Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

Witajcie w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Membran. Nazywam się Martin Caffery. Jest to kolejny artykuł z serii JoVE na temat krystalizacji białek błonowych w celu wyznaczenia ich struktury przy użyciu metody in meso lub fazy kubicznej lipidów.

W pierwszym artykule, JoVE 1 7 1 2, zademonstrowaliśmy sposób przygotowania fazy kubicznej nasyconej białkiem oraz sposób ręcznego dozowania lepkej i kleistej fazy misa do szklanych płytek kanapkowych w celu przeprowadzenia prób krystalizacji. Niniejszy artykuł wideo opisze metody wykorzystania robota do krystalizacji in meso. Robot oferuje takie zalety jak szybkość, dokładność, precyzyjna miniaturyzacja oraz możliwość pracy przez dłuższy czas w niekomfortowych warunkach, na przykład w ciemności lub w niskich temperaturach.

Roboty, przy właściwym zastosowaniu, mogą znacznie zwiększyć wydajność badań nad strukturą i funkcją białek błonowych. W niniejszym artykule wideo demonstrujemy zastosowanie trzech dostępnych komercyjnie robotów. Pierwszy robot został opracowany w grupie biologii strukturalnej i funkcjonalnej błon i jest szczegółowo opisany w odniesieniu pierwszym.

Pozostałe dwa stały się dostępne dopiero niedawno i zostały tutaj uwzględnione dla pełności obrazu. Przygotowanie płytek krystalizacyjnych do robotycznego przeprowadzenia prób krystalizacji rozpoczyna się od przygotowania płyty bazowej szklanej płytki krystalizacyjnej typu „sandwich”, opisanej szczegółowo w odniesieniu do płyty bazowej; najpierw musi ona zostać poddana sylonizacji, a następnie do płytki należy przykleić perforowany podkład dwustronnie klejący, który tworzy dołki. Materiały niezbędne do tego procesu są tutaj przedstawione.

Zestaw obejmuje szklaną płytkę bazową do krystalizacji, perforowany podkład dystansowy, wałek lub brayer, chusteczki papierowe oraz zlewkę z wodą ultraczystą. Płytkę umieszcza się na ręczniku papierowym na blacie laboratoryjnym. Nanieś kilka kropli roztworu, a następnie rozprowadź go równomiernie po powierzchni płytki za pomocą chusteczki papierowej.

Płytkę przemywa się z nadmiaru roztworu silicylizującego, zanurzając ją całkowicie w zlewce z wodą. Płytkę wyjmuje się ze zlewki i kładzie na suchym ręczniku papierowym. Stroną z silikonem do góry, a jej odsłoniętą powierzchnię osusza się, delikatnie przecierając ręcznikami papierowymi.

Następnie zużywa się osłonę ochronną z perforowanego dwustronnego dystansera samoprzylepnego i nakłada dystanser na zyloryzowaną powierzchnię szklanej płytki. Ważne jest, aby dystanser został prawidłowo umieszczony na płytce podstawowej, tak aby jego górny lewy róg oraz dwa przyległe boki pokrywały się z krawędziami płytki. Do wygładzenia dystansera na płytce podstawowej i zapewnienia szczelnego połączenia między nimi używa się wałka lub brayera.

Nawiasowo zaznaczamy, że płytki z silosami wraz z perforowanymi przekładkami są dostępne w sprzedaży, zgodnie z opisem w sekcji referencyjnej. Po przygotowaniu podstawowej płytki do krystalizacji przechodzimy do konfiguracji i obsługi robota in meso. Jak zostanie wskazane w dalszej części, zaprezentujemy wykorzystanie trzech robotów in meso.

We wszystkich przedstawionych przypadkach roboty są skonfigurowane i wykorzystywane w pomieszczeniu z kontrolowaną temperaturą ustawioną na 20 °C. Meso Robot One, pierwszy z robotów meso zaprezentowanych w tym filmie, został opracowany w laboratorium głównego badacza (PI) i jest obecnie dostępny w sprzedaży. Pełne szczegóły znajdują się w sekcji referencyjnej.

