Zastosowanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

Witam w Grupie Biologii Strukturalnej i Funkcjonalnej Błon. Nazywam się Martin Caffery. Jest to kolejny z serii artykułów JO na temat krystalizacji białek błonowych do ustrukturyzowanego oznaczania metodą in meso lub lipic cubic phase.

W pierwszym artykule, JoVE 1 7 1 2, pokazaliśmy, w jaki sposób przygotowuje się fazę sześcienną obciążoną białkiem i jak lepka i lepka faza misa jest dozowana ręcznie do szklanych płytek warstwowych w celu przeprowadzenia prób krystalizacji. W tym artykule wideo opiszemy metody korzystania z robota do krystalizacji w mezo. Robot oferuje zalety szybkości, dokładności, precyzyjnej miniaturyzacji i możliwości pracy przez dłuższy czas w niekomfortowych warunkach, takich jak ciemność lub niskie temperatury.

Roboty, jeśli są właściwie używane, mogą znacznie poprawić produktywność badań nad strukturą i funkcją białek błonowych. W tym artykule wideo pokazujemy zastosowanie trzech dostępnych na rynku robotów. Pierwszy robot został opracowany w grupie biologii strukturalnej i funkcjonalnej błon i został szczegółowo opisany w referencji pierwszej.

Pozostałe dwa zostały niedawno udostępnione i zostały tutaj zamieszczone w celu uzupełnienia. Przygotowanie płytki krystalizacyjnej, ustawienie do przeprowadzenia próby krystalizacji w sposób zautomatyzowany, rozpoczyna się od przygotowania płyty bazowej szklanej płytki krystalizacyjnej typu sandwich, opisanej szczegółowo w odniesieniu do płyty podstawowej, należy najpierw zsilizować, a perforowaną przekładkę z podwójnym sztyftem, która tworzy dołki, należy nałożyć na płytę. Potrzebne do tego materiały są pokazane tutaj.

Obejmują one szklaną płytę bazową do krystalizacji, perforowany roztwór do mieszania z podwójnym sztyftem, wałek lub chusteczki papierowe Brayer oraz zlewkę z wodą UE. Talerz umieszcza się na ręczniku papierowym na blacie stołu. Nakłada się kilka kropli cichego roztworu, a następnie równomiernie rozprowadza na powierzchni płytki za pomocą chusteczki papierowej.

Płytkę myje się z nadmiaru roztworu zaklejającego, zanurzając ją całkowicie w zlewce z wodą. Płytkę wyjmuje się ze zlewki umieszczonej na suchym ręczniku papierowym. Silosową stroną do góry, a jej odsłoniętą powierzchnię suszy się, lekko przecierając ręcznikami papierowymi.

Następnie zdejmuje się osłonę ochronną z perforowanej podwójnej przekładki drążka dystansowego i nakłada się ją na silosową powierzchnię szklanej płyty. Ważne jest, aby podkładka dystansowa była prawidłowo umieszczona na płycie podstawy, tak aby lewy górny róg i dwie sąsiednie strony podkładki dystansowej i płyty pokrywały się. Wałek lub frezarka służy do spłaszczania przekładki na płycie podstawy i tworzenia szczelnego uszczelnienia między nimi.

W nawiasie zauważamy, że płyty silosowe wraz z perforowanymi przekładkami są dostępne w handlu zgodnie z opisem w sekcji referencyjnej. Po przygotowaniu płyty bazowej do krystalizacji przechodzimy następnie do konfiguracji i korzystania z robota in mezo. Jak wspomniano poniżej, demonstrujemy zastosowanie trzech w robotach mezo.

We wszystkich pokazanych przypadkach roboty są ustawiane i używane w pomieszczeniu o kontrolowanej temperaturze ustawionej na 20 stopni Celsjusza w meso robot one, pierwszym w meso robocie, który zostanie zademonstrowany w tym filmie. Artykuł został opracowany w laboratorium PI i jest już dostępny na rynku. Szczegółowe informacje można znaleźć w sekcji referencyjnej.

