Ustanowienie mikrobialnych kultur wzbogaconych eukariotów z chemicznie uwarstwionego jeziora antarktycznego oraz ocena potencjału wiązania węgla

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie kultur wzbogaconych protistów z antarktycznego jeziora Bonnie oraz pomiar wiązania węgla jako wstępnego wskaźnika różnorodności metabolicznej. Osiąga się to poprzez pobranie próbek wody z głębokości jeziora Bonnie odpowiadających znanym maksimom liczebności protistów i fitoplanktonu. Próbki wody jeziornej są następnie szczepione w różnych pożywkach i inkubowane w komorze wzrostowej wyposażonej w regulator temperatury i oświetlenie przez okres od czterech do sześciu tygodni.

Kultury można transportować w temperaturze 4°C, jeśli jest to konieczne. Kolejnym krokiem jest wyekstrahowanie surowych lizatów komórkowych z kultur wzbogaconych. Ostatnim etapem tej procedury jest ocena potencjału wiązania węgla w lizacie komórkowym za pomocą testu radioizotopowego na aktywność rybulozo-1,5-bisfosforanowej karboksylazy/oksygenazy, czyli Rubisco.

W ostateczności kultury wzbogacane wykazują zróżnicowanie potencjału wiązania węgla w naturalnej społeczności protistów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące ekologii mikroorganizmów jeziornych. Przykładem jest rola eukariotycznych mikroorganizmów w cyklu węglowym na różnych etapach w stratyfikowanych jeziorach Antarktydy.

Choć pobieranie próbek z kolumny wody do kolejnych generacji kultur wzbogaconych jest często stosowaną techniką, metoda ta zawiera modyfikacje pozwalające na pracę w ekstremalnie zimnym środowisku, w którym mogą wystąpić nieprzewidziane komplikacje. Pomysł na tę metodę pojawił się u mnie podczas poszukiwania sposobów przetestowania testu Redisco w naturalnych próbkach jeziornych. Wizualna demonstracja tej metody jest kluczowa, ponieważ etapy pobierania próbek są trudne do wyobrażenia, gdyż miejsca poboru znajdują się w środowisku obcym dla wielu badaczy.

Próbki pobierane są z jeziora Bonnie, jednego z wielu stale pokrytych lodem jezior znajdujących się w suchych dolinach McMurdo na Antarktyce. Na jeden dzień przed pobraniem próbek z kolumny wody należy wybrać i przygotować miejsce poboru. Pozwoli to na ponowne uformowanie się warstw stratyfikacyjnych kolumny wody po zakłóceniach spowodowanych wierceniem i topnieniem otworu w lodzie. Wyznacz za pomocą GPS lokalizację miejsca wiercenia, aby uzyskać dostęp do kolumny wody.

Rozpocznij od wywiercenia otworu w lodzie za pomocą świdra Jiffy Ice przymocowanego do czterocalowego przedłużenia Jiffy flight oraz odpowiedniego ryzaka, aby zapobiec zamarznięciu świdra w otworze. Staraj się uniknąć wiercenia w wodzie ciekłej, zatrzymując proces wiercenia na około 4–6 cali powyżej górnej granicy słupa wody. Otwór wiertniczy musi zostać poszerzony z średnicy sześciu cali do dwóch stóp w celu pobrania próbek.

Jest to realizowane przy użyciu urządzenia do wytwarzania otworów w modelu gorącego morza, które pompuje podgrzany glikol polietylenowy przez miedzianą rurkę. Topnienie trwa zazwyczaj do 18 godzin w dniu poprzedzającym pobieranie próbek z kolumny wody. Należy upewnić się, że cały wymagany sprzęt oraz naczynia do przechowywania próbek zostały zgromadzone w miejscu poboru.

Materiały do pobierania próbek obejmują butlę NICU o pojemności od 5 do 10 litrów, wciągarkę z kablem skalibrowanym pod kątem głębokości, wystarczającą liczbę butelek na każdą głębokość poboru, ciężarek (messenger) oraz lodówki do transportu próbek. Pobieranie próbek należy rozpocząć wcześnie rano, około godziny 5:00, ponieważ filtrowanie wody jeziornej powinno zostać zakończone w dniu poboru. Należy użyć czerpaka Kin przymocowanego do skalibrowanej ręcznej wciągarki.

Pobierz próbki wody o objętości od jednego do pięciu litrów z głębokości wymaganych w niniejszym badaniu. Głębokości poboru to 6 m, 15 m oraz 18 m, mierzone od symetrycznego poziomu wody PI w otworze w lodzie. Próbki jeziorne przechowuj w chłodziarkach i transportuj z miejsca poboru do laboratorium polowego.

Przy użyciu sani przytwierdzonych do A TV próbki powinny zostać przetworzone lub ustabilizowane w laboratorium polowym. Bezpośrednio po pobraniu próbek, po ich przetransportowaniu do laboratorium polowego, należy rozpocząć hodowlę kultur wzbogaconych. Skoncentruj od 0,5 do jednego litra wody jeziornej na filtrze o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.