Poniżej przedstawiono materiały i sprzęt niezbędne do zrobotyzowanego przygotowania prób krystalizacji. Obejmują one notatnik laboratoryjny, roztwór białka w strzykawce Hamiltona, przygotowany zgodnie z opisem w artykule Jo 1 7 1 2, usilikonizowane płytki podstawowe z dystansami i dopasowanymi szkiełkami nakrywkowymi, butelkę z wodą oraz chusteczki, a także robota in miso.

Pierwszy widok przedstawia robota z pustym blatem. Następny widok ukazuje robota wyposażonego w stację parkowania nawilżacza, płytę bazową do krystalizacji oraz blok głębokich studzienek zawierający roztwory precypitantu. Konfigurację rozpoczynamy od umieszczenia płyty bazowej na blacie robota.

Posiada ona własną platformę, wyraźnie oznakowaną w miejscach rozmieszczenia dołków w celu wyrównania płytki podstawowej. Płytka powinna być wyraźnie opisana w celu jej identyfikacji. Blok 96-dołkowy zawierający roztwory precypitantu jest zamocowany we własnej platformie na pokładzie robota, obok płytki do krystalizacji.

Blok otwiera się, ostrożnie zdejmując plastikową pokrywę górną. Strumień wilgoci z nawilżacza jest kierowany tak, aby przepływał nad płytą bazową na pokładzie robota Konfiguracja robota. Robot jest inicjowany zgodnie z instrukcjami producenta.

Nie będziemy tutaj demonstrować tego procesu szczegółowo, ponieważ dokładne protokoły zmieniają się z czasem. W zasadzie podczas inicjalizacji ramię dozujące meza w robocie otrzymuje pozycje referencyjne w trzech ortogonalnych kierunkach: x, Y i Z. Następnie do pierwszego ramienia robota mocowana jest strzykawka Hamiltona z igłą dozującą, zawierająca fazę meza z białkiem; szczegółowe informacje na temat przygotowania fazy meza i strzykawki opisano w artykule JoVE 1 7 1 2 oraz w odniesieniu pierwszym. Końcówka igły strzykawki dozującej musi zostać teraz wyrównana z dnem i środkiem najwyższej studni w lewym górnym rogu płytki do krystalizacji. Odpowiada to identyfikatorowi studni A1, przy czym pierwszym krokiem jest wyrównanie z dnem studni A1.

Jest to realizowane poprzez regulację wysokości lub współrzędnej Z ramienia dozującego, przy jednoczesnej obserwacji odległości końcówki igły od dna dołka. To, czy końcówka ledwie dotyka dna dołka, można ocenić, przesuwając płytkę ręcznie na platformie z boku na bok i jednocześnie bardzo delikatnie korygując wysokość ramienia dozującego. Współrzędną Z ramienia dozującego, przy której końcówka styka się z płytką, wprowadza się do komputera; dozowanie jest programowane tak, aby odbywało się w odległości kilku mikrometrów od tej referencyjnej pozycji Z, która odpowiada powierzchni płytki bazowej. Następnie aktywuje się robota, aby przeszedł przez serię kroków wymuszonych przez użytkownika w celu ustawienia końcówki igły w centrum dołka A1.

Referencyjne współrzędne XY ramienia dozującego, w których znajduje się środek końcówki, są zapisane w komputerze sterującym robotem. Służą one do zdefiniowania środka pozostałych dołków na płytce. Po ustawieniu tych współrzędnych referencyjnych w komputerze, ramię dozujące mease otrzymuje polecenie powrotu do pozycji startowej w celu przygotowania strzykawki.

Należy teraz przygotować strzykawkę dozującą. Jest to konieczne, aby upewnić się, że świeża mease wypełnia igłę dozującą oraz że pierwsza studzienka na płytce otrzyma pełną dawkę mease. W programie sterującym robotem znajduje się komenda przygotowania, która aktywuje ten proces.

Powoduje to stopniowe przesuwanie tłoka w strzykawce pod kontrolą użytkownika. W tym czasie końcówkę igły sprawdza się pod kątem pojawienia się kropli; ewentualny nadmiar fazy usuwa się za pomocą chusteczki. Tym samym kończy się proces przygotowania systemu (priming) przed uruchomieniem robota.