Materiały i sprzęt wymagane do przeprowadzenia próby krystalizacji w sposób zrobotyzowany przedstawiono tutaj. Obejmują one zeszyt laboratoryjny, białko białkowe, świeżo przygotowane zgodnie z opisem w artykule 1 7 1 2 i umieszczone w strzykawce Hamiltona. Silosowe płyty podstawy z przekładkami i pasującą szklaną pokrywą, butelką na wodę i chusteczkami higienicznymi oraz robotem in miso.

Pierwszy widok przedstawia robota z czystym pokładem. Następny widok przedstawia robota wraz ze stacją parkowania nawilżaczy, płytą podstawy krystalizacji i blokiem studni głębinowej zawierającym roztwory strącające. Konfigurację rozpoczynamy od umieszczenia płyty podstawy na pokładzie robota.

Posiada własną platformę, wyraźnie oznaczoną pozycjami studni w celu wyrównania płyty podstawy. Tabliczka powinna być wyraźnie oznakowana w celu identyfikacji. Blok 96 dołków zawierający roztwory strącające jest zabezpieczony na własnej platformie na pokładzie robota obok płytki krystalizacyjnej.

Blok otwiera się, ostrożnie zdejmując plastikową zaślepkę sufitu. Strumień wilgoci z nawilżacza jest kierowany do przepływu przez i w poprzek płyty podstawy na pokładzie robota Konfiguracja robota. Robot jest inicjowany zgodnie z instrukcjami producenta.

Nie będziemy tego tutaj szczegółowo demonstrować, ponieważ dokładne protokoły będą się zmieniać z czasem. Zasadniczo to, co dzieje się podczas inicjalizacji, polega na tym, że ramię dozujące mease w robocie jest wyposażone w pozycje odniesienia w trzech ortogonalnych kierunkach, x, Y i Z.Następnie faza meza obciążona białkiem w strzykawce Hamilton wraz z igłą dozującą jest przymocowana do ramienia jednego z robotów, pełne szczegóły dotyczące przygotowania fazy meza i strzykawki są opisane w Jo w artykule 1 7 1 2 oraz w odniesieniu pierwszym, Końcówka igły strzykawki dozującej musi być teraz wyrównana z dnem i środkiem górnej studzienki w lewym rogu płytki krystalizacyjnej. Odpowiada to identyfikatorowi studni A, który jest wyrównany z dnem studni A jako pierwszy porządek pracy.

Odbywa się to poprzez regulację wysokości lub współrzędnej Z po ramieniu dozującym, obserwując, jak blisko dna studzienki dochodzi końcówka igły. To, że końcówka dotyka tylko dna studzienki, można ocenić, przesuwając płytkę ręcznie z boku na bok na platformie przy jednoczesnej niewielkiej regulacji wysokości ramienia dozującego, współrzędna Z ramienia dozującego, w miejscu, w którym końcówka styka się z płytką wprowadzaną do dozowania komputerowego, jest zaprogramowana tak, aby odbywała się z końcówką igły kilka mikrometrów od tej referencyjnej pozycji Z, która odpowiada powierzchni płyty podstawy. Robot jest następnie aktywowany, aby przejść przez serię kroków podpowiadanych przez użytkownika, aby umieścić końcówkę igły w środku studni A.

Referencyjna współrzędna XY ramienia dozującego, w którym wyśrodkowana jest końcówka, jest przechowywana w komputerze sterującym robotem. Służy do definiowania środka pozostałych studzienek na płycie. Po ustawieniu tych współrzędnych odniesienia w komputerze, ramię dozujące mease zostaje poinstruowane, aby powrócić do pozycji wyjściowej, zalewając strzykawkę.

Strzykawka dozująca musi być teraz zagruntowana. Ma to na celu zapewnienie, że świeży mease wypełni igłę dozującą i że pierwsza studzienka na płytce otrzyma pełny zestaw żołądka. W programie znajduje się polecenie zalewania, które uruchamia aktywację robota.

Powoduje to, że tłok w strzykawce przesuwa się stopniowo pod kontrolą użytkownika. Podczas gdy to się dzieje, końcówka igły jest badana pod kątem pojawienia się mease, wytłaczana faza meza jest usuwana za pomocą chusteczki. Na tym kończy się proces zalewania robota.