Filtry z polietersulfonu (PES) przy zastosowaniu łagodnej filtracji. Jeśli wymagana jest analiza różnorodności naturalnej społeczności, należy przefiltrować drugą próbkę przez membranę o średnicy 47 mm i rozmiarze porów 0,45 µm.

Filtry z polietersulfonu zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie. Przenieść każdy filtr do sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml zawierającej około 20 ml przefiltrowanej wody jeziornej, pobranej z tej samej głębokości co próbka na filtrze.

Przenieś zawiesinę komórkową do sterylnej kolby do hodowli komórek o powierzchni 25 cm², aby przeprowadzić namnażanie na różnych pożywkach. Przygotuj wiele powtórzeń dla każdej głębokości poboru próbek. Do każdej kolby dodaj 50 x sterylnych roztworów następujących pożywek: bold basil medium, BG 11 oraz F two.

Jeśli wymagana jest hodowla organizmów miksotroficznych, należy przygotować dwa naczynia uzupełnione pożywką F2 i dodać dwa do trzech ziarenek sterylnego ryżu do jednej z kolb z kulturą inkubowaną w niskiej temperaturze i przy niskim natężeniu promieniowania w inkubatorze wzrostowym z kontrolą temperatury przez co najmniej cztery tygodnie przed wysyłką do laboratorium w USA. Przenieś kultury wzbogacone do sterylnych probówek Falcon o pojemności 50 ml. W zgłoszeniu wysyłkowym zaznacz wymagania dotyczące transportu: nie zamrażać i przechowywać w chłodzie. Po dotarciu do USA przenieś 5 ml każdej kultury wzbogaconej do 45 ml odpowiedniej pożywki wzrostowej w naczyniu o pojemności 125 ml.

Sterylna kolba Erlenmeyera zamknięta sterylną gąbką. Utrzymując kultury wzbogacone jako kultury stojące w komorze wzrostowej o kontrolowanej temperaturze 4 °C, przenosić kultury do świeżych mediów co 30 dni. Aby rozpocząć procedurę ekstrakcji lizatu komórkowego, przefiltrować 5 L kultury wzbogaconej na filtr Watman GFF o średnicy 25 mm, stosując delikatną próżnię.

Następnie za pomocą sterylnych stalowych nożyczek należy pociąć filtr na cztery do pięciu części. Następnie, używając sterylnej pęsety, przenieść fragmenty do probówki z nakrętką o pojemności 2 ml, wypełnionej w jednej piątej objętości roztworem o średnicy 0,1 mm.

Kuleczki krzemionkowo-cyrkonowe. Do probówki należy dodać 1,25 ml buforu do ekstrakcji filtrów, a następnie zniszczyć komórki za pomocą mini homogenizatora kuleczkowego przez 30 sekund przy ustawieniu prędkości 48, a następnie schłodzić na lodzie przez jedną minutę. Procedurę homogenizacji kuleczkowej należy powtórzyć jeszcze dwa razy, z jednominutową inkubacją na lodzie pomiędzy cyklami, aby zapobiec przegrzaniu próbki w wirówce.

Odwirować zawiesinę przez dwie minuty przy 3000 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby utworzyć luźny pellet włókien filtra GFF i resztek ścian komórkowych. Pobrać 200 µL osadu i zanurzyć w 800 µL lodowatego 90% acetonu.

Przenieś pozostały supernatant do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml. Zmierz zawartość ekstrahowalnego chlorofilu A za pomocą spektrofotometru przy długościach fal 664 nm i 647 nm. Odwiruj pozostały supernatant przez dwie minuty przy 15 000 ×g w temperaturze 4 °C.

Przenieś S do czystej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mililitra, unikając pobrania osadu nierozpuszczalnych błon komórkowych oraz pozostałych włókien filtra GFF. Ten rozpuszczalny lizat komórkowy może teraz zostać wykorzystany w teście aktywności karboksylazy rubisko, który zostanie omówiony w dalszej części. Aby rozpocząć ten test, przenieś 125 mikrolitrów każdego rozpuszczalnego lizatu do probówki do mikrocentryfugi z nakrętką o pojemności 1,5, która została uprzednio schłodzona na lodzie.

W przypadku próbek kontroli negatywnej do probówki mikrowirówkowej z nakrętką o pojemności 1,5 ml należy dodać 125 µL rozpuszczalnego lizatu, pomijając dodanie substratu. Następnie należy przeprowadzić reakcje w dwóch powtórzeniach dla wszystkich próbek oraz kontroli negatywnych. Należy przygotować 10 ml świeżego buforu do analizy i schłodzić go w lodzie.

Odmiar odpowiednią ilość buforu do testu dla wszystkich próbek i kontroli negatywnych do probówki o objętości pięciu mililitrów. Od tego momentu wszystkie kolejne kroki muszą być wykonywane pod wyciągiem. Do odmierzonego buforu dodaj znakowany C 14 wodorowęglan sodu i przechowuj bufor w lodzie.