Robot jest teraz gotowy do uruchomienia w trybie automatycznym. Program robota XAP rozpoczyna serię kroków płukania, podczas których końcówki dozujące precypitant na drugim ramieniu robota są myte i przygotowywane do aspiracji roztworów precypitantu z bloku głębokich studni. Aktywacja funkcji dozowania robota uruchamia sekwencyjne napełnianie studni, najpierw ośmiu jednocześnie, roztworem białka, a następnie roztworami precypitantu pomiędzy kolejnymi aplikacjami. Ramię dozujące białko wraca do pozycji parkingowej, gdzie końcówka igły jest umieszczana w wilgotnej gąbce, aby zapobiec wysychaniu białka na końcówce.

Najczęściej stosowanymi wartościami w próbach krystalizacji przeprowadzanych w grupie biologii strukturalnej i funkcjonalnej membran są 50 nanoliters treści i 800 nanoliters roztworu precypitanta. Program sterujący robotem w tej demonstracji został skonfigurowany tak, aby oba ramiona poruszały się jednocześnie.

W ten sposób możliwe jest zakończenie napełniania płytki 96-dołkowej próbką i osadnikiem w ciągu pięciu minut. Natychmiast po napełnieniu płytki i powrocie ramion robota do pozycji parkingowych, płytka zostaje zdjęta z platformy robota i umieszczona na płaskiej, stabilnej powierzchni.

Szkiełko nakrywkowe kładzie się ostrożnie na płycie podstawowej, tak aby stykało się z górną lepką powierzchnią dystansera. Należy upewnić się, że wszystkie 96 dołków jest całkowicie przykrytych, że szkiełko nakrywkowe jest wyrównane z płytą podstawową i że nie wystaje ono poza obrys płyty podstawowej. Do stworzenia szczelnego i jednorodnego połączenia między szkiełkiem nakrywowym a dystanserem używa się wałka lub brayera.

Na tym etapie należy sprawdzić płytkę, aby upewnić się, że przygotowanie przebiegło prawidłowo. Należy szukać obrazu przypominającego jajko sadzone na patelni. W każdej studzience żółtko jaja odpowiada fazie meza.

Białko jaja pełni rolę roztworu wytrącającego, a krawędź patelni wyznacza obwód krystalizacji. W idealnym przypadku te trzy elementy są koncentryczne. Płytka jest teraz gotowa do umieszczenia w obszarze przechowywania z kontrolowaną temperaturą w celu wzrostu kryształów.

Jeśli nie planuje się przygotowania kolejnych płytek, blok z wytrącaczem należy zdjąć z platformy robota, szczelnie zamknąć i odłożyć do miejsca przechowywania. Strzykawkę zawierającą mease należy zdjąć z ramienia dozującego robota i zdemontować jej poszczególne części, w tym igłę dozującą i ferrul. Następnie należy je starannie przemyć metanolem i osuszyć, przygotowując do kolejnego użycia w robocie Meso two mosquito LCP.

Kolejny klip wideo przedstawia robota mosquito LCP, który może być wykorzystany do przygotowania prób krystalizacji in meso. Wykorzystuje on system dozowania fazy meph podobny do opisanego wcześniej w tym artykule. W przypadku robota one osadnik jest jednak dozowany przy użyciu jednorazowych końcówek.

Tutaj przedstawiono samo urządzenie. Składa się ono z platformy, na której umieszcza się płytkę do krystalizacji i blok z osadnikiem, oraz komory z oknami służącej do kontroli wilgotności. Na tym widoku okna komory wilgotności zostały otwarte, ukazując szpulę z końcówkami dozującymi, ramię dozujące oraz czujnik laserowy służący do ustalenia położenia igły dozującej fazę meph.

Podwyższona platforma, na której spoczywa płytka do krystalizacji, oraz zagłębiona platforma do trzymania bloku z ekranem precypitantów. W tej sekwencji robot przeszedł przez procedurę inicjującą uruchamianą po włączeniu urządzenia. Oprogramowanie sterujące służy do konfiguracji instrumentu pod kątem pracy z konkretnymi płytkami do krystalizacji i blokami precypitantów oraz do dozowania określonych objętości próbki i precypitantu w заданной sekwencji.

Takie szczegóły są dostarczane przez producenta i nie zostaną tutaj przedstawione. Przygotowanie płytki do krystalizacji za pomocą robota rozpoczyna się w następujący sposób: strzykawkę firmy Hamilton z igłą, wypełnioną roztworem białka, przygotowuje się zgodnie z opisem powyżej w sekcji „in meso robot one” oraz w JoVE 1 7 1 2. Strzykawka zostaje zamocowana w pozycji pod ramieniem dozującym robota.