Robot jest teraz gotowy do pracy w trybie automatycznym, rozpoczynając bieg. Program Robot XAP inicjuje rundę etapów płukania, w których końcówki dozujące środek strącający na drugim ramieniu robota są myte i przygotowywane do zasysania roztworów strącających z bloku studni głębinowej, aktywując funkcję dozowania na zestawach robota w ruchu, sekwencyjne ładowanie studzienek miazgą obciążoną białkiem pierwszych ośmiu dołków na raz, po których następują roztwory strącające Między dostawami. Ramię dozujące mease powraca do pozycji parkowania, w której koniec igły umieszcza się w zwilżonej gąbce, aby zapobiec wysychaniu mease na końcówce.

Najczęściej wartości stosowane w próbach krystalizacji przeprowadzanych w membranie. Grupa biologii strukturalnej i funkcjonalnej to 50 nanolitrów mease i 800 nanolitrów roztworu strącającego. Program uruchamiający robota w tej demonstracji został skonfigurowany w taki sposób, że oba ramiona poruszają się jednocześnie.

W ten sposób możliwe jest zakończenie ładowania płytki 96-dołkowej z mąką i środkiem strącającym w ciągu pięciu minut. Natychmiast płyta jest napełniana, a ramiona robota wracają do pozycji parkowania. Płyta jest zdejmowana z pokładu robota i umieszczana na płaskiej, twardej powierzchni.

Szkło nakrywkowe kładzie się delikatnie na górze płyty podstawy, stykając się z górną lepką powierzchnią przekładki. Ważne jest, aby upewnić się, że wszystkie 96 studzienek jest w pełni zakrytych, że szkło nakrywkowe jest wyrównane prostopadle z płytą podstawy i że żadna ze szklanych pokryw nie wystaje poza powierzchnię płyty podstawy. Wałek lub brayer służy do stworzenia szczelnego i jednolitego uszczelnienia między szkłem nakrywkowym a przekładką.

Na tym etapie należy sprawdzić płytę, aby upewnić się, że konfiguracja przebiegła tak, jak powinna. To, czego się szuka, to jajko sadzone na patelni. W każdej studzience jarzmo jajka odpowiada fazie mezy.

Białko jaja jest roztworem strącającym, a krawędź patelni jest obwodem krystalizacji. Cóż, idealnie byłoby, gdyby te trzy były koncentryczne. Płytka jest teraz gotowa do umieszczenia w obszarze przechowywania o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów.

Jeśli nie ma potrzeby ustawiania więcej płyt, blok strącający należy usunąć z pokładu robota, odpowiednio uszczelnić i ponownie umieścić w magazynie. Strzykawka zawierająca mease jest wyjmowana z ramienia dozującego robota, demontowana jest jego różne części, w tym igła dozująca i dzika. Dokładnie umyte metanolem i wysuszone w ramach przygotowań do następnego użycia w robocie Meso dwa komary LCP.

Ten następny klip wideo pokazuje robota LCP Mosquito, który może być używany do ustawiania prób krystalizacji w mezo. Zawiera podobny system dozowania fazy meph do opisanego wcześniej w tym artykule. Jednak w przypadku robota pierwszego środek strącający jest dozowany za pomocą jednorazowych końcówek.

Sam instrument jest pokazany tutaj. Obejmuje pokład, na którym płyta krystalizacyjna i blok strącający tworzą okienną komorę do kontroli wilgotności. W tym widoku okna w komorze wilgotnościowej zostały otwarte, szpula z końcówkami dozującymi, ramię dozujące mease, czujnik laserowy do ustalania położenia igły dozującej fazę meph.

Podniesiona platforma, na której znajduje się płyta krystalizacyjna, zapadnięta platforma do trzymania bloku sita strącającego. W tej sekwencji robot widział, jak przechodzi przez inicjalizującą sekwencję działań, gdy instrument jest włączony. Oprogramowanie do programowania służy do ustawiania przyrządu do pracy z określonymi płytkami krystalizacyjnymi i blokami strącającymi oraz do dozowania ustawionych objętości gęstości i środka strącającego w określonej kolejności.

Takie szczegóły są dostarczane przez producenta i nie będą tutaj pokazywane. Używanie robota do ustawienia płytki krystalizacyjnej rozpoczyna się w następujący sposób: Strzykawkę Hamiltona w komplecie z igłą i wypełnioną białkowym mease'em przygotowuje się zgodnie z powyższym opisem w mezo robocie pierwszym i w Jo 1 7 1 2. Strzykawka jest zaciśnięta w pozycji pod ramieniem dozującym robota.