Pobrać 10 µL buforu do testu zawierającego C 14 i rozcieńczyć w jednym mililitrze buforu do testu, odwracając probówkę w celu wymieszania. Dodać 100 µL rozcieńczonej mieszaniny do trzech mililitrów koktajlu do zliczania scyntylacyjnego bios safe two w fiolce scyntylacyjnej i odwrócić w celu wymieszania. Zmierzyć liczbę zliczeń C 14 za pomocą licznika Beckman LS 6, 500; przed kontynuacją testu liczba zliczeń scyntylacyjnych powinna przekraczać 18 000 zliczeń na minutę.

Po dodaniu odpowiedniej ilości wodorowęglanu sodu znakowanego C 14 do buforu do testu, przenieś probówki z reakcją do suchej kąpieli ustawionej na 25 °C i inkubuj przez od trzech do pięciu minut. Następnie dodaj 100 µL buforu do testu do lizatów i inkubuj w temperaturze 25 °C przez pięć minut. Po pięciu minutach dodaj rybulozo-1,5-bisfosforan do każdej próbki i pozwól reakcji przebiegać przez od pięciu do 10 minut w temperaturze 25 °C.

Aby zatrzymać reakcję, należy dodać 100 µL 100% kwasu probiotycznego i wirować przez jedną godzinę przy 2000 ×g w celu usunięcia niewiązanego C 14. Na koniec całą objętość próbek należy przenieść do fiolek scyntylacyjnych zawierających trzy mililitry koktajlu do zliczania scyntylacyjnego bios. Safe 2, aby określić liczbę zliczeń na minutę dla kwasu stabilnego.

Produkty końcowe określono za pomocą zliczania scyntylacyjnego. Hodowlę wzbogaconą zastosowano w celu wyizolowania nowych zimnolubnych protistów fototroficznych i miksotroficznych z antarktycznego jeziora Bonnie z trzech różnych głębokości. Aby wyselekcjonować większą różnorodność organizmów, zastosowano różne rodzaje pożywek wzrostowych: pożywkę Bold's, pożywkę BBMF dwa si, pożywkę morską oraz pożywkę BG 11.

Stężenie składników odżywczych oraz promieniowanie aktywne fotosyntetycznie (PAR) przedstawione w tej tabeli reprezentują warunki w momencie pobierania próbek. Inspekcja wizualna kultur wzbogaconych za pomocą mikroskopii świetlnej wykazała, że w kulturach dominowały protisty fototroficzne, na co wskazywała obecność pigmentu chlorofilu w większości komórek. W kulturach występowała również różnorodność morfologii komórek, zależna od głębokości pobrania inokulum oraz rodzaju użytego medium hodowlanego.

Maksymalne szybkości aktywności karboksylazy katalizowanej przez enzym rubis zmierzono w kulturach wzbogaconych jako wskaźnik wiązania węgla. Monitorowano również zawartość chlorofilu a jako szacunek biomasy protistów fototroficznych, co przedstawiono tutaj.

Pomimo hodowli wszystkich kultur w tej samej temperaturze, potencjał wiązania węgla i biomasa fototroficzna różniły się znacząco pomiędzy kulturami wzbogacanymi, mimo identycznego reżimu oświetleniowego. Maksymalna aktywność rubis O zaobserwowana została w kulturach wzbogacanych numer cztery i sześć hodowanych na pożywce BBM oraz w kulturach wzbogacanych 13 i 14 hodowanych na pożywce BG 11. Z kolei kultury 1921 i 23 wzbogacane na pożywce wzrostowej F dwa wykazały maksymalną aktywność karboksylazy, która była od 4 do 34 razy niższa.

Różnice te nie wynikały z niższego poziomu biomasy w dwóch kulturach F, ponieważ aktywność karboksylazy wyrażono w przeliczeniu na chlorofil a. Co więcej, analiza korelacji Pearsona wykazała, że aktywność rubisco nie korelowała z stężeniem chlorofilu a. Kultury BBM zaszczepiono wodą jeziorną pobraną z głębokości sześciu metrów oraz 15 metrów.

W piątym forum wzbogaconym odnotowano najwyższy poziom chlorofilu A, podczas gdy we wszystkich pozostałych kulturach poziom chlorofilu a był stosunkowo niski, niezależnie od aktywności enzymu rubisko. Po opanowaniu technik pobierania prób z jeziora, ich wykonanie zajmuje około dwóch godzin. W zależności od liczby pobranych próbek, test karboksylazy również trwa dwie godziny, jeśli jest przeprowadzany prawidłowo. Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak test aktywności enzymatycznej heterotrofów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, np. na jakiej głębokości występują heterotrofy. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat sposobu pobierania prób z jeziora, ich wzbogacania w celu produkcji oraz przeprowadzania testu aktywności rubisko karboksylazy.