerów w siedliskach kriosfery

Tematem tego artykułu jest szczegółowe opisanie najlepszych praktyk tworzenia pożywek dla wymagających mikroorganizmów beztlenowych pozyskanych ze środowiska. Metody te pomagają w zarządzaniu kulturami beztlenowymi i mogą być stosowane do wspomagania wzrostu nieuchwytnych mikroorganizmów niehodowlanych, "mikrobiologicznej ciemnej materii".

Zestaw symulowanych formatów pożywek opartych na informacjach in situ do hodowli mikroorganizmów beztlenowych nabytych w środowisku

Opisano protokół przygotowania prostego modelu ekosystemu, który odtwarza gradient przeciwstawny metanowo-tlenowy występujący w naturalnym środowisku tlenowych bakterii utleniających metan, umożliwiając badanie ich fizjologii w przestrzennie rozwiązanym kontekście. Opisano również modyfikacje popularnych testów biochemicznych do stosowania z ekosystemem modelowym opartym na agarozie.

Modelowy ekosystem oparty na agarozie do hodowli metanotrofów w przeciwgradieniu metanowo-tlenowym

Poznaj metodę izolacji eukariotów mikrobiologicznych z jeziora Bonney na Antarktydzie i oceny ich potencjału wiązania węgla za pomocą testu izotopowego RubisCO.

Ustanowienie mikrobiologicznych kultur wzbogacających w eukariotyzm z chemicznie rozwarstwionego jeziora antarktycznego i ocena potencjału wiązania węgla (Wideo) | JoVE Journal

Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Przeglądaj więcej filmów