Współrzędne X i y igły w strzykawce dozującej są ustalane za pomocą zamontowanego na platformie czujnika laserowego. Jest to istotny krok, niezbędny do zapewnienia dokładnego dozowania mease w centrum każdej studzienki na płytce do krystalizacji. Po naciśnięciu przycisku na panelu sterowania strzykawka zostaje przygotowana do wypuszczenia mease z końcówki igły.

Wyduszony nadmiar jest następnie usuwany za pomocą chusteczki w ramach przygotowań do napełniania dołków przez robota, przed zamocowaniem płytki krystalizacyjnej na pokładzie urządzenia. Powierzchnię platformy zwilża się kilkoma kroplami wody, aby utrzymać płytkę na miejscu. Za pomocą pęsety zdejmuje się z płytki pokrywę ochronną, a następnie mocno dociska się płytkę do platformy, aby zapewnić jej dobre przyleganie.

Na platformie znajdują się trzy punkty orientacyjne, nad którymi centrowane są trzy narożne dołki, aby zapewnić prawidłowe ustawienie płytki względem końcówki igły dozującej; instrument jest teraz gotowy do rozpoczęcia cyklu konfiguracji. Zaczyna się on od drugiego etapu przygotowania (priming), podczas którego Mease jest dozowany na małą szklaną płytkę bezpośrednio przed załadowaniem świeżego mease na płytkę. W tej sekwencji widzimy, jak robot najpierw ładuje mease do pionowej kolumny ośmiu dołków na płytce, a następnie używa jednorazowych końcówek, aby nanieść roztwór precypitantu na grudkę mease.

Proces ten powtarza się 11 razy wzdłuż płytki, aż wszystkie dołki zostaną wypełnione. Cały proces trwa około pięciu minut. W tym konkretnym filmie do każdego dołka naniesiono 50 nanolitrów Mease oraz 800 nanolitrów roztworu precypitantu.

Napełnioną płytkę zdejmuje się z platformy robota umieszczonego na stole laboratoryjnym. Nakłada się szkiełko przykrywowe, a płytkę uszczelnia za pomocą bra, zgodnie z opisem powyżej w sekcji meso robot one. Prawidłowo oznakowaną płytkę można teraz umieścić w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów w Meso robot three, Griffin LCP.

Ten końcowy klip wideo przedstawia robota Griffin LCP podczas przygotowywania prób krystalizacji in meso. Robot Griffin wykorzystuje system dozowania fazy meph podobny do opisanego powyżej w przypadku pierwszego robota. W tym przypadku wszystkie 96 roztworów precypitantów jest jednak dozowanych jednocześnie.

Tutaj przedstawiono samo urządzenie. Składa się ono z pokładu, na którym znajdują się płytka do krystalizacji i blok z precypitantem, ramienia dozującego oraz głowicy z końcówkami Phoenix 96. W ostatniej sekwencji wideo pokazano robota w działaniu podczas dozowania roztworów precypitantu.

Głowica z 96 końcówkami jest najpierw napełniana roztworem precypitantu. Przewidziano opóźnienie definiowane przez użytkownika, aby ułatwić aspirację lepkich precypitantów. Faza MEA jest dozowana sekwencyjnie do 96 dołków w procesie, którego zakończenie trwa około jednej minuty.

Na koniec głowica z 96 końcówkami dozuje jednocześnie wszystkie 96 roztworów precypitantu na bolusy fazy MEA w studzienkach krystalizacyjnych. Cały proces ładowania płytki trwa dwie minuty. Wypełnioną płytkę zdejmuje się z platformy robota, uszczelnia szkiełkiem nakrywkowym i umieszcza w magazynie w kontrolowanych warunkach temperaturowych w celu wzrostu kryształów.

Kolejnymi krokami w ogólnym procesie wyznaczania struktury metodą krystalografii makromolekularnej są wycinanie i schładzanie kryształów kriogenicznie, a następnie rejestracja i przetwarzanie dyfrakcji rentgenowskiej z tych kryształów. Tematy te są omawiane w oddzielnych artykułach poświęconych procedurom w tej serii.I.