Współrzędne X i y igły na strzykawce dozującej są ustalane za pomocą czujnika laserowego zamontowanego na pokładzie. Jest to ważny krok, który jest wymagany, aby zapewnić, że mease jest dokładnie dozowany w środku każdej studzienki na płytce krystalizacyjnej. Za naciśnięciem jednego przycisku na panelu sterowania, strzykawka jest przygotowywana do usuwania mazi z końcówki igły.

Wytłaczana mleka jest następnie usuwana za pomocą chusteczki w celu przygotowania do użycia robota do załadunku studni przed zamontowaniem płytki krystalizacyjnej na pokładzie robota. Powierzchnię platformy zwilża się kilkoma kroplami wody, aby utrzymać płytę na miejscu. Za pomocą kapilary osłona ochronna jest zdejmowana z płytki, a płytka jest mocno umieszczana na platformie, aby zapewnić dobre przyleganie.

Na platformie znajdują się trzy otwory referencyjne, nad którymi trzy narożne dołki są wkrótce wyśrodkowane, aby zapewnić prawidłowe ustawienie płytki w stosunku do końcówki igły dozującej, instrument jest teraz gotowy do wejścia w cykl konfiguracji. Rozpoczyna się to od drugiego etapu zalewania, w którym Mease jest dozowany na małą szklaną płytkę bezpośrednio przed przejściem do załadowania na płytkę świeżego mease'u. W tej sekwencji widzimy, jak robot najpierw ładuje mease, pionową kolumnę z ośmioma dołkami na talerzu, a następnie za pomocą jednorazowych końcówek dozuje roztwór strącający na bolus mease.

Proces ten powtarza się 11 razy na całej długości płytki, aż wszystkie studzienki zostaną wypełnione. Cały proces trwa około pięciu minut. W tym konkretnym filmie do każdej studzienki dozowano 50 nanolitrów Mease i 800 nanolitrów roztworu strącającego.

Napełnioną płytę zdejmuje się z platformy robota umieszczonego na ławce. Nakłada się szkło nakrywkowe, a płytkę uszczelnia się biustonoszem, jak opisano powyżej w sekcji w miso robot one. Odpowiednio oznakowana płytka może być teraz umieszczona w środowisku o kontrolowanej temperaturze w celu wzrostu kryształów w trzecim robocie Meso, Griffin LCP.

Ten ostatni klip wideo pokazuje robota Griffin LCP w użyciu, ustawiającego się w próbach krystalizacji mezo. Griffin zawiera podobny system dozowania fazy meph do opisanego powyżej dla robota pierwszego. W tym przypadku jednak wszystkie 96 roztworów strącających jest dozowanych jednocześnie.

Sam instrument jest pokazany tutaj. Zawiera pokład, na którym znajduje się płytka krystalizacyjna i blok strącający, ramię dozujące mease i głowicę końcówki Phoenix 96. W przypadku dozowania roztworów strącających, robot w akcji jest pokazany w tej końcowej sekwencji wideo.

Głowica końcówki 96 jest najpierw ładowana roztworem strącającym. Zapewnione jest opóźnienie zdefiniowane przez użytkownika, aby ułatwić zasysanie lepkich środków strącających. Faza MEA jest dozowana sekwencyjnie do 96 dołków w procesie, który trwa około jednej minuty.

Wreszcie, głowica z 96 końcówkami dozuje jednocześnie wszystkie 96 roztworów strącających na bolusy fazy MEA w studzienkach krystalizacyjnych. Cały proces ładowania płyty jest zakończony w ciągu dwóch minut. Napełnioną płytkę wyjmuje się z pokładu robota, a następnie zamyka się ją szkłem nakrywkowym i umieszcza w magazynie w kontrolowanych warunkach temperatury w celu wzrostu kryształów.

Kolejnymi etapami w ogólnym procesie oznaczania strukturalnego za pomocą krystalografii makromolekularnej są zbieranie i chłodzenie kryształów w krioterapii oraz rejestrowanie i przetwarzanie dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego z nich. Tematy te zostały omówione w osobnych artykułach o pracę w tej serii.